CN109912720B - 一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝；将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH敏感的N端结构域、A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH敏感的C端结构域和C.moluccensis来源的核心域模块组装溶解度高、pH敏感的蜘蛛丝蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。采用亲和层析法或尿素溶解法分离纯化获得目标蛋白，并制备高浓度且均匀透明的纺丝原液，利用湿法纺丝法将纺丝原液注入凝固浴中直接成丝，由于蛛丝蛋白的高pH敏感性使其可在pH2‑pH11较广的范围内成丝。

Description

一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝；具体涉及蛛丝蛋白的基因设计、含有融合蛋白基因片段的重组表达载体的构建、在大肠杆菌中的发酵表达、融合蛋白的分离纯化方法以及应用湿法纺丝制备蛛丝。

背景技术

典型的织网蜘蛛分泌出七种不同类型的蛛丝纤维(牵引丝、捕获丝、鞭毛状丝、包卵丝、包装丝、固着丝、黏合丝)。蜘蛛丝具有良好的生物相容性，可生物降解性，并且具有适合生物医学应用的低过敏性。蜘蛛丝蛋白可以加工成涂层，用于改善生物材料的生物相容性和表面性质，例如医用级硅树脂植入物；由蛛丝蛋白和聚合物制成的网状物具有用于伤口愈合和作为组织工程中人造细胞外基质的巨大潜力。最近，蜘蛛丝就被用作神经再生的人工支持，周围神经的缺损可以通过由静脉、蜘蛛丝纤维和基质胶混合制成的神经移植物来修复；此外，将天然蜘蛛丝作为外科缝合线进行测试，结果表明，蜘蛛丝缝合线的力学性能优于目前的临床黄金标准尼龙，其有望作为显微外科手术和神经外科手术中医用材料；蜘蛛丝也可用于包装活性成分，如药物，蛋白质，基因和细胞等，用于递送或诊断[SchachtK,Scheibel T.Processing of recombinant spider silk proteins into tailor-madematerials for biomaterials applications[J].Current Opinion in Biotechnology,2014,29:62-69]。

蛛丝纤维中性能最佳的是被称为蜘蛛生命线的牵引丝，牵引丝蛋白主要分为两种，MaSp1和MaSp2，它们的脯氨酸含量和疏水性不同。所有主要的蛛丝蛋白都是由高度重复的核心结构域组成，侧翼为非重复末端。在核心结构域中，不同的氨基酸基序(富含甘氨酸的重复序列和聚丙氨酸嵌段)使得二级结构(α-螺旋、β-片层、α-转角和无规则卷曲)赋予了纤维的机械性能；末端结构域在蛛丝蛋白作为纺丝原液储存期间以及纤维开始组装期间起着重要作用[Bauer J,Schaal D,Eisoldt L,et al.Acidic Residues Control theDimerization of the N-terminal Domain of Black Widow Spiders’Major AmpullateSpidroin 1[J].Scientific Reports,2016,6:34442]。

天然蜘蛛丝的主要缺点是纤维的不均匀性，因为在个体蜘蛛之间甚至在环境变化的个体中会发生丝性质的差异；另一个缺点是由于基于蜘蛛的同类相食行为的农业问题而导致天然材料的低可用性。所以近几年利用微生物宿主生产人造蛛丝成为研究热点，而此方法主要瓶颈问题是：大片段基因的遗传不稳定性；重组蛛丝蛋白溶解度低导致的后续纺丝困难。因此成功实现人造蜘蛛丝的重要的先决条件是重组蛛丝蛋白具备小分子量、高度可溶性和简易的成丝方法。pH敏感性使蛛丝蛋白能被不同pH值的凝固浴诱导末端结构域二聚化，可较易组装成纤维。不同类型蜘蛛的蛛丝蛋白N端和C端结构域溶解度和pH敏感性是不同的，而较好的溶解度和pH敏感性有利于成丝，目前蛛丝蛋白的成丝范围约为pH4.5-6，其成丝范围需进一步扩大从而简化成丝条件；核心结构域决定了蛋白分子量大小和丝的机械性能，基于C.moluccensis来源的人造蛛丝为至今机械性能和天然蛛丝最相近且分子量最小的蛛丝蛋白[Thamm C,Scheibel T.Recombinant production,characterization andfiber spinning of an engineered short major ampullate spidroin(MaSp1s)[J].Biomacromolecules,2017,18(4)]。

针对上述问题，我们进行了研究和试验，利用合成生物学模块化思想，挖掘分子量较小、功能较好的模块，将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH环境敏感的N端结构域、A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH环境敏感的C端结构域和C.moluccensis来源的核心域模块组装溶解度高、pH敏感的蜘蛛丝蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶解度高、pH敏感的蛛丝蛋白，高溶解度使蛛丝蛋白易于制备高浓度纺丝原液，这是蛋白组装成纤维最重要的先决条件；蛋白的pH敏感性使其能被不同pH值的凝固浴诱导末端结构域二聚化，进而在更广的条件下组装成蛛丝纤维。本发明首次构建了溶解度高、pH敏感的蛛丝蛋白，采用亲和层析法和尿素溶解法分离纯化获得高产的目标蛋白，制备高浓度且均匀透明的纺丝原液，利用湿法纺丝法将纺丝原液注入凝固浴中直接成丝，由于蛛丝蛋白的高pH敏感性使其可在pH较广的范围内成丝。

本发明构建了一种溶解度高、pH敏感的蛛丝蛋白，氨基酸序列(如SEQ ID NO.4所示序列)包含E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH环境敏感的N端结构域(如SEQ IDNO.1所示序列)、A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH环境敏感的C端结构域(如SEQ ID NO.2所示序列)和C.moluccensis来源的核心域模块组装蜘蛛丝蛋白(如SEQ IDNO.3所示序列)。

一种蛛丝蛋白的设计合成方法；将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH敏感的N端结构域、A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH敏感的C端结构域和C.moluccensis来源的核心域模块组装蜘蛛丝蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

所述E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH环境敏感的N端结构域的序列为SEQ ID NO.1；A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH环境敏感的C端结构域的序列为SEQ ID NO.2；C.moluccensis来源的核心域模块组装蜘蛛丝蛋白序列为SEQ ID NO.3。

所述得到的蛛丝蛋白基因序列进行宿主密码子优化，利用人工合成基因序列或通过PCR合成基因序列，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，构建含有NdeI和HindIII限制性酶切位点、六聚组氨酸标签、T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因的蛛丝蛋白表达质粒pET-28a-NMC，基因序列SEQ ID NO.6所示。

所述合成蛛丝蛋白方法是：将质粒pET-28a-NMC转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS宿主中，通过含有卡那霉素的抗性固体平板筛选，获得能够表达新型蛛丝蛋白的工程菌株；将工程菌株用LB培养液进行发酵实验，16-37℃、100-300rpm培养条件下培养；生产蛛丝蛋白。

所述蛛丝蛋白的纯化方法是，采用亲和层析法或尿素溶解法两种方法分离纯化目标蛋白，利用目标蛋白中组氨酸标签能特异性结合镍纯化柱纯化上清可溶性目标蛋白，采用高浓度尿素溶解目标蛋白包含体，通过透析复性和除盐获得蛛丝蛋白。

利用本发明的方法得到的蛛丝蛋白获得蛛丝纤维的方法，包括步骤如下：

(1)将冷冻干燥制成的粉末状蛛丝蛋白充分溶解于Tris-HCl缓冲液中，制备浓度为100-300mg/mL的纺丝原液；(2)配备pH值为2-11的氯化钠和醋酸钠凝固浴；

(3)用微量进样器吸取纺丝原液，利用注射泵注入凝固浴中，获得蛛丝纤维；

(4)用玻璃棒将蛛丝纤维从凝固浴中拉出，晾干。

所述Tris-HCl缓冲液浓度为20mM，pH为8。

所述凝固浴中氯化钠浓度为200mM，醋酸钠浓度为300-700mM。

所述微量进样器为0.5μL微量进样器。

详细说明如下：

(1)一种新型蛛丝蛋白的设计：将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛MiSp蛋白的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域模块(SEQ ID NO.3)组装新型蜘蛛丝蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.4；

(2)对新型蛛丝蛋白基因序列进行宿主密码子优化，人工合成基因序列或通过PCR合成基因序列，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，构建新型蛛丝蛋白表达质粒pET-28a-NMC，基因序列如SEQ ID NO.6所示。

(3)将质粒pET-28a-NMC转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS宿主中，通过卡那霉素抗性筛选，获得能够表达新型蛛丝蛋白的工程菌株,并于16-37℃、100-300rpm培养条件下培养；

(4)新型蛛丝蛋白的纯化，采用亲和层析法或尿素溶解法两种方法分离纯化目标蛋白。

本发明第二个目的是提供一种新型蛛丝，利用新型蛛丝蛋白高溶解性的特点制备高浓度蛋白纺丝原液，将其注入凝固浴中，通过不同pH凝固浴诱导原液形成蛛丝纤维。

具体实施方案如下：

(1)将冷冻干燥制成的粉末状新型蛛丝蛋白充分溶解于20mM Tris-HCl(pH 8)缓冲液中，制备浓度约为100-300mg/mL的纺丝原液。

(2)配备pH值为2-11的200mM氯化钠和400mM醋酸钠凝固浴。

(3)用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，利用注射泵注入凝固浴中，即可获得蛛丝纤维。

(4)用玻璃棒将蛛丝纤维从凝固浴中拉出，晾干。

本发明采用合成生物学模块化思想，挖掘分子量较小、功能较好的模块，科学设计新型蜘蛛丝蛋白，高溶解度和pH环境敏感的N端结构域(SEQ ID NO.1)、高溶解度和pH环境敏感的C端结构域(SEQ ID NO.2)和分子量较小的核心域(SEQ ID NO.3)组装新型蜘蛛丝蛋白。采用亲和层析法或尿素溶解法分离纯化获得纯度大于90％的新型蛛丝蛋白，运用不同pH凝固浴诱导蛋白末端结构域二聚化形成纤维，可在较为广泛的条件下(pH2-pH11)成丝,不同pH凝固浴所成蛛丝表面均光滑，粗细均匀，直径为80μm左右，pH6条件下所成蛛丝发生了最大形变(97％)，拉伸强度(52.92Mpa)和韧性(3.563MJm^-3)达到最高值，pH7条件下所成蛛丝拉伸强度和pH6的相差不多为52.84Mpa，其杨氏模量达到最高值为2.03GPa。

附图说明

图1：为重组表达载体pET-28a-NMC示意图；重组表达载体pET-28a-NMC中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点、融合蛋白NMC编码基因及六聚组氨酸标签。

图2：为大肠杆菌表达的融合蛋白及分离纯化后的融合蛋白；其中泳道M：蛋白Maker；泳道a：大肠杆菌全菌蛋白；泳道b：大肠杆菌破碎后上清可溶蛋白；泳道c：大肠杆菌破碎后包含体不可溶蛋白；泳道d：尿素处理后上清蛋白；泳道e：尿素处理后沉淀蛋白；泳道f：分离纯化后的融合蛋白。

图3：为不同pH凝固浴中成丝图；a:pH2；b:pH3；c:pH4；d:pH5；e:pH6；f:pH7；g:pH9；h:pH11。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质有权利要求来限定。

本发明以具体实施例提供一种N端和C端均为pH敏感的新型融合蛛丝蛋白的构建，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明对人工蛛丝蛋白基因序列进行宿主密码子优化，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明构建含有上述蛛丝蛋白基因的重组表达载体，将蛛丝蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子，六聚组氨酸标签以及卡那霉素抗性筛选标记基因。

本发明提供含有上述蛛丝蛋白基因的宿主细胞，所述的宿主细胞为含有如SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

本发明提供一种产生上述蛛丝蛋白的方法，其特征在于将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(如SEQ ID NO.1所示序列)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(如SEQ IDNO.2所示序列)和C.moluccensis来源的核心域模块利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体pET-28a-NMC，再将质粒载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行蛛丝蛋白的表达，通过亲和层析法或尿素溶解法纯化蛛丝蛋白。本发明提供一种产生新型蛛丝的方法，将纯化的pH敏感的蛛丝蛋白制备高浓度纺丝原液，利用微量进样器将其注射到含有氯化钠和醋酸钠的凝固浴中成丝，晾干即可获得丝纤维。

上述制备新型蛛丝的步骤如下所示：

(1)获得新型蛛丝蛋白的基因SEQ ID NO.5

①确定pH敏感的蛛丝蛋白N端结构域、C端结构域和核心域的氨基酸序列。

②根据上述信息确定目标蛋白氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化，人工合成或通过PCR法获得全基因序列；

(2)构建含有蛛丝蛋白基因的表达载体

①无菌操作取微量穿刺菌加入5mL含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，从穿刺菌中提取质粒(pET-28a-NMC)，加入NdeI和HindIII限制性酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳验证载体(5311bp)和目标基因(1335bp)两个片段大小正确，确定表达载体(pET-28a-NMC)成功构建；

(3)构建产pH敏感的蛛丝蛋白的工程菌株

①将重组表达载体质粒pET-28a-NMC与感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS混合均匀，冰上孵育30min，42℃热激后迅速在冰上静置3min，使感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS吸收重组表达载体质粒pET-28a-NMC；再加入LB培养基复苏2h，将复苏后的培养液涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上；

②无菌操作从LB固体培养基上挑选数个菌落；根据载体中目标基因两端序列设计引物，进行目标基因菌落PCR扩增，再利用琼脂糖凝胶电泳验证扩增片段大小的正确性。将上述验证结果呈阳性的菌落接种到5mL含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，提取质粒，通过NdeI和HindIII限制性酶处理和琼脂糖凝胶电泳进一步筛选目的基因位置准确的菌株，获得经过验证的产新型蛛丝蛋白的工程菌株。

③将产新型蛛丝蛋白的工程菌株菌液与40％甘油按1:1比例储存在-80℃的冰箱中。

(4)大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，卡那霉素浓度为50μg/mL，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有LB培养基的摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。适宜条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6-0.8mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16-37℃，200-250rpm过夜培养。

(5)新型蛛丝蛋白分离和纯化

①将发酵液离心，收集菌体，菌体用PBS缓冲液清洗除去培养基残液。发酵液离心，沉淀加入上样缓冲液(loading buffer)热激后，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

②将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、40mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎，离心收集上清液和沉淀。取破碎后菌液离心，沉淀和上清加入上样缓冲液(loading buffer)热激后，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

③选用5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elution buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，将蛋白冻干。

④将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡加速溶解，离心取上清进行梯度透析，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

(6)湿法纺制新型蛛丝

①将浓缩后的蛋白用冷冻干燥机制成粉末状，然后用20mM Tris-HCl(pH 8)溶解形成200mg/mL的高浓度蛋白纺丝原液。

②用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，借助注射泵使进样器以一定速度注射进入凝固浴中(200mM氯化钠、400mM醋酸钠)，形成的蛛丝纤维从凝固浴中抽出晾干即可。

实施例1：pH 2凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后,按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子,转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH2的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH2的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为75μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH2条件下所成的蛛丝最大形变为34％，拉伸强度为25.71Mpa,韧性为0.45MJm^-3,杨氏模量为0.821GPa。

实施例2：pH 3凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH3的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH3的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为85μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH3条件下所成的蛛丝最大形变为53％，拉伸强度为39.85Mpa,韧性为1.05MJm^-3,杨氏模量为0.45GPa。

实施例3：pH 4凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH 4的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH4的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为85μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH4条件下所成的蛛丝最大形变为59％，拉伸强度为48.54Mpa,韧性为1.81MJm^-3,杨氏模量为1.32GPa。

实施例4：pH 5凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH 5的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH 5的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为88μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH5条件下所成的蛛丝最大形变为78％，拉伸强度为50.32Mpa,韧性为2.67MJm^-3,杨氏模量为1.74GPa。

实施例5：pH 6凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH6的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH6的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为92μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH6条件下所成的蛛丝最大形变为97％，拉伸强度为52.92Mpa,韧性为3.56MJm^-3,杨氏模量为1.65GPa。

实施例6：pH 7凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH 7的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH 7的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为92μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH7条件下所成的蛛丝最大形变为81％，拉伸强度为52.84Mpa,韧性为3.04MJm^-3,杨氏模量为2.03GPa。

实施例7：pH 9凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH 9的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH 9的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为88μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH 9条件下所成的蛛丝最大形变为81％，拉伸强度为46.31Mpa,韧性为2.38MJm^-3,杨氏模量为2.3831.07GPa。

实施例8：pH 11凝固浴中纺制蛛丝

1、重组表达载体和菌株的构建

①重组表达载体的构建

将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的N端结构域(SEQ ID NO.1)、A.ventricosus蜘蛛的C端结构域(SEQ ID NO.2)和C.moluccensis来源的核心域(SEQ ID NO.3)利用基因工程技术进行融合，在不改变其氨基酸序列(SEQ ID NO.4)的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。合成该基因序列(SEQ ID NO.5)并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。

②大肠杆菌的化学转化

将构建正确的重组表达载体pET-28a-NMC(SEQ ID NO.6)注入感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，轻弹混匀，冰上静置30min，42℃水浴放置60s,迅速在冰上静置3min。然后加入900μL LB培养基，37℃，150rpm复苏45min，复苏后取100μL菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，设计引物，进行目的基因菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图在1300bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在1300bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。菌落PCR和质粒双酶切均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。

2、新型蛛丝蛋白的表达纯化

①大肠杆菌发酵表达新型蛛丝蛋白

挑取固体培养基中产新型蛛丝蛋白的单菌落接种到5mL含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将种子液按1:100的比例转移至含有200mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，培养基中按上述比例加入卡那霉素。37℃，250rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8,加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM诱导目标蛋白表达。将发酵液在有助于蛋白折叠的条件下16℃，200rpm培养24h，发酵液在4℃，9000rpm条件下离心10min收集大肠杆菌菌体。

②蛛丝蛋白的分离纯化

将菌体重悬于PBS溶液中，在冰浴中进行超声破碎30min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎后菌液于9000rpm离心10min收集上清液和沉淀。将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包含体加入上样缓冲液(loading buffer)，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。

a.蛛丝蛋白上清的分离纯化：

将菌体重悬于binding buffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、60mM咪唑，pH7.0)，在冰浴中进行超声破碎30min，9000rpm离心15min收集上清液和沉淀。

选用GE公司的5mL His trap亲和层析柱，先用水和binding buffer进行柱平衡，上清液经过0.22μm膜过滤后再加入到和层析柱中，目标蛋白中含有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni²⁺通过配位键等结合，溶液中咪唑竞争与Ni²⁺结合，利用elutionbuffer(40mM磷酸钠、0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0)将蛋白从柱中洗脱出来，经梯度透析和超滤浓缩后，用冷冻干燥机将蛋白冻干。

b.新型蛛丝蛋白包含体的分离纯化：

将破碎菌体后获得的沉淀用包含体洗涤液(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、10mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、2M尿素)洗涤除去菌体碎片，9000rpm离心后取沉淀溶解于包含体溶解液中(50mM Tris-HCl(pH 8)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.5％(v/v)TtitonX-10、5mM DTT、8M尿素)，超声震荡5min加速溶解，9000rpm离心取上清在4℃下梯度透析48h，超滤浓缩后即可获得目标蛋白。

纯化得到的新型蛛丝蛋白溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于90％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为44KD。

3、湿法纺制新型蛛丝纤维

将浓缩后蛛丝蛋白用BCA法测量浓度，冷冻干燥制成粉末状，再将其溶于20mMTris-HCl(pH 8)溶液中制成浓度约为200mg/mL的纺丝原液，纺丝原液混合均匀至透明。用0.5μL微量进样器吸取纺丝原液，安装至注射泵上，以10μL/min的速度匀速注入含有200mM氯化钠和400mM醋酸钠的凝固浴中，将凝固浴中的蛛丝用玻璃棒悬出晾干即可。将纺丝原液注入pH 11的凝固浴中，探究酸碱性对成丝的影响。结果如图3所示，新型蛛丝蛋白可在pH11的凝固浴中成丝。

4、新型蛛丝表征

①新型蛛丝形貌表征

用荧光倒置显微镜和电子扫描显微镜检测所成蛛丝的形貌特征，蛛丝表面光滑，粗细均匀，直径为88μm左右。

②新型蛛丝拉力应变测试

用拉力机拉伸所成的蛛丝直至拉断，pH11条件下所成的蛛丝最大形变为48％，拉伸强度为27.56Mpa,韧性为0.85MJm^-3,杨氏模量为1.60GPa。

本发明提出了利用一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝；已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种蛛丝蛋白的设计合成方法和纺丝

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser His Thr Thr Pro Trp Thr Asn Pro Gly Leu Ala Glu Asn Phe Met

1 5 10 15

Asn Ser Phe Met Gln Gly Leu Ser Ser Met Pro Gly Phe Thr Ala Ser

20 25 30

Gln Leu Asp Asp Met Ser Thr Ile Ala Gln Ser Met Val Gln Ser Ile

35 40 45

Gln Ser Leu Ala Ala Gln Gly Arg Thr Ser Pro Asn Lys Leu Gln Ala

50 55 60

Leu Asn Met Ala Phe Ala Ser Ser Met Ala Glu Ile Ala Ala Ser Glu

65 70 75 80

Glu Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Lys Thr Ser Ser Ile Ala Ser Ala

85 90 95

Met Ser Asn Ala Phe Leu Gln Thr Thr Gly Val Val Asn Gln Pro Phe

100 105 110

Ile Asn Glu Ile Thr Gln Leu Val Ser Met Phe Ala Gln Ala Gly Met

115 120 125

Asn Asp Val Ser Ala

130

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Thr Ser Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Thr Ser Ala Ala Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Val Ala Ala Gly Ser Tyr Ala Gly Ala Val Asn Arg Leu Ser Ser

20 25 30

Ala Glu Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Asn Ile Ala Ala Ile Ala Ser

35 40 45

Gly Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ser Val Ile Ser Asn Ile Tyr Ser Gly

50 55 60

Val Val Ala Ser Gly Val Ser Ser Asn Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Leu Leu Ser Ala Leu Val His Val Leu Ser Ser Ala Ser Ile

85 90 95

Gly Asn Val Ser Ser Val Gly Val Asp Ser Thr Leu Asn Val Val Gln

100 105 110

Asp Ser Val Gly Gln Tyr Val Gly

115 120

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Ser Ser Ser Leu Asp Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Gln Thr Val

1 5 10 15

Arg Ile Asn Gly Tyr Gly Gln Ile Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Ser Gly Val Ala Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Glu

35 40 45

Thr Gly Ala Arg Asn Ser Ala Ala Ile Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Arg Ile Gly Tyr Gly Gln Arg Gly Ala Gly

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Pro Ala Ala Thr Val Ala Thr Val Ala Gly Val Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Arg Gly Gly Tyr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Ala Thr Val

100 105 110

Ala Ala Ala Thr Ala Gly Arg Gly Gly Tyr Tyr Gln Gly Gly Ala Gly

115 120 125

Leu Gly Asp Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Arg Ala Glu Arg Gly

130 135 140

Gly Tyr Gly Glu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Ala

145 150 155 160

Ala Gly Glu Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Leu Ser Gly Ser Tyr

165 170 175

Gly Gly Gln Gln Gly Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ala Ala Thr

180 185 190

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Ala Thr Ala Thr Gly Ser His Thr Thr Pro Trp Thr Asn Pro Gly

1 5 10 15

Leu Ala Glu Asn Phe Met Asn Ser Phe Met Gln Gly Leu Ser Ser Met

20 25 30

Pro Gly Phe Thr Ala Ser Gln Leu Asp Asp Met Ser Thr Ile Ala Gln

35 40 45

Ser Met Val Gln Ser Ile Gln Ser Leu Ala Ala Gln Gly Arg Thr Ser

50 55 60

Pro Asn Lys Leu Gln Ala Leu Asn Met Ala Phe Ala Ser Ser Met Ala

65 70 75 80

Glu Ile Ala Ala Ser Glu Glu Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Lys Thr

85 90 95

Ser Ser Ile Ala Ser Ala Met Ser Asn Ala Phe Leu Gln Thr Thr Gly

100 105 110

Val Val Asn Gln Pro Phe Ile Asn Glu Ile Thr Gln Leu Val Ser Met

115 120 125

Phe Ala Gln Ala Gly Met Asn Asp Val Ser Ala Ile Ser Ser Ser Leu

130 135 140

Asp Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Gln Thr Val Arg Ile Asn Gly Tyr

145 150 155 160

Gly Gln Ile Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly

165 170 175

Val Ala Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Glu Thr Gly Ala Arg Asn

180 185 190

Ser Ala Ala Ile Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala

195 200 205

Gly Arg Ile Gly Tyr Gly Gln Arg Gly Ala Gly Thr Gly Asp Ser Pro

210 215 220

Ala Ala Thr Val Ala Thr Val Ala Gly Val Gly Gly Ala Gly Arg Gly

225 230 235 240

Gly Tyr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Ala Thr Val Ala Ala Ala Thr Ala

245 250 255

Gly Arg Gly Gly Tyr Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asp Ala Ala

260 265 270

Ala Ala Thr Gly Ala Gly Arg Ala Glu Arg Gly Gly Tyr Gly Glu Gly

275 280 285

Gly Ala Ala Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Glu Gln Gly

290 295 300

Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Leu Ser Gly Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gly

305 310 315 320

Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ala Ala Thr Val Thr Ser Gly Gly Tyr

325 330 335

Gly Tyr Gly Thr Ser Ala Ala Ala Gly Ala Gly Val Ala Ala Gly Ser

340 345 350

Tyr Ala Gly Ala Val Asn Arg Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ala Ser Arg

355 360 365

Val Ser Ser Asn Ile Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ala Leu

370 375 380

Pro Ser Val Ile Ser Asn Ile Tyr Ser Gly Val Val Ala Ser Gly Val

385 390 395 400

Ser Ser Asn Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Leu Leu Ser Ala

405 410 415

Leu Val His Val Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Asn Val Ser Ser Val

420 425 430

Gly Val Asp Ser Thr Leu Asn Val Val Gln Asp Ser Val Gly Gln Tyr

435 440 445

Val Gly Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr

450 455

<210> 5

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgagcc ataccacacc gtggaccaat ccgggtttag ccgaaaactt catgaatagc 60

tttatgcaag gtttaagcag catgccgggt tttacagcca gtcagctgga cgatatgagc 120

accattgccc agagcatggt gcagagcatt cagagcttag ccgcacaagg tcgcaccagc 180

ccgaacaaac tgcaagcctt aaacatggcc tttgccagca gcatggccga aatcgcagcc 240

agcgaagagg gtggcggtag tctgagcacc aaaaccagca gcattgccag tgccatgagc 300

aatgcctttc tgcagaccac cggtgtggtt aatcagccgt tcatcaacga gattacccag 360

ctggtgagta tgtttgccca agctggcatg aacgatgtta gcgcaatcag cagctcttta 420

gatagcgctg gtgcaagtgc cgcccagaca gtgcgcatta acggctacgg ccagattgaa 480

gccgaggcag cagctgcagc agccgccggt agtggtgtgg cacgtcgtgg cggttatggc 540

caagatgaga ccggtgcccg caatagcgca gcaatcgcaa cagccgcagc agccgctggt 600

gctggtggcg ctggtcgtat cggttacggt cagcgtggtg ccggtaccgg tgatagtccc 660

gctgctaccg tggcaaccgt tgctggtgtt ggcggcgctg gtcgtggtgg ttatgatcaa 720

ggtcgcagcg gtgccacagt tgcagcagcc accgctggtc gtggcggcta ttatcaaggt 780

ggtgccggtt taggtgatgc agccgccgcc actggtgctg gtcgtgcaga acgcggtggc 840

tacggtgaag gcggtgccgc agctggtaat gcagcaacag ccgccgccgg tgaacaaggt 900

ggctatggtg gccaaggtct gagcggtagc tatggtggtc agcaaggtgc agcagcactg 960

gcaagtgcag cagcaaccgt gaccagcggc ggttacggtt atggtaccag cgcagcagct 1020

ggtgccggtg tggcagccgg tagctatgct ggtgcagtga atcgcttaag tagtgcagaa 1080

gccgcaagcc gcgtgagcag caatattgcc gcaattgcaa gcggtggcgc cagcgcactg 1140

ccgagcgtga ttagtaatat ctatagcggt gttgttgcca gtggcgttag cagcaatgag 1200

gctttaatcc aagccttact ggagctgctg agtgccttag ttcacgtgct gagcagcgcc 1260

agcatcggca atgtgagcag cgtgggcgtg gatagtactt taaacgtggt gcaagatagc 1320

gtgggtcagt atgttggtta aaagctt 1347

<210> 6

<211> 6646

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttt 180

aaccaacata ctgacccacg ctatcttgca ccacgtttaa agtactatcc acgcccacgc 240

tgctcacatt gccgatgctg gcgctgctca gcacgtgaac taaggcactc agcagctcca 300

gtaaggcttg gattaaagcc tcattgctgc taacgccact ggcaacaaca ccgctataga 360

tattactaat cacgctcggc agtgcgctgg cgccaccgct tgcaattgcg gcaatattgc 420

tgctcacgcg gcttgcggct tctgcactac ttaagcgatt cactgcacca gcatagctac 480

cggctgccac accggcacca gctgctgcgc tggtaccata accgtaaccg ccgctggtca 540

cggttgctgc tgcacttgcc agtgctgctg caccttgctg accaccatag ctaccgctca 600

gaccttggcc accatagcca ccttgttcac cggcggcggc tgttgctgca ttaccagctg 660

cggcaccgcc ttcaccgtag ccaccgcgtt ctgcacgacc agcaccagtg gcggcggctg 720

catcacctaa accggcacca ccttgataat agccgccacg accagcggtg gctgctgcaa 780

ctgtggcacc gctgcgacct tgatcataac caccacgacc agcgccgcca acaccagcaa 840

cggttgccac ggtagcagcg ggactatcac cggtaccggc accacgctga ccgtaaccga 900

tacgaccagc gccaccagca ccagcggctg ctgcggctgt tgcgattgct gcgctattgc 960

gggcaccggt ctcatcttgg ccataaccgc cacgacgtgc cacaccacta ccggcggctg 1020

ctgcagctgc tgcctcggct tcaatctggc cgtagccgtt aatgcgcact gtctgggcgg 1080

cacttgcacc agcgctatct aaagagctgc tgattgcgct aacatcgttc atgccagctt 1140

gggcaaacat actcaccagc tgggtaatct cgttgatgaa cggctgatta accacaccgg 1200

tggtctgcag aaaggcattg ctcatggcac tggcaatgct gctggttttg gtgctcagac 1260

taccgccacc ctcttcgctg gctgcgattt cggccatgct gctggcaaag gccatgttta 1320

aggcttgcag tttgttcggg ctggtgcgac cttgtgcggc taagctctga atgctctgca 1380

ccatgctctg ggcaatggtg ctcatatcgt ccagctgact ggctgtaaaa cccggcatgc 1440

tgcttaaacc ttgcataaag ctattcatga agttttcggc taaacccgga ttggtccacg 1500

gtgtggtatg gctcatatgg ctgccgcgcg gcaccaggcc gctgctgtga tgatgatgat 1560

gatggctgct gcccatggta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg 1620

gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga 1680

tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 1740

ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 1800

tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 1860

ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 1920

tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc 1980

gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg 2040

gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat 2100

cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa 2160

gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg 2220

ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg 2280

caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg 2340

atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa 2400

cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa 2460

gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac 2520

agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg 2580

ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt 2640

ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa 2700

ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc 2760

gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt 2820

accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa 2880

gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg 2940

caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag 3000

ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc 3060

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 3120

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc 3180

tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat 3240

gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 3300

ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg 3360

cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc 3420

cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt 3480

gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg 3540

ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc 3600

tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac 3660

gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct 3720

accctgtgga acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt 3780

tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg 3840

ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat 3900

tacccccatg aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac 3960

cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa 4020

cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga 4080

gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 4140

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 4200

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 4260

tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 4320

catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 4380

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 4440

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 4500

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 4560

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 4620

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 4680

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 4740

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 4800

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 4860

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 4920

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 4980

ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 5040

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 5100

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 5160

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 5220

tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat 5280

attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 5340

tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 5400

tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 5460

gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 5520

atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg 5580

aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 5640

ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 5700

gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 5760

agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 5820

aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 5880

cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 5940

gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 6000

cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 6060

catttgatgc tcgatgagtt tttctaagaa ttaattcatg agcggataca tatttgaatg 6120

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6180

aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 6240

ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 6300

agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 6360

cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 6420

atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 6480

ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 6540

gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac 6600

acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 6646

Claims (9)

1.一种蛛丝蛋白的设计合成方法；其特征是将E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH敏感的N端结构域、A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH敏感的C端结构域和C.moluccensis来源的核心域模块组装蜘蛛丝蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是E.australis蜘蛛MaSp1蛋白的高溶解度和pH环境敏感的N端结构域的序列为SEQ ID NO.1；A.ventricosus蜘蛛的MiSp蛋白的高溶解度和pH环境敏感的C端结构域的序列为SEQ ID NO.2；C.moluccensis来源的核心域模块组装蜘蛛丝蛋白序列为SEQ ID NO.3。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是对得到的蛛丝蛋白基因序列进行宿主密码子优化，利用人工合成基因序列或通过PCR合成基因序列，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.5所示，构建含有NdeI和HindIII限制性酶切位点、六聚组氨酸标签、T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因的蛛丝蛋白表达质粒pET-28a-NMC，基因序列SEQID NO.6所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是合成蛛丝蛋白方法是：将质粒pET-28a-NMC转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS宿主中，通过含有卡那霉素的抗性固体平板筛选，获得能够表达新型蛛丝蛋白的工程菌株；将工程菌株用LB培养液进行发酵实验，16-37℃、100-300rpm培养条件下培养；生产蛛丝蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是蛛丝蛋白的纯化方法是，采用亲和层析法或尿素溶解法两种方法分离纯化目标蛋白，利用目标蛋白中组氨酸标签能特异性结合镍纯化柱纯化上清可溶性目标蛋白，采用尿素溶解目标蛋白包涵体，通过透析复性和除盐获得蛛丝蛋白。

6.利用权利要求1的方法得到的蛛丝蛋白获得蛛丝纤维的方法，其特征是步骤如下：

(1)将冷冻干燥制成的粉末状蛛丝蛋白充分溶解于Tris-HCl缓冲液中，制备浓度为100-300mg/mL的纺丝原液；

(2)配备pH值为2-11的氯化钠和醋酸钠凝固浴；

(3)用微量进样器吸取纺丝原液，利用注射泵注入凝固浴中，获得蛛丝纤维；

(4)用玻璃棒将蛛丝纤维从凝固浴中拉出，晾干。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是Tris-HCl缓冲液浓度为20mM，pH为8。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是凝固浴中氯化钠浓度为200mM，醋酸钠浓度为300-700mM。

9.如权利要求6所述的方法，其特征是微量进样器为0.5μL微量进样器。

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