CN107119063B - 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，包括：将蛹虫草自身的CmSnf1基因构建同源重组载体及回补过表达载体，经过农杆菌介导的转化，转入到蛹虫草菌株中，通过抗性筛选获得转基因菌株。本发明通过转基因技术获得了蛹虫草的CmSnf1基因敲除突变菌株，该突变菌株和野生型菌株及回补菌株相比，其发酵液中虫草素的产量提高7倍以上，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

Description

一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法

技术领域

本发明属于蛹虫草栽培领域，特别涉及一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法。

背景技术

作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)(Sungetal.,2007)。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎症、杀虫、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神经保护、肾保护等功能，在肿瘤治疗、器官移植、肝肾移植和心脏保护等方面具有重要作用。其主要成分包括四类：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素有抗病毒、抗肿瘤作用。，以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技发达国家的高度重视。它能抑制病毒的RNA合成；对枯草杆菌和鸟结核杆菌均有抑制作用；对HIV-I型病毒也有杀伤作用；尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用。因此，将其作为一种用途广泛的新药来开发是必然的趋势。

Snf1基因是Snf1蛋白激酶复合体的一个组分，是哺乳动物、植物、真菌等维持体内能源代谢所必需的(Hardieetal.,1998,Annualreviewofbiochemistry67:821-855)，其在真核生物中高度保守。在酵母(Saccharomycescerevisiae)中，Snf1是酵母为适应葡萄糖有限的环境下利用其他碳源，如蔗糖、乙醇、乳糖等多必需的；在赤酶菌(Gibberellasaubinetii)中，GzSnf1基因的敲除影响了该菌的有性、无性生殖，改变了赤酶对碳源的应用(Leeetal.,2009,EukaryotCell8(1):116-127)；在青霉(Penicilliumdigitatum)中，PdSnf1基因在正常条件下并不参与CWDE基因的表达调控，然而在以果胶为碳源的生长条件下，PdSnf1基因参与CWDE基因的表达调控；PdSnf1基因缺失突变菌株在以不同碳源的条件下(如葡萄糖、蔗糖、果胶、果糖、甘油等)，突变体的生长速度变慢，菌丝生长受到不同程度的抑制(Zhang，etal.,2013,ApplMicrobiolBiotechnol.DOI10.1007/s00253-012-4593-z)。通过酵母Snf1的氨基酸同源性的比对，在已测序的蛹虫草CM01中找到其同源基因CCM_05552，该基因与酵母的蛋白序列相似性为60％，与食用真菌草菇的蛋白序列相似性为51％，香菇的蛋白序列相似性为38％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，该方法通过转基因技术获得了蛹虫草的CmSnf1基因敲除突变菌株，该突变菌株和野生型菌株及回补菌株相比，其发酵液中虫草素的产量提高7倍以上，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

本发明的一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法，包括：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；将目的基因CmSnf1的上下游片段利用引物进行PCR扩增，将扩增片段构建到PDHt-bar上，得到PDHt-bar-CmSnf1载体；

(2)将上述PDHt-bar-CmSnf1载体转化根癌农杆菌，通过平板培养选出含有目的载体的菌株；(3)将蛹虫草孢子和步骤(2)得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株。

所述步骤(1)中的目的基因CmSnf1的序列如SEQ ID NO.1所示。来源于蛹虫草，已经在GenBank注册，GeneID:18167570。

所述步骤(1)中的引物为：

Snfl-U1：CCCTCGAGTTTGGTTCTATCTGGGCTAA；

Snfl-U2：CGGAATTCAAAGTTTCCGTCCGTCATA；

Snfl-D1：GGACTAGTACAATGGGCTACGGAAAG；

Snfl-D2：CGAGCTCCAAGGGTGTCACTGAGGAC。

所述步骤(1)中的PDHt的序列如SEQ ID NO.2所示。所述载体PDHt-bar为经过改建的PDHt，即加入启动子和bar基因。

所述步骤(2)中的平板培养采用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。

所述步骤(3)中的诱导和筛选采用含300μg/mL头孢霉素和300μg/mL草铵膦的M-100培养基。

有益效果

本发明通过转基因技术获得了蛹虫草的CmSnf1基因敲除突变菌株，该突变菌株和野生型菌株及回补菌株相比，其发酵液中虫草素的产量提高7倍以上，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下了基础。

附图说明

图1为本发明基因敲除载体构建示意图；

图2为本发明基因敲除菌株的PCR、RT-PCR鉴定图；其中，1:Marker；2:Cm01；3，4:ΔCmSnf1；5:Snf1-Comp；

图3为野生型菌株、突变菌株、互补菌株HPLC检测的虫草素含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。蛹虫草菌株所用培养基

PDA培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：马铃薯淀粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂粉15.0g/L。

SDB培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：动物组织胃蛋白酶消化物5.0g/L，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/L，葡萄糖20.0g/L。

M-100培养基：M-100Salt Solution 62.5mL/L，葡萄糖10g/L，KNO₃ 3g/L，琼脂粉15g/L。做覆盖用时，琼脂粉减为0.75g/L。M-100 Salt Solution：KH₂PO₄ 16g/L，Na₂SO₄ 4g/L，KCl 8g/L，MgSO₄.7H₂O 2g/L，CaCl₂ 1g/L，M-100Trace Element Solution 8mL/L。

M-100Trace Element Solution：H₃BO₃ 0.06g/L，MnCl₂·4H₂O 0.14g/L，ZnCl₂0.40g/L，

Na₂MoO₄·2H₂O 0.04g/L，FeCl₃·6H₂O 0.10g/L，CuSO₄·5H₂O 0.40g/L。

细菌菌株所用培养基

LB培养基：购自MDBio(青岛生工生物科技有限公司)。配方：Tryptone 10g/L，NaCl10g/L，Yeastextract 5g/L。若要配制固体培养基，则再添加15g/L琼脂粉。

农杆菌诱导培养基IM(液体)：2.5×MM Salt Solution 400mL/L，葡萄糖1.8g/L，甘油5mL/L，加水定容至940mL。高压灭菌并冷却至50℃后，每升加入40mL 1M MES(pH5.5，过滤除菌)，20mL10m MAS(乙酰丁香酮，DMSO(二甲基亚砜)配制，过滤除菌)。若配置固体培养基，葡萄糖减为0.9g/L，并加入琼脂粉15.0g/L。

2.5×MM Salt Solution：KH₂PO₄ 3.625g/L，K₂HPO₄ 5.125g/L，MgSO₄.7H₂O1.250g/L，NaCl 0.375g/L，CaCl₂·2H₂O 0.165g/L，FeSO₄·7H₂O 0.0062g/L(先配制6.2g/L的溶液，用时移取1mL)，(NH₄)₂SO₄ 1.250g/L。

实施例1

重组载体的构建

1)利用引物Snfl-U/Snfl-D分别扩增获得同源重组载体的上下游同源臂，利用酶切位点酶切、消化、连接，获得重组载体PDHt-bar-CmSnf1。

Snfl-U1	CCCTCGAGTTTGGTTCTATCTGGGCTAA
		Snfl-U2	CGGAATTCAAAGTTTCCGTCCGTCATA
Snfl-D1	GGACTAGTACAATGGGCTACGGAAAG
		Snfl-D2	CGAGCTCCAAGGGTGTCACTGAGGAC
Snfl-CHECK1	TGCGACACCCTCATATCATCAA
		Snfl-CHECK2	ATGTGCCTTCTACACCCGACTT

PCR反应体系和条件为

试剂	体积(μL)
		PCR Magic Mix2.0	25
Primer1	2
		Primer2	2
Template DNA	3
		ddH<sub>2</sub>O	18
Total	50

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后在72℃下补平10min，10℃保存。

2)转化根癌农杆菌：将1μL构建好的载体加入到100μL农杆菌AGL-1感受态中，液氮中放置5min，使感受态彻底冻住；37℃温育5min，使感受态彻底融化；向感受态中加入800μLLB液体培养基，28℃，220rmp振荡培养2h；在超净台中将菌液均匀涂于LB固体培养基上(含50μg/mL卡那霉素)，28℃培养30h。选取3个长出的单菌落分别用Snfl-U/Snfl-D引物进行PCR验证，检验转化是否成功。

实施例2

同源重组载体蛹虫草中的转化

(根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化)

1)从LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选一新鲜培养的含目的载体的农杆菌AGL-1单菌落，接种于5mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，220rpm，28℃过夜培养。

2)次日离心收集菌体，用等体积的液体诱导培养基IM重悬，移取适量的重悬液至5mL液体诱导培养基IM使OD660＝0.14-0.2。

3)28℃、220rpm振荡培养4-6h，菌液浓度至OD660＝0.5-0.8之间即可。

4)蛹虫草孢子的培养和收集：在超净工作中，将在PDA培养基上活化好(25℃，20d)的新鲜菌丝转移至均质仪中，加入50mLSDB液体培养基，均质30s(低速10s，高速10s，低速10s)后，移取10mL至100mLSDB液体培养基中，25℃，150rmp，摇床培养7d至芽生孢子量达到10⁸-10⁹。无纺布过滤收集芽生孢子，储存在4℃待用，一个月内可用。

5)取上述农杆菌菌液和用0.05％Tween20稀释至1×10⁶个/mL的孢子悬液各100μL充分混匀后涂布于IM平板，28℃共培养2d。

6)加入1mL 0.05％Tween20溶液至上述平板，用涂布器充分洗涤(刮取)混匀共培养物。将洗涤下来的培养物按每板200μL均匀涂布在含300μg/mL头孢霉素和300μg/mL草铵膦的

M-100培养基上，25℃培养3～5d至转化子出现，即得基因敲除菌株。

7)挑取转化子至含300μg/mL头孢霉素的M-100培养基上，待其长至直径为1-2cm时小量提取基因组进行PCR验证(图2)，同时提取野生出发菌株和过表达菌株的RNA，进行反转录为cDNA，进行表达量的验证，实验证明CmSnf1的基因几乎不表达。

实施例3

转基因菌株的虫草素含量检测

1)菌丝发酵

分别收集野生型菌株和突变菌株的新鲜孢子悬浮液，浓度调至10⁸，吸取300μL，接种到100mL的SDB培养基中，25℃，150rmp，摇床培养7d；

2)取培养基，经0.22μm水膜过滤于进样瓶中；

3)选用250mm*4.6mm(i.d.)，5μm的C₁₈色谱柱，流动相为20％甲醇和80％水，流速1.0mL/min柱温30℃，紫外波长260nm，进样量为10μL。

结果如图3所示，相对于野生型菌株和回补菌株，突变菌株中的虫草素含量有很大提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2240

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctcacc gaggctttga tgatgaggaa ctaaccattt cgctctcatc aacgcacgtt 60

cgccgacagc agcaaccgca gcacccaccc caccaccgtc atgatgccga ccggccgccc 120

aagccggcgt cccaaaccgt cggcgctccc ccaaaggaaa agacaaagac ggagcagcgt 180

attggtgcct acaaggtgat tcgcacactg ggtgaaggct cgtttggtaa ggtcagacta 240

gccacccaca tcggcaccgg ccagcaggtc gctctcaaga ttatcgcccg caagaagctc 300

atcagccgtg acatggttgg ccgcgttgag cgagagattg agtacctgca gctgctgcga 360

caccctcata tcatcaaact gtgagtgtcc aatacattgc gggcaatccg agacacgcta 420

accgccatcc accatagata caccgtcatc aagacacaga ccgaaatcat catggtcctc 480

gaatacgccg gcggagaact gttcgactac attgtacaaa atggccgcat gaaggagccc 540

gaagctcgac gcttctttca gcaaatgctc tgcgctgtcg agtactgcca tcgccacaag 600

attgttcacc gcgatcttaa gcccgaaaat ctgcttctcg acgagaacct caatgtcaag 660

attgctgatt tcggtctaag caacattatg acggacggaa actttctcaa gacatcctgt 720

ggcagtccca actatgcagc cccagaggtt attggcggaa agctgtatgc tggcccggaa 780

gttgacgtct ggagctgtgg agtaatcctc tacgtcttgc ttgtcggacg tctgcccttt 840

gatgacgagc acatccccag tctctttgcc aagattgcaa gaggaacata tagtatgccc 900

cagtggatgc caagcggcgc cgctaatctc atcaagaaaa tgctcgtcgt caatccagtt 960

cagcgtgcca cgatcgagga tatccgccag gacccatggt tcatgaccga actccccgct 1020

tacctgcagc ctcccgtcga ggagtttctc aacacaggtg tggatcctaa cagagctatt 1080

gagaagagtg acattgctcc caatgcctct gtcaaggtcc aagaacgcct gcataacgag 1140

gttaccgaca agatcagcaa gacaatgggc tacggaaaga cggatgtcga agaggctctc 1200

caatcagagg aaccttccgc catcaaggat gcatacatga ttgtccgcga aaacaaaatg 1260

atgcaagtta accagcttgt cgaagctgtt gccaccgaga ccgaagaagg aagccctgtg 1320

atgagcatgt cttcggcacg ttcgggagtt ccgccgccgc cgcgcccata tgttagcaaa 1380

gttggtatcc tgccttcaag tataggcacg tatcacaaag actacattga gcgtgccaag 1440

tcgggtgtag aaggcacatt gcccgatgag acggccatta acgatgagcc gacgtcggct 1500

cgcactgatg ctgaaaggga agaggcttcc cgacgtctca agccccactc gcgctcacaa 1560

aagcagctag aggagggctt gaagagacca cagggcatga caccgattaa tccgccgaag 1620

aagaccaagc ccgttcgctg gcaattcggt atccgatcgc gcaatgctcc atgggaggca 1680

ctgctgtgca tccacaaggc gctgtataag ctcggcgccg cttatattcc agacgaagac 1740

tatgcgagat tgcggcaaca cgatggagag acgccagttg aggaggagcc acaagaacct 1800

ttggatggga aggaccccac gcaacagtac aagctccccg cggacccttg gcacattcgt 1860

gtgcgctggg agactaagag tatgtgaacc tacgaatgcc attttgctac tgtgtgccac 1920

aggtactaac gtttgtatcc gtagttatgc gcagcacaaa cgcgagcaca ccgacagaga 1980

ccgaagccgg ccaggagacc aagatacccg acacatacca agtgctggag ggcaaggccg 2040

cgcagacgcg ggactttgtc gcgctgcacc tgggcatcca aatctacgaa atggagcagg 2100

gcgtgtatct agtggatttc aagtgctcgg ggtacgagac ggcggatggt aagttgctgg 2160

aggagaagga ggtgatgagc ccttttccgt tcctagacat ggcggcgcgt ctcatcatgc 2220

agcttgctga agctgattga 2240

<210> 2

<211> 7076

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 120

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 180

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga gcagcttgag cttggatcag 240

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ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt 480

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tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc 840

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gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac 1080

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cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga 1200

cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg 1260

ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg 1320

ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta 1380

cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt 1440

gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg 1500

ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta 1560

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gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag 1860

gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag 1920

ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt 1980

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ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc 2340

cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt 2400

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tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg 2580

gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc 2640

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ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4860

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4920

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4980

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 5040

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 5100

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 5160

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 5220

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 5280

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtactaa 5340

aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt gatccccagt 5400

aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat cgaccggacg 5460

cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc aataaagcca 5520

cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg ggaaaagaca 5580

agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg atctttaaat 5640

ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt cagtaagtaa 5700

tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga tatgtcgatg 5760

gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg gctttgttca 5820

tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag attgctccag 5880

ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc cagccatagc 5940

atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct gtccgtcatt 6000

tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg agacattcct 6060

tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg tgatattctc 6120

attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata ccccaagaag 6180

ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac cttaaatacc 6240

agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta tcgacggagc 6300

cgattttgaa accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg 6360

ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa 6420

tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc 6480

ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag 6540

ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact 6600

taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttcgggggat 6660

ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt 6720

tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat 6780

aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aacttggcaa 6840

gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 6900

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 6960

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 7020

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacg 7076

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctcgagtt tggttctatc tgggctaa 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggaattcaa agtttccgtc cgtcata 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggactagtac aatgggctac ggaaag 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgagctccaa gggtgtcact gaggac 26

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcgacaccc tcatatcatc aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgtgccttc tacacccgac tt 22

Claims (1)

1.一种PDHt-bar-CmSnf1在提高蛹虫草中虫草素含量中的应用，其特征在于：所述PDHt-bar-CmSnf1用于敲除CmSnf1基因；构建方法为：利用引物Snfl-U/Snfl-D分别扩增获得同源重组载体的上下游同源臂，利用酶切位点酶切、消化、连接，获得重组载体PDHt-bar-CmSnf1；

其中，引物为：

Snfl-U1：CCCTCGAGTTTGGTTCTATCTGGGCTAA；

Snfl-U2：CGGAATTCAAAGTTTCCGTCCGTCATA；

Snfl-D1：GGACTAGTACAATGGGCTACGGAAAG；

Snfl-D2：CGAGCTCCAAGGGTGTCACTGAGGAC。

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