CN103409397B

CN103409397B - 一种耐高温酸性阿拉伯糖苷酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103409397B
Application number: CN201310391170.2A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 时号; 龙凌凤; 张瑜; 张颖
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-09-02
Also published as: CN103409397A

Abstract

本发明公开了一种耐高温酸性阿拉伯糖苷酶及其编码基因和应用，该耐高温阿拉伯糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该耐高温阿拉伯糖苷酶具有极强的耐热性能和偏酸性pH条件下高活性的特性，在80℃、pH5.5的条件下酶活性最高；该蛋白酶在温度为60-95℃、pH为5.0-7.0的范围内，均具有较高的酶活。该阿拉伯糖苷酶的耐热性能极高，在75℃的反应体系中，保温2h酶活仍保持80%以上。上述特性使得本发明得到的阿拉伯糖苷酶比现有阿拉伯糖苷酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种耐高温酸性阿拉伯糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种耐高温酸性阿拉伯糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

半纤维素是植物细胞壁的主要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源。虽然半纤维素的化学组成随植物原料来源不同而有所不同，但其主要成分为木糖、阿拉伯糖等单糖形成的天然高分子碳水化合物，且阿拉伯糖是半纤维素中仅次于木糖的一种组成单元，主要存在于半纤维素的支链上。对于植物纤维原料中半纤维素的有效生物转化利用，通常可采用木聚糖酶及木糖苷酶使半纤维素中木聚糖降解成为木糖，但要使富含阿拉伯糖的半纤维素完全降解，离不开阿拉伯糖苷酶的协同作用，使其最终彻底降解为木糖、阿拉伯糖等单糖。目前，半纤维素的降解产物木糖、低聚木糖和阿拉伯糖在饲料、食品及生物转化制备生物质化学品等方面体现出的工业价值使其得到广泛研究与开发利用。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种耐高温阿拉伯糖苷酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述耐高温阿拉伯糖苷酶的基因。本发明还有一目的是提供上述耐高温阿拉伯糖苷酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种耐高温阿拉伯糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种耐高温阿拉伯糖苷酶，氨基酸序列为SEQ ID NO.1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯糖苷酶活性的衍生蛋白质。

一种编码耐高温阿拉伯糖苷酶的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

一种表达耐高温阿拉伯糖苷酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

一种扩增编码耐高温阿拉伯糖苷酶的基因的方法，所使用的引物对为：

引物1：5’- GGAATTCCATATGAGAAACAAACTTGTCGACGGT-3；

引物2：5’- CCGCTCGAGACAAATCAGATTTGCAATCAAAACTC-3。

所述的耐高温阿拉伯糖苷酶在酶解4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷中的应用。

所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为60-95℃，pH5.0-7.0。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的阿拉伯糖苷酶具有极强的耐热性能和偏酸性pH条件下高活性的特性，在80℃、pH 5.5的条件下酶活性最高；该蛋白酶在温度为60℃-100℃、pH为5.0-7.0的范围内，均具有较高的酶活。该阿拉伯糖苷酶的耐热性能极高，在75℃的反应体系中，保温2 h酶活保持80%以上。上述特性使得本发明得到的阿拉伯糖苷酶比现有阿拉伯糖苷酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1为阿拉伯糖苷酶Ara2的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2为Ara2活性随温度的变化结果图；

图3为Ara2活性随pH的变化结果图；

图4为Ara2热稳定变化图。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明最进一步的说明。

以下实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法，所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取

采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌种保藏中心）新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中（pH8.0），混匀后在37℃放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55℃放置5 min，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30 min，4℃ 13000 rpm离心20 min，收集沉淀。沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液（pH8.0，10 mM Tris，1 mM EDTA），加入10 mg/mL RNase 3 μL，37℃保温1 h，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30 min，4℃ 13000 rpm离心20 min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0.5 mL超纯水溶解。

实施例2阿拉伯糖苷酶基因ara2的制备

可采用如下方法制备ara2基因，也可以采用人工合成的方式得到。

以Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA为模版（实施例1制备），用下述引物进行PCR扩增：

引物1：5’- GGAATTCCATATGAGAAACAAACTTGTCGACGGT-3’；

引物2：5’- CCGCTCGAGACAAATCAGATTTGCAATCAAAACTC-3；

引物1引入NdeI酶切位点，引物2引入Xho I酶切位点。

PCR反应体系：1 μL T. thermarum 基因组DNA，1 μL引物1，1 μL引物2，25μL Premix ExTaq，22 μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5 min；94℃变性30 sec，52℃退火30 sec，72℃延伸2 min，30Cycles；72℃延伸10 min；4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。

实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-ara2的构建与验证

将纯化过的PCR产物（实施例2制备）、pET-20b（Novagen）分别用Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬，加入1μL 10×Ligase Buffer和1μL Ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μg/mL Amp（氨苄青霉素）的培养皿中，37℃培养10-12h。

从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段（核苷酸长度为2367bp，DNA序列如SEQ ID NO.2所示），进而得到重组克隆表达载体pET-20b-ara2，该目的片段为编码耐高温阿拉伯糖苷酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该蛋白命名为Ara2。

实施例 4 重组阿拉伯糖苷酶Ara2的表达与纯化

将重组克隆、表达载体pET-20b-ara2电转至宿主菌E. coli BL21(DE3)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100μg/mL Amp的Luria-Bertani broth (LB)培养基中，在37℃温度下，200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000mL摇瓶中，37℃下，200rpm震荡培养，当吸光度达到0.6-0.8时，加人200μL的1M IPTG，并在30℃下，120 rpm诱导表达10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下以13000 rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗涤并在4℃下以13000 rpm离心15 min，回收菌体，接着用20mL 1×Binding Buffer 重悬（0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazole，pH7.9），在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下13000 rpm 离心15min，得到含阿拉伯糖苷酶Ara2的粗提液。

粗提液先经60℃加热处理30 min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni²⁺亲和层析柱进行纯化（方法见His-Bind Kits，Novagen）。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，1即表示纯化过后的Ara2蛋白，分子量约为87kDa。

实施例5 重组阿拉伯糖苷酶Ara2的酶学性质分析

酶活定义为：1 min内催化产生1μmol对硝基苯酚（pNP）所需的酶量。

（1）最适温度

用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μL，20mM的4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（pNPAF）10μL，180μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成；反应体系的pH为6.0。将反应体系在60-95℃温育20 min后，加入600μL 1 M Na₂CO₃试剂终止反应，测定410 nm的吸光值。将此温度下的酶活反应体系的酶活定为相对活性100%。实验设3次重复，取平均值作图。结果如图2所示，研究结果表明在80℃时，Ara2具有最高的酶活性；其中，在温度60-95℃的反应体系中均保持较好的酶活力。

（2）最适pH

酶活测定反应体系为200μL，20 M的pNPAF 10μL，180μL pH4.0-pH8.5的0.1 M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成。将反应体系在80℃温育20 min后，加入600μL 1 M Na₂CO₃试剂终止反应，测定410nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为5.5时，Ara2具有最高的酶活性，将此pH值下酶活作为相对活性100%。该阿拉伯糖苷酶在pH5.0-7.0的条件下，酶活约为最大酶活的60%以上。

（3）重组酶热稳定性

用pH值为5.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在70℃、75℃、80℃和85℃分别水浴30min、60min、90min和120min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为5.5，测定温度为80℃。实验设3次重复，取平均值。结果如图4所示，研究结果显示，该酶在75℃温育2h酶活仍保持80%以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种耐高温酸性阿拉伯糖苷酶及其编码基因和应用

<130> 100

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 788

<212> PRT

<213> Thermotoga thermarum

<400> 1

Met Arg Asn Lys Leu Val Asp Gly Trp Thr Leu Ile Cys Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Val Glu Ile Ser Ser Val Pro His Gln Ser Asp Ile Ser Gln Glu

20 25 30

Ser Tyr Pro Asn Ala Ser Cys Gln Gln Leu Val Tyr Glu Arg Lys Leu

35 40 45

Val Glu Leu Lys Gly Met Asp Glu Arg Lys Ala Ile Leu Arg Phe His

50 55 60

Gly Val Asp Leu Gln Ala Ser Val Phe Val Asn Gly Gln Lys Leu Leu

65 70 75 80

Asp His Glu Gly Gly Tyr Asp Leu Phe Glu Val Asp Leu Ser Asn Tyr

85 90 95

Val Lys Phe Asp Gly Asn Asp Leu Leu Arg Leu Val Val Ser Asp Val

100 105 110

Asp Val Arg Ala Glu Pro His Ile Val Met Gly Lys Gln Asp Trp Tyr

115 120 125

Gly Asn Ala Thr Gly Ile Val Gln Glu Val Glu Leu Leu Val Val Pro

130 135 140

Pro Val Tyr Ile Ser Ser Ala Arg Phe Tyr Pro Leu Asp Leu Phe Gly

145 150 155 160

Arg Val Lys Gly Ile Val Glu Phe Ser Asp Gly Lys Asp His Glu Phe

165 170 175

Gln Leu Glu Ile Tyr Asp Ser Lys His Asn Lys Val Tyr Gln Ser Lys

180 185 190

Glu Lys Ser Ser Cys Phe Glu Phe Thr Ile Val Asn Pro His Leu Trp

195 200 205

Ser Ile Asp Asp Pro His Leu Tyr Lys Ala Val Val Thr Leu Glu Thr

210 215 220

Asp Gly Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Thr Ser Phe Gly Ile Arg Ile Phe

225 230 235 240

Gln Thr Lys Asp Asp Lys Leu Leu Leu Asn Gly Glu Pro Val Tyr Ile

245 250 255

Phe Gly Ala Leu Asp Gln Asn Phe Tyr Pro Ile Thr His Tyr Cys Leu

260 265 270

Pro Asp Arg Asn Ser Leu Val Ser Glu Leu Leu Lys Ala Lys Glu Met

275 280 285

Gly Leu Asn Leu Leu Arg Phe His Met Lys Ile Pro Asp Asp Leu Tyr

290 295 300

Leu Glu Ile Ala Asp Glu Ile Gly Leu Leu Ile Trp Ile Asp Leu Pro

305 310 315 320

Tyr Ala Arg Ile Leu Asn Asp Ser Ser Lys Asn Tyr Leu Glu Lys Leu

325 330 335

Met Glu Asn Leu Leu Val Arg His Ala Asn His Pro Ser Phe Val Met

340 345 350

Leu Ser Leu Ile Asn Glu Ser Trp Gly Ile Asp Leu Ser Ile Ala Glu

355 360 365

Glu Arg Gln Trp Leu Arg Lys Phe Tyr Phe Lys Ala Lys Lys Phe Asp

370 375 380

Pro Thr Arg Val Tyr Val Asp Asn Ser Ala Cys Ile Gly Asn Lys His

385 390 395 400

Val Ile Ser Asp Val Asp Asp Tyr His Phe Tyr Lys Ala Tyr Pro Tyr

405 410 415

His Asn Lys Glu Trp Lys Glu Gln Ile Lys Asp Phe Ala Ser Gly Lys

420 425 430

Phe Glu Ser Phe Tyr Glu Pro Ile Asp Lys Lys Leu Pro Lys Leu Val

435 440 445

Ser Glu Phe Gly Ile Trp Gly Ile Ser Asp Pro Lys Thr Trp Leu Gly

450 455 460

Lys Trp Ser Glu Phe Pro Val Thr Val Met Gly Leu Thr Phe Asp Gln

465 470 475 480

Thr Gln Pro Ala Tyr Ala Leu Gln Gly Ile Ala Asn Phe His Asp Leu

485 490 495

Asp Asp Leu Ile Tyr Gln Ala Gln Leu Thr Gln Phe Leu Gly Leu Lys

500 505 510

Tyr Gln Ile Glu Thr Ile Arg Met Gln Pro Glu Ile Ser Gly Tyr Val

515 520 525

Ile Thr Glu Phe Ser Asp Ile Ala Trp Glu Ala Asn Gly Leu Leu Asp

530 535 540

Tyr Asn Arg Met Pro Lys His Phe Tyr Pro Tyr Leu Lys Phe Leu Asn

545 550 555 560

Ser Lys Val Ile Gly Ile Ile Pro Asp His Asn Ser Leu Leu Ile Glu

565 570 575

Gly Asp Phe Tyr Thr Ala Pro Leu Cys Val Ile Asn Ser Asp Ser Lys

580 585 590

Val Leu Lys Ala Arg Val Leu Val Arg Thr Glu Lys Asp Val Ile Leu

595 600 605

Asp Lys Thr Ile Glu Val Gln Pro Trp Glu Ile Lys Glu Ile Ser Ser

610 615 620

Leu Ser Phe Lys Pro Asp Lys Thr Ile His Asn Ile Tyr Val Glu Ile

625 630 635 640

Phe Ser Asp Gly Lys Leu Ile Ser Arg Asn Phe Tyr Pro Met Gln Val

645 650 655

Leu Glu Arg Lys Ala Gly Thr Phe Leu Leu Glu Phe Val Asp Ser Asp

660 665 670

Phe Phe Val Glu Asp Gly Leu Arg Ala Val Arg Glu Asn Thr Lys Val

675 680 685

Gly Gly Val Leu Asp Leu Lys Gly Asp Trp Ile Gly Ala Ala Thr Val

690 695 700

Phe Asn Val Lys Arg Ser Leu Asn Ile Ala Ala Leu Ile Trp Gly Leu

705 710 715 720

Asn Thr Ile Thr Ser Glu Tyr Leu Leu Leu Ala Glu Glu Ser Asn His

725 730 735

Phe Ser Ser Glu Gln Ser Val Ile Thr Lys Val Tyr Gly Trp Gly Tyr

740 745 750

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Tyr Val Ser Arg Lys Asp Gly Glu Thr Lys

755 760 765

Val Phe Thr Thr Leu Lys Asp Thr Glu Leu Ser Arg Val Leu Ile Ala

770 775 780

Asn Leu Ile Cys

785

<210> 2

<211> 2364

<212> DNA

<213> Thermotoga thermarum

<400> 2

atgcgcaaca aactggttga tggctggact ctgatctgcg gcgaaaaggt ggttgaaatc 60

tctagcgtgc cgcatcagag cgacatctct caggagagct acccgaacgc ttcttgtcag 120

cagctggtgt atgagcgtaa actggtggaa ctgaaaggca tggacgaacg taaagcgatc 180

ctgcgctttc acggtgtgga tctgcaggct tctgtttttg ttaacggtca gaaactgctg 240

gatcacgaag gtggctatga cctgttcgag gttgatctgt ctaactatgt gaagttcgac 300

ggtaacgatc tgctgcgtct ggttgtgtcc gatgttgacg tgcgcgctga gccgcatatc 360

gttatgggta aacaggactg gtatggcaac gcgaccggta ttgtgcagga agttgaactg 420

ctggtggtgc cgccggttta catttctagc gcgcgtttct acccgctgga cctgtttggt 480

cgtgttaagg gcattgttga attctccgat ggtaaagacc acgagtttca gctggaaatc 540

tacgattcta aacataacaa ggtgtatcag tctaaggaaa aatcttcttg cttcgagttc 600

accatcgtta acccgcatct gtggtctatc gacgatccgc acctgtacaa ggctgtggtt 660

accctggaga ccgacggtta cattgatcgt tttgagacct ctttcggtat tcgtattttt 720

cagactaaag atgacaagct gctgctgaac ggcgagccgg tgtacatctt tggtgcactg 780

gaccagaact tttacccgat tacccactat tgtctgccgg accgtaacag cctggtgagc 840

gaactgctga aggcaaagga aatgggcctg aacctgctgc gtttccacat gaaaatcccg 900

gacgacctgt atctggagat cgctgacgaa attggcctgc tgatttggat cgacctgccg 960

tacgctcgta ttctgaacga ctcttctaaa aactacctgg aaaaactgat ggagaacctg 1020

ctggtgcgtc acgcgaacca tccgtctttt gtgatgctgt ctctgattaa cgaaagctgg 1080

ggtattgacc tgagcattgc ggaggagcgc cagtggctgc gtaaattcta cttcaaagct 1140

aagaaattcg acccgactcg tgtgtacgtg gataactccg catgtattgg caacaagcat 1200

gttattagcg acgttgacga ctaccacttc tacaaagcat acccgtacca caacaaggaa 1260

tggaaagagc agattaaaga cttcgcttcc ggcaagtttg aatctttcta tgaaccgatc 1320

gacaaaaagc tgccgaagct ggtttccgaa tttggcattt ggggcatctc tgacccgaaa 1380

acctggctgg gtaagtggtc tgagttcccg gttactgtga tgggtctgac ctttgatcag 1440

actcagccgg catacgcact gcagggcatc gcaaactttc atgacctgga tgatctgatt 1500

tatcaggcgc agctgaccca gttcctgggc ctgaagtacc agatcgaaac tattcgcatg 1560

cagccggaaa ttagcggtta tgtgattacc gagttttccg atattgcgtg ggaggcgaac 1620

ggtctgctgg attacaaccg catgccgaaa cacttttatc cgtatctgaa attcctgaac 1680

tctaaagtta tcggcattat tccggatcac aactctctgc tgatcgaggg tgatttctat 1740

accgctccgc tgtgcgttat caactctgac agcaaggttc tgaaagcacg tgtgctggtt 1800

cgtactgaga aggacgttat cctggacaaa actatcgaag ttcagccgtg ggaaatcaaa 1860

gagatcagct ctctgtcttt taagccggac aagactattc acaacatcta tgtggaaatt 1920

ttcagcgacg gcaagctgat tagccgcaac ttctatccga tgcaggtgct ggagcgcaag 1980

gcaggcacct ttctgctgga attcgttgac agcgattttt tcgtggaaga cggcctgcgt 2040

gcggtgcgcg aaaacaccaa ggtgggtggc gttctggatc tgaagggcga ctggatcggt 2100

gcagcgaccg ttttcaacgt taaacgctcc ctgaacatcg cggcactgat ctggggtctg 2160

aacactatta cttctgaata tctgctgctg gcagaggaat ctaaccactt ttcttctgag 2220

cagtctgtta tcactaaagt gtacggttgg ggttatgcgc tgggttccct gctgtatgtg 2280

tcccgcaagg atggcgagac taaggttttt actaccctga aggatactga actgtctcgt 2340

gttctgattg caaacctgat ttgc 2364

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物1序列

<400> 3

ggaattccat atgcgcaaca aactggttga tggct 35

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物2序列

<400> 4

ccgctcgagg caaatcaggt ttgcaatcag aaca 34

Claims

1.一种耐高温阿拉伯糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述耐高温阿拉伯糖苷酶的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达权利要求1所述的耐高温阿拉伯糖苷酶的重组体系，其特征在于：在所述的重组体系上克隆有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

4.一种扩增权利要求2所述的编码耐高温阿拉伯糖苷酶的基因的方法，其特征在于：所使用的引物对为：

引物1：5’- GGAATTCCATATGAGAAACAAACTTGTCGACGGT-3；

引物2：5’- CCGCTCGAGACAAATCAGATTTGCAATCAAAACTC-3。

5.权利要求2所述的耐高温阿拉伯糖苷酶在酶解4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为60-95℃，pH5.0-7.0。