CN106480106A - 一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法，通过微量通气提高了对纤维素水解液中多种抑制物(甲酸、乙酸和糠醛、羟甲基糠醛)的抗性，其葡萄糖和木糖的发酵性能明显改善。通过本方法进行的木糖的发酵与未通气对照组相比，具有多种纤维素水解液抑制物耐受性，且在四种较高浓度混合抑制物条件下，发酵时间缩短，剩余木糖大幅度减少，且木糖醇产率提高。通过本方法进行葡萄糖和木糖混合碳源的发酵与未通气对照组相比，在四种较高浓度混合抑制物条件下，具有促进葡萄糖和木糖同时发酵的作用，且乙醇产率保持不变，木糖醇的产率提高。

Description

一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法。
背景技术
木质纤维素原料转化为生物燃料，如乙醇，可缓解对于汽油的需求，并且可将多样化天然草培育，可持续农业，森林学结合一起而减少CO2的积累；而且，利用木质纤维素乙醇为交通工具的燃料，相比于汽油可减少88％温室气体的排放，而这远远高于使用玉米乙醇所减少的18％；[Yi-Kai Su.,Laura B.Willis.,Thomas W.Jeffries.,Effects ofAeration on Growth,Ethanol and Polyol Accumulation by Spathasporapassalidarum NRRL Y-27907and Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124.Biotechnology and Bioengineering.2015；112:457–469.]
木质纤维素原料主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成；纤维素和半纤维素水解后可产生葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及其他单糖，但木质纤维素原料必须经过预处理后，才能被生物酶所水解；在木质纤维素原料预处理过程中生成的一些毒性副产物，对后续发酵过程存在抑制作用，不利于生物转化的进行；
木质纤维素来源和处理方式的不同，预处理时产生的抑制物的种类和含量也不尽相同，其主要包括有机酸、吠喃衍生物和酚类物质；几类物质的抑制作用机理各不相同；弱酸造成了胞内环境的酸化，必须通过消耗ATP将多余的质子泵出以维持胞内的中性环境，影响了细胞正常的能量供给[Hyland P B,Mun S L S,Mahadevan R.Prediction of weakacid toxicity in Saccharomyces cerevisiae using genome-scale metabolic models[J].Industrial Biotechnology,2013,9(4):229-235]；糠醛等抑制物能抑制胞内的NAD(P)H的合成，或者加快其降解[Liu Chenguang,Xue Chuang,Lin Yenhan,BaiFengwu.Redo:potential control and applications in microaerobic and anaerobefermentations[J].Biotechnology Advances,2013,31(2):257-265]；而NAD(P)H/NAD(P)+作为主要的辅因子，参与细胞多个物质代谢和能量代谢过程；酚类化合物是蛋白质变性剂，其对酵母的毒性最大，主要通过对细胞膜的损伤(影响细胞膜的完整性和选择透过性等)来影响细胞代谢；目前，多采用以下几种方法来降低各类抑制物对发酵过程的影响：1.改善预处理条件降低副产物的生成[Parawira W,Tekere M.Biotechnological strategies toovercome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production:review[J].Critical Reviews in Biotechnology,2011,31(1):20-31]；2.使用脱毒技术去除毒性副产物[杨秀山.复合菌种对木质纤维素水解产物的原位脱毒乙醇发酵方法.专利200810222897.7；Cavka A,LJ.Detoxification of lignocellulosichydrolysates using sodium borohydride.Bioresour Technol.2013,136:368-76]；3.通过长期驯化的方法或基因工程过表达某些基因得到具有抑制物抗性的微生物；[Wang Xin,Bai Xue,Chen Dong-Fang,Chen Fu-Zan,Li Bing-Zhi,Yuan Ying-Jin.Increasingproline and myo-inositol improves tolerance of Saccharomyces cerevisiae tothe mixture of multiple lignocellulose-derived inhibitors[J].BiotechnolBiofuels(2015)8:142]；4.通过在培养基中添加还原性试剂的手段提高细胞的抗性[Alriksson B,Cavka A,Jonsson L J.Improving the fermentability of enzymatichydrolysates of lignocellulose through chemical in-situ detoxification withreducing agents[J].Bioresource Technology,2011,102(2):1254-1263]；
发明内容
本发明提供了一种利用微量通气的方法提高菌株对多种抑制物甲酸、乙酸、糠醛和羟甲基糠醛抗性的方法；
本发明的一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法，包括以下步骤：
1)取马克斯克鲁维酵母1727(Kluyveromyces.marxianus 1727)菌株进行扩大培养；
2)将经过步骤1)扩大培养后的菌种接种至发酵培养基中，控制初始菌体浓度OD6201～3，温度30～45℃，转速120～180rpm/min，pH值4～6，以及0.1～1vvm的微量通气，发酵72～168h得到发酵液；
3)对步骤2)的发酵液组分进行分析；
其中，所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)为中国工业微生物保藏中心保藏菌株，菌种编号为1277；
所述步骤1)中，所述扩大培养的步骤的培养条件具体为：控制扩大培养基的pH值4～6，温度28～35℃，转速100～200rpm/min；
所述步骤1)中，所述扩大培养步骤所选用的扩大培养基包括酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖或木糖20g/L；
所述步骤2)中，所述发酵培养步骤所选用的发酵培养基为中包括重量百分含量为2～10％的葡萄糖以及重量百分含量为1～6％的木糖；
所述发酵培养基中还包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L，经过无菌处理使用；
所述步骤2)中，将经过步骤1)扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬，控制OD620 1～3并接种至步骤2)中的发酵培养基中；
所述离心操作速度为5000～10000rpm/min、时间5～8min；
所述步骤1)中，还包括在所述扩大培养步骤前将所述菌种进行种子液培养的步骤，所用种子液培养步骤条件为：控制pH值4～6，培养温度25～35℃，转速100～200rpm/min；
所述种子液培养步骤的种子液培养基包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，经过无菌处理使用；
进一步的，所述种子液培养为：将所述马克斯克鲁维酵母1727采用所述种子液培养基培养至OD620至1.5～2.5；
所述步骤2)中，所述生物量测定，使用酶标仪(Thermo labsystems MultiskanAscent 354)测OD620值；
所述步骤3)中，所述组分分析方法，发酵液经0.45μm亲水性微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱(Waters 410，Waters，MA，USA)分析各组分的量；色谱柱为有机酸分析柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules，Aminex HPX-87H)，进样量20μ1，流动相为0.01mmol·L-1硫酸溶液，流速为0.5ml·min-1，示差检测器温度50℃，柱温50℃；
本发明具有以下优点：
1.本发明的利用微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，在所述发酵步骤中，通过调节通气量，使得所述微生物在含有多种抑制物混合物的葡萄糖发酵中，发酵时间缩短明显缩短，且发酵活力增强乙醇得率维持不变，具有简单、成本低的特点。
2.本发明的利用微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，通过本方法进行的木糖的发酵与未通气对照组相比，具有多种纤维素水解液抑制物耐受性，且在四种较高浓度混合抑制物条件下，发酵时间缩短，剩余木糖大幅度减少，且木糖醇产率提高。
3.本发明的利用微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，通过本方法进行葡萄糖和木糖混合碳源的发酵与未通气对照组相比，在四种较高浓度混合抑制物条件下，具有促进葡萄糖和木糖同时发酵的作用，且乙醇产率保持不变，木糖醇的产率提高。
附图说明
图1示不同通气量下100g/L葡萄糖培养基中K.marxianus 1727发酵性能考察。
图2示不同通气量下35g/L木糖培养基中K.marxianus 1727发酵性能考察；其中图2A示木糖变化曲线；图2B示木糖醇变化曲线。
图3示不同通气量下40g/L葡萄糖和20g/L木糖培养基中K.marxianus 1727发酵性能考察；其中图3A示葡萄糖、乙醇变化曲线；图3B示木糖、木糖醇变化曲线。
图4示不同通气量下100g/L葡萄糖和35g/L木糖培养基中K.marxianus 1727发酵性能考察；其中图4A示葡萄糖、乙醇变化曲线；图4B示木糖、木糖醇变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的一种提高马克斯克鲁维酵母对纤维素水解液抑制物耐受性的方法做更加具体的描述；
实施例1
本实施例的微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步骤：
1)取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、15min灭菌制备得到种子液培养基，将所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接种至所述培养基，培养18h至菌种浓度达到OD620至2～2.4；
扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量6％接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间14h至菌种浓度达到OD620至2～2.4；
所述扩大培养的培养基为YPD培养基；含有葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取所述扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 8min)，无菌水重悬调节初始接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在30℃，转速150rpm/min，调节pH值至5，保持0.5vvm的通气量；
所述发酵的培养基为添加了多种抑制物的10％葡萄糖培养基；含100g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，经121℃、15min灭菌处理冷却后加入复合抑制物，包括0.8g/L甲酸、1.5g/L乙酸、0.8g/L糠醛和0.6g/L五羟甲基糠醛；
3)取步骤2)中的发酵液10000rpm离心5min后，上清液用于测定发酵产物和残糖含量；
实施例2
本实施例微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例1相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程保持0.2vvm的通气量；
实施例3
本实施例微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例1相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程保持1vvm的通气量；
结果：由图1可知，在复合抑制物存在条件下，以100g/L葡萄糖为碳源时，通气与未通气的发酵性能区别明显；微量通气条件下，葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率显著加快；未通气条件下14h发酵才结束、而0.2、0.5、1vvm条件下分别8h、9h、9h发酵就结束，时间分别缩短了43％、36％、36％；且不同通气量与未通气条件下终乙醇产量未出现明显差异，分别为41.5、41.5、40.8、42.6g/L；其乙醇的率分别为0.41、0.41、0.4、0.43g/g；
实施例4
本实施例的微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步骤：
1)取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、15min灭菌制备得到种子液培养基，将所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接种至所述培养基，培养18h至菌种浓度达到OD620至2～2.4；
扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量6％接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间48h至菌种浓度达到OD620至4～5；
所述扩大培养的培养基为2％木糖培养基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取所述扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 8min)，无菌水重悬调节初始接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在30℃，转速150rpm/min，调节pH值至5，保持0.5vvm通气量，发酵108h；
所述发酵的培养基为添加了复合抑制物3.5％木糖培养基；含35g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，经121℃、15min灭菌处理冷却后加入复合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羟甲基糠醛；
3)取步骤2)中的发酵液10000rpm离心5min后，上清液用于测定发酵产物和残糖含量；
实施例5
本实施例微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例4相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程保持0.2vvm的通气量；
实施例6
本实施例微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例4相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程保持1vvm的通气量；
结果：由图2A、2B可知，在复合抑制剂存在条件下，以35g/L木糖为碳源发酵时，随着通气量增加，耗糖速率增加，相应的木糖醇生产速率加快；0.2、0.5、1vvm通气量条件下，发酵至108h残糖分别为4.92g/L、0.63g/L、0g/L；而未通气残糖高达24.1g/L；且通气的增加使糖醇产量的明显增多，分别为22.6、24.4、23.1g/L，而未通气木糖醇产量仅为9.9g/L；0.2、0.5、1vvm通气量条件下木糖醇得率分别0.73、0.7、0.66g/g；
实施例7
本实施例的微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步骤：
1)取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、15min灭菌制备得到种子液培养基，将所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接种至所述培养基，培养18h至菌种浓度达到OD620至2～2.4；
扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量6％接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间48h至菌种浓度达到OD620至4～5；
所述扩大培养的培养基为2％木糖培养基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取所述扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 8min)，无菌水重悬调节初始接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在30℃，转速150rpm/min，调节pH值至5，保持0.5vvm通气量，发酵144h；
所述发酵的培养基为添加了复合抑制物的4％葡萄糖、2％木糖培养基；含40g/L葡萄糖、20g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，经121℃、15min灭菌处理冷却后加入复合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羟甲基糠醛；
3)取步骤2)中的发酵液10000rpm离心5min后，上清液用于测定发酵产物和残糖含量；
实施例8
本实施例的微量通气提高菌株对纤维素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步骤：
1)取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育过程具体为：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、15min灭菌制备得到种子液培养基，将所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接种至所述培养基，培养18h至菌种浓度达到OD620至2～2.4；
扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量6％接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速150rpm，培养时间48h至菌种浓度达到OD620至4～5；
所述扩大培养的培养基为2％木糖培养基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；
2)取所述扩大培养中得到的菌株，离心浓缩(5000rpm/min 8min)，无菌水重悬调节初始接种OD620至2，并接种至发酵培养基中，发酵温度保持在30℃，转速150rpm/min，调节pH值至5，保持0.5vvm通气量，发酵144h；
所述发酵的培养基为添加了复合抑制物的10％葡萄糖、3.5％木糖培养基；含100g/L葡萄糖、35g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，经121℃、15min灭菌处理冷却后加入复合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羟甲基糠醛；
3)取步骤2)中的发酵液10000rpm离心5min后，上清液用于测定发酵产物和残糖含量；
结果：由图3A、3B、4A、4B可知，在复合抑制存在条件下，无论是较高浓度，还是低浓度葡萄糖、木糖组成的混合糖发酵通气与未通气状况的发酵性能差异明显；微量通气与未通气相比，耗糖速率及木糖醇得率都更高；在低浓度混合糖发酵状况下，微量通气，40g/L葡萄糖耗完时间由不通气的6h提前至4h，发酵时间缩短了30～40％，而100g/L葡萄糖发酵时间由由不通气的18h提前至12h，发酵时间也缩短了30～40％，且两种情况与未通气条件下乙醇得率差别不大，都为0.42g/g；对于木糖的发酵，未通气条件下，20g/L和40g/L发酵至108h残糖含量分别为16.9g/L、25.1g/L，木糖醇产量分别为1.6g/L、3g/L，其木糖醇得率分别为0.35g/g、0.23g/g；微量通气条件下，20g/L和40g/L两种状况发酵结束时残糖含量分别为4.6g/L、11g/L，木糖醇产量分别为6.2g/L、9.9g/L，其木糖醇得率分别为0.42g/g、0.37g/g；
对比例1
本对比例的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例1相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程不通气；
对比例2
本对比例的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例4相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程不通气；
对比例3
本对比例的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例7相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程不通气；
对比例4
本对比例的方法，取所述马克斯克鲁维酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用与实施例8相同的方法进行种子培养与扩大培养，并采用相同的发酵液、发酵条件进行发酵，区别特征仅在于：发酵过程不通气。

Claims (6)

1.一种利用微量通气提高菌株对抑制物抗性的方法，其特征在于以下步骤：
(1)将马克斯克鲁维酵母菌株进行扩大培养；其中，所述马克斯克鲁维酵母为中国工业微生物保藏中心保藏菌株，菌种编号为1277；
培养条件为：控制扩大培养基的pH值4～6，温度25～35℃，转速100～200rpm/min；
所用的扩大培养基包括酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖或木糖20g/L；
(2)将经过步骤(1)扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬，接种至发酵培养基中；其中，离心操作速度为5000～10000rpm/min、时间5～8min；
微量通气0.1～1.2vvm，初始菌体浓度OD6201～3，温度30～45℃，转速120～180rpm/min，pH值4～6，发酵72～168h，得到发酵液；OD620值使用酶标仪测定；
所用的发酵培养基包括重量百分含量为2～10％的葡萄糖以及重量百分含量为1～6％的木糖；
(3)对步骤(2)的发酵液组分进行分析；发酵液经0.45μm亲水性微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱(Waters 410，Waters，MA，USA)分析各组分的量；色谱柱为有机酸分析柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules，Aminex HPX-87H)，进样量20μ1，流动相为0.01mmol·L-1硫酸溶液，流速为0.5ml·min-1，示差检测器温度50℃，柱温50℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抑制物是甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛中两种以上的混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抑制物的浓度分别是：0.4～0.8g/L甲酸、1～1.8g/L乙酸、0.5～1.2g/L糠醛和0.3～0.7g/L五羟甲基糠醛。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的发酵培养基中还包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L，经过无菌处理使用。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母1727采用所述种子液培养基培养至OD620至1.5～2.5。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母1727采用所述种子液培养基培养至OD620至1.5～2.5。
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