CN101775405B - 一种制备重组几丁质酶的方法 - Google Patents
一种制备重组几丁质酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101775405B CN101775405B CN200910075164XA CN200910075164A CN101775405B CN 101775405 B CN101775405 B CN 101775405B CN 200910075164X A CN200910075164X A CN 200910075164XA CN 200910075164 A CN200910075164 A CN 200910075164A CN 101775405 B CN101775405 B CN 101775405B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitinase
- gene
- pdi
- sequence
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 4
- 101150070377 PDI gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 2
- 101150105462 HIS6 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 102100027050 Inorganic pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000895977 Amycolatopsis orientalis Exo-beta-D-glucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000255945 Choristoneura Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N benzoic acid;2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1.OC(=O)C1=CC=CC=C1O CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组几丁质酶的方法，解决利用现有方法得到的几丁质酶产量低、纯度低、活性低等问题，根据几丁质酶基因CH的全长序列设计引物，在CH基因5`末端增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆至pET-21b载体；再将分子伴侣PDI的全长序列克隆并连接到CH基因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入蛋白酶切位点序列pp，重组成表达载体；将表达载体转化至大肠杆菌，诱导表达，用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液，产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备重组几丁质酶的方法。
背景技术
几丁质(chitin)又称甲壳素，它是由N-乙酰-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖，在自然界分布及其广泛。它的降解产物乙酸氨基葡萄糖具有多种用途，而几丁质酶(chitinase，简称CH)则在这一降解过程发挥着重要作用。几丁质又是所有害虫防御系统不可缺少的一部分，几乎所有昆虫病原菌都有产几丁质酶的能力，这就肯定了几丁质酶在害虫生物防治中的重要作用。一般昆虫类害虫的消化道的中肠具有围食膜结构，该结构由几丁质、蛋白质、透明质酸构成，几丁质是其中主要成分，围食膜是蝗虫抵御病原菌的天然屏障，几丁质酶水解蝗虫中肠围食膜中的几丁质，从而致使围食膜穿孔，破坏其消化道，从而提高杀虫效率。另外，昆虫体表的外壳结构主要由蛋白质和几丁质等生物高分子物质构成，其中几丁质含量可达80％，这是昆虫的又一道防御屏障。几丁质酶可对蝗虫体表的结构几丁质产生一定程度的破坏作用，导致其它致病菌或者其它农药侵人蝗虫体内，从而提高害虫感染率和致死率。
1971年，Smimoff首次成功地在苏云金杆菌制剂中添加微量几丁质酶用于防治云杉卷叶蛾幼虫，与单用制剂相比，在低温下加速幼虫死亡，提高死亡率的效果十分明显。17.1℃12h条件下，加酶处理96h和120h幼虫死亡率分别为88％和100％；而单用制剂幼虫死亡率分别只有40％和65％。国内也有相关报道，尹鸿翔等人将一株粘质沙雷氏菌与一种灭蝗剂的主要成分产碱假单饱菌混合后，极大地提高了对蝗虫的致死率。公知，许多的微生物都可以产生几丁质酶，例如沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescen)，芽饱杆菌中的苏云金芽抱杆菌(B.thruingiensis)、蜡状芽抱杆菌(B.eereus)及环状芽抱杆菌(Baeilluscirculans)，豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等等。跟其他种类产生的几丁质酶一样，微生物所产生的几丁质酶也可分为外切几丁质酶(Exochitinase)和内切几丁质酶(Endoehitinase)。不同来源的几丁质酶相对分子质量相差很大，变化范围在1.9x104～1.1x105之间，等电点pH值一般在3.6～8.6，其水解可溶性底物的速度较快，其次是水解胶体几丁质，水解粉状几丁质相当缓慢。因此，能够快速大量的制备几丁质酶，对于我国工业、农业都具有重要的意义。但是迄今为止，国内外仍未很好的解决几丁质酶的大规模生产问题，所有的研究都还停留在试验阶段，而且得到的几丁质酶纯度较低，活性较低，不利于向大众推广。例如，现在一些研究利用二步发酵的方法将微生物的营养生长发酵和产酶发酵培养分开进行，使得哈茨木霉的产酶量比传统的灰褐链霉菌提高了四倍，但是仍然不能满足工业化要求。随着基因重组技术的不断发展，利用基因克隆和诱变筛选等途径大规模生产可溶高活性的几丁质酶，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明为了解决利用现有方法得到的几丁质酶产量低、纯度低、活性低等问题，提供一种制备重组几丁质酶的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种制备重组几丁质酶的方法，包括以下步骤：(1)根据几丁质酶基因CH(chitinase，后面简称CH)的全长序列设计引物，在CH基因序列的5`末端增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并连接到CH基因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶切位点序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI，简称21b-CHP，相应表达出的重组蛋白为HIS6-CH-pp-PDI；(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI转化至大肠杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液；(4)将含有重组几丁质酶的溶液进行纯化处理，得到含有重组几丁质酶的精品。上述CH基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示。
上述步骤中，所述几丁质酶基因CH的全长序列可从多种微生物中获得，本发明经过大量优化筛选试验，利用PCR扩增技术从高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌种中获取高活性的几丁质酶基因CH，如序列表中所示SEQ ID NO：1；所述HIS标签序列HIS6即为六个连续的组氨酸，其序列也是本领域的普通技术人员公知的；分子伴侣PDI的全长基因序列以及蛋白酶切位点序列pp也是公知的，其中分子伴侣PDI的全长基因序列如序列表中所示SEQ ID NO：2；对于将含有重组几丁质酶的溶液进行纯化处理的方法，在现有技术中有很多中，但是大都存在纯化率低、纯化工序复杂等缺点，本发明提供一种最简单的、纯化率较高的最佳方法，具体如下：
步骤(4)中对含有重组几丁质酶的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到重组几丁质酶的精品。
PDI伴侣分子对于CH的可溶性表达具有关键的辅助作用，而它们和CH的相对位置是可变的，伴侣分子PDI和CH最终的重组蛋白包含CH-PDI或PDI-CH或CH-HIS6-PDI或HIS6-PDI-CH中的任意一种，均可以提高CH的可溶性表达。
与现有技术相比，利用本发明的基因重组方法，包括利用PCR技术从粘氏沙雷氏菌中克隆出几丁质酶的基因，连同PDI的分子伴侣一同构建进入大肠杆菌中高效表达载体，使得PDI辅助几丁质酶保持可溶解高活性的正确折叠状态，比包涵体的形式更保持了蛋白酶的活性，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，也大幅度简化了纯化的步骤，这样制得的几丁质酶纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定，产物利于向大众推广，在害虫生物防治中起着重要的作用。
附图说明
图1为pET-21b的质粒示意图谱；
图2为图1的展开构建示意图，显示pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI的质粒构建方法；
图3为利用PCR鉴定21b-CHP质粒中的CH片段的电泳图；
图4为提纯产物中CH含量和纯度的SDS-PAGE结果示意图；
图5为利用N一乙酰氨基葡萄糖(NAG)作为显色反应标准品的浓度-吸光度标准曲线；
图6为利用本发明所述方法得到的提纯产物的浓度-吸光度测活曲线。
具体实施方式
实施例一：CH基因表达载体的构建及表达：
1)选取优化筛选后得到的高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌，利用PCR技术从中克隆CH基因。这个CH基因全长序列如序列表中所示SEQ ID NO：1：针对CH序列设计全套引物，全部从5`-3`排列如下所示：
上游引物
TGAGATATACATATGCACCACCACCATCATCACcgcaaatttaataaacc
下游引物
CCG GAATTC ttgaacgccggcgctgttg
引物稀释成50pmol/ul， PCR扩增得到完整序列HIS6-CH。
PCR反应体系50ul：
ddH2O： 40ul
10*PCR BUFFER 5ul
dNTP 1ul
模板： 1ul
上/下游引物： 1ul
pfu酶 1ul
PCR反应条件：
94℃ 8min
94℃ 30s
65℃ 30s
72℃ 30s 20循环
94℃ 30s
55℃ 30s
72℃ 30s 20循环
72℃ 10min
反应结束之后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测为与1400bp-1800bp之间位置处的一条亮带即为目的基因(HIS6-CH)的大小，凝胶回收目的基因，用限制性内切酶NdeI和EcoRI将其切成粘性末端，如图3所示，左边为碱基标准长度对照，右边为21b-CHP载体利用CH引物的PCR鉴定。图示显示载体中克隆得到符合CH长度大小的条带，初步证明载体构建成功。
2)用步骤1)中的方法同样处理pET-21b载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-HIS6-CH载体。
设计PDI的引物，包含酶切位点：
上游引物：PDI-PPs：5`-3`
TA GAATTC CTGGAAGTTCTGTTCC AGGGGCCC ATGCTGCGCCGCGC
下游引物：PDI-PPa 5`-3`
CT GTCGACTTA CAGTTCATCTTTCACAG
PCR反应条件(Tag酶)：
94℃ 8min
94℃ 30s
65℃ 30s
72℃ 1min 30循环
72℃ 10min
琼脂糖凝胶电泳检测PDI条带位于1600bp左右，胶回收目的基因，用EcoRI和SalI将基因酶切成粘性末端，接入用EcoRI和XhoI酶切后的pET-21b-HIS6-CH载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α。用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI高效表达载体(简写为21b-CHP)。上述CH基因表达载体的构建过程如说明书附图1、2所示，质粒pET-21b的图谱来自商业化的试剂盒，扩增的序列经过设计插入其中的多克隆位点中。
3)将正确的21b-CHP质粒转化大肠杆菌Rosseta，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1∶5000加入IPTG储液，25℃培养5-7小时(温度提高会导致产物形成无活性的包涵体，而时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
同时将含有PPase的质粒转入Rosseta菌株，同样操作挑选单斑克隆，在5mlLB培养基培养过夜，然后1∶100转接，摇瓶培养37℃至OD为0.6，按照1∶1000加入IPTG储液，30℃培养6小时，离心收集菌体，取适当与21b-CHP菌体混合(菌体质量比值约为1∶50)。
4)配制适合保存酶活的缓冲体系：
Tris： 6.057g/L
NaCl： 2.925g/L
甘油： 50ml/L
用缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌(可选)，用冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度37℃)，12000rpm/min离心20min，收集上清液。再次调整PH为7.0-8.0，振荡反应约4h(冰上操作有助于提高产物活性，需要延长作用时间至10h左右。这样重组蛋白基本被PPase酶切完全，释放出CH蛋白，此时所得溶液为高浓度的含有CH的溶液。该溶液也可用下述实施例3的方法对其浓度及活性进行鉴定。
实施例二：利用上述得到的CH原液经纯化后制备CH精品
在高浓度的含有CH的溶液中，调整其PH值到8.0。配制上柱缓冲液：
MCAC-15 MCAC-1000
20mM Tris盐酸 PH10.0 20mM Tris盐酸 PH10.0
0.5M NaCl 0.5M NaCl
10％(v/v)甘油(可调整至20％) 10％(v/v)甘油
15mMol/L 咪唑 1M 咪唑
用MCAC-15溶液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后把柱材和CH溶液共育，室温(冰上更佳)轻摇30min。然后上柱，用MCAC-50洗脱杂蛋白，最后用MCAC-250洗脱目的蛋白。将所得产物透析过夜，即得到高纯度的CH精品。
实施例三、纯化后CH精品的鉴定：
首先利用SDS-PAGE鉴定表达产物的浓度：样品处理液：SDS 1g，Glycerol5mL，溴酚蓝(BPB)固体痕量，二硫苏糖醇(DDT)2.5mL，B液25mL，加去离子水至50mL。取酶切后CH溶液10ul，加入2ul样品处理液，至沸水浴5分钟，点样量为5ul/孔，标准蛋白分子量同样处理，用考马氏亮蓝R-250染色。如图4所示，进行SDS-PAGE分析和活性检测，最左边一道为蛋白质分子量对照，右边2道为不同时间精提纯CH产品，显示样品纯度和浓度。纯度大于90％，活性大于2500U/ml，产量大于5ml/g菌体干重。产物可以用于进一步制作成其它成品。
表达产物的活性鉴定：
采用现在普遍使用的DNS水杨酸测定法来测定几丁质酶活力。首先配置胶体几丁质。称取几丁质2g，溶解于100ml的85％的磷酸中，在30℃下反应1.5d。全部溶解后加蒸馏水少量，待胶体沉淀后，将上清液小心倒去。然后加入水，混匀。这样反复水洗直至溶液变为中性。最后用20mmol/L PBS磷酸缓冲液调整终含量为1.0％(体积为200ml)。然后取0.2ml待测液体与0.8ml含有1.0％胶体几丁质的磷酸缓冲液混合均匀，放置于37℃恒温水浴锅中保温1h；然后将作用后的酶液放置于100℃的沸水浴中，水浴10min；冰浴冷却后加入1.0ml 3，5一二硝基水杨酸试剂，100℃沸水浴10min；酶液在室温下，通过6000r/min的转速，离心10min，取上清液；在波长540nm下的紫外分光光度计中测吸光度。整个实验中，利用N一乙酰氨基葡萄糖(NAG)作为显色反应的标准品为对照，如图5所示。对于几丁质酶的活力，国际上有多种标定方法，这里采用的是常用的一种，即在上述条件下，每小时产生1ug NAG所需几丁质酶量为1个酶活力单位，再除以最开始加入酶的体积得到酶的单位活力(U/ml)。如图6所示，检测了提纯后的2个样品，其中样品1的活力为2864U/ml，样品2的活力为4136U/ml。
SEQUENCE LISTING
<110>杨霞
<120>一种制备重组几丁质酶的方法
<160>2
<210>1
<211>1689
<212>DNA
<213>Serratiamarcescen
<400>1
atgcgcaaat ttaataaacc gctgttggcg ctgttgatcg gcagcacgct gtgttccgcg 60
gcgcaggccg ccgcgccggg caagccgacc atcgcctggg gcaacaccaa gttcgccatc 120
gttgaagttg accaggcggc taccgcttat aataatttgg tgaaggtaaa aaatgccgcc 180
gatgtttcgg tctcctggaa tttatggaat ggcgacaccg gtacgacggc aaaagtttta 240
ttaaatggca aagaggcgtg gagcggccct tcaaccggtt cttccggtac ggcgaatttt 300
aaagtcaata aaggcggccg ttatcaaatg caggtggcat tgtgcaatgc cgacggctgc 360
agcgccagcg acgccaccga aattgtggtg gccgacaccg acggcagcca tttggcgccg 420
ttgaaagagc cgctgctgga aaagaataaa ccgtataaac agaactccgg caaagtggtg 480
ggttcttatt tcgtcgagtg gggcgtttac gggcgcaatt tcaccgtcga caagatcccg 540
gcgcagaact tgacccacct gctgtacggc tttatcccga tctgcggcgg caacggcatc 600
aacgacagcc tgaaagagat cgaaggcagc ttccaggcgc tgcagcgctc ctgccagggc 660
cgcgaggact tcaaagtctc gatccacgat ccgttcgccg cgctgcaaaa agcgcagaag 720
ggcgttaccg cctgggatga ctcctacaag ggcaacttcg gccagctgat ggcgctgaaa 780
caggcgcatc ctgacctgaa aattctgccg tcgatcggcg gctggacgct gtccgacccg 840
ttcttcttca tgggtgataa ggtgaagcgc gatcgcttcg tcggttcggt gaaagagttc 900
ctgcagacct ggaagttctt cgatggcgtg gatatcgact gggagttccc gggcggcaaa 960
ggcgccaacc cgaacctggg cagcccgcag gacggggaaa cctatgtgct gctgatgaag 1020
gagctgcggg cgatgctgga tcagctgtcg gcggaaaccg gccgcaaata tgaactgacc 1080
tccgccatca gcgccggcaa ggacaagatc gacaaggtgg cttacaacgt cgcgcagaac 1140
tcgatggatc acattttcct gatgagctac gacttctatg gcgccttcga tctgaagaac 1200
ctggggcatc agaccgcgct gaatgcgccg gcctggaagc cggacaccgc ttacaccacg 1260
gtgaacggcg tcaatgcgct gctggcgcag ggcgtcaagc cgggcaaaat cgtcgtcggc 1320
accgccatgt atggccgcgg ctggaccggg gtgaacggct accagaacaa cattccgttc 1380
accggtaccg ccaccgggcc ggttaaaggc acctgggaga acggcatcgt ggactaccgc 1440
caaatcgctg gccagttcat gagcggcgag tggcagtaca cctacgacgc cacggcagaa 1500
gcgccatacg tgttcaagcc ttccaccggc gatctgatca ccttcgacga tgcccgctcg 1560
gtgcaggcca aaggcaagta cgtgctggat aagcagctgg gcggcctgtt ctcttgggag 1620
gtcgacgcgg acaacggcga tattctcaac agcatgaacg ccagcctggg caacagcgcc 1680
ggcgttcaa 1689
<210>2
<211>1527
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
atgctgcgcc gcgctctgct gtgcctgccg tggcccgccc tggtgcgcgc cgacgccccc 60
gaggaggagg accacgtctt ggtgctgcgg aaaagcaact tcgcggaggc gctggcggcc 120
cacaagtacc cgccggtgga gttccatgcc ccctggtgtg gccactgcaa ggctctggcc 180
cctgagtatg ccaaagccgc tgggaagctg aaggcagaag gttccgagat caggttggcc 240
aaggtggacg ccacggagga gtctgaccta gcccagcagt acggcgtgcg cggctatccc 300
accatcaagt tcttcaggaa tggagacacg gcttccccca aggaatatac agctggcaga 360
gaggctgatg acatcgtgaa ctggctgaag aagcgcacgg gcccggctgc caccaccctg 420
cctgacggcg cagctgcaga gtccttggtg gagtccagcg aggtggccgt catcggcttc 480
ttcaaggacg tggagtcgga ctctgccaag cagtttttgc aggcagcaga ggccatcgat 540
gacataccat ttgggatcac ttccaacagt gacgtgttct ccaaatacca gctcgacaaa 600
gatggggttg tcctctttaa gaagtttgat gaaggccgga acaactttga aggggaggtc 660
accaaggaga acctgctgga ctttatcaaa cacaaccagc tgccccttgt catcgagttc 720
accgagcaga cagccccgaa gatttttgga ggtgaaatca agactcacat cctgctgttc 780
ttgcccaaga gtgtgtctga ctatgacggc aaactgagca acttcaaaac agcagccgag 840
agcttcaagg gcaagatcct gttcatcttc atcgacagcg accacaccga caaccagcgc 900
atcctcgagt tctttggcct gaagaaggaa gagtgcccgg ccgtgcgcct catcaccttg 960
gaggaggaga tgaccaagta caagcccgaa tcggaggagc tgacggcaga gaggatcaca 1020
gagttctgcc accgcttcct ggagggcaaa atcaagcccc acctgatgag ccaggagctg 1080
ccggaggact gggacaagca gcctgtcaag gtgcttgttg ggaagaactt tgaagacgtg 1140
gcttttgatg agaaaaaaaa cgtctttgtg gagttctatg ccccatggtg tggtcactgc 1200
aaacagttgg ctcccatttg ggataaactg ggagagacgt acaaggacca tgagaacatc 1260
gtcatcgcca agatggactc gactgccaac gaggtggagg ccgtcaaagt gcacggcttc 1320
cccacactcg ggttctttcc tgccagtgcc gacaggacgg tcattgatta caacggggaa 1380
cgcacgctgg atggttttaa gaaattccta gagagcggtg gccaagatgg ggcaggggat 1440
gttgacgacc tcgaggacct cgaagaagca gaggagccag acatggagga agacgatgac 1500
cagaaagctgtgaaagatgaactgtaa 1527
Claims (2)
1.一种制备重组几丁质酶的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)根据几丁质酶基因CH的全长序列设计引物，在CH基因序列的5`末端增加HIS标签序列HIS6，再将CH基因序列加HIS标签序列的基因克隆进入pET-21b载体；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并连接到CH基因的3`末端；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，这样即重组成表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI，相应表达出的重组蛋白为HIS6-CH-pp-PDI；
(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-21b-HIS6-CH-pp-PDI转化至大肠杆菌Rosseta，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；
(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0-8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出CH蛋白，得到含有重组几丁质酶的溶液；
(4)将含有重组几丁质酶的溶液进行纯化处理，得到含有重组几丁质酶的精品。
2.根据权利要求1所述的一种制备重组几丁质酶的方法，其特征是步骤(4)中对含有重组几丁质酶的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶液的PH值为7.0-8.0，然后上镍离子亲和柱，用Tris缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，即得到重组几丁质酶的精品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910075164XA CN101775405B (zh) | 2009-08-14 | 2009-08-14 | 一种制备重组几丁质酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910075164XA CN101775405B (zh) | 2009-08-14 | 2009-08-14 | 一种制备重组几丁质酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101775405A CN101775405A (zh) | 2010-07-14 |
| CN101775405B true CN101775405B (zh) | 2012-04-25 |
Family
ID=42511991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910075164XA Active CN101775405B (zh) | 2009-08-14 | 2009-08-14 | 一种制备重组几丁质酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101775405B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178473A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-12-03 | 江苏省农业科学院 | 新型杂合几丁质酶的创制 |
| CN106434682A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-02-22 | 奥普金生物科技（深圳）有限公司 | 类几丁质酶基因序列、ykl‑40蛋白及制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1193352A (zh) * | 1995-06-07 | 1998-09-16 | 阿姆斯特丹大学 | 人几丁质酶,其重组生产,其分解几丁质的用途及其在治疗和预防感染性疾病中的应用 |
| CN100999718A (zh) * | 2006-07-06 | 2007-07-18 | 湖南师范大学 | 几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌 |
-
2009
- 2009-08-14 CN CN200910075164XA patent/CN101775405B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1193352A (zh) * | 1995-06-07 | 1998-09-16 | 阿姆斯特丹大学 | 人几丁质酶,其重组生产,其分解几丁质的用途及其在治疗和预防感染性疾病中的应用 |
| CN100999718A (zh) * | 2006-07-06 | 2007-07-18 | 湖南师范大学 | 几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101775405A (zh) | 2010-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103122027B (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 | |
| Huang et al. | A highly acid-stable and thermostable endo-β-glucanase from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus | |
| CN102994407B (zh) | 黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用 | |
| CN109182360B (zh) | 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用 | |
| CN109439642A (zh) | 糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法 | |
| CN102703368A (zh) | 一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用 | |
| CN101353659B (zh) | 制备可溶高活性重组人表皮生长因子的方法 | |
| CN102943068A (zh) | 甘露聚糖酶Man23及其基因改造 | |
| CN102676561B (zh) | 一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法 | |
| CN101775405B (zh) | 一种制备重组几丁质酶的方法 | |
| JP6340647B2 (ja) | 超耐熱性セロビオハイドロラーゼ | |
| CN109207497B (zh) | 纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用 | |
| CN102260698B (zh) | 大肠杆菌中表达PTA-linker-thanatin融合蛋白及其抗癌研究 | |
| CN102864115B (zh) | 一种产角蛋白酶大肠杆菌基因工程菌及其应用 | |
| CN103045575B (zh) | 一种重组l-阿拉伯糖异构酶及其基因和应用 | |
| CN102898512B (zh) | 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途 | |
| CN105018407A (zh) | 一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN110229220A (zh) | 一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统及其构建方法和应用 | |
| CN104480027A (zh) | 一种高产蛋白酶k的黑曲霉菌株及其应用 | |
| CN104651337A (zh) | 一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用 | |
| CN105755030B (zh) | 一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法 | |
| CN104087604A (zh) | 一种菊糖果糖转移酶基因表达序列 | |
| CN1995343B (zh) | 制备可溶高活性重组纳豆激酶的方法 | |
| US9677059B2 (en) | Endoglucanases with improved properties | |
| CN104480137A (zh) | 一种利用重组钝齿棒杆菌生产黑色素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YI XIANG Free format text: FORMER OWNER: YANG XIA Effective date: 20121206 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yi Xiang Inventor before: Yang Xia |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: YANG XIA TO: YI XIANG Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 030001 TAIYUAN, SHAANXI PROVINCE TO: 518029 SHENZHEN, GUANGDONG PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20121206 Address after: 518029 Guangdong city of Shenzhen province Luohu District Garbotax garden treasure Xiangge 24C Patentee after: Yi Xiang Address before: 030001, room 3, 59 Ankang street, 102 Kangle West Street, Shanxi, Taiyuan Patentee before: Yang Xia |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HEBEI WOPAI GENE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YI XIANG Effective date: 20130820 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 518029 SHENZHEN, GUANGDONG PROVINCE TO: 437100 XIANNING, HUBEI PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130820 Address after: 437100 Changjiang Industrial Park, Xianning Economic Development Zone, Hubei Patentee after: Hubei fertility gene biological Polytron Technologies Inc Address before: 518029 Guangdong city of Shenzhen province Luohu District Garbotax garden treasure Xiangge 24C Patentee before: Yi Xiang |