CN102051350B - 一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程领域，提供了一种新型具有耐低温，并且有β-D-木苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的双功能酶RuXyn1。RuXyn1的氨基酸编码序列如SEQID NO 2所示，其核苷酸编码序列如SEQID NO 1所示。RuXyn1可以采用基因工程方法或者人工合成方法制备。RuXyn1不仅有阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的功能，而且能够在低温的环境下保持较高的活性，可用于纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面等应用领域。

Description

一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明属生物工程领域，涉及一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用。本发明还涉及该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的重组表达质粒和重组基因工程菌株。

背景技术

木质纤维素是自然界中丰富的可再生能源，由四种主要成份：纤维素(～33-51％)，半纤维素(～19-34％)，果胶(～2-20％)以及木质素(～20-30％)。木质纤维素降解产生可发酵的己糖(hexose)(葡萄糖，36～50％；甘露糖，0.3～12％；半乳糖，0.1～2.4％)和戊糖(pentose)(木糖，3.4～23％；阿拉伯糖，1.1～4.5％)。半纤维素的骨架结构是由β-1，4木聚糖，而木聚糖的降解酶主要由内切β-1，4-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和β-1，4-木糖苷酶(β-1，4-xylosidase，EC3.2.1.37)完成，。人们对木聚糖酶进行了系统的研究，但β-木糖苷酶却未得到足够重视。β-木糖苷酶是一种外切酶，以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。β-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分离得到。β-木糖苷酶是木聚糖降解的关键酶之一，有着重要的工业应用价值。在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶系转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在医药行业中，木聚糖酶系水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。例如，1998年Patel等人利用Moraxella.sp β-木糖苷酶水解10-去乙酰巴卡亭III木糖苷和10-去乙酰紫杉醇木糖苷7位木糖残基，得到重要的中间产物10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇，为紫杉醇的合成开辟了一条崭新的途径(AnnuRev Microbiol 52：95-361，1998)。

L-阿拉伯糖属于五碳醛糖，以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖体及类似于高等植物半纤维的形式存在。L-阿拉伯糖是一种没有热量的甜料，能抑制水解双糖的酶，抑制因摄入蔗糖而导致的血糖升高，因此可以抑制肥胖、预防并治疗与高血糖相关的疾病，已被美国食品药品监督局和日本厚生省批准列入健康食品添加剂。L-阿拉伯糖还可以用作医药中间体、用于生化领域中细菌培养基的制备以及香料合成等(化学与生物工程23：50-52，2006)。此外，L-阿拉伯糖可用于合成核苷类似物等抗病毒药物，治疗白血病、癌症的化疗药物等，据了解目前全球共有5种进入三期临床试验的抗乙肝新药，其中两种采用L-阿拉伯糖为原料(Antivir Ther.3：113-121，1998；Tetrahedron 65：1937-1949，2009)。L-阿拉伯糖的工业提取方法一般是采用碱提取植物中的半纤维素，然后酸水解工艺成本高，环境污染严重。因此，高效、节能、环保的生物转化方法生产L-阿拉伯糖成对我国的生物能源产业和功能糖产业都有非常重大的意义。随着国外对β-木糖苷酶的研究已日趋深入，发现一些β-木糖苷酶活还具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性，即双重活性。而国内相关研究仍然报道甚少，仅薛业敏等从嗜热厌氧菌Thermoanaerobacter ethanolicus中克隆到具有这一性质的酶Xar(食品与发酵工业29：22-26，2003)。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的具有木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能的糖苷水解酶。

本发明的另一目的是提供该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的制备方法。

本发明的再一目的是提供该木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的应用。

本发明提供了一种木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。它的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了含有所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列的重组载体，该重组载体包括扩增载体和表达载体等。表达载体可以是例如大肠杆菌表达载体、酿酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体等常规表达载体。本发明还提供了含有上述的重组载体的重组菌株，该菌株的宿主细胞可以是大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、丝状真菌、昆虫或者哺乳动物细胞中等。

本发明的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能的糖苷水解酶，来源于中国牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.2所示的成熟氨基酸序列。该酶属于糖基水解酶43家族(Glycoside hydrolase family 43，GH43)，具有木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶双重功能，并且在低温条件下保持高催化活性。

本发明中，木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶是指同时具备木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽，简称为RuXyn1。该术语还包括同时具备木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括与SEQ ID NO.2的氨基酸序列的同源性达到80％及以上的序列。

本发明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶，它的核苷酸编码序列可以如SEQ ID NO.1所示。

本发明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列只是编码具备木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列，例如SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，SEQ ID NO.1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

本发明提供了核酸构建体，其包含与一个或多个可操作调控序列连接的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的特征的核酸序列，所述调控序列能指导木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶在合适表达宿主中表达。本发明的核酸构建体优先地包含大肠杆菌重组载体，也包括，如酿酒酵母表达载体，毕赤酵母表达载体，枯草芽孢杆菌表达载体，乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体。

本发明提供了重组宿主细胞，其包含木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的特征核酸序列核酸构建体，本发明的宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。在优选的实施方式中，细菌宿主细胞为细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞或者链霉菌属细胞；或者革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌属和假单胞菌属菌种。

本发明宿主细胞可为真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞为真菌细胞，如子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)和结合菌门(Zygomycota)，以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌。在更优选的实施方案中，所述真菌宿主细胞是酵母细胞，包括产子囊酵母(Ascosporogenours)、产担子酵母(Basidiosporogenous)和半知菌类(Fungi Imperfcti)酵母。

上述重组载体和基因工程菌株可以采用本领域常规的技术手段和操作方法制备。

另一方面，本发明提供了所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的制备方法，包括培养重组菌株和分离目标蛋白，依次包括以下步骤：

(1)利用引物进行聚合酶反应扩增，获得权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列，构建木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶重组表达载体；

(2)将重组表达载体导入表达宿主细胞，在重组菌体表达木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶；

(3)分离回收木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶。

上述重组载体和基因工程菌株可以采用本领域常规的技术手段和操作方法制备。本发明的制备本发明木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的方法，还可以包括中国牦牛瘤胃微生物宏基因组文库构建及筛选。

中国牦牛瘤胃微生物宏基因组文库构建及筛选的具体方法是：取青海牦牛的瘤胃内容物，构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库；筛选具有β-木糖苷酶活性的阳性克隆。β-木苷酶的文库筛选采用荧光底物4-甲基伞形酮β-D-1，4-木糖苷作为底物。将96孔板微量培养的细胞冻融破碎后加入10μl的1mg/ml 4-甲基伞形酮β-D-1，4-木糖苷的底物(50mM citrate-phosphate pH4.8)，37℃反应30分钟后加入30μl 1M Na₂CO₃，紫外下呈现荧光即为具有β-木糖苷酶活性的阳性克隆。

本发明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶也可以按照SEQ ID NO.2所示序列人工合成。

本发明提供了所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶在降解纤维素反应中的应用，例如在饲料组合物的制备、半纤维素或阿拉伯木聚糖的糖化或乙醇生产方面的用途。

本发明的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能的糖苷水解酶，具有木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶双重功能，并且在低温条件下保持高催化活性。

木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的性质可用本领域已知的方法进行检测，本发明的实施例中，木糖苷酶底物为对硝基酚-β-D木糖苷(para-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)，阿拉伯糖苷酶底物为对硝基酚-β-D阿拉伯呋喃糖苷(para-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside，pNPA)。

本发明提供的纤维素降解酶的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶，同时具有较高的β-D-木糖苷酶和-α-L-阿拉伯糖苷酶活性。实施实验中显示木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶不仅能显著提高木寡糖的产量，而且能将寡聚木聚糖降解成木糖。

本发明提供的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶与已报报道的木糖苷酶相比，适冷性强，反应温度范围4℃-55℃，最佳的为40℃，随着温度的升高，酶的催化常数kcat逐渐升高，催化常数是指酶在底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。反应pH范围4.0-8.0，最佳的为7.0。

本发明的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶降解半纤维素，条件温和，抑制物少，可应用于各种工业，例如用于生物质转化，如用于由包含生物质的纤维素生产燃料乙醇的过程中，用于淀粉糖化过程，用于饲料组合物中，提高动物对粗纤维的利用率，或用于面包制造面团中。

本发明提供的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶蛋白，不仅有水解α-1，4-L-阿拉伯糖苷键和β-1，4-D-木糖苷键的功能，而且能够在低温的环境下保持较高的活性。本发明提供的新型木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能蛋白可用于纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面等应用领域。

本发明还提供了一种含有木聚糖酶和所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的组合物。

本发明的的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶与木聚糖酶组合，能够更好的降解木聚糖。组合酶能将木聚糖完全降解为单糖木糖，而没有加入RuXyn1的反应液中，木聚糖酶的主要产物是木二糖，并且没有木糖产生。因此，将木聚糖酶和RuXyn1的混合酶降解木聚糖，降解更彻底，能够更高效的利用降解产物。

本发明提供的一种新型适冷的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶。该酶具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，可用于纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业等应用领域。并且，该酶具有低温酶的性质。低温纤维素酶最适作用温度可低至20℃。由于反应温度较低，不但在低温条件下可以高效反应，而且在生产工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活，节约能量与费用，成为人们研究开发的热点。因此，本发明的新型适冷的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶在生物能源，医药等领域具有着重要的应用价值。

附图说明

图1：Ruxyn1大肠杆菌重组表达载体示意图。

图2：琼脂糖电泳检测重组表达载体酶切。M1：DNA ladder；1：重组载体pET21/RuXyn1的EcoR I和Xho I双酶切结果。

图3：重组酶RuXyn1表达、Ni-NTA亲和柱纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图。M2：protein marker；泳道11-14：分别是300mmol、150mmol、100mmol、80mmol的咪唑洗脱收集液。

图4：重组酶RuXyn1的最适反应pH值。

图5：重组酶RuXyn1的最适反应温度。

图6：重组酶RuXyn1的pH值稳定性。本图的纵坐标Ln(relative activity)表示时间t min的活力/0 min的活力比值的自然对数值。

图7：重组酶RuXyn1的米氏常数(Km)-温度曲线。

图8：重组酶RuXyn1的转换常数(k_cat)-温度曲线。纵坐标velocity是速率。

图9：重组酶RuXyn1木糖苷酶对木糖的耐受曲线。本图的纵坐标相对活性(relative activity)值是以0mM的木糖时酶的催化速度为100％。

图10：重组酶RuXyn1阿拉伯糖苷酶对阿拉伯糖的耐受曲线。本图的纵坐标相对活性(relative activity)值是以0mM的阿拉伯糖时酶的催化速度为100％。

图11：重组酶RuXyn1与木聚糖酶组合物降解木聚糖的还原糖产率。纵坐标是还原糖(reducing sugar)。

图12：硅胶板薄层层析检测木聚糖酶解产物。

具体实施方式

实施例1

牦牛瘤胃微生物宏基因组cosmid文库的构建及木糖苷酶的活性筛选

采集中国青海牦牛瘤胃样品，采用3层纱布过滤，滤液离心收集瘤胃微生物菌体，瘤胃微生物宏基因组的提取方法参见An et al.(《Anaerobe》2005年第11卷第207-215页)。瘤胃未培养细菌宏基因组文库的构建方法参照Epicentre公司pWEB::TNC Cosmid Cloning Kit试剂盒产品说明书。抽提的宏基因组DNA经End-Repair Enzyme Mix末端补平，与试剂盒中的去磷酸化的载体pWEB::TNC连接，连接产物用MaxPlax^TM Lambda Packaging Extracts包装后、侵染宿主菌E.coli EPI100，后涂布于LB-ampicillin平板，37℃培养12～16h长出菌落，即为该批样品的宏基因组文库。β-木苷酶的文库筛选采用荧光底物4-甲基伞形酮β-D-1，4-木糖苷作为底物。将96孔板微量培养的细胞冻融破碎后加入10μl的1mg/ml 4-甲基伞形酮β-D-1，4-木糖苷的底物(50mMcitrate-phosphate pH4.8)，37℃反应30分钟后加入30μl 1M Na₂CO₃，紫外下呈现荧光即为具有β-木糖苷酶活性的阳性克隆。

实施例2瘤胃微生物来源的RuBGX1基因的序列的克隆及分析

将筛选到的cosmid阳性文库克隆，在pGEM11z中进行亚克隆、功能筛选并测序分析。具体为：将筛选到的阳性克隆的cosmid质粒用Sau3AI部分酶切为2-5kb片段，连接入经BamHI酶切并去磷酸化的pGEM11z载体中，转化DH5α，以实施例1中描述的方法对亚克隆文库进行功能筛选，得到的亚克隆以T7和SP6通用引物测序，通过分析软件DNAMAN分析β-1，4-木糖苷酶基因的编码区序列，确定其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并命名为RuXyn1。RuXyn1编码332个氨基酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO.2，理论分子量为42kDa。利用SMART软件(http://www.expasy.ch).)对RuXyn1的蛋白结构域进行了分析，结果表明RuXyn1属于糖基水解酶家族43(Glycoside hydrolase family 43)，且RuXyn1的N端氨基酸序列没有疏水性信号肽序列，说明该酶为胞内酶。同源比对利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的blast软件分析，RuXyn1的基因序列比对结果表明与野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的木糖苷酶的同源性最高，核苷酸序列相似度为75％，RuXyn1的蛋白序列比对结果则表明与Bacteroides sp.43家族的xylosidase(ref|ZP_04542936.1|)的同源性最高，相似度达67％，因此，RuXyn1的同源性比对结果说明RuXyn1是一个新型的半纤维素降解酶。

实施例3

RuXyn1基因在大肠杆菌中的重组表达

RuXyn1在大肠杆菌中的重组表达采用6His融合表达策略，选用了大肠杆菌表达载体pET-21a(+)(购自Novagen公司)。具体为：设计合成一组寡核苷酸引物：正向引物21axyn1FE：GGCGAATTC

和反向引物21axyn1FX：CCGCTCGAG

(序列中的以下划线部分分别是限制性内酶EcoRI和XhoI的酶切位点，基因序列以斜体表示)，通过PCR扩增RuXyn1基因，经琼脂糖电泳回收后用EcoRI和XhoI分别酶切后，与EcoRI和XhoI酶切的载体pET-21a(+)连接，构建的RuXyn1重组表达载体示意图如图1所示。连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，得到的转化子利用上述引物进行菌落PCR筛选，获得转化子通过双酶切和测序验证，EcoR I和XhoI酶切结果如图2所示。将测序正确的重组载体(命名为pET21a/RuXyn1)转化大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)进行重组表达。RuXyn1的重组表达与纯化参照pET表达系统使用说明书进行。Ni-NTA亲和柱纯化的重组蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，结果表明最佳洗脱的咪唑浓度范围为80-150mM，获得的蛋白大小为42kD左右，与推断的RuXyn1分子量一致(如图3)。

实施例4

RuXyn1的最适反应条件的分析

木糖苷酶活性的分析以对硝基酚-β-D木糖苷(para-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)为底物，阿拉伯糖苷酶的底物则采用对硝基酚-β-D阿拉伯呋喃糖苷(para-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside，pNPA)。最适反应pH值的测定以2.5mM的pNPX溶解在pH3.5至pH8.0的50mM柠檬酸-磷酸缓冲液中，反应中止条件为加入等体积的1MNa₂CO₃，利用分光光度仪在410nm检测对硝基酚释放量来测定酶的活性。从图4可以发现RuXyn1的最适反应pH值为7.0，且酸性条件下酶的活力较碱性条件稳定，表明该酶属于中性偏酸性的半纤维素酶。最适的木糖苷酶活性温度和最适的阿拉伯糖苷酶活性温度的分析分别以2.5mM pNPX(pH7.0)和2.5mM pNPA(pH7.0)为底物，温度测定范围从4℃-55℃，结果如图5所示，RuXyn1的木糖苷酶活性最适温度为40℃，而阿拉伯糖苷酶活性的最佳活性温度为45℃，并且RuXyn1具有很强的低温耐受性(cold-tolerance)，4℃时仍保留10％左右的活力。

木糖苷酶的酶活单位定义为：指每分钟催化pNPX生成1μmol对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需要的酶量为一个酶活单位(IU)；阿拉伯糖苷酶的酶活单位定义为：指每分钟催化pNPA生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活单位(IU)。以10mM的2.5mM pNPX(pH7.0)和10mM pNPA(pH7.0)分别测定40℃时RuXyn1木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性，结果表明，重组RuXyn1能够催化pNPX生成对硝基苯酚，具备木糖苷酶活性(39.3IU/mg蛋白)；同时，能够催化pNPA生成对硝基苯酚，具备阿拉伯糖苷酶活性(12.9IU/mg蛋白)。

实施例5

RuXyn1的稳定性的分析

RuXyn1的pH稳定性的分析通过分析RuXyn1在不同的pH值下t_1/2(酶活性丧失50％所需的时间)。测定方法：分别将RuXyn1在pH5.0、pH6.0、pH7.0和pH8.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中，40℃处理一定时间后测定RuXyn1残余的木糖苷酶活，以时间为横坐标，相对活力的自然对数(ln)为纵坐标作图，结果如图6所示。t_1/2的计算采用公式为t_1/2＝ln2/k_inact(k_inact为ln相对活力与时间的斜率，通过计算获得pH5.0的t_1/2为49min，pH6.0的t_1/2为99min，pH7.0的t_1/2为173min，pH8.0的t_1/2为34min，说明RuXyn1在中性条件下即pH7.0时最稳定。

实施例6

金属离子及部分化学试剂RuXyn1活性的影响

在酶的最适合条件下(pH70，40℃)测定金属离子及部分化学试剂对RuXyn1水解pNPX和pNPA活力的影响。反应体系为：酶在一定浓度的金属离子及部分化学试剂(详见下表)中，室温处理30min后加入终浓度为5mM的pNPG或pNPX，40℃反应5分钟后加入1倍体积的1M Na₂CO₃的中止反应，410nm分光光度法测定产物pNP生成量，结果如下表，5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)对木糖苷酶性和阿拉伯糖苷酶活性抑制分别是23.7％和33.5％，说明RuXyn1并非金属离子依赖型酶，但是，10mmol金属离子如Mg²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺可以提高酶活性。从结果还发现10％浓度的乙醇对木糖苷酶性和阿拉伯糖苷酶活性抑制也分别只有21％和33％左右，该结果表明该酶可适用于纤维乙醇的同步发酵。

实施例7

RuXyn1的底物亲和力和催化效率分析

RuXyn1的米氏常数Km的测定采用反应速度(V)和底物浓度(S)双倒数法，即Lineweaver-Burk法，底物测定范围0.5-5mM pNPX，测定的温度范围从4℃到55℃，结如图7所示，在4℃到30℃之间，Km值基本不变，说明在该温度范围内，酶对底物的亲和力基本相同，当温度上升至30℃后，酶对底物的亲和里明显迅速减低，说明该酶是一个低温酶(cold-active enzyme)。催化常数k_cat的计算利用公式为k_cat＝V_max/E₀，其中V_max表示最大反应数度，E₀是酶的摩尔浓度。通过计算，RuXyn1的催化常数(k_cat)发现在4℃-40℃温度范围内酶的催化效率随着温度升高保持升高趋势(如图8所示)，但在4℃到30℃之间升高趋势明显较低于30-40℃温度范围。

实施例8

RuXyn1的产物抑制效应分析

RuXyn1的木糖苷酶产物抑制分析采用10mM，100mM，250mM和500mM的D-木糖，阿拉伯糖苷酶的产物抑制分析则以10mM，100mM，250mM和500mM的L-阿拉伯糖，分别测定在不同浓度的D-木糖或L-阿拉伯糖下酶的活力，结果如图8和图9所示，酶的催化效率随底物浓度的增高而加快，并且在低浓度的底物(pNPX或pNPA)下，酶的催化效率受产物抑制效应明显高于高浓度底物，说明提高底物的浓度能抑制酶的产物抑制效应，同时，这一结果为该酶的工业应用提供了理论依据。因此，为了实现酶得催化能力最大化，优化底物的浓度是一个非常有效的工艺参数。

实施例9

组合酶法降解半纤维素

利用木聚糖酶XynR8和RuXyn1的混合酶降解木聚糖，以3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖产量反应木聚糖水解程度。实施方法：200μl反应体系中含2％的木聚糖中(pH7.0，50mmol citrate/phosphate缓冲液配制)中，分别加入2μl的木聚糖酶(FEMS Microbiology Letters 251：233-241，2005)和6μl的纯化的RuXyn1，升温至40℃水解，分在10min、20min、40min、60min、80min、100min取5μl反应液稀释到100μl，加入100μl 3，5-二硝基水杨酸(1％(w/v)1，3-dinitrosalicylic acid，0·05％(w/v)sodium sulfite，1％(w/v)sodium hydroxide，10％(w/v)sodium potassium tartrate)，98℃加热10min显色后测定OD₄₉₀值.结果如图10，加入适量的RuXyn1可以促进木聚糖的降解，显著的提高还原糖的产量。降解产物通过硅胶板薄层层析检测产物，展开剂采用丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶1)，层析1.5小时后吹干再重复一次，层析结束后硅胶板用显色剂(甲醇∶硫酸(7∶3))喷雾，放至105℃烘烤15分钟后显色，结果如图12所示，表明组合酶能将木聚糖完全降解为单糖木糖，而没有加入RuXyn1的反应液中，木聚糖酶的主要产物是木二糖，并且没有木糖产生。

序列表

<210>1

<211>999

<212>DNA

<213>牦牛瘤胃微生物

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(999)

<223>

<400>1

atg gct gat aaa gtt aag aaa cgc tat ctc ttc ccc gag gat ttc atg     48

Met Ala Asp Lys Val Lys Lys Arg Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Phe Met

1               5                   10                  15

gcc gac ccg tcg gtg cat gtg ttc gac gga aaa ctg tac atc tat cct     96

Ala Asp Pro Ser Val His Val Phe Asp Gly Lys Leu Tyr Ile Tyr Pro

            20                  25                  30

tcc cac gac tgg gag tcc gcc gct ccg gac gat gat ttc ggc agc gag    144

Ser His Asp Trp Glu Ser Ala Ala Pro Asp Asp Asp Phe Gly Ser Glu

        35                  40                  45

tac gac atg aag gac tac cac gtg ctg tcc ctg gaa ggt ccg gac ccg    192

Tyr Asp Met Lys Asp Tyr His Val Leu Ser Leu Glu Gly Pro Asp Pro

    50                  55                  60

atg act tcc ccc gtg aag gac aac ggt gtc gcc ctg gac atc aag gac    240

Met Thr Ser Pro Val Lys Asp Asn Gly Val Ala Leu Asp Ile Lys Asp

65                  70                  75                  80

gtg ccg tgg gcc cgc cgt cag ctg tgg gac aac gag gtc gtg aag ggt    288

Val Pro Trp Ala Arg Arg Gln Leu Trp Asp Asn Glu Val Val Lys Gly

                85                  90                  95

cgc gac ggc aag tac tac atg tac ttc ccg gcc aag gac aag act gac    336

Arg Asp Gly Lys Tyr Tyr Met Tyr Phe Pro Ala Lys Asp Lys Thr Asp

            100                 105                 110

atc ttc cgc tgc ggc gtc gcc gtc tcg gac agc ccc acc ggt ccc ttc    384

Ile Phe Arg Cys Gly Val Ala Val Ser Asp Ser Pro Thr Gly Pro Phe

        115                 120                 125

aag gcc atg ccg gat ccc atc cgc ggc agc tat tcc atc gac tac gcc    432

Lys Ala Met Pro Asp Pro Ile Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala

    130                 135                 140

atc ctg cac gat gac gcc gac gac gag tac tac atg tac ttc ggc ggc    480

Ile Leu His Asp Asp Ala Asp Asp Glu Tyr Tyr Met Tyr Phe Gly Gly

145                 150                 155                 160

atc tgg ggc ggc cag ctc cag cgc tac gag gac aac ctc gcc aag gac    528

Ile Trp Gly Gly Gln Leu Gln Arg Tyr Glu Asp Asn Leu Ala Lys Asp

                165                 170                 175

aac ggc acc tcc tac ccc gcc gac gga cag ccc gct atc ccg gcc cgc    576

Asn Gly Thr Ser Tyr Pro Ala Asp Gly Gln Pro Ala Ile Pro Ala Arg

            180                 185                 190

gtc gtg aag ctt gcg aag gac atg ctc cag ttc gcc gag gag ccc aag    624

Val Val Lys Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Phe Ala Glu Glu Pro Lys

        195                 200                 205

ccg gtc gtc atc ctg gac gag gac gga acc ccg atc aag gtg gaa gac    672

Pro Val Val Ile Leu Asp Glu Asp Gly Thr Pro Ile Lys Val Glu Asp

    210                 215                 220

aac gag cgc cgc ttc ttc gag gcc agc tgg atg cac aag tac aac gga    720

Asn Glu Arg Arg Phe Phe Glu Ala Ser Trp Met His Lys Tyr Asn Gly

225                 230                 235                 240

aag tac tac ttc agc tac tcc acc ggc gac acg cac aag ctg tgc tac    768

Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Ser Thr Gly Asp Thr His Lys Leu Cys Tyr

                245                 250                 255

gcc atc ggc gac aac cct tac ggc ccg ttc acc tac aag ggc gtg atc    816

Ala Ile Gly Asp Asn Pro Tyr Gly Pro Phe Thr Tyr Lys Gly Val Ile

            260                 265                 270

ctc acc ccc gtc ttc ggc tgg acc acc cac cac tgc atc gtc gag tat    864

Leu Thr Pro Val Phe Gly Trp Thr Thr His His Cys Ile Val Glu Tyr

        275                 280                 285

aac ggc aaa tgg tgg ctt ttc cac cac gac agc ggc atc tcc aag ggt    912

Asn Gly Lys Trp Trp Leu Phe His His Asp Ser Gly Ile Ser Lys Gly

    290                 295                 300

atc aac cgt ctc cgc agc ctc aag gtc tgc gaa ctg aag tac aac ccc    960

Ile Asn Arg Leu Arg Ser Leu Lys Val Cys Glu Leu Lys Tyr Asn Pro

305                 310                 315                 320

gac ggc acc atc cgc acc atc gaa ggc atg gat gag taa                999

Asp Gly Thr Ile Arg Thr Ile Glu Gly Met Asp Glu

                325                 330

<210>2

<211>332

<212>PRT

<213>牦牛瘤胃微生物

<400>2

Met Ala Asp Lys Val Lys Lys Arg Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Phe Met

1               5                   10                  15

Ala Asp Pro Ser Val His Val Phe Asp Gly Lys Leu Tyr Ile Tyr Pro

            20                  25                  30

Ser His Asp Trp Glu Ser Ala Ala Pro Asp Asp Asp Phe Gly Ser Glu

        35                  40                  45

Tyr Asp Met Lys Asp Tyr His Val Leu Ser Leu Glu Gly Pro Asp Pro

    50                  55                  60

Met Thr Ser Pro Val Lys Asp Asn Gly Val Ala Leu Asp Ile Lys Asp

65                  70                  75                  80

Val Pro Trp Ala Arg Arg Gln Leu Trp Asp Asn Glu Val Val Lys Gly

                85                  90                  95

Arg Asp Gly Lys Tyr Tyr Met Tyr Phe Pro Ala Lys Asp Lys Thr Asp

            100                 105                 110

Ile Phe Arg Cys Gly Val Ala Val Ser Asp Ser Pro Thr Gly Pro Phe

        115                 120                 125

Lys Ala Met Pro Asp Pro Ile Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala

    130                 135                 140

Ile Leu His Asp Asp Ala Asp Asp Glu Tyr Tyr Met Tyr Phe Gly Gly

145                 150                 155                 160

Ile Trp Gly Gly Gln Leu Gln Arg Tyr Glu Asp Asn Leu Ala Lys Asp

                165                 170                 175

Asn Gly Thr Ser Tyr Pro Ala Asp Gly Gln Pro Ala Ile Pro Ala Arg

            180                 185                 190

Val Val Lys Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Phe Ala Glu Glu Pro Lys

        195                 200                 205

Pro Val Val Ile Leu Asp Glu Asp Gly Thr Pro Ile Lys Val Glu Asp

    210                 215                 220

Asn Glu Arg Arg Phe Phe Glu Ala Ser Trp Met His Lys Tyr Asn Gly

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Ser Thr Gly Asp Thr His Lys Leu Cys Tyr

                245                 250                 255

Ala Ile Gly Asp Asn Pro Tyr Gly Pro Phe Thr Tyr Lys Gly Val Ile

            260                 265                 270

Leu Thr Pro Val Phe Gly Trp Thr Thr His His Cys Ile Val Glu Tyr

        275                 280                 285

Asn Gly Lys Trp Trp Leu Phe His His Asp Ser Gly Ile Ser Lys Gly

    290                 295                 300

Ile Asn Arg Leu Arg Ser Leu Lys Val Cys Glu Leu Lys Tyr Asn Pro

305                 310                 315                 320

Asp Gly Thr Ile Arg Thr Ile Glu Gly Met Asp Glu

                325                 330

Claims (10)

1.一种木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶，其特征是，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶，其特征是，它的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种含有权利要求2所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征是，该重组载体是大肠杆菌表达载体、酿酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体中的任意一种。

5.一种含有权利要求3所述的重组载体的重组菌株。

6.如权利要求5所述的重组菌体，其特征是，该菌株的宿主细胞是大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、丝状真菌、昆虫或者哺乳动物细胞中的任意一种。

7.如权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的制备方法，包括培养重组菌株和分离目标蛋白，其特征是该制备方法依次包括以下步骤：

(1)以牦牛瘤胃微生物宏基因组cosmid文库为模板，利用引物进行聚合酶反应扩增，获得权利要求2所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的核苷酸编码序列，构建木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶重组表达载体；

(2)将重组表达载体导入表达宿主细胞，在重组菌体表达木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶；

(3)分离回收木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶。

8.如权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的制备方法，其特征是按照SEQ ID NO.2所示序列人工合成所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶。

9.权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶在饲料组合物的制备、半纤维素或阿拉伯木聚糖的糖化或乙醇生产方面的用途。

10.一种含有木聚糖酶和权利要求1所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双功能酶的组合物。

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