CN116854824A - 一种多嵌段自组装力学蛋白以及一种生物蛋白纤维的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物蛋白纤维技术领域，涉及一种多嵌段自组装力学蛋白以及一种生物蛋白纤维的制备方法。该多嵌段自组装力学蛋白包括盲鳗腺角蛋白的α亚基或γ亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块。本发明从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了两种多嵌段自组装力学蛋白，并进一步将这两种多嵌段自组装力学蛋白体外自组装，通过与镁离子的配位作用和戊二醛的化学交联作用制备得到一种生物蛋白纤维，其断裂强度和韧性均优于许多重组蛛丝，甚至可以与一些天然蛛丝相媲美。本发明设计了一种可以利用体外自组装提升纤维力学性能的新方法，为探索性能优异的蛋白纤维材料提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物蛋白纤维技术领域，尤其涉及一种多嵌段自组装力学蛋白以及一种生物蛋白纤维的制备方法。
背景技术
轻质、高强的蛋白质纤维在许多技术领域中应用前景广阔。尽管目前对基于蜘蛛丝和蚕丝蛋白的生物纤维已经进行了广泛的研究，但仍存在合成分子量小、结构破坏、性能弱、应用范围窄等缺陷，因此，开发低成本蛋白质和简单的纺丝技术来制造性能优异的生物纤维具有重要意义。
鉴于生物蛋白纤维组装与性能调控方面：成型手段单一，化学交联会破坏蛋白原有的二级结构，缺乏有效的组装调控方法，力学性能提升面临局限和挑战的问题，我们拟通过合成生物学技术和多组装调控手段建立多结构融合蛋白自组装材料体系，最后通过微流控技术制备高性能多生物融合蛋白纤维。
发明内容
本发明的目的是提供一种多嵌段自组装力学蛋白以及一种生物蛋白纤维的制备方法，从而解决现有技术中基于蜘蛛丝和蚕丝蛋白的生物纤维仍然存在合成分子量小、结构破坏、性能弱、应用范围窄等缺陷的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种多嵌段自组装力学蛋白，包括盲鳗腺角蛋白(hagfish)的α亚基或γ亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白(Araneus diadematus)的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块；其中，所述盲鳗腺角蛋白的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述盲鳗腺角蛋白的γ亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述类弹性蛋白的VPGKG模块的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明的一个优选方案，所述多嵌段自组装力学蛋白包括：从N端到C端由盲鳗腺角蛋白的α亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块顺序连接而成的αck蛋白，或从N端到C端由盲鳗腺角蛋白的γ亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块顺序连接而成的γck蛋白。
根据本发明的第二方面，提供一种编码如上面所述的多嵌段自组装力学蛋白的核酸分子。
根据本发明的第三方面，提供一种含有如上面所述的核酸分子的多嵌段自组装力学蛋白表达质粒。
根据本发明的第四方面，提供一种转染或转化有所述多嵌段自组装力学蛋白表达质粒的重组基因工程菌。
根据本发明的第五方面，提供一种所述多嵌段自组装力学蛋白表达质粒的构建方法，所述重组载体的骨架载体选自PET系列，具体可为pET25b。包括以下步骤：A1，合成编码αck蛋白的αck基因序列，将αck基因序列连接到克隆载体m13上，获得质粒m13-αck；A2，利用Nde1和EcoR1内切酶分别将质粒m13-αck及质粒pET25b进行线性化，再利用连接的方法，获得一种多嵌段自组装力学蛋白表达质粒pET25b-αck；或B1，合成编码γck蛋白的γck基因序列，将γck基因序列连接到克隆载体m13上，获得质粒m13-γck；B2，利用Nde1和EcoR1内切酶分别将质粒m13-γck及pET25b进行线性化，再利用连接的方法，获得一种多嵌段自组装力学蛋白表达质粒pET25b-γck。
根据本发明的一个优选方案，还在多嵌段蛋白编码序列的3’端和终止密码子之间插入6×His标签用于筛选验证目的蛋白。
根据本发明的第六方面，提供一种所述多嵌段自组装力学蛋白的制备方法，培养所述重组基因工程菌，诱导多嵌段自组装力学蛋白的表达。
优选地，所述蛋白表达方法包括：将重组表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，将单克隆在100mL小摇瓶中进行种子培养，随后转接至5L大摇瓶中进行发酵培养并添加诱导剂诱导蛋白大量表达，最终将菌液离心，收集菌体。
优选地，所述蛋白提取、纯化的步骤，包括：将菌体破碎后离心取沉淀，用一系列buffer洗包涵体，除去脂质、多糖等杂质，至溶液为乳白色，再用8M尿素重悬菌体，离心取上清后依次经过镍柱亲和层析、透析和分子筛层析进行精细纯化。
根据本发明的第七方面，提供一种多嵌段生物蛋白体外自组装的方法，将所述αck蛋白和γck蛋白以等浓度混合在一起，在5％乙酸溶液中经过尿素梯度透析，即可获得一种自组装生物蛋白αck-γck。
根据本发明的第八方面，提供一种生物蛋白纤维的制备方法，包括：S1，将生物蛋白αck、γck、或αck-γck溶解在98％甲酸中至蛋白终浓度为200～300mg/mL；S2，将0.1％戊二醛水溶液加入到上述蛋白溶液中，至戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5～10min，获得预交联产物；S3，将预交联产物注射到1.0～1.5wt％的含戊二醛及镁离子的HEPES溶液凝固浴中，注射泵挤出速度为5～20μL/min，以0.4～1.0m/min的线速度收集纤维，即可获得一种生物蛋白纤维。优选地，镁离子浓度为100～300mM。
根据本发明的一个优选方案，还包括从收集到的纤维中选取表面光滑均匀的纤维，在水中浸泡2～10s至纤维蜷缩变软，再将纤维拉伸到原长的100％至250％，即可获得一种力学强度进一步提升的生物蛋白纤维。
本发明中，盲鳗腺角蛋白含有α和γ两个亚基，其中谷氨酸残基(Glutamic acid，E)和天门冬氨酸残基(Aspartic acid，D)的游离羧基可以提供空轨道，与带正电荷的镁离子等发生配位作用和静电相互作用。通过离子交联在纤维内部形成长程有序的结构，有助于提高蛋白纤维的断裂强度。
本发明中，蛛丝蛋白核心区域c序列可以分为两个基序：GPGXX重复区域，形成螺旋结构并负责纤维的弹性以及polyA区域。这些结构控制着纤维的各种结构和功能，有助于平衡纤维的强度和弹性。
本发明中，类弹性蛋白k由五肽重复单元GKGVP组成，其中赖氨酸残基(Lysine,K)的游离氨基提供了戊二醛交联位点，通过戊二醛交联在纤维内部形成长程有序的结构，进一步提高多嵌段蛋白纤维的断裂强度。此外，k蛋白内在的无规卷曲结构有助于保持蛋白纤维的韧性。
因此，本发明成功构建可大量生产、纯度高的αck和γck两种蛋白。根据本发明的进一步研究发现，盲鳗腺角蛋白的α和γ两个亚基可以在梯度透析过程中实现体外自组装以稳定蛋白的α螺旋结构，因此本发明进一步获得了一种生物蛋白αck-γck，通过二者的自组装进一步提升了蛋白纤维的力学性能。通过多嵌段自组装力学蛋白制备的纤维经过后拉伸处理，α-helix可以转变成β-sheet结构，从而进一步提升蛋白纤维的力学性能。本发明首次构建这样一种多嵌段自组装蛋白，能够将具有多种蛋白二级结构的氨基酸序列融合在一起，从而提高蛋白纤维的力学性能。
根据本发明提供的一种多嵌段自组装力学蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法，其有益效果如下：
1)从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了一种多嵌段自组装力学蛋白，将盲鳗腺角蛋白的α-螺旋结构与蛛丝蛋白的β-折叠结构及类弹性蛋白的无规卷曲部分融合，实现了通过特定序列驱动的自组装实现具有多级结构蛋白纤维的制备，为开发一种高强高韧的蛋白纤维提供了新方法；
2)αck和γck两种融合蛋白经过自组装获得一种自组装蛋白αck-γck，利用该自组装蛋白αck-γck制备的生物蛋白纤维在断裂强度、杨氏模量、韧性和延展性上均优于单一融合蛋白纤维的力学性能；
3)通过离子交联和戊二醛化学交联两种交联方式，实现了低分子量下高强度蛋白纤维的制备；所用戊二醛交联剂交联速度快，且便宜易得，适用于这种带有赖氨酸的融合蛋白；
4)纺丝工艺简便，易重复，纤维可以得到充分交联，且经过后拉伸之后该生物蛋白纤维更为长程有序，本发明提供的多嵌段自组装力学蛋白通过与镁离子的配位作用和戊二醛的化学交联作用获得的生物蛋白纤维断裂强度和韧性均优于许多重组蛛丝，甚至可以与一些天然蛛丝相媲美。
综上所述，本发明从仿生角度出发，设计了一种可以利用体外自组装提升纤维力学性能的新方法，为探索性能优异的蛋白纤维材料提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中融合蛋白表达质粒pET25b-αck和pET25b-γck的构建示意图；
图2为本发明实施例2中制备得到的融合蛋白αck和融合蛋白γck的凝胶电泳检测结果；
图3为本发明实施例3中生物蛋白纤维的制备过程示意图；
图4为本发明实施例4中融合蛋白αck纤维的拉伸力学性能曲线图；
图5为本发明实施例4中融合蛋白γck纤维的拉伸力学性能曲线图；
图6为本发明实施例4中生物蛋白αck-γck纤维的拉伸力学性能曲线图；
图7为本发明实施例4中融合蛋白αck纤维、融合蛋白γck纤维、自组装蛋白αck-γck纤维的力学强度比较示意图；
图8为本发明实施例4中融合蛋白αck纤维、融合蛋白γck纤维、自组装蛋白αck-γck纤维的韧性比较示意图；
图9为本发明实施例5中自组装蛋白αck-γck纤维在EDTA中浸泡后进行拉伸处理得到的纤维的拉伸力学性能曲线图；
图10为本发明实施例5中自组装蛋白αck-γck纤维在Mg2+溶液中浸泡后进行拉伸处理得到的纤维的拉伸力学性能曲线图；
图11为本发明实施例5中自组装蛋白αck-γck纤维分别在EDTA和Mg2+溶液中浸泡后进行拉伸处理得到的纤维的力学强度比较示意图；
图12为本发明实施例5中自组装蛋白αck-γck纤维分别在EDTA和Mg2+溶液中浸泡后进行拉伸处理得到的纤维的韧性比较示意图。
具体实施方式
为了更好地理解本专利，下面结合实施例对本发明做进一步描述，以下实施例仅是对本发明加以说明而非对其加以限定。
实施例1：多嵌段自组装力学蛋白表达载体构建
通过基因合成公司直接合成构建αck和γck蛋白单元的编码序列(α和/或γ蛋白编码序列+c蛋白编码序列+k蛋白编码序列)，以及XbaI酶切位点(TCTAGA)、NdeI酶切位点(CATATG)、EcoRV酶切位点(GATATC)、组氨酸标签序列(6×His)、终止密码子对应的DNA编码序列(TGATAA)和EcoRI酶切位点(GAATTC)，所有元件连接获得基因元件1：XbaI+NdeI+αck/γck蛋白单元编码序列+EcoRV+6×His+TGATAA+EcoRI；通过XbaI和EcoRV双酶切将基因元件1和m13质粒连接，获得嵌合蛋白载体m13-αck、m13-γck。
利用Nde1和EcoR1内切酶分别将m13-αck、m13-γck及pET25b进行线性化，在T4连接酶作用下，分别得到融合蛋白表达质粒pET25b-αck和pET25b-γck，其构建示意图如图1所示。
实施例2：多嵌段自组装力学蛋白异源表达和纯化
将融合蛋白表达质粒pET25b-αck和pET25b-γck分别转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)。挑取阳性克隆在10mL LB培养基(100μg/mL氨苄西林)中培养8-12小时(37℃，220rpm)，摇瓶体积为100mL，待菌液OD600至3-4时，将其转移至含1LTB培养基(100μg/mL氨苄西林)的5L大摇瓶中培养2-3小时(37℃，220rpm)，待菌液OD600至3-4时添加诱导剂IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.3mM，诱导蛋白大量表达，继续发酵培养(28.5℃，220rpm)过夜后，将菌液离心(6000rpm，8min，4℃)，将收集的菌体保存在-80℃。
菌体高压破碎后离心(15000g，30min，4℃)弃去上清，先用缓冲液A(100mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，500mM NaCl，2％ Triton X-100，2M Urea)洗去脂质等杂质，然后用缓冲液B(100mM Tris-HCl(pH8.0))洗一次，最后用8M Urea重悬沉淀，离心后的上清液依次经过镍柱，透析，除盐柱进行精细纯化，分别得到融合蛋白αck和融合蛋白γck。对各融合蛋白进行SDS凝胶电泳检测和分析(图2)，最终将融合蛋白αck和融合蛋白γck水溶液冻干并置于-80℃保存备用。
实施例3：多嵌段自组装力学蛋白纤维的制备
将实施例2制备得到的αck蛋白和γck蛋白以等浓度混合在一起，在5％乙酸溶液中经过尿素梯度透析，即可获得一种自组装蛋白αck-γck。
将初始质量浓度为0.1％戊二醛水溶液分别加入到融合蛋白αck、γck以及自组装蛋白αck-γck的甲酸溶液(300mg/mL)中，戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5～10min。
将经过预交联后的蛋白溶液用注射器挤入戊二醛质量浓度为1.5wt％的含200mMMg2+的HEPES溶液中，并用注射泵调节推进速度为10μL/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维(图3)。
将收集到的纤维晾干，选取光滑均匀的一段纤维，将其置于超纯水中浸泡至纤维蜷缩变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的200％，分别获得生物蛋白αck纤维、生物蛋白γck纤维、自组装生物蛋白αck-γck纤维。
实施例4：多嵌段自组装力学蛋白纤维性能对比
多嵌段自组装力学蛋白纤维的力学性能测试：利用力学拉伸测试仪分别在室温下测试自组装纤维和单一亚基制备的纤维的力学性能并进行统计分析(如图4-图8所示)。结果发现，自组装后的αck-γck纤维力学性能均优于单一蛋白亚基αck纤维，γck纤维。
实施例5：多嵌段自组装力学蛋白纤维的离子响应性
我们将制备的生物蛋白αck-γck纤维浸泡在含有200mM乙二胺四乙酸(EDTA)的HEPES缓冲液中2h，以尽可能地去除金属离子后，进行拉伸试验测试发现力学强度下降到300MPa左右。有趣的是，将EDTA孵育后的蛋白纤维在含有200mM MgCl2的HEPES缓冲液中重新孵育2h后，纤维的抗拉强度能够恢复到400MPa左右，结果如图9-图12所示。这些结果高度暗示镁离子可能与氨基酸序列中带负电荷的基团(例如羧基)发生配位作用。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种多嵌段自组装力学蛋白，其特征在于，包括盲鳗腺角蛋白的α亚基或γ亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块；其中，
所述盲鳗腺角蛋白的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述盲鳗腺角蛋白的γ亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述类弹性蛋白的VPGKG模块的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的多嵌段自组装力学蛋白，其特征在于，所述多嵌段自组装力学蛋白包括：从N端到C端由盲鳗腺角蛋白的α亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块顺序连接而成的αck蛋白，或从N端到C端由盲鳗腺角蛋白的γ亚基、天然蜘蛛牵引丝蛋白的核心区域c以及类弹性蛋白的VPGKG模块顺序连接而成的γck蛋白。
3.一种编码根据权利要求1～2中任意一项所述的多嵌段自组装力学蛋白的核酸分子。
4.一种含有根据权利要求3所述的核酸分子的多嵌段自组装力学蛋白表达质粒。
5.一种根据权利要求4所述的多嵌段自组装力学蛋白表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1，合成编码如权利要求2所述的αck蛋白的αck基因序列，将αck基因序列连接到克隆载体m13上，获得质粒m13-αck；
A2，利用Nde1和EcoR1内切酶分别将质粒m13-αck及质粒pET25b进行线性化，再利用连接的方法，获得一种多嵌段自组装力学蛋白表达质粒pET25b-αck；或
B1，合成编码如权利要求2所述的γck蛋白的γck基因序列，将γck基因序列连接到克隆载体m13上，获得质粒m13-γck；
B2，利用Nde1和EcoR1内切酶分别将质粒m13-γck及pET25b进行线性化，再利用连接的方法，获得一种多嵌段自组装力学蛋白表达质粒pET25b-γck。
6.一种转染或转化有根据权利要求4所述的多嵌段自组装力学蛋白表达质粒的重组基因工程菌。
7.一种根据权利要求1或2所述的多嵌段自组装力学蛋白的制备方法，其特征在于，培养如权利要求6所述的重组基因工程菌，诱导多嵌段自组装力学蛋白的表达。
8.一种多嵌段生物蛋白体外自组装的方法，将如权利要求2所述的αck蛋白和γck蛋白以等浓度混合在一起，在5％乙酸溶液中经过尿素梯度透析，即可获得一种自组装蛋白αck-γck。
9.一种生物蛋白纤维的制备方法，其特征在于，包括：
S1，将根据权利要求1所述的多嵌段自组装力学蛋白或根据权利要求8所述的方法制备得到的自组装蛋白αck-γck溶解在98％甲酸中至蛋白终浓度为200～300mg/mL；
S2，将0.1％戊二醛水溶液加入到上述蛋白溶液中，至戊二醛终浓度稀释至质量浓度为0.01％，交联5～10min，获得预交联产物；
S3，将预交联产物注射到1.0～1.5wt％的含戊二醛及镁离子的HEPES溶液凝固浴中，注射泵挤出速度为5～20μL/min，以0.4～1.0m/min的线速度收集纤维。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括从收集到的纤维中选取表面光滑均匀的纤维，在水中浸泡2～10s至纤维蜷缩变软，再将纤维拉伸到原长的100％至250％，即可获得一种力学强度进一步提升的生物蛋白纤维。
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