CN104651337A - 一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用。一种编码所述木聚糖酶的木聚糖酶基因xyn-lxy，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。发明人通过设计引物成功将其克隆，并在原核表达系统中成功表达，经诱导超声纯化所得的产物与山毛榉木聚糖反应，酶解产物液相色谱分析结果显示，反应96h后，产物只有木二糖和木糖。在反应开始时有木三糖出现，但反应至4h时完全被降解，木二糖和木糖的酶解效率最后稳定在0.25100mg/U和0.07559 mg/U。Xyn-LXY木聚糖酶的水解产物主要是木二糖，且产量高，在工业上非常适合作为功能性保健品开发的工具。

Description

一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶、其编码基因xyn-lxy及其应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，在自然界含量丰富，无论在人类日常饮食中还是在畜禽日粮组成上，植物性纤维都占据了相当大的比例。但是人体以及单胃动物消化道内缺少降解半纤维素的酶，无法对木聚糖进行有效的降解，因而增加了消化道食糜的黏性，干扰小肠绒毛对营养物质的吸收和利用。反刍动物瘤胃内含有大量的微生物，对木聚糖具有一定的降解能力，是获取新型木聚糖酶的重要发掘源。目前已经从瘤胃内分离获得大量编码木聚糖酶基因的微生物，但是只有活性高、稳定性好的木聚糖酶应用到工业生产中，以达到提高饲料转化率和改善动物生长性能的目的。而近年来的研究发现，木聚糖酶的水解产物——低聚木糖对人体健康有着重要的意义，在消化道内可激发双歧杆菌和乳酸菌大量增殖，抑制肠道腐败菌的生长，改善肠道微生态环境，从而增强机体的免疫力。除此之外，低聚木糖还具有的难消化、热量低的特性，在机体代谢过程中不易转成脂肪和胆固醇，降低了心脑血管疾病突发的可能性。因此低聚木糖在功能性保健品的应用上具有较大的开发空间。

通常木聚糖酶的水解产物含有木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，木糖的产量决定了木聚糖酶是否具有生产低聚木糖的开发价值，液相色谱法能够利用物质在载体和固定相中分配系数的差别来将其高效、高速分离，这为检测木聚糖酶水解产物和测定酶解效率提供了保障，能准确评估木聚糖酶在功能性保健品行业中应用前景。由于酶解产物的多样性及木糖产量原因，目前市场上还没有专门生产低聚木糖的酶(系)供应。因此，寻找活性良好、低聚木糖产量高的木聚糖酶基因尤为重要。

发明内容

本发明提供一种木聚糖酶基因，其原核表达后水解产物只有木二糖和木糖，较为单一，且木二糖的产量高，能降工业生产的成本。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种编码所述木聚糖酶的木聚糖酶基因xyn-lxy，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明木聚糖酶基因xyn-lxy克隆自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库，具有高效产功能性低聚木糖功能。高效液相色谱检测其酶解产物主要是木二糖和木糖，未检测到其它低聚木糖，其中木二糖的酶解效率每U可生产0.25100mg，是木糖产率的3.33倍，产物单一、木二糖产率高是该酶的优势。

一种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重组载体。

一种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的转基因细胞系。

一种包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重组菌。

一种制备木聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到木聚糖酶。

一种所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。

扩增所述木聚糖酶基因xyn-lxy采用的特异性引物为：LXY-F：5’CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，LXY-R：5’CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTT ACCAA 3’，其核苷酸序列如SEQ IDNo.4。

本发明所述木聚糖酶基因xyn-lxy的获取方法如下：

a、木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重组质粒pET-30a/xyn-lxy的构建；

b、重组质粒pET-30a/xyn-lxy在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达；

c、重组蛋白Xyn-LXY的诱导、纯化及酶学特性分析；

d、重组酶Xyn-LXY水解产物高效液相色谱分析。

作为优选，步骤a木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重组质粒pET-30a/xyn-lxy的构建过程具体如下：

①PCR扩增木聚糖酶编码基因xyn-lxy；

②限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-30a；

③构成重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

本发明所克隆的基因来自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库，保证基因的新颖性。本发明进行PCR扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产物特异性；本发明进行了酶的定量分析并将酶解时间延长至96h，能准确计算出酶解效率和生产低聚木糖的最佳时间。

本发明的木聚糖酶96h水解产物只有木二糖和木糖，产物较单一，木二糖产量高，生产功能性低聚木糖具有优势；该木聚糖酶反应速率快，仅需2h可使低聚木糖的生产效率达到最高。

附图说明

图1是xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表达策略；

图2是克隆xyn-lxy PCR产物；

图3是重组蛋白Xyn-LXY的SDS-PAGE分析图；

图4是重组蛋白Xyn-LXY的Western Blot鉴定；

图5是pH对Xyn-LXY酶活性的影响；

图6是Xyn-LXY酶的pH稳定性；

图7是温度对Xyn-LXY酶活性的影响；

图8是Xyn-LXY酶的热稳定性；

图9是木糖及标准低聚木糖的HPLC图谱；

图10是Xyn-LXY酶解产物液相分析。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一、xyn-lxy基因的克隆及重组质粒pET-30a/xyn-lxy的构建

xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表达策略如图1所示，方法如下：

①设计含有EcoRⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点的引物:

LXY-F：5’CCGGAATTC ATGATCTTCGCCCAGTGCGG 3’，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

LXY-R：5’CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTTACCAA 3’，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

②PCR扩增Fosmid文库中含xyn-lxy基因的阳性质粒，扩增体系如下：

涡旋振荡混匀，稍离心后放入PCR仪中。xyn-lxy基因的扩增条件如下：

PCR结果见图2，扩增得到1923bp的条带，泳道中无其它杂带出现，说明设计引物的特异性良好。

③目的基因质粒与pET-30a载体双酶切

混匀后37℃酶切过夜。酶切结束后清洗回收。

④目的基因与pET-30a载体连接

20μl体系，目的基因与表达载体摩尔比为7:1，4℃过夜连接。

二、重组质粒在大肠杆菌中的表达

热激转化  取10μl连接产物与大肠杆菌感受态BL21(DE3)小心混匀，冰浴30min；42℃水浴热激60s，立即取出冰浴2-3min；加入890μl 37℃预热的SOC溶液，150rpm恒温培养1h；吸取60μl转化后的菌液，涂布于含卡那霉素筛选培养基中，37℃恒温培养12-16h；挑取菌斑进行菌液PCR鉴定，确认为阳性的克隆子转接到含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养。

三、阳性菌株的诱导、纯化及酶学特性分析

①阳性菌株的诱导

吸取10μl阳性菌液转接至5mL含卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，226rpm培养12-14h。

将5mL菌液转接至100mL LB液体培养基中，37℃，226rpm继续培养至OD＝0.5-1.0(大约8小时)。

加入100μl IPTG(终浓度1mmol/L)，25℃，150rpm低温诱导培养10-12h。

将诱导表达的菌液转移至50mL离心管中，12000rpm，4℃离心15min，弃掉上清，加入20mL PBS缓冲液(pH7.4)充分重悬菌体。

放入至盛有冰块的烧杯中，超声波反复破碎2次(每次超声15min，工作时间3s，间歇时间5s，6号变幅杆，破碎功率195W)。

破碎菌液12000rpm，4℃离心15min，所得上清为粗蛋白液，立即使用或4℃保存。

②目的蛋白亲和层析

取20mL上步所获得的粗蛋白液，加入400μl的1mol/L咪唑(终浓度为15mmol/L)，充分混匀后，加入Ni-NTA树脂填料700mL，水平放置于冰上缓慢振荡1h，使镍离子与目的蛋白上的6×His标签充分结合。

将粗蛋白与Ni-NTA树脂混合液转移到层析柱子，反复上柱收集穿透液(flow-through)，记为FT。

待混合蛋白样液液面接近Ni-NTA树脂填料时，用20倍柱床体积(20mL)的Washing buffer 1(含20mmol/L咪唑)洗涤柱子，除去杂蛋白，用1.5mL离心管收集清洗液，重复操作一次，分别记为W1、W2。

用2倍柱床体积(2mL)的washing buffer 2(含50mmol/L咪唑)涤柱子，用1.5mL离心管收集清洗液，记为W3。

Washing buffer洗涤后，用1个柱床体积(1mL)的Elution buffer(含250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，洗脱4次，用1.5mL离心管收集洗脱液，记为E1、E2、E3、E4。

将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析(图3)，在97kDa和37kDa出有条带，经western blot鉴定(图4)，97kDa出现的蛋白为目的蛋白，说明pET-30a/xyn-lxy重组质粒在原核中表达后，蛋白质分子量为97kDa。

③酶学特性分析

木聚糖酶活力单位定义：每分钟产生1μmol还原糖的酶量为1个活力单位(U)，计算公式：

A:产生还原糖的浓度(μmol/mL)，

K:纯酶稀释倍数，

T:酶解反应时间(min)，

C:纯酶蛋白浓度(mg/mL)。

pH对酶活性的影响

最适pH:分别采用pH 3.0-10.0的缓冲液(其中pH 3.0-8.0采用McIlvaine’s缓冲液，pH 8.0-9.0采用Tris-HCl缓冲液，pH9.0-10.0采用glycine-NaOH缓冲液)配置1％木聚糖反应底物，在50℃条件下测定相对活性，结果显示(图5)：重组酶Xyn-LXY的最适pH为6.0，为瘤胃环境pH范围。

pH稳定性：将木聚糖酶分别在pH 3.0-10.0、37℃条件下孵育30min，然后在最适条件下检测酶活。以未处理的木聚糖酶在最适条件下的酶活为对照，计算残余木聚糖酶的相对活性，结果显示(图6)：重组酶Xyn-LXY在pH 6-7环境中孵育30min依然能保持80％以上的活性，在强酸和强碱环境下稳定性不佳。

温度对酶活的影响

最适温度：用最适pH缓冲液配制1％木聚糖底物，采用DNS法分别测定木聚糖酶在30℃-90℃时的，计算相对活性，结果显示(图7)：重组酶Xyn-LXY的最适反应温度为50℃，但在热稳定性结果中，重组酶Xyn-LXY在50℃环境下酶活活力已不足20％，重新测得在45℃温度下酶活力高于50℃，因此重组酶Xyn-LXY的最适反应温度为45℃。

热稳定性：在最适pH、30℃-90℃条件下分别保温30min，在最适条件下测定酶活。以未处理的木聚糖酶在最适条件下的酶活为对照，计算残余木聚糖酶的相对活性，结果显示(图8)：Xyn-LXY为嗜低温酶，热稳定新不佳，温度高于50℃时，活性不足20％。

四、木聚糖酶水解产物液相色谱分析(HPLC)

①木糖及低聚木糖标准品保留时间和浓度方程

分别称取一定量的木糖、木二糖、木三糖、木四糖标准品溶解在适量的ddH2O配置20mg/mL混合母液，依次稀释成10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.1mg/mL混合标品，0.22μm滤膜过滤。逐一进行高效液相色谱(HPLC)分析，进样量为10μl，图9为标准品的保留时间、标准品的浓度与峰面积之间的方程。

②高效液相色谱分析条件

流动相为50mg/L的EDTA钙盐，柱温为80℃，流速0.3mL/min。木糖至木四糖保留时间分别为19.871min、16.128min、13.836min和12.370min。将不同浓度的混合标样分别进样，以峰面积为横坐标(x)，糖浓度为纵坐标(y)作线性回归，得到各糖组分浓度的标准曲线方程和相关系数见表1。

表1木糖及标准木寡糖浓度方程

③水解产物的测定

取80U Xyn-LXY纯酶与1％山毛榉木聚糖混合，45℃水浴中作用96h，分别在0、5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和96h取样。所取样品置于100℃水浴10min，迅速置于冰上。12，000rpm，4℃，离心15min，0.22μm滤膜过滤，取上清进行HPLC分析，进样量为10μl，液相结果见图10。

本发明的具有高效产功能性低聚木糖的新型木聚糖酶基因Xyn-LXY成功克隆表达后，水解产物高效液相色谱分析结果显示，在水解反应的初始阶段，低聚木糖产量迅速上升，5min后，木二糖和木三糖的产率迅速增高，且木三糖的产量达到最高值(0.06978mg/U)，反应至4h，木二糖和木糖的产量达到峰值(0.22970mg/U和0.06558mg/U)，而木三糖的产量下降。在随后的反应时间中，木二糖和木糖的产量先下降后升高，96h后木二糖和木糖最终分别稳定在0.25100mg/U和0.07559mg/U，木二糖的产率是木糖产率的3.33倍，而木三糖最终消失。从图10中可知，生产低聚木糖的最佳时间为反应第2h，可保证低聚木糖生产效率最高。

以上所述的实施例是本发明挖掘基因和液相分析水解产物的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江大学

 

<120>  一种木聚糖酶、其编码基因Xyn-LXY及其应用

 

<130>  ZD002

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1923

<212>  DNA

<213>  木聚糖酶基因Xyn-LXY

 

<400>  1

atgaagaaga aactgacgag aatcttcgcg gccggactcg gccttacgat gatcttcgcc     60

 

cagtgcggct gcaaggccgg cacaccgggc cagaccggcg caagcaatgc gcctgatgcg    120

 

gttcagaccg atattcccga cctttgcaag acagtggcaa gcaaagacgg tcttggagag    180

 

gatgcgatcg tcggcacatg ttacggcgat gatgagatca gcgatgccaa gctgatgcag    240

 

cttgtaacca agcatttcaa cgcggtcacg cttgagaatg aactcaagcc tgagaccatg    300

 

ttcggcaaca gcaatgccgc tcctgcttct gacagtatcc ataaggaaga gctgggcggc    360

 

gaacagatcg acgttcccac acttagttat gcaagggcag acaagatgct tgaccagatt    420

 

gtggagtgga acagcaagaa ccctgatcac aagatcaggg tcagaggcca cgtcctcgta    480

 

tggcactccc agacgcccga gtggttcttc catgaaggtt acgacaagag caaggattat    540

 

gtctccaaag atgagatgaa caagcgtctt gaatggtata tcaagacggt ccttacatac    600

 

tacacgggcg atcagagcaa gtataaggat ctcttctacg gtttcgacgt agttaacgaa    660

 

gctatcagcg atgcttccgc cacataccgt acggacaccg agcagggcgg tgataatctc    720

 

acggatgaca cgcacagctc aaagtccagc tggtggaagg tttacggaag caacgagtac    780

 

atcatcaacg cgttcaggtt tgccaacaag tacgctcctg cttctctcga actctattac    840

 

aacgattaca acgagtgcga tgctaaaaag cgcggcggca taatccagct catcaatgat    900

 

gtaaaggctg ccgagggcac caggatcacc ggcttcggaa tgcagggaca ctacggagta    960

 

aattcccctt cggtcacgca gtttgaagaa gctgccaagg aatatgccaa acatgtagaa   1020

 

aaggtcatgc ttaccgagct ggatctcaag ccgagcgcaa cattcgacgg ttccgaggcg   1080

 

aagctcgccg atgaactcaa ccgtgaaggc gactatttcg cacgccttta tgagacttct   1140

 

aagaacctca aaaagggcgg tgttaacttc tgcggaatta ctctctgggg agttatagat   1200

 

tccaactcat ggcttcagag cgcgaataac gtcggaggcg cttcagacgg caagatgaag   1260

 

gtcttcccgc tccttttcga cgaaaaatat caggccaagc tcacgtactg ggcgttcgtt   1320

 

gatccttcaa agatcgagcc cgttgatgcg ctcaagagac ctacgatgga gatcactcag   1380

 

ggcagcgtaa acatcgatgg cgagatagac gaagcatgga ataaggtgca ggccgtaaag   1440

 

cttgagatcg tcgtccagag cgttgccgta acctgtgatg ccaagcttct ctgggacaaa   1500

 

gaatatcttt atgtcccgat ggatgtaaag gacaaggatc tcaacgataa gagctccgat   1560

 

gaatggcagc aggattccat tgaagtcttc atcgatgaag accacaagaa gcctgaagcc   1620

 

tatgcccccg atgacaagca gtacagggtc aactacaaga acaagctgag cttcaacggt   1680

 

gagaagtgca aggcggaaaa catgaaatcg gctgccaaga tcactgacgg cggatatctc   1740

 

gtcgaggcat gcttcaagtg gaccgacatc acgcctgaag cgggcaagac ggtcatcgga   1800

 

cttgaactcc aggtcaacga tgcgacatcc gcaggttccc gcaccggaac gctcagctgg   1860

 

gcagatgata ccggaacggg atacatgaac ccttccgtac ttggtaacgc caagctggta   1920

 

taa                                                                 1923

 

 

<210>  2

<211>  640

<212>  PRT

<213>  木聚糖酶

 

<400>  2

 

Met Lys Lys Lys Leu Thr Arg Ile Phe Ala Ala Gly Leu Gly Leu Thr

1               5                   10                  15     

 

 

Met Ile Phe Ala Gln Cys Gly Cys Lys Ala Gly Thr Pro Gly Gln Thr

            20                  25                  30         

 

 

Gly Ala Ser Asn Ala Pro Asp Ala Val Gln Thr Asp Ile Pro Asp Leu

        35                  40                  45             

 

 

Cys Lys Thr Val Ala Ser Lys Asp Gly Leu Gly Glu Asp Ala Ile Val

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Thr Cys Tyr Gly Asp Asp Glu Ile Ser Asp Ala Lys Leu Met Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Val Thr Lys His Phe Asn Ala Val Thr Leu Glu Asn Glu Leu Lys

                85                  90                  95     

 

 

Pro Glu Thr Met Phe Gly Asn Ser Asn Ala Ala Pro Ala Ser Asp Ser

            100                 105                 110        

 

 

Ile His Lys Glu Glu Leu Gly Gly Glu Gln Ile Asp Val Pro Thr Leu

        115                 120                 125            

 

 

Ser Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Met Leu Asp Gln Ile Val Glu Trp Asn

    130                 135                 140                

 

 

Ser Lys Asn Pro Asp His Lys Ile Arg Val Arg Gly His Val Leu Val

145                 150                 155                 160

 

 

Trp His Ser Gln Thr Pro Glu Trp Phe Phe His Glu Gly Tyr Asp Lys

                165                 170                 175    

 

 

Ser Lys Asp Tyr Val Ser Lys Asp Glu Met Asn Lys Arg Leu Glu Trp

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Ile Lys Thr Val Leu Thr Tyr Tyr Thr Gly Asp Gln Ser Lys Tyr

        195                 200                 205            

 

 

Lys Asp Leu Phe Tyr Gly Phe Asp Val Val Asn Glu Ala Ile Ser Asp

    210                 215                 220                

 

 

Ala Ser Ala Thr Tyr Arg Thr Asp Thr Glu Gln Gly Gly Asp Asn Leu

225                 230                 235                 240

 

 

Thr Asp Asp Thr His Ser Ser Lys Ser Ser Trp Trp Lys Val Tyr Gly

                245                 250                 255    

 

 

Ser Asn Glu Tyr Ile Ile Asn Ala Phe Arg Phe Ala Asn Lys Tyr Ala

            260                 265                 270        

 

 

Pro Ala Ser Leu Glu Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu Cys Asp Ala

        275                 280                 285            

 

 

Lys Lys Arg Gly Gly Ile Ile Gln Leu Ile Asn Asp Val Lys Ala Ala

    290                 295                 300                

 

 

Glu Gly Thr Arg Ile Thr Gly Phe Gly Met Gln Gly His Tyr Gly Val

305                 310                 315                 320

 

 

Asn Ser Pro Ser Val Thr Gln Phe Glu Glu Ala Ala Lys Glu Tyr Ala

                325                 330                 335    

 

 

Lys His Val Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Leu Asp Leu Lys Pro Ser

            340                 345                 350        

 

 

Ala Thr Phe Asp Gly Ser Glu Ala Lys Leu Ala Asp Glu Leu Asn Arg

        355                 360                 365            

 

 

Glu Gly Asp Tyr Phe Ala Arg Leu Tyr Glu Thr Ser Lys Asn Leu Lys

    370                 375                 380                

 

 

Lys Gly Gly Val Asn Phe Cys Gly Ile Thr Leu Trp Gly Val Ile Asp

385                 390                 395                 400

 

 

Ser Asn Ser Trp Leu Gln Ser Ala Asn Asn Val Gly Gly Ala Ser Asp

                405                 410                 415    

 

 

Gly Lys Met Lys Val Phe Pro Leu Leu Phe Asp Glu Lys Tyr Gln Ala

            420                 425                 430        

 

 

Lys Leu Thr Tyr Trp Ala Phe Val Asp Pro Ser Lys Ile Glu Pro Val

        435                 440                 445             

 

 

Asp Ala Leu Lys Arg Pro Thr Met Glu Ile Thr Gln Gly Ser Val Asn

    450                 455                 460                

 

 

Ile Asp Gly Glu Ile Asp Glu Ala Trp Asn Lys Val Gln Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

 

 

Leu Glu Ile Val Val Gln Ser Val Ala Val Thr Cys Asp Ala Lys Leu

                485                 490                 495    

 

 

Leu Trp Asp Lys Glu Tyr Leu Tyr Val Pro Met Asp Val Lys Asp Lys

            500                 505                 510        

 

 

Asp Leu Asn Asp Lys Ser Ser Asp Glu Trp Gln Gln Asp Ser Ile Glu

        515                 520                 525            

 

 

Val Phe Ile Asp Glu Asp His Lys Lys Pro Glu Ala Tyr Ala Pro Asp

    530                 535                 540                

 

 

Asp Lys Gln Tyr Arg Val Asn Tyr Lys Asn Lys Leu Ser Phe Asn Gly

545                 550                 555                 560

 

 

Glu Lys Cys Lys Ala Glu Asn Met Lys Ser Ala Ala Lys Ile Thr Asp

                565                 570                 575    

 

 

Gly Gly Tyr Leu Val Glu Ala Cys Phe Lys Trp Thr Asp Ile Thr Pro

            580                 585                 590        

 

 

Glu Ala Gly Lys Thr Val Ile Gly Leu Glu Leu Gln Val Asn Asp Ala

        595                 600                 605            

 

 

Thr Ser Ala Gly Ser Arg Thr Gly Thr Leu Ser Trp Ala Asp Asp Thr

    610                 615                 620                

 

 

Gly Thr Gly Tyr Met Asn Pro Ser Val Leu Gly Asn Ala Lys Leu Val

625                 630                 635                 640

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  LXY-F

 

<400>  3

ccggaattca tgaagaagaa actgacgag                                       29

 

 

<210>  4

<211>  32

<212>  DNA

<213>  LXY-R

 

<400>  4

ccgctcgagt tataccagct tggcgttacc aa                                   32

 

Claims (8)

1.一种木聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。

2.一种编码权利要求1所述木聚糖酶的木聚糖酶基因Xyn-LXY，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

3. 一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的转基因细胞系。

5.一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的重组菌。

6.一种制备木聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求5所述的重组菌，得到木聚糖酶。

7.一种权利要求5所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。

8.  扩增权利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY采用的特异性引物为：LXY-F：5’ CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG 3’ ，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

LXY-R： 5’CCGCTCGAG TTATACCAGCTTGGCGTT ACCAA 3’  ，其核苷酸序列如SEQ ID No.4。