CN110117328B - 一种重组蛛丝蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种重组蛛丝蛋白，序列结构包括：至少两个蛛丝蛋白结构域单体，和至少一个蛋白酶酶切位点；所述蛋白酶酶切位点位于相邻的两个所述蛛丝蛋白结构域单体之间；通过在相邻的两个蛛丝蛋白结构域单体之间插入蛋白酶酶切位点，当重组蛛丝蛋白在体外使用时，可以结合工具酶，控制重组蛛丝蛋白酶解，相比于现有的蛛丝蛋白需要在微生物协助下长时间的缓慢降解，本发明的重组蛛丝蛋白具有可控降解的优势，当重组蛛丝蛋白在人体内使用时，由于重组蛛丝蛋白上的蛋白酶酶切位点可以被人体内的酶酶解，可以使得由重组蛛丝蛋白制成的生物材料在人体内可以缓慢降解，提高重组蛛丝蛋白的应用价值，用途更加广泛。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质技术领域，具体涉及一种重组蛛丝蛋白及其用途。
背景技术
蜘蛛丝是一种天然高分子量的蛋白纤维，具有良好的机械性能和生物学品质，主要体现在其具有的强度高，弹性好，质地轻，耐高低温，生物相容性好及可降解等特点，使其具有非常广泛的应用前景。如早有研究发现，蛛丝比现在的已知的任何天然丝或人造丝的强度都要大，相当于同体积钢丝的5倍，在重量方面，蛛丝比化学合成丝轻25％，但弹性可延伸到原长的10倍，由于蛛丝具有强度高、弹性好和质地轻等优势，早在18世纪便有人将蛛丝应用到纺织品中，此外蛛丝曾被用作显微镜、望远镜、瞄准系统中光学装置的十字准线，还有将蛛丝制成防弹背心能挡住高速子弹，甚至能够承受一辆汽车的冲击。又如由于蛛丝蛋白具有良好的生物相容性，与人体相容性高，在医疗保健方面，蛛丝蛋白也具有非常大的应用价值，如将其用于制作生物工程材料，如人工的关节韧带、人造皮肤等。再如蛛丝由于韧性高，可用作外科手术中的缝合线，在日常生活中蛛丝还可以制成环保型可降解的塑料袋与垃圾袋。综上，蛛丝蛋白的综合品质远远超过了蚕丝以及现阶段人工合成的高性能材料纤维，是一种亟待开发的战略资源，在生物医学工程、航天航空以及军事等领域有着不可估计的应用价值。
现有技术中便有通过对蛛丝蛋白进行改造提高其机械性能使其应用价值更好，如中国CN103833838B提供的一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法，所述类蛛丝蛋白的性能优于天然蛛丝蛋白性能，例如，与天然蛋白相比较，所述类蛛丝蛋白的硬度和弹性都有较大的提高。再如中国专利文献CN102475909A中公开的一种组织工程用多孔支架材料，以解决现有组织工程材料在生物相容性、生物降解性和机械性能的不足，根据蜘蛛丝独特的机械特性和生物相容性以及其本质是蛋白质的结构特点，利用重组蜘蛛丝蛋白和生物可降解的高聚物为主要原料制备生物相容性好、可降解的组织工程支架材料。该支架材料不仅能被降解成人体可吸收氨基酸，具有很好的生物相容性和较好的机械性能。可见，目前对蛛丝蛋白的应用大多在于其机械性能和生物相容性。由于蛛丝蛋白降解非常缓慢，通常情况下需要微生物的协助，如将其制成可降解的塑料袋埋在土壤里需要微生物长达几年时间的发酵降解，降解时间过长，不宜应用于需要降解时间较短的材料中，因此对于组织材料来说，对于蛛丝蛋白利用主要在于其强机械性能和生物相容性，对于有可降解要求的生物组织材料来说，则需要将蛛丝蛋白与可降解材料组合应用，如CN102475909A中使用生物可降解的高聚物与蛛丝蛋白组合。然而，目前研究人员还未意识到降解性能高和降解可控性高的蛛丝蛋白具有更广阔的应用价值和市场潜力，完全忽略了对蛛丝蛋白的可降解性能的改进，因此，还未有人提出一种行之有效的方法提高蛛丝蛋白的可降解性，并且使得蛛丝蛋白的可降解性能是可控的。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组蛛丝蛋白及其用途，所述重组蛛丝蛋白在保证原有的机械性能或生物学品质的基础上，还可以具有较高的降解性能，且降解性是可以控制的，具有非常广泛的用途。
为此，本发明提供了如下技术方案：
一种重组蛛丝蛋白，序列结构包括：至少两个蛛丝蛋白结构域单体，和至少一个蛋白酶酶切位点；所述蛋白酶酶切位点位于相邻的两个所述蛛丝蛋白结构域单体之间。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括至少一个丝氨酸。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括如下酶切位点ENLYFQS，上述的字母为常见氨基酸缩写字母。
优选的，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括至少一个连续的两个丝氨酸。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括如下酶切位点KSS、DSS、ESS或RSS中的至少一种。上述的KSS为赖氨酸(Lys)-丝氨酸(Ser)-丝氨酸(Ser)，DSS为天冬氨酸(Asp)-丝氨酸(Ser)-丝氨酸(Ser)，ESS为谷氨酸(Glu)-丝氨酸(Ser)-丝氨酸(Ser)，RSS为精氨酸(Arg)-丝氨酸(Ser)-丝氨酸(Ser)。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列的两端分别具有至少一个氨基酸保护。为了使得所述重组蛛丝蛋白在降解时，蛋白酶酶解时不影响到到蛛丝蛋白中的蛛丝蛋白结构域单体，进而影响功能性多肽的完整性，因此，在蛋白酶酶切位点的氨基酸序列的两端分别连接至少一个氨基酸，所述氨基酸为任意一种氨基酸，将蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中的酶切位点与蛛丝蛋白结构域单体分隔开。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列结构为XXXFFFFXXX；其中F代表一个所述酶切位点；X代表一个氨基酸。
所述的重组蛛丝蛋白，蛋白序列结构为[T-Wn-T-Wn]m；其中，T代表任意一个所述蛛丝蛋白结构域单体；W代表任意一个蛋白酶酶切位点；m和n分别为大于或等于1的整数。优选的，m为≤100；n为≤20。更优选的，m为≤20；n为≤4。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛛丝蛋白结构域单体为源于天然蛛丝蛋白中的功能性多肽。所述天然蛛丝蛋白可以来源于如下蜘蛛：希氏尾园蛛(Arachnura higginsi)，Araneus circulissparsus，十字园蛛，Argiope picta，条带园蛛(Banded Garden Spider)(三带蜘蛛(Argiope trifasciata))，Batik Golden Web Spider(Nephila antipodiana)，Beccari′s Tent Spider(Cyrtophora beccarii)，鸟粪蛛(Bird-dropping Spider)(Celaenia excavata)，黑白棘蛛(Black-and-White Spiny Spider)(库氏棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑黄园蛛(Black-and-yellow Garden Spider)(Argiopeaurantia)，流星锤蛛(Bolas Spider)(Ordgarius furcatus)，流星锤蛛-巨蜘蛛(BolasSpider-Magnificent Spider)(Ordgarius magnificus)，棕色水手蛛(Brown SailorSpider)(嗜水新园蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛(Brown-Legged Spider)(Neosconarufofemorata)；Capped Black-Headed Spider(帆楚蛛(Zygiella calyptrata))，普通园蛛(Common Garden Spider)(Parawixia dehaani)，普通园蛛(Common Orb Weaver)(Neoscona oxancensis)，蟹样棘园蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver)(Gasteracanthacancriformis(elipsoides))，Curved Spiny Spider(Gasteracantha arcuata)，皿云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)，Cyrtophora parnasia，Dolophones conifera，Dolophonesturrigera，Doria′s Spiny Spider(Gasteracantha doriae)，双点棘蛛(Double-SpottedSpiny Spider)(Gasteracantha mammosa)，Double-Tailed Tent Spider(方格云斑蛛(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蛛(Aculeperia ceropegia)，Eriophorapustulosa，Flat Anepsion(Anepsion depressium)，Four-spined Jewel Spider(Gasteracantha quadrispinosa)，花园圆网蛛(Garden Orb Web Spider)(Eriophoratransmarina)，Giant Lichen Orbweaver(Araneus bicentenarius)，金色网蛛(GoldenWeb Spider)(Nephila maculata)，Hasselt′s棘蛛(Hasselt′s Spiny Spider)(Gasteracantha hasseltii)，Tegenaria atrica，Heurodes turrita，Island CyclosaSpider(岛艾蛛(Cyclosa insulana))，Jewel or Spiny Spider(Astracantha minax)，肾形园蛛(Kidney Garden Spider)(丽园蛛(Araneus mitificus))，Laglaise′s园蛛(Laglaise′s Garden Spider)(Eriovixia laglaisei)，Long-Bellied Cyclosa Spider(Cyclosa bifida)，Malabar Spider(Nephilengys malabarensis)，Multi-Coloured StAndrew′s Cross Spider(多色金蛛(Argiope versicolor))，观赏性树干蛛(OrnamentalTree-Trunk Spider)(裂腹蛛(Herennia ornatissima))，Oval St.Andrew′s CrossSpider(好胜金蛛(Argiope aemula))，Red Tent Spider(单色云斑蛛(Cyrtophoraunicolor))，Russian Tent Spider(Cyrtophora hirta)，Saint Andrew′s Cross Spider(凯氏金蛛(Argiope keyserlingi))，猩红阿秋蛛(猩红阿秋蛛(Acusilas coccineus))，银色金蛛(Argiope argentata)，Spinybacked Orbweaver(Gasteracantha cancriformis)，斑点园蛛(Spotted Orbweaver)(Neoscona domiciliorum)，St.Andrews Cross(Argiopeaetheria)，St.Andrew′s Cross Spider(Argiope Keyserlingi)，Tree-Stump Spider(无鳞波蛛(Poltys illepidus))，Triangular Spider(Arkys clavatus)，Triangular Spider(Arkys lancearius)，Two-spined Spider(Poecilopachys australasia)，络新妇蛛属(Nephila)物种。
所述的重组蛛丝蛋白，所述蛛丝蛋白结构域单体包括如下(1)-(2)中任意一个氨基酸序列：
(1)具有如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12任意一个所示的氨基酸序列；
(2)与(1)中所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12任意一个所示的氨基酸序列具有同源性为75％以上的氨基酸序列。
一种编码所述的重组蛛丝蛋白的基因。
一种载体，包括所述的基因。
所述的载体，所述载体是表达载体。
所述的载体，所述载体是质粒载体或病毒载体。
一种宿主，包括所述的载体。
所述的宿主，所述宿主为原核细胞或真核细胞。
所述的宿主，所述原核细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
一种所述的重组蛛丝蛋白在生物材料、医药、航天航空或军事领域中的用途。
一种纸产品，包括所述的重组蛛丝蛋白。
一种薄膜，包括所述的重组蛛丝蛋白。
一种纺织品，包括所述的重组蛛丝蛋白。
一种涂层，包括所述的重组蛛丝蛋白。
一种纤维，包括所述的重组蛛丝蛋白。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种重组蛛丝蛋白，序列结构包括：至少两个蛛丝蛋白结构域单体，和至少一个蛋白酶酶切位点；所述蛋白酶酶切位点位于相邻的两个所述蛛丝蛋白结构域单体之间；通过在相邻的两个蛛丝蛋白结构域单体之间插入蛋白酶酶切位点，当重组蛛丝蛋白在体外使用时，可以结合工具酶，控制重组蛛丝蛋白酶解，相比于现有的蛛丝蛋白需要在微生物协助下长时间的缓慢降解，本发明的重组蛛丝蛋白具有可控降解的优势，当重组蛛丝蛋白在人体内使用时，由于重组蛛丝蛋白上的蛋白酶酶切位点可以被人体内的酶酶解，可以使得由重组蛛丝蛋白制成的生物材料在人体内可以渐渐降解，提高重组蛛丝蛋白了应用价值，用途更加广泛，而且所述重组蛛丝蛋白可以保证原有的机械性能或生物学品质。
2.本发明提供的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括至少一个丝氨酸，通过在蛋白酶酶切位点中设置丝氨酸，保证了人体内的大部分酶可以酶解所述重组蛛丝蛋白。
3.本发明提供的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括如下酶切位点KSS、DSS、ESS或RSS中的至少一种，通过在所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中设置上述的酶切位点，保证所述重组蛛丝蛋白在人体内可以降解。
4.本发明提供的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中包括如下酶切位点ENLYFQS，通过在所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中设置上述的酶切位点，保证所述重组蛛丝蛋白在体外可以被工具酶如TEV酶酶解，实现重组蛛丝蛋白的可控降解。
5.本发明提供的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列的两端分别具有至少一个氨基酸保护，目的在于将所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中的酶切位点与蛛丝蛋白结构域单体间隔开，避免所述重组蛛丝蛋白在降解时，蛛丝蛋白结构域单体完整性受到影响，进而影响蛛丝蛋白结构域单体本身的功能。
6.本发明提供的重组蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列结构为XXXFFFFXXX；其中F代表任意一个所述酶切位点；X代表任意一个氨基酸；上述结构的蛋白酶酶切位点，保证了重组蛛丝蛋白的降解性能，同时保证了重组蛛丝蛋白本身的功能。
7.本发明提供的重组蛛丝蛋白，蛋白序列结构为[T-Wn-T-Wn]m；其中，T代表任意一个所述蛛丝蛋白结构域单体；W代表任意一个蛋白酶酶切位点；m和n分别为大于或等于1的整数；上述序列结构的重组蛛丝蛋白在保证本身的性能和降解性能的基础上，还具有容易合成的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2中的重组蛛丝蛋白MaSp1的SDS-PAGE鉴定图，图中1为M1，2为蛋白MaSp1；
图2是本发明实施例2中的重组蛛丝蛋白MaSp1的Western blotting鉴定图，图中1为M1，2为蛋白MaSp1；
图3是本发明实施例4中的重组蛛丝蛋白MaSp2的SDS-PAGE鉴定图，图中1为M1，2为重组蛛丝蛋白MaSp2；
图4是本发明实施例4中的重组蛛丝蛋白MaSp2的Western blotting鉴定图，图中1为M1，2为重组蛛丝蛋白MaSp2；
图5是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp1纤维的电镜图；
图6是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp1薄膜的电镜图；
图7是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp2纤维的电镜图；
图8是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp2薄膜的电镜图。
具体实施方式
下述实施例中的表达载体pET-28a、大肠杆菌BL21、LB培养基、工具酶TEV酶酶液为市售产品。本发明的重组蛛丝蛋白可以委托生物技术公司合成，也可以按照下述的实施例的方法进行制备。
实施例1人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp1
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为[T1-Wn-T2-Wn]m，其中n＝1，m＝4，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为KKKKSSDSSESSRSSSSSS(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，所述重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，所述见序列表中SEQ ID NO.14的核苷酸序列。
实施例2、人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp1在大肠杆菌中的高效表达
(1)由基因合成公司合成MaSp1基因，将其克隆至含有T7强启动子的原核生物表达载体pET-28a+中，构建成含有人工合成的MaSp1基因的重组质粒pET-28a+-MaSp1；
(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用热休克法(42℃热激45秒)将重组质粒pET-28a+-MaSp1转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；
(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中，37℃，220rpm摇床培养，当工程菌培养液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，然后进行裂解，将所得的细胞裂解液进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1，取所述细胞裂解液进行重组蛛丝蛋白MaSp1的提取、纯化，将纯化后的重组蛛丝蛋白MaSp1进行Western blotting鉴定，结果见图2。
实施例3人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp2
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为[T1-Wn-T2-Wn]m，其中n＝1，m＝4，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQS(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，所述重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID NO.16的核苷酸序列。
实施例4、人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp2在大肠杆菌中的高效表达
(1)由基因合成公司合成MaSp2基因，将其克隆至含有T7强启动子的原核生物表达载体pET-28a+中，构建成含有人工合成的基因MaSp2基因的重组质粒pET-28a+-MaSp2；
(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用热休克法(42℃热激45秒)将重组质粒pET-28a+-MaSp2转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；
(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中，37℃，220rpm摇床培养，当工程菌培养液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，然后进行裂解，将所得的细胞裂解液进行SDS-PAGE鉴定，结果见图3，取所述细胞裂解液进行重组蛛丝蛋白MaSp1的提取、纯化，将纯化后的重组蛛丝蛋白MaSp1进行Western blotting鉴定，结果见图4。
实施例5人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp3
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为[T1-Wn-T2-Wn]m，其中n＝20，m＝100，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQS(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，然后按照实施例2中的方案制备相应的重组蛛丝蛋白MaSp3。
实施例6人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp4
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为[T1-Wn-T2-Wn]m，其中n＝1，m＝20，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQS(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，然后按照实施例2中的方案制备相应的重组蛛丝蛋白MaSp4。
实施例7人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp5
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为T1-Wn-T2，其中n＝1，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQID NO.10所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为AAAAARSSESSKSSDSSAAAAA(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，然后按照实施例2中的方案制备相应的重组蛛丝蛋白MaSp5。
实施例8人工合成重组蛛丝蛋白的基因MaSp6
本实施例选择的重组蛛丝蛋白序列结构为T1-Wn-T2，其中n＝1，T1的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，T2的蛛丝蛋白结构域单体的氨基酸序列如SEQID NO.12所示，W的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为AAAAARSSESSKSSDSSAAAAA(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，根据上述选择的重组蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与重组蛛丝蛋白氨基酸序列一致的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列，然后按照实施例2中的方案制备相应的重组蛛丝蛋白MaSp6。
实施例9纸产品
将实施例4纯化后的重组蛛丝蛋白进行干燥，然后按照常规工艺制成纸产品。
实施例10薄膜
将实施例5纯化后的重组蛛丝蛋白进行干燥，然后按照常规工艺制成薄膜。
实施例11纺织品
将实施例6纯化后的重组蛛丝蛋白进行干燥，然后按照常规工艺制成纺织品。
实施例12涂层
将实施例6纯化后的重组蛛丝蛋白进行干燥，然后按照常规工艺制成涂层。
实施例13纤维
将实施例7纯化后的重组蛛丝蛋白进行干燥，然后按照常规工艺制成纤维。
实验例
将实施例2和实施例4中获得的重组蛛丝蛋白分别进行纯化，干燥，然后进行以下的试验
(1)韧性和强度检测
a、取干燥后的蛋白样品使用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP)进行溶解，投料量为15％(wt％)，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮。
b、取上述纺丝液2mL加入到注射器中，选择注射针为27G针头，设定注射速率为0.2mL/h，将纺丝液注入凝固浴(100％乙醇)，然后制备成纤维和薄膜，然后电镜观察纤维及薄膜的形貌，如图5-8所示。
c、检测上述形成的纤维和薄膜的最大应力(stress(MPa))和最大应变系数(strain(％))，并检测使上述形成的纤维和薄膜断裂的能量大小(energy to break(MJ/m3))结果如表1所示，
表1 MaSp1和MaSp2纤维和薄膜的最大应力、最大应变系数、断裂能量
由此可见，本发明的重组蛛丝蛋白可满足湿法纺丝对蛋白的要求，电镜显示，获得的蛋白丝结构均一，具有一定的韧性和强度。
(2)人体内可降解性检测
取上述制备的重组蛛丝蛋白MaSp1纤维加入人的血液中，其中所述血液(由医院提供)用量为0.5ml，所述重组蛛丝蛋白MaSp1纤维为0.5mg，于37℃降解4小时，观察降解情况。结果表明，本发明制备的重组蛛丝蛋白MaSp1纤维在4小时后完全降解。
(3)体外可控降解性能检测
分别取上述制备的重组蛛丝蛋白MaSp2纤维和重组蛛丝蛋白MaSp2薄膜各0.5mg,分别加入PBS缓冲液1ml，然后各自加入1U/μL的TEV酶酶液10μL，于37℃下孵育10min，观察降解情况。结果表明，本发明制备的重组蛛丝蛋白MaSp2纤维和重组蛛丝蛋白MaSp2薄膜各自在酶处理10min后完全降解。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 李春 李琳
<120> 一种重组蛛丝蛋白及其用途
<130> SHA201900047
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 2
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala
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Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala
35
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<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 5
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala
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Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly
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Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
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Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 7
Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly
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Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly
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Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Ser Gly Pro
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Ser Gly Pro
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 9
Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly
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Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro
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Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly
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Gly Ala Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly
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Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro
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Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly
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Gly Ala Gly Pro Pro Pro Pro Gly Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> 人工合成（artificial synthesis）
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Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly
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Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 13
Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
50 55 60
Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp
85 90 95
Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln
100 105 110
Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys
130 135 140
Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
165 170 175
Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser
195 200 205
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
210 215 220
Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly
225 230 235 240
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser
245 250 255
Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala
260 265 270
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly
275 280 285
Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser
305 310 315 320
Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser
325 330 335
Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala
340 345 350
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355 360 365
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<210> 14
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 14
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ggcaaggtgg ctatggaggg cttggtagtc agggcgcggg acgagggggt ctcggcggac 120
aaggggctgg tgccgcagcg gctgccgcag cggctaaaaa gaaaaagagc tctgattcct 180
cagaatcgag tcggagctct tcctcatcga gtggcggagc cgggcagggt ggctacggag 240
ggctaggtag ccaaggcgca ggaagagggg gtctgggcgg acagggggcg ggtgctgccg 300
cagcggctgc cgcagcggct aaaaagaaaa agtcttccga ctcatcggag agtagcaggt 360
cttcctcatc gagtagcggc gccggacaag ggggttatgg cggattaggg tctcagggtg 420
caggccgtgg agggttgggt ggccaaggag cgggggctgc cgcagcggct gccgcagcga 480
aaaagaaaaa gtcctcagat tcgagtgaaa gctctcgctc ctcatcgagt agctctggtg 540
gcgctggaca ggggggttac ggcggacttg ggtcccaagg tgccggccga ggagggctat 600
gggtgctggc caaggagggt atggtggctt aggatctcag ggggccggtc gtggcggatt 660
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agattcgagt gaaagctctc gctcctcatc gagtagctct gggggtgcgg gccagggagg 780
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<210> 15
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 15
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Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
130 135 140
Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
165 170 175
Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Pro Gly
195 200 205
Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly
210 215 220
Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Pro Gly Gln
245 250 255
Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro
260 265 270
Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
275 280 285
Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
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Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly
305 310 315 320
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
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<212> DNA
<213> 人工合成（artificial synthesis）
<400> 16
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ggccagcagg gcccgggcgg ctatggcccg ggccagcagg gcccgggcgg ctatggcccg 180
ggccagcagg gcccgagcgg cccgggcagc gcggcggcgg cggcggcggc ggcggaaaac 240
ctgtattttc agagcggccc gggccagcag ggcccgggcg gctatggccc gggccagcag 300
ggcccgagcg gcccgggcag cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggaaaa cctgtatttt 360
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ggcagcgcgg cggcggcggc ggcggcggcg gaaaacctgt attttcagag ctaatag 1017
Claims (12)
1.一种重组蛛丝蛋白，其特征在于，所述重组蛛丝蛋白为如SEQ ID NO.13或SEQ IDNO.15所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的重组蛛丝蛋白的基因。
3.一种载体，包括权利要求2所述的基因。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体是表达载体。
5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒载体或病毒载体。
6.一种宿主，包括权利要求3-5任一项所述的载体，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
7.一种如权利要求1所述的重组蛛丝蛋白在航天航空领域、军事领域或制备生物材料中的用途。
8.一种纸产品，包括权利要求1所述的重组蛛丝蛋白。
9.一种薄膜，包括权利要求1所述的重组蛛丝蛋白。
10.一种纺织品，包括权利要求1所述的重组蛛丝蛋白。
11.一种涂层，包括权利要求1所述的重组蛛丝蛋白。
12.一种纤维，包括权利要求1所述的重组蛛丝蛋白。
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