CN1928093A - 一个新型阿拉伯糖苷酶基因的表达及优化方法 - Google Patents

Abstract

一种阿拉伯糖苷酶基因高效表达方法，属于微生物基因工程领域。本发明提供了一种阿拉伯糖苷酶的基因表达方法，具体是将编码阿拉伯糖苷酶的基因插入载体pHsh，构建成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞构建成重组菌；再将重组菌培养至OD₆₀₀为0.5－1.2，通过热激诱导表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。本发明还利用定向改造方法对基因进行改造，进一步提高了表达水平。经本发明表达获得的阿拉伯糖苷酶的重组酶，具有稳定性高、能降解高度聚合的木聚糖酶的阿拉伯糖侧枝、对环境因子具有较强的抗性、催化活性适应较宽的温度和pH条件的特性。本发明的技术可用于阿拉伯糖苷酶工业化生产，其产品的工业用途包括食品加工、饲料添加剂和造纸工艺。

Description

一个新型阿拉伯糖苷酶基因的表达及优化方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、酶学、生物信息学以及基因工程等领域。具体涉及对一个α-阿拉伯糖苷酶基因高效表达的方法。

背景技术

半纤维素在自然界中含量之丰富，仅次于纤维素，如在秸秆中半纤维素的含量占其干重的25％～50％(Glazer AN，Nikaido H Microbial Biotechnology NewYork：FreomanGmpany，1995)。木聚糖类半纤维素是一类可再生资源，经一系列酶水解成为寡糖或单糖，被用作双歧因子或发酵原料。近几年来木聚糖的酶法水解和开发利用问题已发展为一个研究热点。木聚糖的酶法水解所面临的技术挑战之一是需要高性能的木聚糖降解酶，包括水解主链的木聚糖酶、木糖苷酶和分解侧枝的阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶。

阿拉伯糖残基在木聚糖中大量存在。阿拉伯糖残基单体或低聚体以α-1，3或α-1，2键连接在木糖的主链上(Sunna A，Autranikian G，Crital Revieasin Biotechnology，1997，17(1)：39～6)形成侧枝。侧枝的存在会降低木聚糖酶将高聚合度的木聚糖降解为寡糖的反应速度，并阻止木糖苷酶将带有侧枝的寡糖彻底水解为单糖。阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)能够将阿拉伯糖侧枝从主链上除去，能够与木糖苷酶及木聚糖酶发生协同作用，是木聚糖的彻底水解所必须的酶之一。同时，阿拉伯糖苷酶能够释放以糖苷键连接的非挥发的单萜类物质而使酒或果汁的香味增加，它的应用潜力正受到越来越多的关注(Clinche F L，Francisco P，Danie R，etal.J Agric Chem，1997，45：2379～2383)。

不同的阿拉伯糖苷酶对阿拉伯糖侧枝的水解有不同的底物偏好性，有的酶只对低聚木糖上的侧枝有较高的活力，而有的酶对高度聚合的木聚糖上的侧枝也有较高的活力。只有对长链木聚糖具有高活力的阿拉伯糖苷酶才能与木聚糖酶发生协同作用，从而加速木聚糖主链的降解。虽然已有很多种阿拉伯糖苷酶被纯化或克隆，但是多数酶偏好低聚木糖类底物，其它酶的底物偏好性没有得到研究。

不同来源的阿拉伯糖苷酶还具有不同的稳定性，如果不需要终止催化反应，酶的半衰期长就意味着效率高，来源于嗜热微生物的酶通常有更好的稳定性。但是，来源于嗜热微生物的基因在大肠杆菌等常温菌中进行表达时通常表达水平较低，需要通过定点诱变或定向进化提高表达水平，从而降低生产成本，产生商品化价值。

在研究过程中，我们发现了一种由嗜热性芽孢杆菌分泌的、对高度聚合的木聚糖具有较高脱侧枝活力的热稳定性阿拉伯糖苷酶。我们克隆了编码该酶的全基因，并递交至GenBank，获得的登陆号为DQ324528。该基因名为araB，全长为1479个碱基，编码492个氨基酸。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿拉伯糖苷酶基因的表达方法，解决目前阿拉伯糖苷酶种类单一、生产水平低、利用率差等瓶颈问题。

本发明所说的阿拉伯糖苷酶基因的表达方法，是将编码阿拉伯糖苷酶的基因插入载体pHsh，构建成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞构建成重组菌；再将重组菌培养至OD₆₀₀为0.5-1.2，通过热激诱导表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。

所说的编码阿拉伯糖苷酶的基因是araB，其全长为1479个碱基，GenBank的登陆号为DQ324528。将araB或它的成熟肽基因克隆到表达载体pHsh中构建成重组质粒pHsh-araB和不带信号肽的pHsh-ara。但是其自然基因araB在大肠杆菌中的表达水平不够高，通过对重组质粒的分析发现在翻译起始区可能形成二级结构，并且基因的编码区含有一些大肠杆菌的非优势密码子，为了提高阿拉伯糖苷酶的基因的表达水平，本发明提供了进一步的技术方案，通过基因诱变改变密码子偏好性和优化mRNA的二级结构，提高其在大肠杆菌中的表达水平。其具体方法是：

1.将araB或它的成熟肽基因克隆到表达载体pHsh中构建成pHsh-araB和不带信号肽的pHsh-ara；

2.分析pHsh-ara中的密码子及可能产生的mRNA二级结构，设计诱变引物，并在pHsh-ara中进行原位诱变，获得含突变基因的重组质粒。

3、将含突变基因的重组质粒，导入大肠杆菌进行表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。

本发明更具体的方案是：设计诱变引物为引物1：5’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGTTAACG AAGTG ATTGG ACGCA TTTCT AAAC-3’；引物2：5’-TTTTA TATCT CCTTCTTGTC GACGG TTA-3’；获得pHsh-araU。根据该方案得到的阿拉伯糖苷酶突变基因命名为araU，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明用pHsh系统对阿拉伯糖苷酶进行表达，并利用定向改造方法对基因进行改造，进一步提高了表达水平，使热稳定性阿拉伯糖苷酶的重组蛋白的表达量占总蛋白的15％以上。通过本发明得到的重组阿拉伯糖苷酶对环境因子具有较强的抗性，Sr²⁺，Li²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Co²⁺和EDTA对它影响不大；具有较广的温度和pH适应性，在pH 4.8-7.6，40℃-75℃的范围内显示较高的活性；能降解高度聚合的木聚糖的阿拉伯糖侧枝。

附图说明

图1示为重组质粒pHsh-araU示意图。

图2示为重组菌表达水平SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中1：空白对照E.coli/pHsh 2：重组菌E.coli/pHsh-ara 3：重组菌E.coli/pHsh-araU

图3示为重组阿拉伯糖苷酶的酶学性质测定图。

A：最适反应pH图；

B：最适反应温度图；

C：pH稳定性图；

D：温度稳定性图；60℃(◆)，65℃(■)，70℃(▲)，75℃(×)。

图4示为重组阿拉伯糖苷酶降解试验层析图，

其中1：阿拉伯糖；2：本发明方法表达的阿拉伯糖苷酶处理的木聚糖(2％，wt/vol)；3：木聚糖(2％，wt/vol)

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。发下实施例中所说的阿拉伯糖苷酶基因araB由本实验室克隆和保存。

实施例一：阿拉伯糖苷酶基因的定向诱变

1.阿拉伯糖苷酶基因的亚克隆

根据阿拉伯糖苷酶基因(GenBank登陆号DQ324528)序列设计引物，上游5’-CCC CT GCAGA GAATGG CACGG TCAAA GTC-3’前面加入Pst I位点；下游5’-CCC AA GCTTATTAAG CCAGA TCGAC GTCAA AC-3’引入Hind III位点。加入两个终止密码子UAA、UAA来加强翻译终止。以基因araB为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加入DNA聚合酶Pyrobest，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，3min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。扩增产物经Pst I和Hind III双酶切，与用同样的酶双酶切的表达载体pHsh连结，得到重组质粒pHsh-ara。

2.酶基因的定点诱变

对pHsh-ara的翻译起始区的密码子的偏好性和二级结构进行分析，并对其进行优化，设计引物对其进行改造。引物1：5’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGT TAACG AAGTGATTGG ACGCA TTTCT AAAC-3’；引物2：5’-TTTTA TATCT CCTTC TTGTC GACGGTTA-3’。其中黑体表示用优势密码子进行了替换，斜体表示为二级结构优化而进行的定点突变。碱基的改变不改变氨基酸序列。以pHsh-ara为模板，用内部定点突变引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加高保真性DNA聚合酶Pyrobest(Takara)，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，30s；56℃，90s；72℃，3min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。PCR产物是含有pHsh和突变基因araU的线性DNA，Pyrobest酶扩增产生平端片段，经DNA激酶磷酸化和T₄ DNA连接酶连接后，产生含突变基因araU的重组质粒pHsh-araU(如图1)。经测序，araU的序列如其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例二：阿拉伯糖苷酶基因及其突变体的表达

重组菌的培养：重组质粒pHsh-araB、pHsh-ara、pHsh-araU；用电穿孔法(electroporation)将分别将pHsh-araB、pHsh-ara、pHsh-araU质粒转入大肠杆菌菌株JM109，挑选出的转化子接入20ml含有100μg ml氨苄青霉素的LB培养基，在37℃摇床中进行振荡培养至对数期，以2％的接种量转接到300ml含有100μg ml的氨苄青霉素的LB培养基，在200rpm 30℃摇床中进行振荡培养至OD₆₀₀ 0.6左右再42℃热激诱导8小时，离心收获细胞。

重组阿拉伯糖苷酶的制备：将细胞悬浮于磷酸缓冲液，通过高压细胞破碎仪使细胞裂解；将细胞裂解液用50％-80％硫酸铵分级沉淀，获得接近电泳纯的阿拉伯糖苷酶。pHsh-araU在大肠杆菌中的表达产量高于araB和ara(图2)。

实施例三：重组阿拉伯糖苷酶酶学性质及降解试验

对实施例二中araB、ara和araU的表达产物进行酶学分析，其酶学性质相同。

最适pH的测定：将重组酶纯酶分别在pH 44-8.0的50mmol L咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液(IP缓冲液)，60℃下测定酶活。计算相对酶活确定最适pH。结果酶的最适pH为6.4(图3A)。

最适反应温度的测定：将重组酶分别在45℃-80℃，在pH 60(IP缓冲液)下测定酶活，计算相对酶活确定最适反应温度。结果显示最适反应温度为60℃，但在45℃-75℃范围内酶保持相对较高的酶活(图3B)。

温度稳定性测定：将重组酶在pH 64(IP缓冲液)，分别在60℃、65℃、70℃和75℃保温10min、20min、40min、60min、90min和120min，然后在60℃，pH 60下测定酶活，以保存于冰浴中(未保温)的酶活力为100％。计算相对酶活，制作温度稳定性曲线，发现重组酶在70℃下的半衰期为1小时(图3C)。

pH稳定性测定：将重组酶置于不同pH值(4.8-8.0)的IP缓冲液中，在60℃保温60min，再加入底物测定残留活力，冰浴保存的酶样在相对应pH条件下的活力为100％，比较酶在不同pH条件下的稳定性，分析发现重组酶在pH 4.8-7.6都保持较高的稳定性(图3D)。

二价离子和螯合剂对重组酶的影响：将重组酶在60℃pH 64(IP缓冲液)下，分别与1mM的Sr²⁺，Mn²⁺，Li²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ca²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺和EDTA混合孵育10min，然后在60℃，pH 60下测定酶活，以未加离子或螯合剂的酶活力为100％。计算相对酶活，发现Sr²⁺，Li²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺和EDTA对重组酶没有影响，Cu²⁺和Co²⁺对重组酶有轻微的抑制作用。

重组酶对高聚合度的木聚糖阿拉伯糖侧支的降解：在200μl的反应体系含：重组阿拉伯糖苷酶(0.2U)，2％(wt/vol)xylan(Oat spelts，Sigma)溶解于IP缓冲液，pH 64。在55℃反应12小时。反应液在沸水中煮5min终止反应，样品11,000g离心10min，取上清液进行薄层层析(silica gel 60 F254，Merck Co)，流动相(正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1)。显色剂为100mL硫酸甲醇溶液(硫酸∶甲醇＝2∶8)中加入100mg 5-甲基-13苯二酚，显色条件是60℃，20min。结果如图4，显示高聚合度的木聚糖上的阿拉伯糖侧枝被重组酶水解，在薄层层析板上产生新斑点。

                              SEQUENCE LISTING

<110>南京师范大学

<120>一个新型阿拉伯糖苷酶基因的表达及优化方法

<160>1

<210>1

<211>1479

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1479)

<223>对阿拉伯糖苷酶基因ara进行密码子替换

<400>1

atgaacggca ctgttaaagt taacgaagtg attggacgca tttctaaaca catctatgga      60

cactttcaag agcatttagg aagaggaatt tatgacggca tttgggtagg gaaagattca      120

gagattgatc atgttgaagg gattcgtact gatgtgctaa aggcccttca agcattacat      180

atcccggtgc ttaggtggcc gggtggctgt tttgcagacg agtatcattg ggcaaacggc      240

gtcggtgatc tgagtgaacg aaagccgatg gtgaatactc attggggtgg caccgttgaa      300

tcaaatgcgt ttggtacaca tgaatttatg agactgtgtg aattacttga atgtgagcct      360

tatatttgtg gaaacgttgg aagcggctct gtacaagaat tagcagaatg gattgaatat      420

atcacatttc ctaaagggac acctatgtcg gattggcgca ttcaaaatgg aaaacaagaa      480

ccgtgggagc tgacgtatgt tggtgtaggt aatgaaagct ggggatgcgg tggaaatatg      540

acaccagagt attatgcaga cttatataaa cgctaccaaa cgtatgtgag agaatttgct      600

ggtcagcgca tttacaaaat tgcatgcggt gcgaattcaa atgatgtgaa ttggacaaaa      660

gtattaatgg agcgtgcagc gccttggatg gatgggctca gtttgcatta ctatacggtc      720

ccaggaacat gggagaaaaa agggtcagcg accgattttg acgaggatga gtggtttaca      780

acgctgaaaa aggcgtctga aatggagcgg cttgttgtag atcacggaga gatcatggat      840

cgttatgatc cagacaagcg aatcgggatg attattgatg aatgggggac atggtatgat      900

ccagaaccgg ggacaaatcc aggttttttg tatcagcaaa acacattaag agatgcccta      960

gtctgtgcct tgcattttca tatttttcat cgccattgcc tgcggattca tatggcgaat      1020

attgcccaaa ccgtcaatgt gctgcaagcg atggtgttaa cgcaggacga aaagatgctc      1080

ctgacgccaa cctatcacgt atttcacatg tttcaagtgc atcaagaaga agaagcgctt      1140

gaagtagaat tgaatgcccc ttcgtatgaa cgccggggtg aaaaaatccc tcaagtcagt      1200

gtgtcagcct cgcggtcatc tgacaagatg catataagtt tatgtcatgt gaatccccat      1260

gaaaaagcag acgtatctct tgcgatagag ggaatcgatg caaaaacgaa ggtcactggc      1320

cgtgtgctga ctgctgatcg gatgaatgcg cacaacacgt tcgatgatcc tcattccgtt      1380

cagcctgagg actttcggca atttgctgtt aagcacggcg agctgactat tgatctgccg      1440

cctatgtcgg ttgtaatgtt gaccgtcgat ctggcttga 1479

Claims (4)

1、一种阿拉伯糖苷酶基因的表达方法，是将编码阿拉伯糖苷酶的基因插入载体pHsh，构建成重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞构建成重组菌；再将重组菌培养至OD₆₀₀为0.5-1.2，通过热激诱导表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。

2、如权利要求1所说的的表达方法，其特征在于，所说的编码阿拉伯糖苷酶的基因是araB，将araB或它的成熟肽基因ara克隆到表达载体pHsh，构建成重组质粒pHsh-araB和不带信号肽的重组质粒pHsh-ara，将重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞构建成重组菌；再将重组菌培养至OD₆₀₀为0.5-1.2，通过热激诱导表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。

3、如权利要求2所说的的表达方法，其特征在于：分析pHsh-ara中的密码子及可能产生的mRNA二级结构，设计诱变引物，并在pHsh-ara中进行原位诱变，获得含突变基因的重组质粒；将含突变基因的重组质粒，导入大肠杆菌进行表达，获得重组阿拉伯糖苷酶。

4、如权利要求3所说的的表达方法，其特征在于：其中所说的诱变引物为：

引物1：5’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGT TAACG AAGTG ATTGG ACGCATTTCT AAAC-3’；

引物2：5’-TTTTA TATCT CCTTC TTGTC GACGG TTA-3’；

获得含突变基因的重组质粒pHsh-araU，其中araU的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

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