CN104812767B - 从槐糖脂生产槐糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从槐糖脂生产槐糖的方法，其中在酸性化合物的存在下在水性介质中进行槐糖脂的水解步骤。

Description

从槐糖脂生产槐糖的方法
本发明涉及一种通过槐糖脂的酸水解来生产槐糖的方法。本发明也涉及使用本发明的方法获得的水解液作为用于诱导编码纤维素酶的基因的表达的溶液的用途。最后，本发明也涉及用于对该水解液的槐糖进行纯化的方法。
背景技术
适合使多糖水解的纤维素酶允许产生它们的微生物利用纤维素和半纤维素(植物的主要成分)作为碳源，其通过将这些聚合物水解成为简单糖(葡萄糖，木糖等)来进行。
目前，这些酶用于很多领域，例如清洁剂，纺织工业或食品工业，和用于以木质纤维素生物质的生物化学增值为目的的工艺中(例如用于第二代乙醇生物燃料的生产)。目前，里氏木霉(Trichoderma reesei)在从木质纤维素生物质生产生物燃料的工艺中被认识到是最好的生产纤维素酶的微生物，这主要是因为其高的分泌能力。
然而，纤维素酶的生产成本仍然居高，并且代表了对被称为“第二代”的工艺的工业规模应用的经济障碍之一。
工业上，在使用含有乳糖作为诱导纤维素酶生产的糖的进料溶液的分批进料方案(不取出的供料)中获得了通过里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶的最佳生产(EP0448430B1)。尽管乳糖已在工业规模上使用，但是考虑到低成本纤维素酶的生产其具有昂贵的缺点。
槐糖已知是里氏木霉纤维素分解体系的非常好的诱导剂。在1962年，Mandels M.等[Sophorose as an inducer of cellulase in Trichoderma viride.Journal ofBacteriology 1962，83：400-408]论证了：尽管只以0.006％的量作为杂质存在于葡萄糖中，槐糖也能用来诱导分解纤维素酶(或纤维素酶)的生产。这些槐糖杂质通过在淀粉的酸水解成葡萄糖的过程中的葡基转移作用的机理形成。
槐糖(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖)是通过经由苷键(osidic bond)β(1→2)连接的两个葡萄糖单元构成的二糖。其存在于自然中，例如存在于来自槐树(Sophorajaponica)的小鳞茎中，从其中所述槐糖在1938年第一次被分离出来。
不幸的是，槐糖的高价格意味着其仍然不能在工业规模上使用。直到现在，其仅仅已经在实验室中用于需要强诱导的实验中。
本发明的一个目的在于克服上述缺点，并且特别是提供一种用于从槐糖脂生产槐糖的简单和经济的方法。由此在水解液中含有的槐糖然后可用作为在能够生产纤维素酶的微生物中，特别是在里氏木霉中的诱导剂。
发明概述
该目的通过以下工艺达成，其中：
a)提供槐糖脂的水溶液；
b)添加酸性化合物至槐糖脂的水溶液中，该酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.01wt％-6wt％；
c)对步骤b)中获得的混合物在60℃-110℃的温度下加热2-200小时。
本发明的工艺采用在酸性化合物(即其能够在溶液中释放H+离子)的存在下在水性介质中的槐糖脂的水解。
在本发明的上下文中，术语“槐糖脂”(或槐糖脂类)表示包含经由苷型(osidictype)键(在槐糖的1’碳与脂肪酸的ω-1碳之间)与脂肪酸相连的槐糖单元的化合物。该槐糖脂可通过微生物，特别是通过假丝酵母菌属(genus Candida)的酵母来生产。根据提供给微生物的脂类和培养条件，可以获得不同槐糖脂的混合物，其为酸形式(自由羧基官能团)或环内酯形式(在脂肪酸和在槐糖的4”位中的-OH基团之间的酯键)，且具有可被乙酰化的6’和6”-OH基团。
在介质中槐糖脂的量通常为2-800g/L，并且优选100-400g/L。
酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.01wt％-6wt％，优选相对于槐糖脂重量的0.1wt％-2wt％。还更优选，该酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.1wt％-1wt％。
依据一种特别的实施方式，在介质中槐糖脂的量为100-400g/L，且酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.1wt％-2wt％。
使用的酸性化合物为无机酸或有机酸。
优选地，该酸性化合物为无机酸，其选自硫酸，盐酸，磷酸和硝酸。优选地，该无机酸为硫酸。
依据该工艺的一种特别的实施方式，进行使获自水解步骤的混合物的脂相和水相分离的步骤，以回收包含槐糖和葡萄糖的水溶液(水解液)。
将通过这种方式在水解步骤结束并且在脂相分离后获得的水解液用作为用于在微生物(如，例如为里氏木霉)中诱导编码纤维素酶的基因的表达的溶液。
在使用其作为诱导溶液之前，也可通过添加产醇(alcoholigenic)微生物来纯化所述包含槐糖和葡萄糖的混合物的水溶液，该产醇微生物能够发酵葡萄糖以形成乙醇至该溶液中，然后通过进行乙醇发酵并最终通过将乙醇分离出去(例如通过汽提)以回收经纯化的包含槐糖的水解液。
发明详述
本发明描述了用于进行酸水解的条件，目的在于生产槐糖和避免槐糖脂的完全水解，槐糖脂的完全水解将导致每个槐糖脂分子的两个葡萄糖单元的释放。
在下面描述的条件下，水解能够用于优先断裂在槐糖和脂族链之间的苷键，其导致槐糖的释放。然而不可避免地且根据操作条件在或多或少的程度上，释放的槐糖本身也可能被水解成两个葡萄糖单元。
在实践中，首先提供槐糖脂的水溶液。该水溶液的槐糖脂浓度通常为2-800g/L，优选100-400g/L。优选地，将以酸形式而不以内酯形式来使用槐糖脂。该酸形式可通过在生产槐糖脂过程中优化发酵条件，或通过在碱性条件下对发酵产品进行水解(皂化)来获得。
将酸性化合物添加至该溶液以在混合物中产生相对于槐糖脂的重量为0.01wt％-6wt％，优选0.1wt％-2wt％，更优选0.1wt％-1wt％的酸浓度。
该酸性化合物为有机酸或无机酸。优选使用无机酸，其可选自硫酸、盐酸、磷酸和硝酸。优选该酸为硫酸。如果使用有机酸，其可选自甲酸、乙酸、草酸、三氟乙酸和马来酸。
水解通过加热该酸混合物至通常为60℃-110℃的温度持续2小时-200小时，优选5小时-24小时来进行。在该处理结束后，通过水解释放的脂肪酸形成不与水混溶的相，其可以容易地与水相分离。该水相(称为水解液)包含葡萄糖和槐糖的混合物，它们的比例作为所使用的酸的剂量和水解时间的函数而变化。
以这种方式获得的水解液可用于通过微生物生产有用蛋白质(纤维素酶)，该微生物的编码基因受可由槐糖诱导的促进剂的控制。特别地，该微生物来自木霉菌属(genusTrichoderma)，优选里氏木霉。
可使用适合该微生物的并且本领域技术人员已知的任何类型的生产工艺。特别地，将包含槐糖的水解液用在如文件FR2555603中所描述的“分批进料”类型的工艺中。
为此，准备包含微生物和培养基的预培养，该培养基包含无机盐和常用的维生素补充物以及碳源和能量源，优选为可溶性糖(例如乳糖)的形式。然后将该预培养转移至包括培养基的酶生产发酵罐中，该培养基含有至少一种糖并且以通常方式补加诱导溶液。在本发明的上下文中，使用的诱导溶液是获自槐糖脂水解的水解液。接下来，在发酵罐中通过保持微生物和培养基之间的必要接触并且通过以规则方式(例如连续地)供应槐糖诱导溶液来生产酶。
在使用前，也可纯化该获自水解步骤的混合物(水解液)以分离产生的槐糖。为此，向所述混合物添加能够将葡萄糖发酵为乙醇的微生物，如，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，然后进行发酵步骤。发酵后获得的最终混合物经历用于汽提乙醇的步骤以回收槐糖的水溶液。也可使用获得的槐糖水溶液作为用于诱导在微生物中的基因表达的溶液。
附图说明
图1表示在葡萄糖、乳糖和槐糖脂单独地或作为混合物存在时，生产的纤维素酶的浓度。
图2表示作为用于槐糖脂受控水解的硫酸的浓度的函数的葡萄糖和槐糖的浓度变化。
图3比较了使用包含葡糖糖和乳糖或槐糖的溶液在用间歇进料供应的生产期间通过里氏木霉生产的纤维素酶的比速率。
实施例
实施例1(不依据本发明)
在烧瓶中在10g/L的葡萄糖上生长里氏木霉(T.reesei)直到葡萄糖耗尽之后，获得包含5g/L的生物质(T.reesei细胞)的培养基。在该培养基中，实施浓缩的葡萄糖溶液和获自假丝酵母菌(candida bombicola)培养的为酸形式的槐糖脂溶液的注入，以获得如图1中所示的所希望量的葡萄糖和槐糖脂。也进行了葡萄糖单独注入，乳糖(传统工业诱导剂)单独注入和槐糖脂单独注入，对应于对照培养基。
在培育20h之后，分析在各种测试培养基中生产的蛋白质(纤维素酶)的量。通过Lowry OH等(1951)提出的方法[Protein measurement with Folin phenolreagent.Journal of Biological Chemistry in 193，1，265-275]使用DC蛋白质定量分析试剂盒(Biorad)进行蛋白质定量分析。
现参考图1，结果显示在槐糖脂存在下生产的酶的量仍然低于在乳糖存在下的量，因此未精制的槐糖脂与乳糖相比是更差的诱导剂。
实施例2(用于槐糖脂的受控酸水解的条件的优化)
在试管中，使1mL酸形式的大约250g/L的槐糖脂水溶液(获自假丝酵母菌培养)与浓缩的硫酸进行混合，以获得以酸重量计相对于槐糖脂重量的0.25％-2％的硫酸浓度。
用密封塞密封该试管，然后将其放置在100℃下的干浴中16小时。使用HPLC测量在水解过程中释放的糖(葡萄糖和槐糖)的浓度。
参考图2，可以看出，当增加硫酸的量时，糖的总的释放得到改进(对于相同的水解时间)，然而混合物主要包含葡萄糖。相反，对于较少量的硫酸，即相对于槐糖脂的重量的0.1wt％-1wt％的硫酸，在水解之后，混合物的总糖含量更低，但是槐糖的比例是高得多的(在使用相对于槐糖脂重量的0.25wt％的硫酸水解的混合物中存在41wt％的槐糖)。
使用相对于槐糖脂重量的8wt％的硫酸进行相同的实验5小时，导致了单独的葡萄糖的释放而没有相关的槐糖的释放。
实施例3(受控的槐糖脂水解)
制备200mL包含大约200g/L的酸形式的槐糖脂和相对于槐糖脂重量的0.25％的硫酸的溶液。在曲颈瓶中使该溶液在搅拌和在回流下沸腾12小时。将由水解得到的包含脂类的油性级分与水相分离，并通过HPLC分析释放在水性级分中的糖(葡萄糖和槐糖)。测量的浓度为10.3g/L的槐糖和16.6g/L的葡萄糖，即在释放的糖混合物中38wt％的槐糖。
实施例4(用槐糖脂水解液来诱导通过里氏木霉的纤维素酶生产)
在搅拌的烧瓶中在葡萄糖上生长里氏木霉(T.reesei)CL847细胞(Durand H.等(1988a)Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for theselection of improved cellulolytic industrial strains.In：FEMS Symposium n°43：Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，p. 135-151.Academic Press，London)直到葡萄糖消耗完之后，使用“分批进料”工艺使用具有如下组成的溶液来进行纤维素酶的生产：50g/L的糖混合物和15mL/L的20wt％NH3，如在出版物“A newstoichiometric miniaturization strategy for screening of industrial microbialstrains：application to cellulose hyper-producing Trichoderma reesei strains”，Microbial Cell Factories 2012，11：70中所描述的。
使用的糖混合物包含(100-x)％重量的葡萄糖和x％重量的诱导糖：
-在第一种情况下(对照)，诱导糖为乳糖，其量为x＝8％
-在第二种，第三种和第四种情况下，诱导糖为来自在实施例3中获得水解液的槐糖，该水解液补加纯的葡萄糖以分别具有x＝8％，x＝0.3％和x＝0.03％。
该分批进料工艺进行166小时，使用0.3mL/h的溶液供应流速并在30℃的温度下。
每天采取样品以监测细胞的浓度和蛋白质的浓度。将用于该分批进料工艺的糖混合物的诱导能力以蛋白质生产的比速率(每克生产细胞每小时产生的蛋白质mg)表示。
在图3中将观察到，在相同浓度下，包含槐糖的混合物引起的诱导大约为包含乳糖的混合物的两倍高，分别具有为12mg/g/h对6.4mg/g/h的比蛋白质生产速率。
此外，在图3中将观察到，包含0.03％槐糖的混合物已经引起与包含8％乳糖的混合物相当的诱导，具有为6mg/g/h的比蛋白质生产速率。
最后，在图3中将观察到，包含0.3％槐糖的混合物引起与包含8％槐糖的混合物相当的诱导，具有为10.5mg/g/h和12mg/g/h的各自比蛋白质生产速率。

Claims (6)

1.一种用于从槐糖脂生产槐糖的方法，其中：
a) 提供槐糖脂的水溶液；
b) 添加酸性化合物至槐糖脂的水溶液中，该酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.01wt%-2 wt%；
c) 对步骤b)中获得的混合物在60℃-110℃的温度下加热2-200小时，
其中所述酸性化合物为选自硫酸，盐酸，磷酸和硝酸的无机酸或者选自甲酸、乙酸、草酸、三氟乙酸和马来酸的有机酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中水溶液中的槐糖脂的量为2-800g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中酸性化合物的量为相对于槐糖脂重量的0.1wt%-2wt%。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性化合物为硫酸。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行用于使获自步骤c)的混合物的脂相和水相分离的步骤，以回收包含槐糖和葡萄糖的含水水解液。
6.一种对根据权利要求5的方法获得的水解液的槐糖进行纯化的方法，包括以下步骤：
a) 在水解液中添加能够将葡萄糖发酵为乙醇的微生物；
b) 对水解液进行乙醇发酵以提供经发酵的水解液；
c) 汽提在经发酵的水解液中存在的乙醇。
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