CN103890171B - 使用适用于具有低容积传氧系数KLa的发酵罐的丝状真菌用于生产纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在搅拌、通气的生物反应器中使用丝状真菌的菌株生产纤维素酶的方法，其包括至少两个生长步骤，即：第一生长步骤，在至少一种碳质生长底物的存在下，在分批阶段具有10-80g/L的碳生长底物浓度；和第二生长和生产步骤，在至少一种诱导性碳底物的存在下，在分批补料阶段存在以50-140mg/克细胞/小时的碳源限流。

Description

使用适用于具有低容积传氧系数KLa的发酵罐的丝状真菌用于生产纤维素酶的方法
技术领域
本发明涉及使用对于木质纤维素生物量酶水解必需的丝状真菌生产纤维素酶的方法，所述丝状真菌用在例如称为第二代方法的生物燃料的生产方法中，或化工、造纸及纺织工业的其它方法中。
现有技术
用于生产第二代生物燃料的经济上可行的方法的开发目前是一个“热点”。这些燃料从木质纤维素生物量生产，并且与从甘蔗、玉米、小麦或甜菜生产的“第一代”生物燃料相比，在关于与用于食物的农业用地的使用竞争方面产生更少的问题。
木质纤维素生物量表征为由三个主要级分组成的复杂结构：纤维素、半纤维素和木质素。将其转化成乙醇的常规方法包括一些步骤。预处理可以使纤维素能与酶，即纤维素酶接触。酶水解步骤可以用于转化纤维素成葡萄糖，其然后在发酵步骤过程中转化成乙醇，所述发酵通常使用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。最后，蒸馏步骤可以从发酵液（fermentationmust）中分离并回收乙醇。
各种技术-经济的研究已证明，减少纤维素酶的成本是在从木质纤维素物质开始的生物乙醇生产方法中的关键点之一。目前，工业纤维素酶主要是由丝状真菌，里氏木霉（Trichodermareesei）生产，因为其高的纤维素酶分泌能力。该工业上应用的策略是使真菌快速增长到一个给定的浓度，然后诱导纤维素酶的产生，以使生产率和产量最大化。里氏木霉是严格好氧的并且它的生长会导致培养基粘度的大幅度增加，使氧的传递困难，氧的传递对其生存是必需的。氧传递与KLa值有关，其被称为每单位体积培养基的容积传氧系数。其是系数KL（以m/s或m/h表示的总O2交换系数）与系数“a”的（以m2/m3培养基表示的每单位液相培养基体积的具体交换面积）的乘积。KLa值正比于搅拌和通气。为了满足在真菌生长阶段增加的对氧的生物需求，有必要增加氧传递，一般通过增加搅拌或通气流速来实现。这导致方法的能量消耗（用于搅拌的电机和用于通气的压缩机的功率）增加，结果操作成本增加。搅拌和通气相关的成本可以代表用于生产纤维素酶的方法的至多达50％的操作成本。
因此，减少酶的生产成本的一种方法是通过修饰方法的操作减少操作成本，以便最大限度地减少所需的KLa，同时保持纤维素的生产率。这也意味着，关于工业发酵罐尺寸（通常100-1000m3）的规模放大可以被简化，其对于超过200h-1的KLa值变得困难。
里氏木霉酶复合物的酶类包含三个主要的活性类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶。具有对木素纤维素材料的水解至关重要的功能或活性的其他蛋白也由里氏木霉产生，例如木聚糖酶。诱导物底物的存在对纤维素分解和/或半纤维素分解酶的表达是至关重要的。
对针对各种碳源的纤维素酶基因的调控已经进行了详细研究。它们在纤维素、其水解产物（例如：纤维二糖）或某些低聚糖，例如乳糖或槐糖的存在下诱导（IImén等，1997;ApplEnvironMicrobiol63:1298-1306）。
常规突变基因技术已经能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，例如株MCG77（Gallo-专利US4275167）、MCG80（Allen,A.L.andAndreotti,R.E.,Biotechnol-Bioengi1982,12,451-4591982）、RUTC30（Montenecourt,B.S.andEveleigh,D.E.,ApplEnvironMicrobiol1977,34,777-782）和CL847（Durand等,1984,ProcColloqueSFM"Génétiquedesmicroorganismesindustriels"[Geneticsofindustrialmicroorganisms].Paris.H.HESLOTEd,pp39-50）。
为了获得良好的酶生产率，用于生产纤维素酶的工业方法，例如专利FR2881753中所述，例如，是以两个步骤进行：
“分批”模式的生长步骤，其中其对于提供可快速吸收用于里氏木霉生长的碳源是必需的，然后
“补料分批”生产步骤，使用诱导物底物例如乳糖，例如，其允许纤维素酶的表达和分泌到培养基中。这些可溶性碳质底物的连续供应，由此限制培养物中的残留浓度并由此优化糖的量，意味着可以获得高酶生产率。所引用专利中应用的碳质来源的最佳流是在35-45mg（糖）.g（细胞干重）-1.h-1的范围。
此方案遭受迫使高能量输出以满足微生物对氧的需求的缺点。在生长期结束时，氧气的需求是非常高的。事实上，当所有的底物都过量可利用，对于菌株，生长以接近最大生长速率的生长速率发生。对于氧的生物需求，其是生长速率和生物量浓度的函数，将会增加。从培养物调节溶解氧的浓度到恒定值开始，氧传递速率OTR必须等于耗氧速率ROC（或氧的生物需求）。
KLa*(O2*-O2L)=(μ*X)/RX/O2
其中：O2 *：饱和氧浓度
O2L：液相中的氧浓度
μ：微生物生长速率(h-1)
RX/O2：关于消耗氧的细胞生物量产量
X=细胞生物量的浓度(干重)。
此类方法因此需要非常高的KLa以满足此需求。这通常通过增加搅拌（或通气），消耗电能实现。
如果KLa减半，则使用相同生长速率，可能获得的最大生物量减半。在较低的生长速率，其有可能获得相同量的生物量，但是这需要更多的时间，并且从而导致对于分泌酶的最终生产率下降。
本发明可以用于更好地控制对于氧的生物需求而不降低酶的生产率。这通过在碳质底物限制条件下利用丝状真菌，例如里氏木霉的生理特征来实现。
发明概述
本发明涉及通过丝状真菌（其可以用于维持酶生产率性能）的纤维素酶的生产，通过使用具有低容积传氧系数KLa的生物反应器。
附图说明
图1表示使用在Tolan和Foody(1999)的论文中引用的从另一种里氏木霉获得的实验值与通过模型模拟的值的比较。
图2表示实施例1对应的生物量浓度、蛋白的浓度和KLa随时间的变化。
图3表示实施例2对应的状态变量随时间的变化。
图4表示实施例3对应的状态变量随时间的变化。
图5表示实施例3对应的KLa随时间的变化。
发明详述
本发明涉及在搅拌、通气的生物反应器中使用丝状真菌的菌株生产纤维素酶的方法，其包括至少两个步骤：
第一生长步骤，在至少一种碳质生长底物的存在下，在分批阶段具有范围10-80g/L的碳质生长底物浓度；
生长和生产的第二步骤，在至少一种诱导物碳质底物的存在下，在分批补料阶段存在以50-140mg/克细胞/小时范围的限制的碳源流。
优选地，碳质生长底物的浓度是10-20g/L的范围。更优选地，其在12-17g/L的范围。
在生长阶段期间，碳质底物的浓度是使得生长以最高生长速率发生的浓度。
优选地，补料分批阶段使用的诱导物碳质底物的浓度在70-100mg/克细胞/小时的范围内。仍然更优选地，其在80-90mg/克细胞/小时的范围内。
本发明所用的生物反应器从而可以具有在40-180h-1范围内，优选在40-150h-1范围内的容积传氧系数KLa。
第二步骤在限制诱导物碳质底物条件下进行，具有在最大株消耗能力（maximumstrainconsumptioncapacity）以下的流。
碳质生长底物优选地选自乳糖、葡萄糖、木糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵后所得残留物和/或衍生自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
诱导物碳质底物优选地选自乳糖、纤维二糖、槐糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵后所得残留物和/或衍生自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
上文引用的诱导物生长底物可以单独或作为混合物使用。
取决于其性质，选择用于生产生物量的碳质生长底物在灭菌之前被导入发酵罐或它被分开灭菌，并在灭菌后引入生物反应器。
在补料分批阶段引入的诱导物碳质底物被导入反应器之前独立地灭菌。
优选地，当所述诱导物碳源是乳糖时，水溶液制备为200-250g/L的浓度。
本发明的方法可以用于使用具有低两倍半的氧传递能力（即100h-1而不是250h-1的KLa值）的生物反应器获得类似的纤维素酶的生产率。将KLa连接到通气和搅拌的生物反应器中消耗的功率的相关性（correlation）（例如如在NREL报告"Lignocellulosicbiomasstoethanolprocessdesignandeconomicsutilizingco-currentdiluteacidprehydrolysisandenzymatichydrolysis,currentandfuturisticscenarios",RWooley等，NREL/TP-580-26157(1999),酶生产部分中所指示的）如下：
KLa=0.026*(P/V)0.4*VG0.5
其中：P/V：消耗的功率，以W/m3表示
VG：气体的表面速率(m/s)。
因此，根据此相关性，消耗的功率（P/V）对于100h-1的KLa比当KLa是250h-1时所必需的小约10倍。
根据本发明的方法的优点是允许在方法规模放大到工业规模（通常从100到1000m3）过程中的简化和操作成本中的降低。
方法简单、鲁棒（robust）并利用真菌在碳质底物限制条件下的生理性质。
与常规方法比较，所述操作模式一方面已通过在“分批”模式方法的第一阶段期间降低生长底物的初始浓度以减少在此阶段结束时的最大生物氧需求，并且另一方面通过在“补料分批”阶段（在此阶段的开始期间以降低的生长速率）增加碳质底物流以继续生产细胞生物量同时生产酶。利用真菌的生理性质以确定补料分批的流速和所期望的生物量的浓度。
这意味着可以保持最终生产率性能同时对于生物反应器需要更小的氧传递能力。
本方法中使用的菌株是属于木霉属（Trichoderma），曲霉属（Aspergillus），青霉属（Penicillium）或裂褶菌属（Schizophyllum）的丝状真菌菌株。
优选地，所采用的菌株是属于里氏木霉种的菌株。
所使用的工业菌株属于里氏木霉菌种，所述菌株可能通过突变选择方法修饰以改善纤维素分解和/或半纤维素分解酶，例如，如菌株IFPCL847；也可以使用通过基因重组技术改善的菌株。这些菌株在搅拌、通气的发酵罐中培养，在与它们生长和与酶生产相容的条件下。也可以使用与对于木霉使用的那些类似的方法生产酶类的其它微生物菌株。
优选地，所用菌株是通过基因突变、选择或重组修饰的里氏木霉菌株。
作为实例，所述菌株是CL847、RutC30、MCG77或MCG80菌株。
多于约140mg糖/g生物量/h的适量的诱导物碳质底物流qs导致在培养基中的糖积累并修饰里氏木霉的生理行为，导致蛋白生产的比速率qp下降（分解代谢阻遏现象）。通过限制此流到50-140mg糖/克生物量/小时范围内的值，当在限制条件下时，菌株同时产生生物量和酶类并趋于其中它仅制造酶类的平衡状态。
基于这些观察建立了模型，并应用到模拟生物量和酶的生产，所述生产在0.018h-1的稀释度对于各种初始碳质底物浓度连续进行。所述条件对应描述于Tolan和Foody的论文中的研究（"Cellulasefromsubmergedfermentation",(1999),Advinbiochemicalengineeringbiotechnology,Vol65,p42-67），其引用Nicholson等，(1989)（Proceedingsofthe7thCanadianbioenergyseminar,EnergyMines,andResources）的工作，并提供关于生物量和蛋白的浓度的实验结果。我们保留了对CL847菌株确定的动力学参数，尽管那些作者使用不同的菌株。结果报告在图1中并在模型和实验之间证明了非常好的一致性。
这也证明了该模型对于里氏木霉的其他菌株是有效的，其具有与CL847菌株相同的生理行为。
在分批阶段期间碳质生长底物的浓度相比现有技术的公开内容（FR2881753）更低，以减少在这个阶段结束时对于氧的最大生物需求（以μmax表示），用于具有100h-1的KLa的生物反应器。碳质底物流在“补料分批”阶段期间随后相比专利FR2881753增加，其推荐在35-45mg诱导物碳质底物/克生物量/小时的范围的流。这意味着，生物量可以继续与酶在该阶段的开始时同时产生，但以降低的生长速率，这意味着对氧的生物需求是可控制的。从而在补料分批阶段的碳源流增加至多于在补料分批阶段的开始时的50mg糖/克生物量/小时的值。生长与酶生产同时继续并在碳质源的流接近对于菌株最优时稳定。
实施例
在下面的实施例中，实施例1展示了使用专利FR2881753的参考条件与具有250h-1的KLa的生物反应器的培养。实施例2展示了在与实施例1相同的条件下使用具有100h-1的KLa的生物反应器的进行的实验。该实施例结束时具有高生物量生产和低酶生产的碳质底物的积累。实施例3是实施本发明的方法的实施例。其使用具有100h-1的KLa的生物反应器用于获得类似于实施例1的生产率。
实施例1：基于葡萄糖的酶的生产
在机械搅拌的发酵罐中进行纤维素生产。矿质培养基具有下列组成：KOH1.66g./L、85%H3PO42mL/L、(NH4)2SO42.8g/L、MgSO4.7H2O0.6g/L、CaCl20.6g/L、MnSO43.2mg/L、ZnSO4、7H2O2.8mg/L、CoCl2104.0mg/L、FeSO4.7H2O10mg/L、玉米（CornSteep）浸出1.2g/L、消泡剂0.5mL/L。
包含矿质培养基的发酵罐在120℃灭菌20分钟，碳质源是在120℃灭菌20分钟然后以无菌方式添加到发酵罐以产生30g/L终浓度的葡萄糖溶液。发酵罐用里氏木霉CL847菌株液体预培养物接种至10%（v/v)。用于预培养的矿质培养基与发酵罐的培养基相同，除了添加5g/L邻苯二甲酸钾以缓冲pH。使用在30g/L浓度的葡萄糖作为碳质底物进行在预培养期间的真菌的生长。接种物的生长持续2至3天并在28℃在搅拌的培养器中在大气压下进行。如果葡萄糖的残留浓度低于15g/L则进行向发酵罐的转移。
在生物反应器中进行的实验包括两个阶段：
生长阶段，在葡萄糖碳质底物（初始浓度=30g/L）上，在27℃的温度和pH4.8（使用5.5M氨性溶液设置）下。通气在0.5vvm并且搅拌增加到200和800rpm之间作为O2压力（溶氧的压力）的函数，其设置在30%。
酶生产阶段30小时后，250g/L乳糖溶液以35mg/g细胞/小时连续注射250小时。温度下降到25℃并且pH到4，直至培养结束。通过添加5.5M氨性溶液设置pH，所述氨性溶液提供对于分泌蛋白合成必需的氮。通过搅拌动作将溶氧的量保持高于30%。
酶生产随后是使用Lowry法基于用BSA（“牛血清白蛋白”）进行校准测定细胞外蛋白，在通过过滤或离心分离菌丝体之后进行。确定的纤维素分解活性如下：
-滤纸活性或FP，以FPU表示（滤纸单位），其可以用于测定内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶混合物（pool）的总体活性；
-对于比活性的β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性。
FP活性以50g/L的初始浓度在WhatmanN°1纸上测量（IUPAC生物技术委员会推荐的程序）；确定待分析的酶溶液的测试样品在60分钟内释放2g/L葡萄糖的等价物（比色法测定）。滤纸活性的原理是通过DNS（二硝基水杨酸）测定来确定从WhatmanN°1纸获得的还原糖的量。
用于确定β-葡萄糖苷酶活性的底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）。它被β-葡萄糖苷酶切割，其释放对硝基苯酚。
β-葡萄糖苷酶活性单位定义为每分钟从PNPG产生1微摩尔对硝基苯酚所需要的酶的量，并表示为IU/mL。
测定木聚糖酶活性的原理在于，通过DNS法，确定从水解的木聚糖溶液获得还原糖的量。此测定方法使用糖，主要是木糖的还原性质。木聚糖酶活性表达为IU/mL并对应每分钟产生1微摩尔木糖所需的酶的量。
通过将表示为IU/mL的活性除以蛋白浓度获得比活性。它们表示为IU/mg。
在验证碳和氧化还原平衡后根据气体平衡确定KLa值。
对实施例1的最终发酵液的分析确定产生下列结果：
细胞生物量，g/L=15.5
蛋白，g/L=50.1
生产率=0.20g/L/h
FPU=29.1IU/mL
木聚糖酶比活性=8.2IU/mg
β-葡萄糖苷酶比活性=1.0IU/mg。
图2重复生物量、蛋白的浓度和KLa随时间的变化。可以看到，在实验的前50小时期间，细胞生物量增加到多达15g/L，并且KLa是240h-1。在前50小时期间，蛋白浓度略微上升，然后从生物量的浓度稳定时起快速上升。当培养已经结束时，其达到50g/L。
实施例2：
实施例2在与实施例1相同的条件下实施，不同之处在于所用的发酵罐中具有100h-1的最大KLa值并且它的初始体积为750mL。发酵导致细胞生物量（45g/L）的高生产和低蛋白生产（19g/L）（参见图3）。
这是由于在实验期间存在碳质底物（乳糖、葡萄糖）的大量残留浓度。这重新启动了纤维素生产，其在对于诱导物碳质底物的限制条件下被诱导。葡萄糖未被消耗，因为生物反应器的氧传递能力小2.5倍，其降低了碳质底物消耗的速率，碳质底物消耗的速率与O2消耗的速率成正比。
事实上，氧传递速率表示如下：
OTR=KLa(O2*-O2L)
其中：O2 *：饱和氧浓度
O2L：液相中的氧浓度。
耗氧速率从而被OTR（其小2.5倍）所限制。
对最终发酵液的分析确定产生下列结果：
细胞生物量，g/L=45
蛋白，g/L=19
FPU=10.1IU/mL
木聚糖酶比活性=8.5IU/mg
β-葡萄糖苷酶比活性=1.2IU/mg。
实施例3（根据本发明）
使用具有100h-1KLa的生物反应器，但是生产方法被修饰以根据本发明。
初始葡萄糖浓度从而降低到15g/L使得最大生物氧气消耗速率与所使用的发酵罐相容。当这过量存在时，关于葡萄糖的细胞生物量的生产产量是0.5g/g。这意味着，对于此葡萄糖的量，最大氧气消耗速率是0.5g/L/h（0.08h-1的最大生长速率和1.2g/g的氧气向生物量的转化产量）。
补料分批阶段在24小时后开始，具有89mg底物/克生物量/小时（250g/L乳糖溶液）。生长阶段与蛋白生产同时发生。后者在240小时的实验后达到51.7g/L（图4）。因此，最终的蛋白生产率得以保持，尽管使用具有降低的传递能力的发酵罐。其为0.21g/L/h(在实施例1的情况下，其为0.20g/L/h)。
图5说明在实验期间KLa的变化，其停留在低于100h-1。
对最终发酵液的分析确定给出下列结果：
细胞生物量，g/L=18.9
蛋白，g/L=51.7
生产率=0.21g/L/h
FPU=30.1IU/mL
木聚糖酶比活性=9.5IU/mg
β-葡萄糖苷酶比活性=1.12IU/mg。

Claims (9)

1.生产纤维素酶的方法，其在搅拌、通气的生物反应器中使用属于丝状真菌的菌株，包括至少两个步骤：
·第一生长步骤，在分批阶段在至少一种碳质生长底物的存在下，使用在10-20g/L的范围内的碳质生长底物浓度进行；
·生长和酶生产的第二步骤，在至少一种诱导物碳质底物的存在下，在分批补料阶段存在以70-100mg/克细胞生物量/小时范围内的限制的碳源流，
其中所述生物反应器具有在40-150h-1范围内的容积传氧系数KLa，
其中所使用的菌株是里氏木霉（Trichodermareesei）菌株。
2.根据权利要求1的方法，其中所述碳质底物的浓度在12-17g/L的范围内。
3.根据权利要求1的方法，其中所述碳源流是在80-90mg/克细胞生物量/小时范围内。
4.根据权利要求1的方法，其中所述碳质生长底物选自乳糖、葡萄糖、木糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵后所得残留物和/或衍生自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述诱导物碳质底物是乳糖、纤维二糖、槐糖、纤维素生物量的酶水解产物的单糖的乙醇发酵后所得残留物和/或衍生自纤维素生物量的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。
6.根据权利要求1的方法，其中选择用于生产生物量的碳质生长底物在灭菌前导入发酵罐。
7.根据权利要求1的方法，其中选择用于生产生物量的碳质生长底物分开灭菌并在灭菌后导入生物反应器。
8.根据权利要求1的方法，其中在补料分批阶段导入的诱导物碳质底物在导入反应器之前独立地灭菌。
9.根据权利要求1的方法，其中所使用的菌株是通过基因突变、选择或重组的里氏木霉菌株。
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