CN105755025A - 一种重组蛛丝蛋白的制备方法 - Google Patents

一种重组蛛丝蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组蛛丝蛋白的制备方法，以大腹园蛛次壶腹腺丝的全长编码基因和梨状腺丝完整重复区为模板，采用融合PCR技术进行拼接，并与pET28a载体连接，构建重组质量，转入BL21中进行表达，使用变性纯化手段，最终获得重组蛛丝蛋白溶液，并冻干保存。本发明反应条件温和，成本低廉，工艺简单，易于操作；制备出的重组蛛丝蛋白，具有良好的生物相容性，并且经称量后，表达产量较高，可以预见，本发明制备的重组蛛丝蛋白具有产业化实施的前景，是一种潜在的蛋白纤维材料。

Description

一种重组蛛丝蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于蛋白的制备领域，特别涉及一种重组蛛丝蛋白的制备方法。
背景技术
蜘蛛丝是一种天然高分子量的蛋白纤维，具有良好的机械性能和生物学品质，如强度高，弹性好，质地轻，耐高低温及生物相容性好等，综合品质远远超过了蚕丝以及现阶段人工合成的高性能材料纤维，是一种亟待开发的战略资源，在生物医学工程、航天航空以及军事等领域有着不可估计的应用价值。但是目前为止蛛丝的大规模量产以及仿生应用仍有待加强，主要有以下几个原因：1.蜘蛛是肉食性动物，不易驯化，不能像蚕一样高密度饲养；2.天然蜘蛛丝的组分，成丝机理和纺丝过程极其复杂；2釆用基因工程的方法在异源宿主中表达生产重组蛛丝蛋白是目前为止最有潜力的方法。但是这同样面临着困难，因为大部分蜘蛛丝蛋白的中央是高度重复的序列，其分子量可以达到90％以上，并且重复区富含甘氨酸和丙氨酸。在用异源宿主表达蜘蛛丝蛋白的时候不仅面临着密码子使用偏好性问题，这种序列特点同时带来了库需要共进化，同时这种高含量的造成特殊二级结构，并导致基因重组。因此生产出来的蜘蛛丝蛋白达到天然蜘蛛丝蛋白的大小，产量低，性能远不及天然蛛丝蛋白。因此对重组蛛丝蛋白的构建与表达成为近年来该领域的研究热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组蛛丝蛋白的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的新型混合蛛丝纤维蛋白能够在大肠杆菌中高效表达，而这种新型混合蛛丝纤维形态均匀，性能稳定，具有产业化实施的前景。
本发明的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，包括：
(1)以大腹园蛛次壶腹腺丝MiSp的全长编码基因为模板，然后通过PCR扩增得到次壶腹腺丝MiSp的NT端基因片段MiSp-NT，然后以梨状腺丝PySp完整重复区Rp的编码基因作为模板，通过PCR扩增获得一个完整重复区的基因片段PySp-Rp；
(2)将步骤(1)中两段基因片段MiSp-NT、PySp-Rp通过PCR技术按照天然蛛丝蛋白纤维功能模块顺序进行拼接得到得到完整基因片段MiSpNT-PySpRp，对PCR产物进行琼脂糖凝胶后切胶回收；
(3)将上述完整基因片段MiSpNT-PySpRp、pET28a质粒分别进行双酶切，然后进行纯化回收后混合，再加入T4连接酶反应，得到连接产物；
(4)将上述连接产物使用热击的转化方法，转入DH5α感受态细胞中进行转化，将转化后的菌液涂布在具有Amp抗性的培养基上，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的重组质粒Pet28a-MiSpNT-PySpRp，转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆(携带重组质粒的BL21单克隆)接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中培养，培养至A600的OD值为0.6-0.8之间，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；
(5)将上述菌体重悬于裂解缓冲液LysisBuffer中，高压破菌后，离心，收集沉淀，纯化、冻干，得到蛋白粉末。
所述步骤(1)中通过PCR扩增得到次壶腹腺丝MiSp的NT端基因片段MiSp-NT为：
CAACCAATCTGGACCAACCCAAATGCAGCAATGACCATGACCAACAACCTGGTCCAATGTGCGAGTCGGTCAGGTGTGCTCACAGCCGATCAGATGGACGACATGGGAATGATGGCAGACTCTGTTAACTCGCAGATGCAGAAAATGGGACCAAACCCACCTCAACACAGACTCAGGGCAATGAATACCGCCATGGCCGCAGAAGTAGCTGAAGTAGTAGCAACTTCGCCACCACAAAGTTATTCTGCAGTTTTAAATACCATTGGTGCTTGCTTGAGGGAATCAATGATGCAAGCGACAGGCTCCGTCGACAATGCATTCACAAATGAAGTAATGCAATTGGTAAAAATGTTATCTGCGGATAGCGCGAATGAAGTATCTACAGCAAGTGCATCAGGAGCCAGTTACGCAACAAGTACGTCATCTGCAGTAAGCTCATCTCAAGCAACAGGATACAGCACTGCAGCAGGTTATGGAAAC，SEQIDNO.1所示。
通过PCR扩增获得一个完整重复区的基因片段PySp-Rp：
GCTCCAGCACCTGCACCTAGACCAGCTCCTCGACCACTACCAGCCCCAATTCAAGCCCCAAGACCAGCACCCGCACCACAACCTGCACCGGTTTACGCACCAGCCCCAGTCGTTTCACAAGTTCAGGCAACTTCTTCCTCTCAAGCCTCGGCTCAACAGAGTGCCTTCGCACAGTCCCAACAATCTTCAGTTGTTCAATCTCAACAAAGTTCAAACGCTTATTCTGCAGCATCAACTGCCGGTTCAAGTGTGTCGCAATCTCAGGCGATTGTCTCAAGCGCTCCTGTTTATTTTAACACGCAAACTTTAAGTAGCAGCCTGTCTTCTTCTCTGCAATCACTCAGTGCACTCAATTCGTTAGCGAGTGGTCAACTGAGCTCCTGGAATGCCGCTTCTATTATAGCGAGTGCGGTAGCACCGTCACTTGGAGTGTCCCAAGCGTCGGTTCAAAATAGTATAAGCCAACAGTTGAGAAGCGTAGGGCCCGGATCTTCCACGTCCTCTGTCGCTCAAGCAATAGCAAATGGAGTGGCTAACGCAGTTGGAGCATCAGGAACAGGAGTTGCAGGACAAGAACAATCTATTTCACAATCCATATATACTTCAGTTTCCACTGCTCTATCTCAACTGGCAGCACCG。SEQIDNO.2所示步骤(1)中PCR反应所用基因：
NT正向引物：CGGGATCCCAACCAATCTGGACCAACCCA，SEQIDNO.3所示；
反向引物：CTGGTCTAGGTGCAGGTGCTGGAGCGTTTCCATAACCTGCTGCAGTG；SEQIDNO.4所示；
PySp重复区
正向引物为GCACTGCAGCAGGTTATGGAAACGCTCCAGCACCTGCACCTAGACC；SEQIDNO.5所示；
反向引物为：CGCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATA；SEQIDNO.6所示。
所述步骤(1)中NT端基因片段MiSp-NT大小为480bp，基因片段PySp-Rp为636bp。
所述步骤(2)中两段基因片段MiSp-NT、PySp-Rp通过PCR技术具体为：选取步骤(1)中NT的正向引物与Rp的反向引物与两个扩增产物，再次进行PCR扩增。PCR条件为：98℃变性3min，65℃退火1min，72℃延伸5min，循环35次。
所述步骤(2)中完整基因片段MiSpNT-PySpRp的基因大小为1116bp，共编码372个氨基酸，蛋白分子量为37.36KDa。
步骤(3)中pET28a载体上具有6个His标签，用于蛋白鉴定与纯化。
所述步骤(3)中进行双酶切为：加入内切酶BamH1与XhoI，37℃条件下反应1h进行双酶切；加入T4连接酶反应，反应温度为20℃，时间为12h。
步骤(4)中连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10，复苏时间为1h；酶切正确的重组质粒和BL21感受态细胞体积比为1:50，BL21感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
步骤(4)中LB培养基中含有氨苄青霉素，氨苄青霉素在培养基中的浓度为100μg/mL；IPTG工作浓度为300μg/mL。
所述步骤(4)中诱导培养温度为16℃培养过夜。
所述步骤(5)中LysisBuffer中只含有20mMPB缓冲液，PH7.8，高压破菌的破菌压强为1300bar；离心：离心转速为12000r/min。
所述步骤(5)中纯化具体为：将沉淀用含有2M尿素的LysisBuffer漂洗三次后，用含有8M尿素的LysisBuffer重悬沉淀，12000rpm离心后收集上清液，梯度透析于超纯水。
步骤(5)中鉴于重组蛋白6His–MiSpNT-PySpRp处于沉淀组分中，先用2mol/L的蛋白漂洗液重悬包涵体，超声混匀4℃离心10min收集沉淀，反复进行三次漂洗，最后用8mol/L的高浓度尿素裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎90次，至溶液清澈，孵育2小时后4℃离心30min，收集上清液，将上清液中重组蛋白进行梯度透析，去除尿素，最终透析于不含有尿素的透析液中，使蛋白复性，收集透析液中的上清。漂洗超声功率为300W，工作设定5son/7soff30次；8M尿素超声功率为400W，工作时间5s，间隔时间8s，共99次。梯度透析由6M→4M→2M→0M的梯度在室温条件下透析。
步骤(5)中将蛋白粉末用六氟异丙醇溶解后，注入75％的甲醇溶剂，制备成蛛丝纤维。
所述重组蛛丝蛋白与六福异丙醇比例为1:20，即100mg加入2ml六氟异丙醇。
本发明首先采用MiSp全长基因与PySp重复区基因为模板，采用融合PCR技术进行拼接，然后构建Pet28a-MiSpNT-PySpRp重组质粒，转入大肠杆菌中进行表达，用变性纯化方法进行纯化，获得MiSpNT-PySpRp重组蛛丝蛋白溶液。并冻干保存。实验结果表明，该重组蛛丝蛋白在大肠杆菌中可获得大量表达，并且该蛋白的二级结构特征也与天然蛛丝蛋白相似，且在不同PH值的条件下，都能保持稳定状态。
本发明操作简单易行，原材料成本较低，蛛丝蛋白具有良好的生物相容性，稳定性高并且对环境无污染。制备得重组蛛丝蛋白表现出良好的形态特征和生物相容性。本发明使用SnapGene软件，PCR扩增，WesternBlot与SDS-PAGE，变性纯化，梯度透析，冷冻干燥等技术构建和纯化该重组蛛丝蛋白，WesternBlot与SDS-PAGE用来对该蛋白进行鉴定，并通过圆二色谱(CD)分析该重组蛛丝蛋白纤维二级构象特征，以及该蛋白溶液的稳定性测试结果如下：SnapGene软件构建电子克隆：
图1为电子克隆构建流程图；
图2为WesternBlot与SDS-PAGE鉴定结果图，从图中可以看出，在SDS-PAGE胶图中相比于诱导前的大肠杆菌中的蛋白分布，诱导后在45KDa与35KDa之间，明显多出一条表达量较高的蛋白条带，并经WesternBlot抗His检查发现诱导前大肠杆菌内不具有带His标签的蛋白，诱导后出现抗His标签的蛋白且与SDS-PAGE胶图中多出的蛋白条带位置重合。说明该混合蛛丝蛋白在大肠杆菌中获得表达。
图3为MiSpNT-PySpRp重组蛋白经2M尿素漂洗后再用8M尿素溶解后的上清与沉淀组分，从图中可以看出2M尿素漂洗液可去除该重组蛋白的大部分杂质，在8M尿素溶解后可完全溶解在上清组分中。
图4为重组蛛丝蛋白溶液在不同PH值下的二级结构特征，圆二色谱分析(CD)结果：从图a中可以看出，该重组蛛丝蛋白在192nm呈现正峰，在208和222nm则拥有2个负峰，说明MiSpNT-PySpRp重组蛋白主要以α-helix的构象存在，从图b不同PH值降中二级结构组成看出，将低溶液的PH值后α-helix与β-sheet含量没有明显变化。说明降低溶液PH值后MiSpNT-PySpRp重组蛋白溶液二级结构保持不变。
图5是本发明制备的重组蛛丝蛋白粉末制备成纤维的电镜图。说明该蛋白可制成直径大约为0.22mm的丝状纤维。
有益效果
(1)本发明制备工艺简单，反应条件温和，易于操作纯化，所用均为环境友好的材料；
(2)本发明制备的MiSpNT-PySpRp重组蛋白具有天然蛛丝蛋白纤维的二级结构特特征，并且该重组蛛丝蛋白具有良好的水溶性和生物相容性，表达产量可观，可以预见，本发明制备的重组蛛丝蛋白具有产业化实施的前景，是一种潜在的蛋白纤维材料。
附图说明
图1是本发明制备的电子克隆构建流程图；
图2是实施例1制备的WesternBlot与SDS-PAGE鉴定结果图；其中A为SDS-PAGE胶鉴定结果，B为WesternBlot鉴定结果；其中1为诱导前大肠杆菌中蛋白组成，2为诱导后大肠杆菌中蛋白组成，S为破菌离心后的上清液，P为破菌离心后的沉淀组分；
图3是实施例12M尿素漂洗与8M尿素变性溶解的SDS-PAGE图；其中P1为2M尿素漂洗后沉淀，S1为2M尿素漂洗后上清溶液，P2为8M尿素溶解后沉淀，S2为8M尿素溶解后上清；
图4是本发明制备的重组蛛丝蛋白溶液在不同PH值下的二级结构特征；其中a为蛋白溶液在三种不同PH值条件下的峰值图；b为不同PH值下蛋白各二级结构所占比例；
图5是本发明制备的重组蛛丝蛋白粉末制备成纤维的电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取大腹园蛛MiSp基因组1μL,以NT基因序列设计的一对正反引物各2.5μL，加入25μLQ5MasterMIX酶最后加入19μLddH2O混匀，对NT基因进行PCR扩增，PCR条件为98℃变性3min，65℃退火1min，72℃延伸10min，共35次循环，NT正向引物：CGGGATCCCAACCAATCTGGACCAACCCA，反向引物：CTGGTCTAGGTGCAGGTGCTGGAGCGTTTCCATAACCTGCTGCAGTG；再以大腹园蛛PySp重复区设计正反引物，PySp重复区正向引物为GCACTGCAGCAGGTTATGGAAACGCTCCAGCACCTGCACCTAGACC，反向引物为：CGCTCGAGTTACGGTGCTGCCAGTTGAGATA，PySp的正向引物带有NT末端的23bp核苷酸，NT反向引物后23bp核苷酸与PySp正向互补配对。PCR条件为：98℃变性3min，65℃退火1min，72℃延伸5min，循环35次。将PCR扩增后的两部分基因片段，再次进行PCR扩增，选取NT的正向引物与Rp的反向引物各2.5μL，两个扩增产物各2μL，加入25μLQ5MasterMIX酶，最后加入11μLddH2O混匀。进行PCR扩增。PCR条件为：98℃变性3min，65℃退火1min，72℃延伸5min，循环35次。使用1％的琼脂糖凝胶电泳，切取片段大小为1116bp左右的片段，该片段即为重组片段MiSpNT-PySpRp，使用胶回试剂盒回收用30μLddH2O洗脱，在洗脱液中分别加入BamH1与Xho1内切酶各2μLBuffer5μL最后加入11μLddH2O混匀后37℃反应1小时，同时吸取30μLpET28a载体分别加入BamH1与Xho1内切酶各2μLBuffer5μL最后加入11μLddH2O混匀后37℃反应1小时后，对反应液分别使用PCR产物纯化试剂盒回收，都用20μLddH2O洗脱后，吸取片段MiSpNT-PySpRp6μL，酶切过的载体Pet28a2μL,T4Ligase酶1μL，Buffer1μL混匀后于室温条件下连接反应12小时，取5μL连接产物加入50μLDH5α感受态细胞，进行转化，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的单克隆，转入BL21中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入10mlLB中，37℃过夜培养后，转接入1LLB培养基中37℃培养至OD值为0.8后加入IPTG，16℃过夜培养后，8000rpm收集菌体，同时分别对诱导前后菌液制样。重悬于80mlLysisBuffer(只含有20mMPB缓冲液，PH7.8)中高压破菌后，12000rpm离心30mins，收集沉淀，并对破菌后的沉淀与上清分别制样，并对诱导前后与上清沉淀分别制样，并同时进行SDS-PAGE鉴定与WesternblottingAnti-his鉴定。然后用含有2M尿素的LysisBuffer漂洗沉淀三次后，用含有8M尿素的LysisBuffer重悬沉淀，分别对2M漂洗液上清与沉淀，8M尿素重悬离心后上清与沉淀，分别制样。12000rpm离心后收集上清液，梯度透析于超纯水中，使用冻干机冻干后，称量获得150mg蛋白粉末。
在150mg蛋白粉末中加入3ml六氟异丙醇充分溶解后，注入75％的甲醇溶剂中，获得蛛丝纤维。

Claims (10)

1.一种重组蛛丝蛋白的制备方法，包括：
(1)以大腹园蛛次壶腹腺丝MiSp的全长编码基因为模板，然后通过PCR扩增得到次壶腹腺丝MiSp的NT端基因片段MiSp-NT，然后以梨状腺丝PySp完整重复区Rp的编码基因作为模板，通过PCR扩增获得一个完整重复区的基因片段PySp-Rp；
(2)将步骤(1)中两段基因片段MiSp-NT、PySp-Rp通过PCR技术得到完整基因片段MiSpNT-PySpRp；
(3)将上述完整基因片段MiSpNT-PySpRp、pET28a质粒分别进行双酶切，然后进行纯化回收后混合，再加入T4连接酶反应，得到连接产物；
(4)将上述连接产物转入DH5α感受态细胞中进行转化，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的重组质粒Pet28a-MiSpNT-PySpRp，转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中培养，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；
(5)将上述菌体重悬于裂解缓冲液中，高压破菌后，离心，收集沉淀，纯化、冻干，得到重组蛛丝蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中NT端基因片段MiSp-NT大小为480bp，基因片段PySp-Rp为636bp。
3.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中完整基因片段MiSpNT-PySpRp的基因大小为1116bp，共编码372个氨基酸，蛋白分子量为37.36KDa。
4.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中pET28a载体上具有6个His标签；进行双酶切为：加入内切酶BamH1与XhoI，37℃条件下反应1h进行双酶切；加入T4连接酶反应，反应温度为室温，时间为12h。
5.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(4)中连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10；酶切正确的重组质粒和BL21感受态细胞体积比为1:50，BL21感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
6.根据权利要求1所诉的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(4)中LB培养基中含有氨苄青霉素，氨苄青霉素在培养基中的浓度为100μg/mL；IPTG工作浓度为300μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中诱导培养为16℃条件下过夜培养。
8.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中裂解缓冲液为LysisBuffer，其中LysisBuffer只含有20mMPB缓冲液，PH7.8，高压破菌的破菌压强为1300bar；离心：离心转速为12000r/min。
9.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中纯化具体为：将沉淀用含有2M尿素的LysisBuffer漂洗三次后，用含有8M尿素的LysisBuffer重悬沉淀，12000rpm离心后收集上清液，梯度透析于超纯水。
10.根据权利要求1所述的一种重组蛛丝蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(5)中将重组蛛丝蛋白用六氟异丙醇溶解后，注入75％的甲醇溶剂，制备成蛛丝纤维。
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