CN111363022B

CN111363022B - 高浓度重组蛛丝蛋白纺丝液的制备方法及其纺丝

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Publication number: CN111363022B
Application number: CN202010259753.XA
Authority: CN
Inventors: 夏小霞; 胡春飞; 钱志刚
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111363022A

Abstract

一种高浓度重组蛛丝蛋白纺丝液的制备方法及其纺丝，该重组蛛丝蛋白的分子结构为NTD‑(RP)n‑CTD，其中整数n代表RP重复结构域的重复次数，每个RP重复结构域的氨基酸序列如Seq ID No.1或Seq ID No.2所示。本发明能够高效、低成本的制备高浓度重组蛛丝蛋白纺丝液并得到易于修饰和改性且力学性能优良的人造蜘蛛丝。

Description

高浓度重组蛛丝蛋白纺丝液的制备方法及其纺丝

技术领域

本发明涉及的是一种生物高分子领域的技术，具体是一种浓度达到50-500mg/mL的重组蛛丝蛋白的纯化和液-液相分离浓缩方法及其人造蜘蛛丝的制备方法。

背景技术

蜘蛛牵引丝作为最强韧的生物材料之一，由于兼具高强度和良好的延展性，使其具有优于绝大多数合成材料的超强韧性。Nephila clavipes牵引丝由MaSp1和MaSp2两种高分子量蛛丝蛋白组成，其中超过80％都为MaSp1。制备高浓度的蛋白纺丝液是进行重组蛛丝蛋白仿生纺丝的重要前提之一。

现有技术采用将纯化后的低浓度蛛丝蛋白溶液通过离心浓缩至高浓度并进行仿生纺丝；或将纯化后的蛛丝蛋白溶液进行冷冻干燥，再用六氟异丙醇等强溶剂将蛛丝蛋白冻干粉溶解成高浓度的蛛丝蛋白纺丝液。离心浓缩方法需要耗费较长的时间且容易导致高分子量蛛丝蛋白在浓缩过程中发生无序聚集现象；而利用六氟异丙醇等强溶剂溶解蛛丝蛋白会造成环境污染且会导致高分子量蛛丝蛋白的降解及末端结构域功能丧失，因此上述方法不适于带有两个末端结构域的类天然高分子量重组蛛丝蛋白的纺丝液制备。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种重组蛛丝蛋白的分离纯化和液液相分离制备高浓度纺丝液，然后利用酸性凝固浴纺丝再进行后处理的方法；能够高效、低成本的制备重组蛛丝蛋白纺丝液并得到力学性能优良、易于修饰和改性的人造蜘蛛丝。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一类重组蛛丝蛋白，其分子结构为NTD-(RP)n-CTD，其中整数n代表RP重复结构域的重复次数，每个RP重复结构域的氨基酸序列如Seq ID No.1或Seq ID No.2所示。

所述的重复次数为1-128。

所述的NTD，即氨基端结构域的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；

所述的CTD，即羧基端结构域的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。

所述的RP重复结构域的氨基酸序列来源于Nephila clavipes MaSp1或MaSp2。

本发明涉及上述重组蛛丝蛋白高浓度纺丝液的制备方法，通过将表达有重组蛛丝蛋白的大肠杆菌菌体破壁后经过酸处理、透析、加热、硫酸铵沉淀，实现重组蛛丝蛋白溶液从其良溶剂向不良溶剂的转变。

所述的表达有重组蛛丝蛋白的大肠杆菌菌体的获得方式为：将带有末端结构域的重组蛛丝蛋白表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达获得。

所述的破壁是指：将表达有重组蛛丝蛋白的大肠杆菌湿菌体以1:10-2:10的质量比重悬于含有1-2mol硫脲和6-8mol尿素的破壁缓冲液中，搅拌4-12小时，随后离心收集上清，得到破壁后的重组蛛丝蛋白混合液。

所述的制备方法具体是指：将破壁后的重组蛛丝蛋白混合液的pH调至4.0使杂质沉淀，离心收集上清；将得到的重组蛛丝蛋白混合液透析到含有氯化钠的缓冲液中，再将其置于水浴中加热使部分杂质沉淀，离心收集得到上清液；再对上清液搅拌的同时加入硫酸铵，使重组蛛丝蛋白沉淀；最后用4-8mol尿素溶液溶解沉淀，得到重组蛛丝蛋白溶液。

所述的重组蛛丝蛋白液液相分离是指：通过透析或者添加大分子拥挤剂来使得重组蛛丝蛋白溶液实现液液相分离，并得到位于下层的高浓度重组蛛丝蛋白凝聚相。

所述的透析是指：将重组蛛丝蛋白从含有4-8摩尔尿素和/或0-0.5摩尔氯化钠的溶液中向含有0.5摩尔以下尿素和/或0.1摩尔以下氯化钠的溶液中进行透析。

所述的添加大分子拥挤剂是指：向溶于1摩尔以下尿素和/或0.5摩尔以下氯化钠的蛛丝蛋白溶液中添加大分子拥挤剂。

所述的大分子拥挤剂采用但不限于：终浓度不小于50mg/mL的葡聚糖(平均分子量不小于70000)或终浓度不小于50mg/mL的聚乙二醇(平均分子量不小于8000)或终浓度不小于100mg/mL的聚蔗糖(平均分子量不小于70000)。

本发明涉及上述重组蛛丝蛋白的应用，将其用于纺织，具体为人工纺丝。

所述的应用具体包括：

i)利用注射泵将重组蛛丝蛋白凝聚相通过微流体芯片挤出到凝固浴中固化成初生纤维。

所述的微流体芯片是指：模拟蜘蛛腺体通道设计的微流体芯片，其微通道的两侧面与水平面相交的轨迹为指数函数。

所述的凝固浴，为pH≤6.0的70-90％乙醇溶液。

ii)将初生纤维浸泡在拉伸浴中，初生纤维开始伸长、变软发生玻璃化转变；当初生纤维在玻璃化转变的状态下，将其拉伸至原长的2-6倍，再置于交联浴中浸泡。

所述的拉伸浴，其仅含有纯水。由于蜘蛛丝对水敏感，其非晶区蛛丝蛋白链段在水分子的作用下发生了玻璃化转变。在玻璃化转变状态下，非晶区分子链段开始运动，更容易发生结构转变或者与其他分子发生相互作用。

所述的交联浴，采用任意能够与蛛丝蛋白分子发生相互作用或者能够诱导蛛丝蛋白分子发生构象转变的物质，包括但不限于：磷酸钾、磷酸二氢钾、氯化锌、氯化铜、硅钨酸、金纳米颗粒、银纳米颗粒、石墨烯、碳纳米管等的水溶液。

iii)初生纤维经过上述处理之后，将其以拉伸状态置于室温下干燥得到人造蜘蛛丝。

技术效果

本发明整体解决了带有两个末端结构域的高分子量重组Nephila clavipes牵引丝蛋白难以分离纯化的问题，利用液-液相分离的方法简单快速地获得类天然重组Nephilaclavipes牵引丝蛋白的高浓度水溶液纺丝液(50-500mg/mL)，该纺丝液性质稳定，不易聚集成无序沉淀，且整个制备过程无需使用有机溶剂。

与现有技术相比，本发明可模拟天然蜘蛛丝全水溶液纺丝过程，制备韧性显著提升的人造蜘蛛丝。

附图说明

图1表示重组蛛丝蛋白NTD-(RP)₁₆-CTD分子架构示意图；

图2表示重组蛛丝蛋白NTD-(RP)₁₆-CTD纯化后样品的SDS-PAGE分析图，其中M表示蛋白分子量标准，泳道1是NTD-(RP)₁₆-CTD纯化样品；

图3表示重组蛛丝蛋白发生液液相分离形成下层的凝聚相和上层的稀薄相；

图4表示在pH 5.0和pH7.4的乙醇凝固中制备的人造蜘蛛丝的韧性比较。

图5表示高分量重组蛛丝蛋白NTD-(RP)₆₄-CTD纯化后样品的SDS-PAGE分析图，其中M表示蛋白分子量标准，泳道1是NTD-(RP)₆₄-CTD纯化样品。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，为本实施例涉及的用于制备人造蜘蛛丝的重组蛛丝蛋白为NTD-(RP)₁₆-CTD的分子架构。

本实施例涉及上述重组蛛丝蛋白溶液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)将表达有重组蛛丝蛋白的大肠杆菌菌体以1:10的质量比重悬于含有2mol硫脲和8mol尿素的破壁缓冲液中，搅拌12小时，随后离心收集上清，得到重组蛛丝蛋白混合液A；

步骤2)将步骤1得到的混合液A的pH调至4.0使一部分杂质沉淀，离心收集上清，得到重组蛛丝蛋白混合液B；

步骤3)将混合液B透析到含有0.3mol氯化钠的缓冲液中，得到冲重组蛛丝蛋白混合液C；

步骤4)将混合液C在80℃的水浴中加热20分钟使部分杂质沉淀，离心收集上清，得到重组蛛丝蛋白混合液D；

步骤5)边搅拌边向混合液D中加入10％的硫酸铵，使重组蛛丝蛋白沉淀，得到重组蛛丝蛋白沉淀E；

步骤6)用8mol尿素溶液溶解沉淀E，得到重组蛛丝蛋白溶液，其SDS-PAGE分析结果如图2所示。

本实施例涉及上述重组蛛丝蛋白高浓度纺丝液的制备方法，将上述纯化后的重组蛛丝蛋白溶液透析到含有0.5mol尿素和0.04mol的氯化钠缓冲液中，在透析过程中重组蛛丝蛋白溶液会发生液液相分离，上层为低浓度的重组蛛丝蛋白溶液称为稀薄相，下层为高浓度的重组蛛丝蛋白溶液称为凝聚相(如图3所示)。

本实施例涉及上述凝聚相中高浓度的重组蛛丝蛋白的应用，将其用于人工纺丝，具体步骤包括：

i)利用注射泵将重组蛛丝蛋白凝聚相通过微流体芯片挤出到pH 5.0的90％乙醇凝固浴中固化成初生纤维。

ii)将初生纤维浸泡在纯水中，初生纤维开始伸长、变软发生玻璃化转变；当初生纤维在玻璃化转变的状态下，将其拉伸至原长的6倍，再置于交联浴中浸泡12小时。

iii)初生纤维经过上述处理之后，将其以拉伸状态置于湿度为50％的室温下干燥12小时得到人造蜘蛛丝。

相比现有技术在pH 7.4的90％乙醇凝固浴，在pH 5.0的90％乙醇凝固浴中制备的现有人造蜘蛛丝，本实施例制备得到的人造蜘蛛丝韧性有显著的提高，平均可达101MJ/m³(如图4所示)。

实施例2

本实施例涉及高分量NTD-(RP)₆₄-CTD重组蛛丝蛋白溶液的制备方法，包括以下步骤：

步骤6)用8mol尿素溶液溶解沉淀E，得到重组蛛丝蛋白溶液，其SDS-PAGE分析结果如图5所示。

本发明首次在体外利用重组Nephila clavipes牵引丝蛋白溶液的液液相分离制备了高浓度的重组蛛丝蛋白纺丝液并通过改变交联浴中的掺杂物种类可以实现人造蜘蛛丝的多样化修饰和改性。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 高浓度重组蛛丝蛋白纺丝液的制备方法及其纺丝

<130> fnb964e

<141> 2020-04-02

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 蜘蛛(Nephila clavipes RP序列1)

<400> 1

Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly

20 25 30

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> 蜘蛛(Nephila clavipes RP序列2)

<400> 2

Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln

20 25

<210> 3

<211> 131

<212> PRT

<213> 蜘蛛(Nephila clavipes 氨基端结构域)

<400> 3

Gln Asn Thr Pro Trp Ser Ser Thr Glu Leu Ala Asp Ala Phe Ile Asn

1 5 10 15

Ala Phe Met Asn Glu Ala Gly Arg Thr Gly Ala Phe Thr Ala Asp Gln

20 25 30

Leu Asp Asp Met Ser Thr Ile Gly Asp Thr Ile Lys Thr Ala Met Asp

35 40 45

Lys Met Ala Arg Ser Asn Lys Ser Ser Lys Gly Lys Leu Gln Ala Leu

50 55 60

Asn Met Ala Phe Ala Ser Ser Met Ala Glu Ile Ala Ala Val Glu Gln

65 70 75 80

Gly Gly Leu Ser Val Asp Ala Lys Thr Asn Ala Ile Ala Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Ser Ala Phe Tyr Gln Thr Thr Gly Ala Ala Asn Pro Gln Phe Val

100 105 110

Asn Glu Ile Arg Ser Leu Ile Asn Met Phe Ala Gln Ser Ser Ala Asn

115 120 125

Glu Val Ser

130

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 蜘蛛(Nephila clavipes 羧基端结构域)

<400> 4

Val Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Arg Leu Ser

1 5 10 15

Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Asn Leu Val

20 25 30

Ala Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ile Ser Asn

35 40 45

Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu Ser Gly Cys Asp

50 55 60

Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala Leu Ile Gln Ile

65 70 75 80

Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly Ser Ala Gly Gln

85 90 95

Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Val Tyr Gln Ala Leu Gly

100 105 110

Claims

1.一种基于重组蛛丝蛋白的人造蜘蛛丝制造方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)将表达有重组蛛丝蛋白NTD-(RP)₁₆-CTD的大肠杆菌菌体以1:10的质量比重悬于含有2mol硫脲和8mol尿素的破壁缓冲液中，搅拌12小时，随后离心收集上清，得到重组蛛丝蛋白混合液A；

步骤3)将混合液B透析到含有0.3mol氯化钠的缓冲液中，得到重组蛛丝蛋白混合液C；

步骤5)边搅拌边向混合液D中加入10%的硫酸铵，使重组蛛丝蛋白沉淀，得到重组蛛丝蛋白沉淀E；

步骤6)用8mol尿素溶液溶解沉淀E，得到重组蛛丝蛋白NTD-(RP)₁₆-CTD溶液，将纯化后的重组蛛丝蛋白溶液透析到含有0.5mol尿素和0.04mol的氯化钠缓冲液中，在透析过程中重组蛛丝蛋白溶液会发生液液相分离，上层为低浓度的重组蛛丝蛋白溶液即稀薄相，下层为高浓度的重组蛛丝蛋白溶液即凝聚相；

所述的NTD，即氨基端结构域的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；

所述的CTD，即羧基端结构域的氨基酸序列如Seq ID No.4所示；

每个RP重复结构域的氨基酸序列如Seq ID No.1所示；

步骤7)利用注射泵将重组蛛丝蛋白的凝聚相通过微流体芯片挤出到pH 5.0的90%乙醇凝固浴中固化成初生纤维；

步骤8)将初生纤维浸泡在纯水中，初生纤维开始伸长、变软发生玻璃化转变；当初生纤维在玻璃化转变的状态下，将其拉伸至原长的6倍，再置于交联浴中浸泡12小时；

步骤9)初生纤维经过上述处理之后，将其以拉伸状态置于湿度为50%的室温下干燥12小时得到人造蜘蛛丝。