CN109504686A - 番茄SlCaM6基因在提高低温抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供番茄SlCaM6基因在提高低温抗性中的应用，所述SlCaM6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的SlCaM6基因为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究蔬菜作物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

Description

番茄SlCaM6基因在提高低温抗性中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及番茄SlCaM6基因在提高番茄低温抗性中的应用。
背景技术
光照、温度等环境因子对作物的生长发育起着至关重要的作用，直接影响到作物品质和作物产量。近年来，随着全球气候不稳定性的增加，低温越来越成为限制作物生长发育的非生物逆境，尤其是北方地区或高山地区。2015-2017年，低温冷冻和雪灾对我国农作物造成的直接经济损失高达287亿元，对农业生产以及农产品供给平衡造成了很大的危害。因此，研究植物对低温胁迫的响应作用及其分子机制，寻找提高植物耐低温能力的关键基因具有重要意义和重大价值。
番茄(Solanum lycopersicum L.)原产南美洲，属于茄科作物，是世界上广泛栽培的蔬菜，为喜温性植物，对低温敏感。番茄因基因组小、染色体图谱研究清楚、易于转化等优点，被广泛用于功能基因组学、分子生物学等研究中。以番茄为对象进行研究，不仅能够对番茄产业的发展起直接促进作用，更能清晰的阐述植物在冷害冻害下的伤害机制及应答机制，为提高植物的抗寒性提供理论依据。
基因编辑技术可以实现对特定DNA片段的敲除、加入等，有锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶和CRISPR/Cas等方法，其中CRISPR/Cas是一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，其靶向为DNA而非RNA。 CRISPR/Cas9系统由于几乎可以靶向任何目标序列，容易设计，价格便宜，技术门槛低，使用多个sgRNA可一次靶定多个标靶等特点而受到广泛应用。
发明内容
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对番茄SlCaM6基因进行定点敲除，其对番茄营养生长和生殖生长均没有明显影响，但可以提高番茄的低温抗性。本发明的目的是提供 SlCaM6基因敲除在提高番茄低温抗性中的应用。
SlCaM6基因来源于番茄，在番茄基因组数据库中的编号为Solyc03g098050，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SlCaM6的敲除，可利用CRISPR/Cas9基因编辑方法，还可以采用T-DNA插入、EMS 诱变等方法；且载体导入方法不局限于通过农杆菌转化方法，还包括通过花粉管导入作物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得的植株。
对野生型和SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株分别进行低温处理，SlCaM6CRISPR/Cas9基因敲除植株表现为耐低温的表型。
本发明提供的SlCaM6基因为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究蔬菜作物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。
附图说明
图1为番茄SlCaM6 CRISPR/Cas9株系#2和#3 DNA测序结果；
图2为野生型和SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株在低温处理后的表型；
图3为野生型和SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株在低温处理后的相对电导率；
图4为野生型和SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株在低温处理后的最大光化学效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建及SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株的获得：为探究SlCaM6缺失对番茄耐低温能力的影响，我们设计SlCaM6的靶基因序列，通过酶切连接构建pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35S-cas9SK载体，利用CRISPR/Cas9技术敲除SlCaM6来进行研究。
首先，利用CRISPR-P网站((http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计SlCaM6基因的靶序列sgRNA1:5’-CACCATCAATATCTGCCTCT-3’。将合成的sgRNA1序列(单链)进行退火，形成双链sgRNA1，同时其两端具有BbsI限制性内切酶酶切位点。将形成的sgRNA1与 BbsI限制性内切酶酶切过的AtU6-26SK载体进行连接，提取阳性质粒备用，命名为 U6-26-sgRNA1-SlCaM6-SK。利用Kpn I与Sal I限制性内切酶同时对 U6-26-sgRNA1-SlCaM6-SK和35S-Cas9SK载体进行双酶切，将各自酶切产物回收并将酶切过的U6-26-sgRNA1-SlCaM6片段连接到同样酶切过的35S-Cas9SK载体上。菌液PCR检测引物为，U6-26-F：5'-GACGGCCAGTGAATTGTA-3'，U6-26-R：5 '-TATCTAAGCGATGTGGGACT-3'，测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为 U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35S-cas9SK。利用Kpn I与Xba I限制性内切酶同时对 U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35S-cas9SK和pCAMBIA1301载体进行双酶切， U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35S-cas9SK回收约6kb的条带，即U6-26-sgRNA-SlCaM6-35S-cas9 片段，连到酶切过的pCAMBIA1301载体上。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，于含50mg/L卡那霉素(Kan)的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。在pCAMBIA1301载体的5’端设计引物进行菌液PCR检测(～550bp)，上下游引物分别为，U6-26-Cas9-F：5'-GCTCGTATGTTGTGTGGAAT-3'，U6-26-Cas9-R： 5'-TATCTAAGCGATGTGGGACT-3'。测序验证阳性克隆，提取阳性质粒备用，命名为 pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35Scas9SK。通过电击法将阳性质粒转入农杆菌 GV3101，与甘油1:1混合，-70℃保存。
上述载体利用“叶盘法”通过GV3101农杆菌侵染野生型(Ailsa Craig)番茄子叶，获得转化pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1-SlCaM6-35S-cas9SK敲除载体的抗性芽系，移栽后获得相应植株。最终，得到SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除株系14个。提取株系#2和#3 DNA进行测序，结果显示，株系#2插入1bp突变，株系#3缺失9bp突变(图1)。
实施例2：SlCaM6 CRISPR/Cas9基因敲除植株耐低温能力观察
试验选用的番茄品种为野生型Ailsa Craig和实施例1中所得的SlCaM6 CRISPR/Cas9株系#2和#3，将种子播种于盛满3：1草炭和蛭石复合栽培基质的塑料盆中，出苗后按照基质水分情况浇水保持基质湿润，整个过程浇霍格兰营养液，待四叶一心时进行低温处理，处理温度为4℃。
试验共设6个处理：1)WT常温组；2)SlCaM6 CRISPR/Cas9#2常温组；3)SlCaM6CRISPR/Cas9#3常温组；4)WT低温组；5)SlCaM6 CRISPR/Cas9#2低温组；6)SlCaM6 CRISPR/Cas9#3低温组。低温处理时间为7d。低温处理结束后进行表型拍摄、光系统II最大光化学效率测定和相对电导率测定。
光系统Ⅱ最大光化学效率具体测定方法为：将植株置于暗环境适应30分钟后，使用叶绿素荧光成像仪(IMAG-PAM；Heinz Walz，Germany)照射检测光(<0.5μmol m-2s-1)，测得最小荧光Fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m-2s-1)，测得最大荧光Fm。
荧光参数计算方法：PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)＝(Fm-Fo)/Fm。
植株相对电导率测定方法为：将处理结束后的番茄叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.2g，分别置于装有20ml去离子水的刻度离心管中，盖上盖子置于室温摇床中浸提2h。用电导仪测定浸提液电导R1.然后沸水浴加热15min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导R2。相对电导率＝R1/R2*100％.
结果显示(图2-4)，在低温条件下，SlCaM6 CRISPR/Cas9植株表现出抗冷的表型，这说明SlCaM6基因敲除后能够显著提高番茄对低温的耐受能力。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 番茄SlCaM6基因在提高低温抗性中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ctgaagtgtc caaacaaaaa cataagcaaa aaacgcgagc atagggtttt tacagtaatc 60
gaaggaattg ttaaagaaaa aaaaaaaaag aggagaaaaa tggcagagca gctgacggag 120
gagcagatcg ctgagttcaa ggaagctttt agccttttcg acaaggatgg cgatggctgt 180
attactacca aggagttggg aacagtgatg agatcacttg gtcagaatcc cactgaagct 240
gaactacagg atatgatcag tgaagttgat gctgatcaga atggaaccat tgattttcca 300
gagttcttga atctgatggc acggaagatg aaggacactg attctgagga agaactcaaa 360
gaggctttta aggtttttga taaagatcag aatggcttta tttctgcagc tgagcttcgt 420
catgtaatga caaaccttgg agagaagctg actgatgaag aggtggatga gatgatccga 480
gaggcagata ttgatggtga tggacaagtt aattatgagg agtttgtccg tatgatgctt 540
gccaagtgat gactttaaga ttctgttagc tactatgtaa tctatgatag ctgctcagtt 600
agttactaca acttatagct ggcagactca ggagcggttc aagtatatta gtggcctaaa 660
gcggctcctt aaacttgaat tgttaataac ttttgtataa ctgatttctt ctagttttac 720
ctgcatcttg actcc 735

Claims (3)

1.番茄SlCaM6基因在提高低温抗性中的应用，所述SlCaM6的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用具体为：对番茄的SlCaM6进行定点敲除。
3.根据权利要求1和2所述的应用，其特征在于，所述敲除的手段包括CRISPR/Cas9基因编辑技术。
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