MX2014000665A - Proceso de produccion de celulasas para hongo filamentoso adaptado a fermentador que tiene un coeficiente reducido de transferencia volumetrica del oxigeno. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso de producción de celulasas por una cepa de un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y ventilado, que comprende al menos dos etapas de crecimiento: - la primera etapa de crecimiento en la presencia de al menos un sustrato carbonoso de crecimiento en la fase por lotes con una concentración en el sustrato carbonoso de crecimiento comprendido entre 10 y 80 g/l, - una segunda etapa de crecimiento y de producción en la presencia de al menos un sustrato carbonoso inductor en la fase por lotes de alimentación en la presencia de un flujo limitante de la fuente del carbono comprendido entre 50 y 140 mg por gramo de las células y por hora.

Description

PROCESO DE PRODUCCION DE CELULASAS PARA HONGO FILAMENTOSO ADAPTADO A FERMENTADOR QUE TIENE UN COEFICIENTE REDUCIDO DE TRANSFERENCIA VOLUMETRICA DEL OXIGENO Campo de la Invención La invención está relacionada con un proceso de producción de celulasas por un hongo filamentoso, necesario para la hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica utilizada por ejemplo en los procesos de producción de biocarburantes llamados de segunda generación o de otros procesos de las industrias químicas, papeleras o de textiles.

Antecedentes de la Invención La elaboración de los procesos económicamente viables de producción de biocarburantes de segunda generación es en el presente de un amplio tema de actualidad. Estos últimos son producidos a partir de una biomasa lignocelulósica y poseen menos problemas de concurrencia del uso de tierras agrícolas con la alimentaria, con respecto a los biocarburantes llamados de la primera generación que son producidos a partir del azúcar de caña, del maíz, del trigo o de la remolacha.

La biomasa ligno-celulósica se caracteriza por una estructura compleja constituida de tres principales fracciones: la celulosa, las hemicelulosas y las ligninas. De manera clásica, el proceso de su transformación en etanol Ref. 245751 comprende varias etapas. El pretratamiento permite hacer accesible la celulosa a las enzimas que son de las celulasas. La etapa de hidrólisis enzimática permite la transformación de la celulosa en glucosa que es transformada enseguida en etanol en el momento de la etapa de fermentación en general por la levadura de Saccharomyces cerevisiae . Por último, la etapa de destilación va a permitir separar y recuperar el etanol del mosto de la fermentación.

Los diferentes estudios técnicos-económicos demuestran que la reducción del costo de las celulasas es uno de los puntos clave de los procesos de producción biológica del etanol a partir de las materias primas lignocelulósicas . En el presente, las celulasas industriales son producidas principalmente por un hongo filamentoso, Trichoderma reesei, en razón de su gran poder de secreción. La estrategia que es aplicada industrialmente es hacer crecer rápidamente el hongo hasta una concentración dada, luego inducir la producción de celulasas para maximizar la productividad y el rendimiento. Trichoderma reesei es estrictamente aeróbico y su crecimiento conduce a un gran aumento de la viscosidad del medio lo cual hace difícil la transferencia del oxígeno necesaria para su supervivencia. Esto último está relacionado con la KLa que es llamado el coeficiente de transferencia volumétrica del oxígeno calculado sobre una unidad de volumen del medio. Este es el producto del coeficiente KL (coeficiente de intercambio global para 02 en m.s"1 o m.h"1) por el coeficiente "a" (aire de intercambio específico calculado sobre una unidad del volumen de la fase líquida del medio de cultivo, en m2 por m3 del medio de cultivo) . La KLa es proporcional a la agitación y a la ventilación. A fin de satisfacer la demanda biológica de oxígeno que aumenta durante la fase de crecimiento del hongo, es necesario aumentar la transferencia de oxígeno que se hace generalmente por un aumento de la agitación o del caudal de ventilación. Esto conduce a un aumento de los consumos energéticos del proceso (potencia del motor para la agitación y del compresor para la ventilación) con un aumento, como una consecuencia, de los costos operativos. Los costos relacionados con la agitación y la ventilación pueden representar hasta 50 % de los costos operativos del procedimiento de producción de las celulasas.

Una de las vías de disminución del costo de la producción de las enzimas es así reducir los costos operativos modificando el manejo del proceso a manera de minimizar el KLa necesario manteniendo la productividad de las celulasas. Esto permite además simplificar el estudio de la puesta a escala (o escalamiento en inglés) para el diseño del termentador industrial (típicamente, de 100 a 1000 m3) que se vuelve difícil para los valores de KLa superiores a 200 h"1.

Las enzimas del complejo enzimático de Trichoderma. reesei contienen tres grandes tipos de actividades: las endoglucanasas , las exoglucanasas , y las celobiasas o beta-glucosidasas . Otras proteínas poseen funciones o actividades indispensables para la hidrólisis de los materiales ligno-celulósicos son producidos igualmente por Trichoderma reesei, las xilanasas por ejemplo. La presencia de un sustrato inductor es indispensable para la expresión de las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas .

La regulación de los genes de las celulasas sobre diferentes fuentes de carbono ha sido estudiada con detalle. Los mismos son inducidos en la presencia de celulosa, de sus productos de las hidrólisis (por ejemplo: la celobiosa) o de ciertos oligosacáricos como la lactosa o la soforosa (limen et al., 1997; Appl . Environ. Microbiol . 63: 1298-1306). Las técnicas de genética clásicas para mutación han permitido la selección de las cepas de Trichoderma reesei hiperproductoras de celulasas tales como las cepas MCG77 (Gallo - patente US 4275 167), MCG 80 (Alien, A. L. y Andreotti, R. E . , Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt , B. S. y Eveleigh, D. E. , Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand et al, 1984, Proc . Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriéis". París, H. HESLOT Ed, pp 39-50). Para obtener buenas productividades de las enzimas, los procesos industriales de producción de las celulasas como por ejemplo aquellos descritos en la patente FR 2 881 753 se encuentran en dos etapas : - una etapa de crecimiento en el modo "por lotes" en donde es necesario aportar una fuente de carbono rápidamente asimilable para el crecimiento de Trichoderma reesei, luego una etapa de producción en el modo de "alimentación por lotes" utilizando un sustrato inductor como por ejemplo la lactosa que permite la expresión de las celulasas y la secreción en el medio de cultivo. La alimentación de manera continua de estos sustratos carbonosos, solubles, limitando la concentración residual en los cultivos y optimizando la cantidad del azúcar, permite obtener grandes productividades enzimáticas. El flujo óptimo de la fuente carbonosa aplicada en la patente citada está comprendido entre 35 y 45 mg (de azúcar) .g (de peso seco celular) ~1. h"1.

Este protocolo presenta el inconveniente de necesitar un gran consumo de energía para responder a la demanda de oxígeno del microorganismo. Al final de la fase de crecimiento, la demanda de oxígeno es muy elevada. En efecto, cuando todos los sustratos están disponibles en exceso, el crecimiento se hace a una tasa de crecimiento próxima a la tasa de crecimiento máxima de las cepas. La demanda biológica del oxígeno que es una función de la tasa de crecimiento y de la concentración de la biomasa va a aumentar. Como los cultivos se hacen regulando la concentración de oxígeno disuelto a un valor constante, la velocidad de transferencia del oxígeno VTO debe ser igual a la velocidad de consumo de oxígeno VCO (o demanda biológica de oxígeno) . kLa* (02*-02L) = ( *X)/RX/02 con: 02*: concentración de oxígeno en la saturación 02L: concentración de oxígeno en la fase líquida µ: tasa de crecimiento del microorganismo (h-1) Rx02 = rendimiento de la biomasa celular con respecto al oxígeno consumido X = concentración de la biomasa (peso seco) celular Este tipo de proceso necesita así una kLa muy elevada para satisfacer esta demanda. Esta se hace en general por un aumento de la agitación (o de la ventilación) consumidora de energía eléctrica.

Con una kLa 2 veces más reducida, la biomasa máxima que es posible lograr con la misma tasa de crecimiento es de 2 veces más reducida. Es posible lograr la misma cantidad de biomasa con una tasa de crecimiento más reducida pero esto necesita más tiempo y así ocasiona una baja de la productividad final de las enzimas secretadas.

La presente invención permite controlar mejor la demanda biológica de oxígeno sin disminuir la productividad de las enzimas. Esto se ha vuelto posible por la explotación de las características fisiológicas de los hongos filamentosos tales como Trichoderma reesei en condición de limitación por el sustrato carbonoso.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un proceso de producción de las celulasas por un hongo filamentoso que permite mantener los funcionamientos de la productividad en las enzimas utilizando un biorreactor que tiene un coeficiente reducido de transferencia volumétrica de oxígeno kLa.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa una comparación de los valores simulados por el modelo con los valores experimentales citados en el artículo de Tolan y Foody (1999) obtenidos con otra cepa de Trichoderma reesei.

La Figura 2 representa la evolución de la concentración de la biomasa, de las proteínas y de la kLa que corresponden al ejemplo 1.

La Figura 3 representa la evolución de las variables de estado en el transcurso del tiempo que corresponden al ejemplo 2.

La Figura 4 representa la evolución de las variables de estado en el transcurso del tiempo que corresponden al ejemplo 3.

La Figura 5 representa la evolución de kLa en el transcurso del tiempo que corresponde al ejemplo 3.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención incluye un proceso de producción de celulasas por una cepa de un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y ventilado que comprende al menos dos etapas : - la primera etapa de crecimiento en la presencia de al menos un sustrato carbonoso de crecimiento en la fase por lotes con una concentración del sustrato carbonoso de crecimiento comprendido entre 10 y 80 g/1. - una segunda etapa de crecimiento y de producción en la presencia de al menos un sustrato carbonoso inductor en la fase de alimentación por lotes en la presencia de un flujo limitante de la fuente de carbono comprendida entre 50 y 140 mg por gramo de células y por hora.

De manera preferida, la concentración del sustrato carbonoso de crecimiento está comprendida entre 10 y 20 g/1. Todavía más preferentemente, la misma está comprendida entre 12 y 17 g/1.

Durante la fase de crecimiento, la concentración del sustrato carbonoso es tal que el crecimiento se hace a la tasa de crecimiento máxima.

De manera preferida, la concentración del sustrato carbonoso inductor utilizado en la fase por lotes de alimentación está comprendida entre 70 y 100 mg por gramo de células y por hora. Todavía más preferentemente, la misma está comprendida entre 80 y 90 mg por gramo de células y por hora .

El biorreactor utilizado en la presente invención puede tener así un coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno kLa comprendido entre 40 y 180 h"1, de preferencia entre 40 y 150 h"1.

La segunda etapa es realizada en condición de limitación del sustrato carbonoso con un flujo inferior a la capacidad máxima de consumo de la cepa.

El sustrato carbonoso de crecimiento es elegido de preferencia entre la lactosa, la glucosa, la xilosa, los residuos obtenidos después de la fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos de la biomasa celulósica, y/o de un extracto bruto de pentosas hidrosolubles que provienen del pretratamiento de una biomasa celulósica .

El sustrato carbonoso inductor es elegido de preferencia entre la lactosa, la celobiosa, la soforosa, los residuos obtenidos después de la fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos de la biomasa celulósica, y/o un extracto bruto de pentosas hidrosolubles que provienen del pretratamiento de una biomasa celulósica .

Los sustratos de crecimiento e inductores citados posteriormente pueden ser utilizados solos o mezclados. Según su naturaleza, el sustrato carbonoso de crecimiento elegido para la obtención de la biomasa es introducido en el termentador antes de la esterilización o es esterilizado separadamente y se introduce en el biorreactor después de la esterilización.

El sustrato carbonoso inductor introducido durante la fase de alimentación por lotes es esterilizado de manera independiente, antes de ser introducido en el reactor.

De manera preferida, cuando la fuente de carbono inductora es la lactosa, la solución acuosa es preparada a la concentración de 200-250 g.l"1.

El proceso según la presente invención permite obtener una productividad análoga a las celulasas utilizando un biorreactor que tienen una capacidad de transferencia del oxígeno de dos veces y media más reducida, o sea una KLa de 100 h"1 en lugar de 250 h"1. La correlación que relaciona la KLa con la potencia disipada en los biorreactores ventilados y agitados, tales como aquellos indicados por ejemplo en el reporte NREL "Lignocellulosic Biomass to Etanol Process Design and economic utilizing co-current Dilute acide prehydrolysis and enzymatic hydrolysis current and futuristic scenarios" , R Wooley et al. NREL/TP-580-26157 (1999), sección de producción de enzimas, es la siguiente: KLa = 0.026* (P/V) °-4*VG0-5 con: P/V: potencia disipada en W/m3 VG: velocidad superficial del gas (m/s) .

Así, siguiendo esta correlación, la potencia disipada (P/V) para una K^a de 100 h"1 es aproximadamente 10 veces inferior a aquella necesaria cuando la KLa vale 250 h"1.

La ventaja del proceso según la presente invención es permitir una simplificación de la extrapolación del proceso a la escala industrial (típicamente de 100 a 1000 m3) y una reducción de los costos operativos.

El proceso es simple, robusto y explota las propiedades fisiológicas del hongo en condiciones de limitación por el sustrato carbonoso.

El modo de conducción ha sido adaptado con respecto al proceso clásico, por una parte disminuyendo la concentración inicial en el sustrato del crecimiento en el momento de la primera fase del proceso en el modo "por lotes" , a fin de reducir la demanda biológica máxima de oxígeno al final de esta fase y por otra parte aumentando el flujo del sustrato carbonoso en el momento de la fase de "alimentación por lotes" para continuar, durante el inicio de esta fase, en producir, a una tasa de crecimiento reducido, la biomasa celular al mismo tiempo que las enzimas. Las propiedades fisiológicas del hongo son explotadas para determinar el caudal de la alimentación por lotes y la concentración de la biomasa deseada.

Esto permite mantener los funcionamientos finales en la productividad del proceso necesitando capacidades de transferencia del oxígeno menores del biorreactor.

La cepa utilizada en el proceso es una cepa de un hongo filamentoso que pertenece a los géneros Trichoderma., Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum. De manera preferida, las cepas utilizadas son las cepas que pertenecen a la especie Trichoderma reesei .

Las cepas industriales utilizadas que pertenecen a la especie Trichoderma reesei, eventualmente modificadas para mejorar las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas por los procesos de mutación-selección como por ejemplo la cepa IFP CL847; las cepas mejoradas por las técnicas de recombinación genética pueden ser utilizadas igualmente. Estas cepas son cultivadas en termentadores agitados y ventilados en las condiciones compatibles con su crecimiento y la producción de las enzimas. Otras cepas de microorganismos que producen enzimas según los procesos semejantes a aquellos utilizados por Trichoderma pueden ser utilizados.

De manera preferida, la cepa utilizada es una cepa de Trichoderma reesei modificada por mutación, selección o recombinación genética.

Por ejemplo, la cepa es una cepa CL847, RutC30, MCG77, o MCG80.

Un flujo del sustrato carbonoso inductor qs superior a aproximadamente 140 mg de azúcar por g de la biomasa por h ocasiona una acumulación de azúcar en el medio y modifica el comportamiento fisiológico de Trichoderma conduciendo a una reducción de la velocidad específica de producción de las proteínas qp (fenómeno de represión catalítica) . Limitando este flujo a los valores comprendidos entre 50 y 140 mg de azúcar por gramo de biomasa y por hora, la cepa produce simultáneamente, cuando está en la condición de limitación, la biomasa y las enzimas, para tender hacia un estado de equilibrio en donde no se hacen más que las enzimas .

Un modelo ha sido establecido sobre la base de estas observaciones y ha sido aplicado para simular la producción de la biomasa y de las enzimas realizada de manera continua a una tasa de disolución de 0.018 h"1 para diferentes concentraciones iniciales del sustrato carbonoso. Las condiciones corresponden a los trabajos descritos en un artículo de Tolan y Foody ("Cellulase from submerged fermentation" , (1999), Adv. in biochemical engineering biotechnology, Vol . 65, p 42-67) que cita los trabajos de Nicholson et al. (1989) (Proceedings 7th Canadian bioenergy seminar, Energy Mines, and Resources) y que proporciona los resultados experimentales de las concentraciones de la biomasa y de las proteínas. Se han considerado los parámetros cinéticos identificados de la cepa CL847 aún si los autores utilizan una cepa diferente. Los resultados son reportados en la Figura 1 y demuestran una muy buena adaptación entre el modelo y la experiencia.

Esto demuestra igualmente que este modelo es valioso para otras cepas de Trichoderma reesei que tienen el mismo comportamiento fisiológico que la cepa CL847.

La concentración del sustrato carbonoso de crecimiento durante la fase por lotes ha sido reducida con respecto a la enseñanza del arte previo (FR 2 881753) para reducir la demanda biológica máxima de oxígeno al final de esta fase (a umax) para un biorreactor que tiene una kLa de 100 h"1. El flujo del sustrato carbonoso es aumentado enseguida en el momento de la fase de "alimentación por lotes" con respecto a la patente FR 2 881 753 que recomienda un flujo comprendido entre 35 y 45 mg del sustrato carbonoso inductor por gramo de la biomasa y por hora. Esto permite continuar una producción de la biomasa al mismo tiempo que las enzimas durante el inicio de esta fase pero a una tasa de crecimiento reducida, lo que permite controlar la demanda biológica de oxígeno. El flujo de la fuente de carbono durante la fase de alimentación por lotes es aumentada así a un valor superior a 50 mg de azúcar por gramo de la biomasa y por hora al inicio de la fase por lotes de alimentación. El crecimiento es proseguido al mismo tiempo que la producción de las enzimas y se estabiliza cuando el flujo de la fuente carbonosa estará próximo al óptimo de la cepa.

Ej em los Entre los ejemplos que siguen, el ejemplo 1 presenta un cultivo utilizando las condiciones de referencia de la patente 2 881 753 con un biorreactor que tiene una kLa de 250 h"1. El Ejemplo 2 presenta una experiencia realizada en las mismas condiciones que el ejemplo 1 con un fermentador que tiene una kLa de 100 h"1. Este ejemplo produce una acumulación del sustrato carbonoso con una gran producción de biomasa y una producción reducida de enzimas. El ejemplo 3 es aquel que utiliza el proceso según la presente invención. El mismo permite obtener una productividad análoga a aquella del ejemplo 1 con un biorreactor que tiene una kLa de 100 h"1.

Ejemplo 1: Producción de enzimas sobre la glucosa La producción de las celulasas es efectuada en el fermentador agitado mecánicamente. El medio mineral tiene la siguiente composición: KOH 1.66 g/1, H3P04 85 % 2 ml/1, (NH4)2S04 2.8 g/1, gS04 7 H20 0.6 g/1, CaCL2 0.6 g/1, MnS04 3.2 mg/1, ZnS04í 7 H202.8 mg/1, CoCl2 10 4.0 mg/1, FeS04 7 H20 10 mg/ml, concentrado de maíz 1.2 g/1, anti -espumante 0.5 ml/1.

El fermentador que contiene el medio mineral es esterilizado a 120 °C durante 20 minutos, la fuente carbonosa es una solución de glucosa esterilizada aparte a 120 °C durante 20 minutos luego agregada de manera estéril en el fermentador de manera que tenga una concentración final de 30 g/1. El fermentador es sembrado al 10 % (v/v) con un precultivo líquido de la cepa de Trichoderma reesei CL847. El medio mineral del precultivo, es idéntico a aquel del fermentador colocado aparte de la adición del ftalato de potasio a 5 g/1 para amortiguar el pH. El crecimiento del hongo en el precultivo se hace utilizando la glucosa como el sustrato carbonoso, a la concentración de 30 g.L"1. El crecimiento del inoculo dura de 2 a 3 días y es efectuado a 28 °C en un incubador agitado a presión atmosférica. La transferencia hacia el fermentador es realizada si la concentración residual de glucosa es inferior a 15 g/1.

El experimento efectuado en el biorreactor comprende dos fases: Una fase de crecimiento sobre el sustrato carbonoso de glucosa (concentración inicial = 30 g/1) a una temperatura de 27 °C y a un pH de 4.8 (regulado por una solución de amoniaco 5.5 M) . La ventilación es de 0.5 wm y la agitación es aumentada entre 200 y 800 rpm en función de la p02 (la presión del oxígeno disuelto) , que es regulada a un 30 %.

- Una fase de producción de enzimas. Después de 30 horas, la solución de la lactosa a 250 g.L"1 es inyectada de manera continua al caudal de 35 mg por g de células y por hora hasta 250 horas. La temperatura es reducida a 25 °C y el pH a 4 hasta el final del cultivo. El pH es regulado por la adición de una solución de amoniaco al 5.5 N que lleva el nitrógeno necesario para la síntesis de las proteínas excretadas. El contenido de oxígeno disuelto es mantenido arriba del 30 % por la acción de la agitación.

La producción de las enzimas es seguida por la dosificación de las proteínas extracelulares por el proceso de Lowry basado sobre una calibración realizada con la BSA (siglas en inglés para "Albúmina del suero del bovino"), después de la separación del micelio por filtración o centrifugación. Las actividades celulolíticas determinadas son : - La actividad del papel filtro o FP, expresada en UPF (siglas en inglés para papel filtro unitario) que permite dosificar la actividad global de la agrupación enzimatica de endoglucanasas y exoglucanasas .

- Las actividades de las ß-glucosidasas y xilanasas para las actividades específicas.

La actividad FP es medida sobre papel hatman No. 1 (proceso recomendado por la comisión biotecnológica IUPAC) a la concentración inicial de 50 g.l"1; se determina la toma del ensayo de la solución enzimatica que se va a analizar, que libera el equivalente de 2 g.L"1 de la glucosa (dosificación colorimétrica) en 60 minutos. El principio de la actividad del papel filtro es el de determinar para la dosificación del DNS (ácido dinitrosalicílico) la cantidad de azúcares reductores salidos de un papel Whatman No. 1. El sustrato utilizado para determinar la actividad de la ß-glucosidasa es el p-nitrofenil-p-D-glucopiranósido (PNPG) . Es clave para la ß-glucosidasa que libere el p-nitrofenol . Una unidad de actividad de la ß-glucosidasa está definida como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µp??? de p-nitrofenol a partir de PNPG por minuto y es expresado en IU/ml . El principio de la dosificación de la actividad de la xilanasa reposa sobre la determinación para la dosificación de DNS de la cantidad de los azúcares reducidos surgidos de la solución del xilano hidrolizado. Este proceso de dosificación utiliza las propiedades reductoras de los azúcares y principalmente de la xilosa. La actividad de la xilanasa es expresada en IU/ml y corresponde a la cantidad de la enzima necesaria para producir 1 µt??? de xilosa por minuto.

Las actividades específicas son obtenidas dividiendo las actividades expresadas en IU/ml entre la concentración de las proteínas. Las mismas son expresadas en IU.mg"1.

Las KLa son determinadas a partir de los balances gaseosos después de la verificación de los balances de carbono y redox.

Las determinaciones analíticas sobre el mosto final del Ejemplo 1 dan los resultados siguientes: Biomasa celular g/1 15.5 Proteínas g/1 50.1 Productividad = 0.20 g/L/h UPF 29.1 IU/ml Xilanasa específica 8.2 IU/mg ß-glucosidasa específica 1.0 IU/mg La Figura 2 representa la evolución de la concentración de la biomasa, de las proteínas y de la KLa en el transcurso del tiempo. Se constata que la biomasa celular aumenta hasta 15 g/1 durante las 50 primeras horas del experimento y que la KLa es de 240 h"1. La concentración de las proteínas aumenta ligeramente durante las 50 primeras horas luego fuertemente a partir del momento en donde la concentración de la biomasa es estable. Se logran 50 g/1 al final del cultivo.

Ej emplo 2 : El ejemplo 2 es realizado en las mismas condiciones que el ejemplo 1 salvo que el fermentador utilizado tiene una KLa máxima de 100 h"1 y que su volumen inicial es de 750 mi. La fermentación condujo a una gran producción de la biomasa celular (45 g/1) y a una producción reducida de proteínas (19 g/1) (véase la Figura 3) . Esto se debe a la presencia de las concentraciones residuales importantes del sustrato carbonoso (lactosa, glucosa) de principio a fin del experimento. Esto reprime la producción de las celulasas que es inducida en condición de limitación ser sustrato carbonoso inductor. La glucosa no ha sido consumida porque las capacidades de transferencia del oxígeno del biorreactor son 2.5 veces más reducidas, lo que disminuye la velocidad de consumo del sustrato carbonoso que es proporcional a la velocidad del consumo de 02. En efecto, la velocidad de transferencia del oxígeno es expresada de la siguiente manera: VTO = KLa (02*-02L) con: 02*: concentración del oxígeno en la saturación 02L: concentración de oxígeno en la fase líquida La velocidad de consumo de oxígeno está limitada así por la VTO que es 2.5 veces más reducida. Las determinaciones analíticas sobre el mosto final proporcionan los resultados siguientes: Biomasa celular g/1 45 Proteínas g/1 19 UPF 10.1 IU/ml Xilanasa específica 8.5 IU/mg ß-glucosidasa específica 1.2 IU/mg Ejemplo 3 (según la invención) El biorreactor que tiene una kLa de 100 h"1 es utilizado, pero el proceso de producción es modificado para ser utilizado según la presente invención.

La concentración de la glucosa inicial es así reducida a 15 g/1 de manera que la velocidad biológica máxima del consumo de dioxígeno sea compatible con el termentador utilizado. El rendimiento de la producción de la biomasa celular con respecto a la glucosa es de 0.5 g/g cuando la misma está presente en exceso. Lo que significa que la velocidad máxima de consumo del dioxígeno para esta cantidad de glucosa sea de 0.5 g.l"1.!!-1 (para una tasa de crecimiento máxima de 0.08 tf1 y un rendimiento de la conversión del dioxígeno en la biomasa de 1.2 g/g.

La fase de alimentación por lote es puesta en marcha después de 24 horas con un flujo de 89 mg del sustrato por gramo de la biomasa y por hora (solución de lactosa a 250 g/1) . La fase de crecimiento es proseguida al mismo tiempo que la producción de proteínas. Esta última logra 51.7 g/1 después de 240 horas de experiencia (Figura 4) . La productividad final de las proteínas es mantenida así a pesar de la utilización del termentador que tiene capacidades de transferencia reducidas. La misma es de 0.21 g/l/h (la misma es de 0.20 g/l/h en el caso del ejemplo 1) .

La Figura 5 ilustra la evolución del kLa en el transcurso del experimento que permanece inferior a 100 h"1.

Las determinaciones analíticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados.

Biomasa celular g/1 18.9 Proteínas g/1 51.7 Productividad = 0.21 g/l/h UPF 30.1 IU/ml Xilanasa específica 9.5 IU/mg ß-glucosidasa específica 1.12 IU/mg Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor proceso conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso de producción de celulasas por una cepa que pertenece a un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y ventilado, caracterizado porque comprende al menos dos etapas : - la primera etapa de crecimiento en la presencia de al menos un sustrato carbonoso de crecimiento en una fase por lotes es realizada con una concentración en el sustrato carbonoso de crecimiento comprendido entre 10 y 60 g/1 - una segunda etapa de crecimiento y de producción de enzimas en la presencia de al menos un sustrato carbonoso inductor alimentado en la fase por lotes de alimentación en la presencia de un flujo limitante de la fuente de carbono comprendido entre 50 y 140 mg por gramo de la biomasa celular y por hora .

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración del sustrato carbonoso de crecimiento está comprendido entre 10 y 20 g/1-

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración del sustrato carbonoso está comprendida entre 12 y 17 g/1.

4. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el flujo de la fuente de carbono está comprendido entre 70 y 100 mg por gramo de la biomasa celular y por hora.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el flujo de la fuente de carbono está comprendido entre 80 y 90 mg por gramo de la biomasa y por hora .

6. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el biorreactor tiene un coeficiente de transferencia volumétrica del oxígeno kLa comprendido entre 40 y 180 h"1.

7. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el biorreactor tiene un coeficiente de transferencia volumétrica del oxígeno kLa comprendido entre 40 y 150 h"1.

8. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sustrato carbonoso de crecimiento es elegido entre la lactosa, la glucosa, la xilosa, los residuos obtenidos después de la fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos de la biomasa celulósica, y/o un extracto bruto de pentosas hidrosolubles que provienen del pretratamiento de una biomasa celulósica.

9. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sustrato carbonoso inductor es elegido entre la lactosa, la celobiosa, la soforosa, los residuos obtenidos después de la fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos de la biomasa celulósica, y/o de un extracto bruto de pentosas hidrosolubles que provienen del pretratamiento de una biomasa celulósica.

10. Un proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sustrato carbonoso de crecimiento elegido para la obtención de la biomasa es introducido en el termentador antes de la esterilización.

11. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el sustrato carbonoso de crecimiento elegido para la obtención de la biomasa es esterilizado separadamente e introducido en el biorreactor después de la esterilización.

12. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sustrato carbonoso inductor introducido durante la fase por lotes de alimentación es esterilizado de manera independiente, antes de ser introducido en el reactor.

13. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la cepa utilizada es una cepa de Trichoderma reesei .

14. El proceso de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la cepa utilizada es una cepa de Trichoderma reesei modificada por mutación selectiva o recombinación genética.