BRPI0612207A2 - método para a produção de etanol - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA A PRODUçãO DE ETANOL. A presente invenção refere-se ao etanol que foi produzido utilizando biocatalisadores que são capazes de fermentar açúcares derivados da biomassa tratada. Os açúcares foram obtidos pelo tratamento prévio da biomassa sob condições de concentração alta de sólidos e baixa de amónia, seguida pela sacarificação.

Description

"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL"

O presente pedido reivindica o beneficio do pedido provisório US60/670437, depositado em 12 de abril de 2005.

Declaração dos Direitos Governamentais

A presente invenção foi realizada com o suporte do governo dosEstados Unidos da América sob o Contrato de número 04-03-CA-70224concedido pelo Departamento de Energia. O governo possui certos direitossobre a presente invenção.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a métodos para a produção deetanol utilizando açúcares fermentáveis derivados de biomassa tratada.Especificamente, os açúcares obtidos pelo tratamento prévio da biomassa sobcondições de concentração alta de sólidos e baixa de amônia, seguido pelasacarificação, são utilizados na fermentação pelos biocatalisadores deprodução de etanol.

Antecedentes da Invenção

As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos,tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos de silvicultura, lodo dafabricação de papel, e resíduos sólidos industriais e municipais, fornecem umamatéria-prima de grande potencial de renovação para a produção desubstâncias químicas, plásticos, combustíveis e suprimentos. As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros decarboidratos que compreendem a celulose, hemicelulose, glucanos e Iigninasão, em geral, tratados por uma variedade de meios químicos, mecânicos eenzimáticos para liberar principalmente os açúcares de hexose e de pentose,que podem ser fermentados a produtos úteis.

Os métodos de tratamento prévio são utilizados para fabricar ospolímeros de carboidrato de materiais de celulose e Iignocelulose disponíveismais rapidamente para as enzimas de sacarificação. Os métodos detratamento prévio padrão têm utilizado historicamente e principalmente osácidos fortes em temperaturas elevadas; entretanto, devido aos altos custos deenergia, altos custos de equipamento, altos custos de recuperação docatalisador de tratamento prévio e incompatibilidade com as enzimas desacarificação, têm sido desenvolvidos métodos alternativos, tais comotratamento prévio enzimático ou o uso de ácido ou base em temperaturas maisamenas onde a menor hidrólise dos polímeros de carboidrato da biomassaocorre durante o tratamento prévio, requerendo melhores sistemas de enzimaspara sacarificar tanto a celulose quanto a hemicelulose.

Uma série de métodos de pré tratamento que utilizam base forampropostos. Gould (Biotech. and Bioengr. (1984) 26:46-52) descreve um métodode tratamento prévio para a biomassa de Iignocelulose utilizando peróxido dehidrogênio (H2O2). O tratamento é mais eficiente utilizando H2O2 em umaquantidade de pelo menos 0,25 em peso/peso com relação ao substrato.

Teixeira, L. et ai, (Appl. Biochem. and Biotech. (1999) 77-79:19-34) descrevem uma série de tratamentos prévios de biomassa utilizandoquantidades estequiométricas de hidróxido de sódio e hidróxido de amônio,com uma concentração de biomassa muito baixa. A razão da solução e dabiomassa é de 14:1.

Elshafei, A. et al., (Bioresource Tech. (1991) 35:73-80)examinaram o pré tratamento da forragem de milho utilizando NaOH.

Kim, TeY. Lee (Bioresource Technology (2005) 96:2007-2013)relataram o uso de altas quantidades de amônia aquosa para o tratamentoprévio da forragem de milho.

O documento WO 2004/081185 descreve os métodos parahidrolisar a lignocelulose, que compreende o contato da Iignocelulose com umasubstância química; a substância química pode ser uma base, tal comocarbonato de sódio ou hidróxido de potássio, em um pH de cerca de 9 a cercade 14, sob condições moderadas de temperatura, pressão e pH.

As patentes US 5.916.780 e US 6.090.595 descrevem umprocesso de tratamento prévio em que uma razão especificada dearabinoxilano e os polissacarídeos totais de não amido (AX/NSP) é avaliada eutilizada para selecionar a matéria prima.

A fim de ser um processo economicamente competitivo, umprocesso comercial para a produção de combustíveis a partir uma fonte debiomassa renovável requer a hidrólise de carboidratos na biomassalignocelulósica para fornecer altos rendimentos de açúcares em altasconcentrações, utilizando baixas quantidades de substâncias químicas, paraproduzir uma fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidade que sãoutilizados por biocatalisadores para produzir combustíveis.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção fornece métodos para a produção de etanol quefaz uso da biomassa. O processo da presente invenção envolve o tratamento préviode biomassa, em concentrações relativamente altas, com uma baixa concentraçãode amônia com relação ao peso seco da biomassa. Seguindo o tratamento prévio, abiomassa é tratada com uma associação de enzima de sacarificação para produziraçúcares fermentáveis. Os açúcares são então colocados em contato com umbiocatalisador que pode fermentar os açúcares e produzir etanol. Em umarealização da presente invenção, o método compreende:

(a) colocar a biomassa em contato com uma solução aquosa quecompreende amônia, em que a amônia está presente em uma concentração pelomenos suficiente para manter o pH alcalino da m istura de amônia aquosa ebiomassa, mas em que dita amônia está presente a menos do que cerca de 12%em peso com relação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco dabiomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15%em peso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa;

(b) colocar o produto da etapa (a) em contato com umaassociação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas paraproduzir açúcares fermentáveis; e

(c) colocar o produto da etapa (b) sob condições apropriadas defermentação em contato com um biocatalisador adequado para produzir etanol.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o crescimento da Zymomonas mobilis 8b(descrita no pedido de patente US 2003/ 0162271 A1, exemplos IV, Vl e XII) napresença ou ausência de acetamida e ácido acético.

Descrição Detalhada da Invenção

A Depositante incorpora especificamente todo o conteúdo de todasas referências citadas nessa descrição. Ainda, quando uma quantidade,concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalopreferido ou uma lista de valores preferidos superiores e valor preferidos inferiores,isto deve ser entendido como descrevendo especificamente todos os intervalosformados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalo superior ou valorpreferido e qualquer limite de intervalo inferior ou valor preferido,independentemente se os intervalos são descritos separadamente. Onde umintervalo de valores numéricos é citado no presente, a menos que especificado deoutra maneira, o intervalo pretende incluir suas extremidades, e todos os númerosinteiros e frações dentro do intervalo. Não é pretendido que o escopo da presenteinvenção seja limitado aos valores específicos citados na definição de um intervalo.

A presente invenção fornece métodos para a produção de etanol quefaz uso da biomassa da seguinte maneira: os açúcares são derivados da biomassaque são então utilizados como fonte de carbono para o crescimento demicroorganismos que podem fazer etanol como um produto de seu metabolismo.Os açúcares são liberados da biomassa pelo tratamento prévio da mesma, emconcentração relativamente alta, com uma concentração relativamente baixa deamônia com relação ao peso seco da biomassa. A biomassa tratada com amônia éentão digerida com uma associação de enzima de sacarificação para produziraçúcares fermentáveis. Os açúcares são utilizados como um substrato defermentação para o crescimento de um microorganismo, ou biocatalisador, que écapaz de produzir etanol (etanologeno).

Definições

No presente relatório descritivo, uma série de termos é utilizada.

As seguintes definições são fornecidas:

O termo "açúcar fermentável" refere-se a oligossacarídeos e

monossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono por ummicroorganismo em um processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" refere-se a uma composição quecompreende ambas a Iignina e a celulose. O material lignocelulósico tambémcompreende a hemicelulose.

O termo "celulósico" refere-se a uma composição quecompreende a celulose.

Por "peso seco" de biomassa, entende-se o peso da biomassapossuindo toda ou essencialmente toda a água removida. O peso seco étipicamente medido de acordo com a American Society for Testing and Materials(ASTM) Padrão E1756-01 (Método de Teste Padrão para a Determinação deSólidos Totais na Biomassa) o u Technical Association of the Pulp and PaperIndustry, Inc. (TAPPI) Padrão T-412 om-02 (Umidade na Polpa, Papel e Cartolina).

O etanol que é "derivado da biomassa" é o etanol produzido porum processo onde a biomassa é hidrolisada para liberar açúcaresfermentáveis, e os açúcares fermentáveis são fermentados utilizando pelomenos um biocatalisador para produzir etanol.

Os termos "plastificante" e "agente amaciante" referem-se amateriais que causam a redução das forças intermoleculares coesivas ao longoou entre as cadeias poliméricas. Tais materiais podem agir, por exemplo, nadiminuição da cristalinidade ou na quebra de ligações entre as fibras decarboidrato de Iignina e de não Iignina (por exemplo, celulose ou hemicelulose).

O termo "sacarificação" refere-se à produção de açúcaresfermentáveis a partir de polissacarídeos.

O termo "condições apropriadas para produzir açúcaresfermentáveis" refere-se a co ndições tais como pH, composição do meio etemperatura sob as quais as enzimas de sacarificação são ativas.

O termo "condições de fermentação apropriadas" refere-se acondições que auxiliam o crescimento na produção de etanol por umbiocatalisador. Tais condições podem incluir pH, nutrientes e outroscomponentes no meio, temperatura, atmosfera e outros fatores.

O termo "biomassa tratada previamente" significa biomassa quefoi submetida ao tratamento prévio antes da sacarificação.

O termo "biomassa" refere-se a qualquer material celulósico oulignocelulósico e inclui os materiais que compreendem celulose e,opcionalmente, compreendem ainda a hemicelulose, lignina, amido,oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também podecompreender os componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Deacordo com a presente invenção, a biomassa pode ser derivada a partir deuma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada demais de uma fonte, por exemplo, a biomassa pode compreender uma misturade espigas de milho e forragem de milho ou uma mistura de grama e folhas. Abiomassa inclui, mas não está limitada a: culturas bioenergéticas, resíduosagrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo dafabricação de papel, resíduos de terrenos, resíduos de madeira e desilvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a:grãos de milho, espigas de milho, resíduos de plantação, tais como cascas demilho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha decevada, feno, palha de arroz, grama do gênero Panicum, resíduos de papéis,bagaço da cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos doprocessamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira,serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal. Em umarealização, a biomassa que é útil para a presente invenção inclui a biomassaque possui um valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente denso,e/ou é relativamente fácil de coletar, transportar, armazenar e/ou manipular.

Em uma realização da presente invenção, a biomassa que é útil inclui asespigas de milho, as forragens de milho e o bagaço da cana de açúcar.

Para os propósitos da presente invenção, uma "solução aquosaque compreende amônia" refere-se ao uso de gás amônia (NH3), compostosque compreendem íons amônio (NH4+) tais como hidróxido de amônio ousulfato de amônio, compostos que liberam amônia sob a degradação tais comouréia, e as suas combinações em um meio aquoso.

A concentração de amônia utilizada no presente método é, demaneira mínima, uma concentração que é suficiente para manter o pH damistura de amônia aquosa e de biomassa alcalina e, de maneira máxima,menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Estabaixa concentração de amônia é suficiente para o tratamento prévio, e a baixaconcentração também pode ser menos do que cerca de 10% em peso comrelação ao peso seco da biomassa. Uma concentração muito baixa de 6% deamônia com relação ao peso seco da biomassa, ou menos, também pode serutilizada para o tratamento prévio. Por alcalino entende-se um pH superior a7,0. Particularmente apropriado é um pH da mistura de amônia aquosa e debiomassa que é superior a 8. Em uma realização, a amônia está presente amenos do que cerca de 10% em peso com relação ao peso seco da biomassa.Particularmente apropriada é a amônia a menos do que cerca de 6% em pesocom relação ao peso seco da biomassa.

A amônia conforme utilizada no presente processo fornece vantagenssobre outras bases. A amônia se divide em uma fase líquida e uma fase vapor. Osgases de amônia podem se difundir mais facilmente através da biomassa do queuma base líquida, resultando em um tratamento prévio mais eficaz em baixasconcentrações. A amônia também é mostrada no presente no Exemplo 10 paracompetir com a hidrólise, por meio de amonólise, dos acetil ésteres na biomassapara formar a acetamida. A acetamida é menos tóxica do que o acetato para certosorganismos fermentadores que produzem etanol, tal como a Zymomonas mobilis(conforme demonstrado no presente no Exemplo 11). Assim, a conversão dos acetilésteres para a acetamida ao invés de para ácido acético reduz a necessidade deremover o ácido acético. O uso de amônia também reduz a exigência desuplementar o meio de crescimento utilizado durante a fermentação com uma fontede nitrogênio. Em adição, a amônia é um material de baixo custo e assim, forneceum processo econômico. A amônia também pode ser reciclada para o reator detratamento prévio durante o tratamento prévio ou seguinte ao tratamento prévio,permitindo assim um processo mais econômico. Por exemplo, seguindo otratamento prévio, conforme a temperatura é diminuída àquela apropriada para asacarificação, o gás de amônia pode ser liberado, opcionalmente, na presença devácuo, e pode ser reciclado. Em um processo contínuo, a amônia pode sercontinuamente reciclada.

De acordo com o presente método, a solução aquosa quecompreende a amônia pode opcionalmente compreender pelo menos umabase adicional, tal como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido depotássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio e carbonato de cálcio. Pelomenos uma base pode ser adicionada em uma quantidade que é combinadacom o amônio para formar uma quantidade de base total que é menos do quecerca de 20% em peso com relação ao peso seco da biomassa. Depreferência, a segunda base total mais a amônia está em uma quantidade queé menos do que cerca de 15% em peso. A(s) base(s) adicional(is) pode(m) serutilizada(s), por exemplo, para neutralizar os ácidos na biomassa, para forneceríons metálicos para as enzimas de sacarificação, ou para fornecer íonsmetálicos para o meio de crescimento da fermentação.

No presente método, o peso seco da biomassa está em umaconcentração inicial de pelo menos cerca de 15% até cerca de 80% do peso damistura de amônia aquosa e biomassa. De maneira mais apropriada, o pesoseco da biomassa está em uma concentração de cerca de 15% a cerca de 60%do peso da mistura de amônia aquosa e biomassa. A porcentagem debiomassa na mistura de amônia aquosa e biomassa é mantida alta paraminimizar a necessidade pela concentração de açúcares resultante dasacarificação da biomassa tratada previamente, para o uso na fermentação. Aalta concentração de biomassa também reduz o volume total do material detratamento prévio, tornando o processo mais econômico.

A biomassa pode ser utilizada diretamente como obtida a partir dafonte, ou a energia pode ser aplicada à biomassa para reduzir o tamanho, aumentara área de superfície exposta, e/ou aumentar a disponibilidade de celulose,hemicelulose, e/ou oligossacarídeo presente na biomassa para a amônia e para asenzimas de sacarificação utilizadas na segunda etapa do método. A energiasignifica útil para a redução do tamanho, aumento a área de superfície exposta,e/ou aumento da disponibilidade de celulose, hemicelulose, e/ou oligossacarídeospresentes na biomassa para a amônia e para as enzimas de sacarificação inclui,mas não está limitada a, moagem, compressão, trituração, despedaçamento, corte,refinação em disco, ultra-som e microondas. Esta aplicação de energia pode ocorrerdepois ou durante o tratamento prévio, antes ou durante a sacarificação ou qualquercombinação dos mesmos.O tratamento prévio da biomassa com solução de amônia érealizado em qualquer recipiente apropriado. Tipicamente o recipiente é umque pode suportar a pressão, possui um mecanismo de aquecimento, e possuium mecanismo para a mistura de conteúdos. Os recipientes disponíveiscomercialmente incluem, por exemplo, o reator Zipperclave® (AutoclaveEngineers, Erie, PA), o reator Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ),e um reator de pistola de vapor (descrita nos Métodos Gerais; AutoclaveEngineers, Erie, PA). Os reatores de escalas muitos maiores com capacidadessimilares podem ser utilizados. Alternativamente, a biomassa e a solução deamônia podem ser combinadas em um recipiente, então, transferida a outroreator. Além disso, a biomassa pode ser tratada previamente em um recipiente,então, processada adicionalmente em outro reator tal como o reator de pistolade vapor (descrito nos Métodos gerais; Autoclave Engineers, Erie, PA).

Antes do contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende amônia, pode ser aplicado vácuo ao recipiente contendo abiomassa. Ao evacuar o ar dos poros da biomassa, pode ser obtida umamelhor penetração de amônia na biomassa. O período de tempo para aaplicação de vácuo e a quantidade de pressão negativa que é aplicada àbiomassa irá depender do tipo de biomassa e pode ser determinadoempiricamente de modo a atingir um tratamento prévio ótimo da biomassa(conforme medido pela produção de açúcares fermentáveis seguindo asacarificação).

O contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende a amônia é realizado em uma temperatura de cerca de 4 0C acerca de 200 0C. O contato inicial da biomassa com amônia a 4 0C, permitindoa impregnação a esta temperatura, foi descoberta por aumentar a eficiência desacarificação pela biomassa nativa não tratada previamente. Em outrarealização, dito contato da biomassa é realizado em uma temperatura de cercade 75 0C a cerca de 150 0C. Aind a em outra realização, dito contato dabiomassa é realizado em uma temperatura superior a 90 0C a cerca de 150 0C.

O contato da biomassa com uma solução aquosa quecompreende a amônia é realizado por um período de tempo até cerca de 25horas. Períodos mais longos de tratamento prévio são possíveis, entretanto,um menor período de tempo pode ser preferível por razões práticas eeconômicas. Tipicamente um período de tratamento de contato da amônia é decerca de 8 horas ou menos. Períodos mais longos podem fornecer o beneficiode reduzir a necessidade de aplicação de energia para a quebra da biomassa,portanto, um período de tempo de até cerca de 25 horas pode ser preferível.

Em uma realização, o processo de tratamento prévio pode serrealizado em uma temperatura relativamente alta por um período de temporelativamente curto, por exemplo, de cerca de 100 0C a cerca de 150 0C porcerca de 5 minutos e cerca de 2 horas. Em outra realização, o processo detratamento prévio pode ser realizado em uma temperatura inferior por umperíodo de tempo relativamente longo, por exemplo, de cerca de 75 0C a cercade 100 0C por cerca de 2 horas e cerca de 8 horas. Em ainda outra realização,o processo de tratamento prévio pode ser realizado na temperatura ambiente(cerca de 22 a 26 0C) ou mesmo por um período de tempo mais longo de cercade 24 horas. Outras combinações intermediárias de temperatura e tempotambém podem ser utilizadas.

Para o processo de tratamento prévio, a temperatura, o tempopara o tratamento prévio, a concentração de amônia, a concentração de umaou mais bases adicionais, a concentração de biomassa, o tipo de biomassa e otamanho de partícula da biomassa são relacionados; assim estas variáveispodem ser ajustadas conforme o necessário para obter um produto ótimo paraser colocado em contato com uma associação de enzima de sacarificação.

Um plastificante, agente amaciante, ou as combinações dosmesmos, tais como os polióis (por exemplo, glicerol, etileno glicol), ésteres depolióis (por exemplo, monoacetato de glicerol), éteres de glicol (por exemplo,dietileno glicol), acetamida, etanol e etanolaminas, podem ser adicionados noprocesso de tratamento prévio (isto é, a etapa (a)). Um plastificante pode seradicionado como um componente da solução de amônia aquosa, como umasolução separada, ou como um componente seco.

A reação de tratamento prévio pode ser realizada em qualquerrecipiente apropriado, tal como um reator em batelada ou um reator contínuo.Um técnico no assunto irá reconhecer que, em maiores temperaturas (acima de100 0C), será necessário um recipiente de pressão. Um recipiente apropriadopode ser equipado com os meios, tais como impulsores,, para a agitação damistura de amônia aquosa e biomassa. O projeto do reator é discutido em Lin,K. H., e Van Ness, H. C. (em Perry, R. H. e Chilton, C. H. (eds), ChemicalEngineerjS Handbok, 5a edição (1973), capítulo 4, McGraw-HiII1 Nova Iorque). Areação de tratamento prévio pode ser realizada como um processo embatelada, ou como um processo contínuo.

É bem conhecido dos técnicos no assunto que uma fonte denitrogênio é necessária para o crescimento de microorganismos durante afermentação; assim o uso de amônia durante o tratamento prévio fornece umafonte de nitrogênio e reduz ou elimina a necessidade de suplementar o meio decrescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio. Se opH do produto do tratamento prévio exceder aquele a qual as enzimas desacarificação são ativas, ou exceder o intervalo apropriado para o crescimentomicrobiano na fermentação, ácidos podem ser utilizados para reduzir o pH. Aquantidade de ácido utilizado para obter o pH desejado pode resultar naformação de sais em concentrações que são inibidoras das enzimas desacarificação ou do crescimento microbiano. A fim de reduzir a quantidade deácido necessário para obter o pH desejado e para reduzir o custo do materialbruto de NH3 no presente processo de tratamento prévio, o gás amônia podeser evacuado do reator de tratamento prévio e reciclado. Tipicamente, pelomenos um porção de amônia é removida, o que reduz o pH, mas deixa algumnitrogênio que fornece este nutriente para o uso na fermentação subseqüente.

A fim de obter quantidades suficientes de açúcar da biomassa, abiomassa pode ser tratamento prévio com uma solução de amônia aquosa umavez ou mais de uma vez. Da mesma maneira, uma reação de sacarificaçãopode ser realizada uma ou mais vezes. Ambos os processos de tratamentoprévio e a sacarificação podem ser repetidos se desejado para obter maioresrendimentos de açúcares. Para avaliar o desempenho dos processos detratamento prévio e de sacarificação, separadamente ou em conjunto, orendimento teórico de açúcares, derivados da biomassa de partida, pode serdeterminado e comparado para os rendimentos medidos.

Sacarificação

Seguindo o tratamento prévio, o produto compreende uma mistura deamônia, biomassa parcialmente degradada e açúcares fermentáveis. Antes doprocessamento adicional, a amônia pode ser removida da biomassa tratamentoprévio pela aplicação de vácuo. A remoção da amônia diminui o pH e, portanto,ácido menos neutralizante é utilizado para obter o pH desejado para a sacarificaçãoe a fermentação. Isto resulta em uma menor carga de sal na mistura do tratamentoprévio. Tipicamente, permanece alguma amônia, que é desejada para fornecer umafonte de nitrogênio para a fermentação.

A mistura do tratamento prévio é então, hidrolisadaadicionalmente na presença de uma associação de enzima de sacarificaçãopara liberar os oligossacarídeos e/ou os monossacarídeos em um hidrolisado.As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa sãoanalisador por Lynd, L. R., et al., (Microbiol. Moi Rev. (2002) 66:506-577). Emuma realização preferida, toda a mistura de tratamento prévio que compreendeambas as frações solúveis e insolúveis é utilizada na reação de sacarificação.

Em outra realização, antes da sacarificação, a fração aquosacompreende a amônia e os açúcares solubilizados podem ser separados dosparticulados insolúveis remanescentes na mistura. Os métodos para aseparação das frações solúveis das insolúveis incluem, mas não estãolimitadas a, decantação e filtração. Os particulados insolúveis podem serreciclados no reator de tratamento prévio. Os particulados insolúveis podem,opcionalmente, ser lavados com um solvente aquoso (por exemplo, água) pararemover os açúcares adsorvidos antes de serem reciclados no reator detratamento prévio. A fração insolúvel pode então ser submetida ao tratamentoadicional com solução de amônia aquosa conforme descrito acima para otratamento prévio, seguido pela sacarificação com uma associação de enzimade sacarificação. A fração solúvel também pode ser concentrada antes dasacarificação utilizando um processo apropriado, tal como a evaporação.

Antes da sacarificação, o produto de tratamento prévio pode sertratado para alterar o pH, a composição ou a temperatura tal que as enzimasda associação da enzima de sacarificação serão ativas, fornecendo, portanto,as condições apropriadas para produzir os açúcares fermentáveis. O pH podeser alterado através da adição de ácidos na forma sólida ou líquida.

Alternativamente, o dióxido de carbono (CO2), que pode ser recuperado dafermentação, pode ser utilizado para diminuir o pH. Por exemplo, o CO2 podeser coletado de um fermentador e alimentado, tal como por borbulhamento,dentro do produto de tratamento prévio enquanto o pH é monitorado até o pHdesejado ser obtido. A temperatura pode ser trazida a uma temperatura que écompatível com a atividade da enzima de sacarificação, conforme registradoabaixo. Quaisquer cofatores requeridos para a atividade das enzimas utilizadasna sacarificação podem ser adicionados.

A associação de enzima de sacarificação compreende uma oumais enzimas selecionadas principalmente, mas não exclusivamente, do grupodas "glicosidases" que hidrolisam as ligações éter de di-, oligo-, epolissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x(Enzime Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com Supplement1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1996) eSupplement 5 (1997), [em Eur. J. Biochem. (1994) 223:1-5, Eur. J. Biochem.(1995) 232:1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237:1-5, Eur. J. Biochem. (1997)250:1-6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264:610-650, respectivamente]) do grupogeral das "hidrolases" (EC3.). As glicosidases úteis no presente método podemser categorizadas pelo componente da biomassa que elas hidrolisam. Asglicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases quehidrolisam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases,celobiohidrolases, β-glucosidases, glicosidases que hidrolisam hemicelulose(por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases,arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), eglicosidases que hidrolisam amido (por exemplo, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Em adição, pode serútil adicionar outros ativos à associação da enzima de sacarificação tais comopeptidases (EC 3.4.x.y), Iipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), Iigninases (EC 1.1.1.x),e estearases de feruloíla (EC 3.1.1.73), para auxiliar na liberação dospolissacarídeos dos outros componentes da biomassa. É bem conhecido noestado da técnica que os microorganismos que produzem enzimashidrolisantes de polissacarídeos exibem freqüentemente uma atividade, talcomo degradação da celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou umgrupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Destemodo, uma "celulase" de um microorganismo pode compreender um grupo deenzimas, todos os quais podem contribuir para a atividade degradante dacelulose. As preparações de enzimas comerciais e não comerciais, tais comocelulase, podem compreender numerosas enzimas dependendo do esquemade purificação utilizado para obter a enzima. Portanto, a associação da enzimade sacarificação do presente método pode compreender a atividade da enzima,tal como a "celulase", entretanto, é reconhecido que sua atividade possa sercatalisada por mais de uma enzima.

As enzimas de sacarificação podem ser obtidascomercialmente, tal como a celulase Spezyme® CP (GenencorInternational, Rochester, NY) e xilanase Multifect® (Genencor). Em adição,as enzimas de sacarificação podem ser produzidas biologicamente,incluindo a utilização de microorganismos recombinantes.

Um técnico no assunto saberia determinar a quantidade eficaz deenzimas para o uso nas associações e ajustar as condições para a atividade ótimada enzima. Um técnico no assunto também saberia otimizar as classes deatividades de enzimas requeridas dentro das associações para obter a sacarificaçãoótima de um dado produto de tratamento prévio sob as condições selecionadas.

De preferência, a reação de sacarificação é realizada na, oupróxima à, temperatura e pH ótimo para as enzimas de sacarificação. Atemperatura ótima utilizada na associação de enzima de sacarificação nopresente método varia de cerca de 15 0C a cerca de 100 0C. Em outrarealização, as temperaturas ótimas variam de cerca de 20 0C a cerca de 80 0C.o pH ótimo pode variar de cerca de 2 a cerca de 11. Em outra realização, o pHótimo utilizado na associação de enzima de sacarificação no presente métodovariar de cerca de 4 a cerca de 10.

A sacarificação pode ser realizada por um período de tempo demuitos minutos a cerca de 120 horas e, de preferência, de cerca de muitosminutos a cerca de 48 horas. O tempo da reação irá depender da concentraçãoda enzima e da atividade específica, bem como, do substrato utilizado e ascondições ambientais, tais como temperatura e pH. Um técnico no assuntopode prontamente determinar as condições ótimas de temperatura, pH e tempoa ser utilizado com um substrato particular e com a(s) associação(ões) deenzima(s) de sacarificação.

A sacarificação pode ser realizada em batelada ou como umprocesso contínuo. A sacarificação também pode ser realizada em uma etapa,ou uma série de etapas. Por exemplo, as diferentes enzimas requeridas para asacarificação podem exibir diferente pH ou temperatura ótima. Um primeirotratamento pode ser realizado com a(s) enzima(s) em uma temperatura e pH,seguida pelo segundo ou terceiro (ou mais) tratamentos com diferente(s)enzima(s) em diferente(s) temperatura(s) e/ou pH. Em adição, o tratamentocom as diferentes enzimas em etapas seqüenciais pode ser no mesmo pH e/outemperatura, ou diferentes pHs e temperaturas, tais como utilizando ashemicelulases estáveis e mais ativas em maiores pHs e temperaturas seguidopelas celulases que são ativas em baixos pHs e temperaturas.

O grau de solubilização dos açúcares da biomassa seguida dasacarificação pode ser monitorado pela medida da liberação dosmonossacarídeos e oligossacarídeos. Os métodos para a medida demonossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos no estado datécnica. Por exemplo, a concentração de açúcares redutores pode serdeterminada utilizando o ensaio do ácido 1,3-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, G.L., Anal. Chem. (1959) 31: 426-428). Alternativamente, os açúcares podem sermedidos por HPLC utilizando uma coluna apropriada conforme descrito abaixono presente na seção de Métodos Gerais.

Os açúcares fermentáveis liberados da biomassa podem serutilizados pelos microorganismos apropriados para produzir etanol. Seguindo asacarificação, mas antes da fermentação, a mistura da sacarificação pode serconcentrada por evaporação, por exemplo, para aumentar a concentração deaçúcares fermentáveis. Opcionalmente, o líquido no produto de sacarificaçãopode ser separado dos sólidos em um método contínuo ou em batelada.Opcionalmente, o líquido ou todo o produto de sacarificação pode seresterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) microorganismo(s)utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, opH pode ser ajustado para o apropriado para a fermentação. Em adição, amistura de sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionaisrequeridos para o crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, porexemplo, extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes denitrogênio, sais e elementos traços. Os componentes requeridos para aprodução de um produto específico, feito por um biocatalisador específico,também podem ser incluídos, tais como um antibiótico para manter umplasmídeo ou um cofator requerido em uma reação catalisada por enzima. Osaçúcares adicionais também podem ser incluídos para aumentar aconcentração de açúcares totais. A mistura de sacarificação pode ser utilizadacomo um componente em um caldo de fermentação, por exemplo, perfazendoentre cerca de 100% e cerca de 10% do meio final. As condições defermentação apropriadas são obtidas pelo ajuste destes tipos de fatores para ocrescimento e a produção de etanol por um biocatalisador.

A temperatura e/ou os gases do espaço vazio (headspace)também podem ser ajustados, dependendo das condições úteis para aformulação do(s) microorganismo(s). A fermentação pode ser aeróbia ouanaeróbia. A fermentação pode ocorrer subseqüente à sacarificação, ou podeocorrer concomitantemente à sacarificação pela sacarificação e fermentaçãosimultânea (SSF). A SSF pode manter os níveis de açúcar baixo, produzidospela sacarificação, reduzindo desta maneira a potencial inibição do produto dasenzimas de sacarificação, reduzindo a disponibilidade do açúcar para osmicroorganismos contaminantes, e melhorando a conversão da biomassatratamento prévio para os monossacarídeos e oligossacarídeos.A fermentação de açúcares a etanol pode ser realizada por um oumais catalisadores apropriados em fermentações únicas ou em múltiplasetapas. Os biocatalisadores podem ser microorganismos selecionados a partirda bactéria, fungos filamentosos e leveduras. Os biocatalisadores podem seros microorganismos do tipo selvagem ou microorganismos recombinantes, eincluem Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia,Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Em outra realização, osbiocatalisadores podem ser selecionados a partir do grupo que consiste emEscherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus,Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum e Pichia stipitis recombinantes.

Os biocatalisadores utilizados na fermentação para produzir o etanolforam descritos e outros podem ser descobertos, produzidos através de mutação oumanipulado através dos meios de recombinação. Qualquer biocatalisador que utilizaos açúcares fermentáveis produzidos no presente método pode ser utilizado parafabricar o etanol por fermentação no presente método.

A fermentação dos carboidratos ao etanol, acetona e butanol(fermentação ABE) pelos solvotogênicos Clostridia é bem conhecida (Jones andWoods (1986) Microbiol. Rev. 50: 484-524). Um processo de fermentação para aprodução do butanol, acetona e etanol, utilizando uma cepa mutante de umClostridium acetobutylicum é descrito no documento US 5.192.673. O uso de umacepa mutante de Clostridium beijerinckii para produzir butanol, acetona e etanol édescrito no documento US 6.358.717. As cepas modificadas geneticamente de £.coli também foram utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol(Underwood et al., (2002) nAppI. Environ. Microbiol. 68: 6263-6272). Uma cepamodificada geneticamente de Zymomonas mobilis que possui uma produçãoaprimorada de etanol é descrita no documento US 2003/0162271 A1.

O tratamento prévio e a sacarificação da biomassa em açúcaresfermentáveis, seguidos pela fermentação de açúcares a etanol, são exemplificadosno Exemplo 9 no presente, para a produção de etanol a partir de espigas de milhotratamento prévio utilizando o Z mobilis como o biocatalisador.

O etanol produzido na fermentação por biocatalisadores pode serrecuperado utilizando diversos métodos conhecidos no estado da técnica. Osprodutos podem ser separados dos outros componentes da fermentação pelacentrifugação, filtração, microfiltração e nanofiltração. Os produtos podem serextraídos por trocas de íons, extração por solvente ou eletrodiálise. Os agentesde floculação podem ser utilizados para auxiliar na separação do produto.

Como um exemplo específico, o etanol bioproduzido pode ser isolado do meiode fermentação utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica para asfermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49;639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27: 61-75 (1992), e suasreferências no presente). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos domeio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação ou similares.

Então, o etanol pode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodostais como destilação, destilação azeotrópica, extração líquido-líquido, adsorção,esvaziamento de gás, evaporação de membrana ou pervaporação.

Exemplos

Métodos Gerais ε Materiais

São utilizadas as seguintes abreviações:

"HPLC" é Cromatografia Líquida de Alta Performance, "C" écentígrado, "kPa" é quiloPascal, "m" é metro, "mm" é milímetro, "kW" équilowatt, "pm" é micrômetro, "μΙ_" é microlitro, "ml_" é milímetro, "L" é litro, "min"é minuto, "mM" é milimolar, "cm" é centímetro, "g" é grama, "kg" é quilograma,"p" é peso, "h" é hora, "temp" ou "T" é temperatura, "teori" é teórico, "trat. pr." étratado previamente, "DWB" é o peso seco da biomassa.

O ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida,extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossufônico (MES)1 fosfato depotássio, glicose, xilose, triptona, cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidospela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reatores de Tratamento Prévio

Reator Zipperclave®

O reator Zipperclave® de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie1 PA) é umrecipiente de pressão por batelada equipado com um balde Hastelloy® de 2,5 litrospara o carregamento de biomassa e um agitador para misturar a biomassa. Orecipiente de reação é cercado por um aquecedor elétrico controlada em umatemperatura de tratamento prévio desejado. A injeção da corrente direta também éutilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de tratamentoprévio. A pressão da corrente é ajustada e controlada para manter a temperatura detratamento prévio. O condensado do vapor formado pelo aquecimento do pratocabeça reator Zipperclave®, recipiente e exterior ao balde, drenam a um reservatórioformado entre o balde e a parede interna do reator, para evitar a diluição excessivada calda tratamento prévio.

Reator Jaygo

O reator Jaygo é um reator do tipo palheta horizontal (JaygoManufacturing, Inc., Mahwah, NJ) de 130 litros (cerca de 51 cm de diâmetro χ 91 cmde comprimento), fabricado pela liga Hastelly® C-22. O reator é equipado com umrevestimento de vapor capaz de aquecer a cerca de 177 0C (862 kPa). A injeçãodireta de vapor também é utilizada para trazer rapidamente a biomassa para atemperatura de tratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada paramanter a temperatura de tratamento prévio desejada. Numerosas interfaces decomunicação permitem a injeção de outros solventes e líquidos quentes.

Reator de Pistola de Vapor no Sistema de Digestão em Batelada

O reator de pistola de vapor de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie,PA) é um reator envolvido por vapor que consiste em um comprimento de 102mm sincronizado com um cano Hastelloy® 80 fechado por duas válvulas bola.

Os aquecedores elétricos adicionais são colocados em toda a superfícieexposta, não envolta do reator e controlada em um ponto fixado da temperaturado tratamento prévio. A injeção de vapor direta também é utilizada para trazerrapidamente a biomassa à temperatura de tratamento prévio. A pressão devapor é ajustada e controlada para manter a temperatura de tratamento préviodesejada. O fundo do reator é estreitado a 51 mm. Todo o material tratadopreviamente sai através de um molde substituível no fundo do reator e écoletado em uma bolsa de náilon (Hotfill®) 0,21 m3 sustentada dentro de umtanque fortemente cercada, revestida e resfriada.

Disco de refinamento

O disco de refinamento é um refinador modelo Waldron Srout30,5 cm (Andritz, Inc., Muncy, PA) equipado com um motor elétrico de 11 kW.

O intervalo entre os pratos estacionários e giratórios é variável. A velocidade daverruma de alimentação também é variável, de 0 a 88 rpm. A entrada dorefinador foi modificada com seis pontos de injeção para permitir a introduçãodo vapor, água quente ou outros gases e líquidos de varredura exatamente àfrente do prato giratório do refinador. O refinador era equipado com pratos(Durametal, Corp., Tulatin, OR) no padrão D2A506 em Ni-Hard ou padrão18034-A em Ni-Hard.

Reator de Tratamento Prévio ε de Hidrólise Enzimática

O PEH Reator de 9L (construído em NREL, Golden, CO; vide opedido provisório US CL3447) possui um recipiente de reação de aço inoxidável decerca de 15 cm χ 51 cm com uma lança de injeção para a introdução dos reagentesde processamento. A lança de injeção é conectada utilizando uma junta giratória aum orifício em um revestimento, em uma extremidade do recipiente que possui umorifício adicional para acessar o recipiente. Quatro septos percorrem o comprimentoda parede do recipiente e são ligados perpendicularmente à parede. Os septos e 22cilindros dos meios de atrito de cerâmica de 3,2 cm χ 3,2 cm (E. R. AdvancedCeramics, East Palestine, OH), que flutuam livremente no recipiente, aplicam amistura mecânica à biomassa e ao reagente quando o recipiente é rotacionado,promovendo a assimilação do reagente na biomassa. O PEHReator é colocado emum Equipamento Bellco Cell-Production Roller (Bélico Technology, Vineland, NJ)que fornece um mecanismo para a rotação, e o reator com o equipamento decilindros é alojado em uma câmara de temperatura controlada que fornece calor.Podem ser aplicados vácuo e pressão ao recipiente de reação ao ligar as fontesexternas ao orifício de conexão da lança no revestimento.

Métodos Analíticos

Quantificação da Celulose

A quantidade de celulose em cada amostra de biomassa departida foi determinada utilizando os métodos bem conhecidos no estado datécnica, tais como ASTM E1758-01 "Método padrão para a determinação decarboidratos por HPLC".

Medidas do Teor de Açúcar. Acetamida. Ácido Láctico ε Ácido Acético

Os açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose,arabinose e manose) acetamida, ácido láctico e ácido acético em caldo desacarificação foram medidos por HPLC (Agilent Model 1100, AgilentTechnologies, Palo Alto, CA) utilizando o Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87colunas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas guarda apropriadas.

Na amostra, o pH foi medido e ajustado a 5-6 com ácido sulfúrico senecessário. A amostra foi então passada através de um filtro de seringa 0,2 pmdiretamente em uma ampola de HPLC. As condições da corrida de HPLCforam como segue:

- Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos):

- Volume de injeção: 10-50 pL, dependente da concentração edos limites do detector- Fase móvel: água de grau HPLC, 0,2 pm filtrado edesgaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 ml_/ minuto

- Temperatura da coluna: 80 a 85 0C, temperatura da colunaguarda < 60 0C

- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna principal

- Detector: índice de refração

- Tempo da Corrida: 35 minutos da coleta de dados mais 15 minutosde pós corrida (com possíveis ajustes para os compostos eluídos posteriormente)

- Biorad Aminex HPX-87P (para carboidratos, acetamida, ácidoláctico, ácido acético e etanol):

- Volume de injeção: 5 - 10 μΙ_, dependente da concentração edos limites do detector

- Fase móvel: ácido sulfúrico a 0,1 N, 0,2 pm filtrado e desgaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 ml_/ minuto

- Temperatura da coluna: 55 0C

- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna

- Detector: índice de refração

- Tempo da Corrida: 25 a 75 minutos da coleta de dados

Após a corrida, as concentrações na amostra foram determinadasa partir das curvas padrão para cada um dos componentes.

Exemplo 1

Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa. AltaTemperatura ε Comparação das Concentrações de Amônia

O recipiente do reator Zipperclave® e o prato cabeça foram aquecidospreviamente a uma temperatura de tratamento prévio alvo antes da introdução dacarga de biomassa ao circular o vapor dentro do reator e ventilar diversas vezes. Ocondensado formado durante o aquecimento prévio foi removido por aspiração avácuo antes do tratamento prévio. O balde Hastelloy® foi carregado com 0,635 cm(1/4 de polegada) de forragem moída (100g, peso seco da base) e inserido dentrodo reator pré aquecido. O agitador do reator foi fixado em 20 rpm enquanto umvácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente interno e à carga de biomassa. Asolução de hidróxido de amônio de força necessária para fornecer um peso seco daconcentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso da mistura deamônia aquosa da biomassa, bem como a concentração de amônia desejadalistada na Tabela 1, foi injetada próxima ao fundo do recipiente com um bocal dotipo spray. As amostras de teste possuíam uma concentração de amônia final de12% com relação ao peso seco da biomassa, enquanto as amostras com umaconcentração de amônia final de 35% com relação ao peso seco da biomassaforam utilizadas como meio de comparação. Quando a temperatura da carga debiomassa atingiu 50 0C1 o vapor foi introduzido próximo ao fundo do reator parafluidizar e aumentar a temperatura da carga de biomassa a 140 0C ou 170 0C. aofinal do tratamento prévio, o reator foi despressurizado através de um condensadorde ventilação, e um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado por 3 minutos para diminuira temperatura e remover a amônia adicional da calda tratada previamente antes daabertura do reator e da recuperação da biomassa tratada previamente.

Toda a calda não lavada, de tratamento prévio contendo 0,5 gde celulose (com base na composição inicial de matéria prima) foiadicionada em um volume final de 50 mL a um frasco de agitação de 125mL. O ácido acético (10 a 100 μι.) foi adicionado, para titular o pH dabiomassa tratada previamente com amônia a 5,0 antes da adição deenzima por causa da sensibilidade das enzimas a ambientes de pHelevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pela adição de50 mM de tampão citrato e a temperatura foi mantida a 50 0C. A celulaseSpezyme® CP celulase (Genencor International, Rochester1 NY1 EUA) foiadicionada à concentração listada para cada amostra na Tabela 1. O teorde açúcar no caldo da sacarificação resultante foi determinado após 96horas de sacarificação de acordo com a medida do protocolo descrito nosMétodos Gerais. A liberação de açúcar após 96 horas é mostrada naTabela 2. Os controles para este experimento foram (1) forragem de milhonão tratado, que rendeu 23% do rendimento teórico de glicose (utilizando56 mg de celulase/ g de celulose) e (2) vapor (140 0C) de forragem demilho tratado previamente, que rendeu 40% do rendimento teórico deglicose (utilizando 56 mg de celulase/ g de celulose); a xilose não foimedida para os controles.

Tabela 1

Liberação do Açúcar a Partir da Forragem de Milho Pré Tratada com 96

Horas de Sacarificação

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Estes resultados indicam que um tratamento prévio utilizandoamônia a 12% por 15 minutos a 140 0C, seguido pela sacarificação, libera maisglicose e xilose do que o tratamento prévio na utilização de amônia a 35% por5 minutos a 140 0C. Desse modo, as vantagens de utilizar pouco amônia podeser incorporada por um pequeno aumento no tempo do tratamento prévio.

Exemplo 2

Tratamento Prévio da Forragem em Alta Concentração de Biomassa.

Baixa Temperatura ε Muito Pouco Amônia

O reator Jaygo foi carregado com 0,635 cm de forragem moída (13Kg, base de peso seco). Um vácuo (67,7 kPa) foi aplicado ao vaso, e a solução dehidróxido de amônio diluída foi injetada para fornecer uma concentração de amôniade 6,2 g de amônia/ 100 g de peso seco da biomassa e um peso seco daconcentração de biomassa de 30% em peso com relação ao peso total da misturaamônia aquosa da biomassa. O vácuo foi substituído e o vapor foi aplicado aorevestimento para aquecer a forragem a 100 0C. A forragem encharcada foi mantidana temperatura por 8 horas com mistura constante a 32 rpm, então deixada resfriarao longo da noite com mistura contínua da calda resultante.

A calda de tratamento prévio não lavada e inteira contendo0,5 g de celulose (com base na composição de matéria prima inicial) foiadicionada em um volume final de 50 ml_ a um frasco de agitação de 125mL. O ácido acético (10-100 μΙ_) foi adicionado, caso necessário paratitular o pH da biomassa tratada previamente com amônia a 5,0 antes daadição da enzima por causa da sensibilidade das enzimas aos ambientesde pH elevado. O pH foi controlado a 5,0 durante a sacarificação pelaadição de 50 mM de tampão citrato, e a temperatura foi mantida a 50 0C.

A celulase Spezyme® CP (Genencor International, Rochester, NovaIorque, EUA) foi adicionada a 56 mg/ g de celulose. O teor de açúcar docaldo de sacarificação resultante foi determinado após 96 horas desacarificação de acordo com os protocoles de medidas de açúcardescritos nos Métodos Gerais e é mostrado na Tabela 2.Tabela 2

Liberação do Açúcar das Forragens de Milho Previamente Tratadas a 96Horas

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Os resultados indicam que estas condições de tratamentoprévio de concentrações muito baixas de amônia e baixas temperaturas,(por um período de 8 horas) são tão eficazes quanto utilizar 12% deamônia a 140 0C por 15 minutos.

Exemplo 3

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Alta Concentração deBiomassa. Baixa Temperatura, ε Concentração Muito Baixa de AmôniaSeguida pela Sacarificação com Alta Concentração de Biomassa

As espigas de milho inteiras ou fracionadas (cerca de 13 kg,base de peso seco) foram colocadas no reator Jaygo. As espigas foramfracionadas ao passar através do refinador em disco (Métodos Gerais)equipado com pratos C-2975. As espigas de milho fracionadas resultantesforam passadas através de uma malha de 1,27 cm. Quaisquer pedaçosretidos foram passados através do refinador em disco novamente comuma pequena fenda de 0,5 cm. Fio aplicado vácuo ao reator e a soluçãode hidróxido de amônia diluída foi injetada para fornecer a concentraçãoamônia final desejada (2% ou 6%), e a concentração de biomassa seca(30% ou 40%) como dado na Tabela 3. O vácuo foi aliviado e o vapor foiaplicado ao revestimento para aquecer as espigas de milho enquantoeram encharcadas a uma temperatura de 93 0C para a amostra de espigainteira e 85 0C para as amostras de espigas fracionadas. Os períodoscurtos de maiores velocidades do agitador (até 96 rpm) foram aplicadosem uma tentativa de aumentar a velocidade de aquecimento. As espigasencharcadas foram mantidas em uma temperatura por 4 ou 8 horas comagitação constante a 32 rpm e então deixadas resfriar ao longo da noitecom agitação contínua.

Antes da biomassa tratada previamente ter sido removida do reator, oreator foi colocado sob vácuo a 90 0C para retirar a amônia da biomassa tratadapreviamente. Antes da sacarificação, o pH da biomassa de espiga de milho tratadapreviamente foi ajustado a 5,5 com ácido cítrico sólido. Cerca de 10 kg de espiga demilho inteira tratada previamente foi sacarificada em um reator Jaygo a 50 0C. Cercade 1.400 g da espiga de milho fracionada tratada previamente foi adicionado aoPEHReator1 junto com 22 cilindros de atrito de cerâmica (3,2 cm de diâmetro χ 3,2 cmde comprimento; E.R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) para sacarificação.

Uma mistura de enzima de 28 mg e Spezyme CP®/ g celulose em ferragem nãotratada mais 28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase® foi utilizada para cada reaçãode sacarificação. O peso seco final da concentração de biomassa no início de cadasacarificação era 30% com relação ao peso total da mistura de associação de enzimade sacarificação da biomassa tratada previamente. O PEHReator foi rotacionadoaxialmente a 19 rpm enquanto manteve uma temperatura de 50 0C. O conteúdo deaçúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado de acordo com oprotocolo de medidas de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação do açúcar após 96horas é mostrada na Tabela 3.

Tabela 3

Liberação de Açúcar das Espigas de Milho Previamente TratadasUtilizando uma alta Concentração de Biomassa (em Peso Seco) Durante aSacarificação

DWB: peso seco de biomassa (a porcentagem é calculada comrelação ao peso total da mistura).<table>table see original document page 31</column></row><table>

Exemplo 4

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Alta Concentração de Biomassa,Baixa Temperatura, ε Concentração Muito Baixa de Amónia Seguida pelaSacarificacão de Alta Concentração de Biomassa

As espigas de milho fracionadas (13 kg, base seca) foramcolocadas no reator Jaygo. Após aplicar um vácuo no reator, a solução dehidróxido de amônio de força apropriada para fornecer 2% de amônia e 30% depeso seco da concentração de biomassa foi bombeada dentro do reator com32 rpm de mistura a temperatura ambiente. Os conteúdos do reator foramentão aquecidos a 95 0C utilizando um revestimento de vapor de baixapressão. Uma vez que o reator atingiu 95 0C1 uma injeção de vapor direta foiutilizada para aquecer os conteúdos do reator a 145 0C. Quando o reatoratingiu 145 0C, os conteúdos do reator foram mantidos a essa temperatura por20 min utilizando o vapor do revestimento e alguma injeção de vapor direta.

Após 20 min, foi aplicado um vácuo na ventilação ao reator e o motor dedesfibração foi ligado por 5 min. Após 1 hora, a água fria foi ligada norevestimento. Os teores do reator Jaygo foram resfriados entre 33 0C e 37 0C;então foi utilizado CO2 para pressurizar o reator a 138 kPa. O CO2 pressurizadoda atmosfera foi mantido por 30 minutos. A temperatura final dos conteúdos doreator era de 27 0C a 31 0C. O pH da biomassa encharcada/ tratadapreviamente foi de cerca de 7,5.

A biomassa tratada previamente foi removida do reator Jaygo etransferido ao PEHReator para a sacarificação e um peso seco final daconcentração de biomassa no início da sacarificação de 30% com relação ao pesototal da mistura de associação de enzima sacarificada de biomassa tratadapreviamente. O pH foi então ajustado a 5,5 com ácido cítrico sólido, e o materialdigerido com 28 mg de Spezyme CP®/ g celulose e 28 mg/ g de celulose MultifectXylanase® / g em espiga não tratada conforme descrito no Exemplo 3. O teor deaçúcar do caldo de sacarificação resultante foi determinado de acordo com oprotocolo de medidas de açúcar nos Métodos Gerais. A liberação do açúcar após96 horas de digestão é mostrada na Tabela 4.

Tabela 4

Liberação de Açúcar das Espigas de Milho Previamente TratadasUtilizando uma alta Concentração de Biomassa íem Peso Seco) Durante aSacarificação

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Exemplo 5

Tratamento Prévio com Adição de Plastificante

A espiga de milho inteira foi tratada previamente conformedescrito no Exemplo 3 em peso seco de concentração de biomassa decerca de 30% com relação ao peso total de mistura de amônia aquosa dabiomassa, 100 0C, por 8 horas no reator Jaygo com 3% em peso relativoao peso seco da biomassa de glicerol adicionado para agir como umplastificante. Após o tratamento prévio o pH do material resultante foiajustado a 5 com ácido cítrico sólido. A espiga tratada previamente foientão digerida conforme descrito no Exemplo 3. Uma mistura de enzimade 28 mg de Spezyme CP®/ g de celulose em forragem não tratada mais28 mg/ g de celulose Multifect Xylanase® em espiga não tratada foiutilizada. Após 96 horas de digestão, a concentração de glicose era de92,3 g/Lea concentração de xilose era de 54,4 g / L.

Exemplo 6

Refinamento do Disco da Biomassa Tratada Previamente

A forragem foi tratada previamente da maneira como descritano Exemplo 1, com amostras diferentes possuindo baixa concentração deamônia (12%) ou concentrações comparativas de amônia (35%), econdições de temperatura, tempo e enzima conforme listado na Tabela 5.

As espigas inteiras foram tratadas previamente conforme descrito noExemplo 3 com diferentes amostras possuindo concentrações muitobaixas de amônia (3% ou 6%), e outras condições conforme listadas naTabela 5. Seguindo o tratamento prévio, as amostras foram passadasatravés de um refinador de disco Sprout Waldron. A fenda entre o pratoestacionário e o prato giratório foi fixada a 0,254 mm (0,010 polegadas) ea velocidade de alimentação da verruma a 7 rpm. O material refinado foisacarificado conforme descrito no Exemplo 2 e o teor do açúcar do caldode sacarificação resultante foi determinado de acordo com o protocolo demedida de açúcar nos Métodos Gerais. Os resultados da sacarificação a96 horas são mostrados na Tabela 5. Os resultados mostraram que com arefinação do disco antes da sacarificação, foi obtido uma melhordigestibilidade, ou foi eficaz o uso de menores concentração de enzima.Tabela 5

Digestibilidade do Material Tratado Previamente que foi Refinado emDisco antes da Sacarificacão

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Exemplo 7

Tratamento por Pistola de Vapor da Biomassa Tratada Previamente

A forragem foi tratada previamente conforme descrito no Exemplo1 utilizando as condições de 30% em peso seco de biomassa relativo ao pesototal da mistura de amônia aquosa da biomassa, 6% em peso de amônia comrelação ao DWB1 100 0C, 8 horas, no reator Jaygo. A espiga foi tratadapreviamente conforme descrita no Exemplo 3 utilizando as condições de 40%em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura de amôniaaquosa da biomassa, 6% em peso de amônia com relação ao DWB1 93 0C1 8horas, no reator Jaygo. As amostras de cada biomassa tratada previamenteforam carregadas em um reator de pistola de vapor de 4 litros. O materialtratado previamente foi submetido a 170 0C por 5 min ou 140 0C por 20 minantes de ser liberado através de um molde. O material resultante foisacarificado conforme descrito no Exemplo 2. Os resultados são dados naTabela 6 abaixo. Os resultados mostrados mostraram que o tratamento pelapistola de vapor antes da sacarificação aprimorou a liberação de glicose.

Tabela 6

Digestibilidade do Material Tratado Previamente após o Tratamento porPistola de Vapor

<table>table see original document page 35</column></row><table>Exemplo 8

Modelagem do Tratamento Prévio com Amõnia Reciclada

As vantagens da reciclagem da amônia foram examinadas com osmodelos Aspen (Aspen Technologies, Cambridge1 MA1 versão 12.1) para doisesquemas de tratamento prévio: baixa temperatura (85 0C), tempo de residêncialongo (4 horas) e alta temperatura (130 0C), tempo de residência curto (20 min). Emcada modelo existiu uma série de 3 tanques flash operando em pressõessucessivamente menores após o reator de tratamento prévio para fornecer um meiopara a reciclagem de amônia. Conforme a corrente de alimentação entrava em cadatanque, ela se dividia em vapor e frações líquidas devido a redução na pressão. Afração do vapor foi reciclada para o tratamento prévio, enquanto a fração líquida foipara a próxima etapa no processo. Assumindo que 2% em peso de amônia comrelação ao DWB e cerca de 27% em peso seco da biomassa com relação ao pesototal da mistura de amônia aquosa na biomassa no tratamento prévio, o fornecimentode amônia fresca e das correntes de reciclagem para cada processo é mostrado naTabela 7. Em ambos os modelos, os tanques flash operaram de modo similar tal quea reciclagem da amônia foi similar. Em ambos os cenários, mais da metade daamônia requerida foi fornecida através de reciclagem, reduzindo a necessidade e ocusto da amônia fresca.

Tabela 7

Amônia Reciclada no Tratamento Prévio - Modelo de Resultados de Aspen

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 9

Produção de Etanol a partir de Biomassa com Tratamento Prévio de

Pouca Amônia ε Espiga de Milho Sacarificada ε Comparação à Forragemcom Tratamento Prévio de Muita Amônia ε Forragem Sacarificada

O hidrolisado de espiga foi gerado pelo t ratamento prévio deespigas inteiras no reator Jaygo por 8 horas a 93 0C com 6% em peso deamônia com relação ao peso seco da biomassa em uma concentração debiomassa em peso seco de 40% com relação ao peso total da mistura deamônia aquosa da biomassa, conforme descrito no Exemplo 3. Após otratamento prévio, a amônia foi removida por aquecimento do reator a 90 0Csob vácuo. O pH da biomassa tratamento prévio foi ajustado a 5 com ácidosulfúrico. A biomassa tratamento prévio foi sacarificação no reator Jaygo a 30%em peso seco da biomassa com relação ao peso total da mistura deassociação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com28 mg/g de celulose Spezyme® celulase e 28 mg/g de celulose Multifect®xilanase por 168 horas a 50 0C e pH 5. O hidrolisado resultante foi utilizadopara a fermentação de Zymomonas mobilis 8b em fermentadores Sixfors(INFORS AG, Suíça). A Zymomonas mobilis 8b é uma cepa de Zymomonasmobilis que foi modificada geneticamente para fornecer, em relação ao tiposelvagem, uma produção melhorada de etanol e é descrita no pedido depatente US 2003/0162271 A1 (Exemplos IV, Vl e XII). O hidrolisado da espigacompreende 78 g/L de glicose, 51 g/L de xilose, 6 g/L de acetamida e 7 g/L deácido acético. O hidrolisado de espiga de milho foi utilizado a 40% e 80% deforça, com o balanço do meio sendo o meio aquoso concentrado que consistede extrato de levedura, e quantidades de KH2PO4 em quantidades tais quesuas concentrações na calda final foram cerca de 5 g/L e 2 g/Lrespectivamente. Adicionalmente, na calda 40% hidrolisada, a glicose e axilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suasconcentrações ao mesmo nível que nas caldas 80% hidrolisadas. Afermentação foi realizada a 37 0C. A agitação nos fermentadores era de 100rpm e o pH foi mantido a 5,5 por adição de KOH a 2N. Os resultados sãomostrados na Tabela 8. Os açúcares e o etanol foram analisados conformedescrito nos Métodos Gerais.

Para fins de comparação, a ferragem hidrolisada foi gerada pelotratamento prévio da ferragem com 35% em peso de amônia com relação ao pesoseco da biomassa em um peso seco da concentração de biomassa de cerca de30% em peso com relação ao peso total da mistura de amônia aquosa de biomassaa 170 0C por 5 minutos no reator Zipperclave®, conforme descrito no Exemplo 1. Abiomassa tratada previamente foi digerida enzimaticamente a 30% em peso secoda biomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzima desacarificação de biomassa tratada previamente com 224 mg/g de celulose SpezymeCP® celulase a 50 0C e pH 5 para gerar uma alta concentração de açúcarhidrolisado para o teste de fermentação. O hidrolisado resultante compreendeu 88g/L de glicose, 52 g/L de xilose, 9 g/L de ácido acético e 15 g/L de ácido láctico.

Para a produção de etanol, a Zymomonas mobilis 8b foi fermentada em caldahidrolisada de 40% ou 80% (v/v). O volume remanescente foi feito de meio aquosoconcentrado que consiste em extrato de levedura, KH2PO4 e tampão MES emquantidades tais que suas concentrações na calda final seria de cerca de 10 g/L, 2g/L e 0,1 M1 respectivamente. Adicionalmente, na calda hidrolisada 40%, a glicose ea xilose foram adicionadas em quantidades suficientes para trazer suasconcentrações ao mesmo nível que a calda hidrolisada a 80%. A fermentação foifeita a 30 0C e a pH 6 em 25 m de frascos de agitação com 20 ml de volumetrabalhado. A agitação foi mantida a 150 rpm. A análise foi com relação à amostrade fermentação do hidrolisado da espiga e os resultados são dados na Tabela 8.

Tabela 8

Utilização do Açúcar ε Rendimentos do Etanol na Fermentação dosHidrolisados de Espiga de Milho ε Forragem

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Estes resultados mostraram que a fermentação para produzir etanol apartir de hidrolisado de espiga de milho tratamento prévio com pouca amônia foimais eficiente do que da ferragem tratamento prévio com muita amônia.

Exemplo 10

Formação da Acetamida Durante o Tratamento Prévio

As amostras derivadas de espigas de milhos tratadaspreviamente de acordo com os processos descritos no Exemplo 3 e Exemplo 4foram analisadas para determinar os destinos dos grupos acetila na biomassa.Os caldos do tratamento prévio (mistura do tratamento prévio com sólidos eminsolúveis removidos) fora m analisados quanto ao teor de ácido acético eacetamida conforme segue. O pH de cada amostra foi ajustado a cerca de 3com H2SO4 (72%). Para as medidas de acetamida, a amostra foi passadaatravés de um filtro de 0,2 pm e analisadas por HPLC de acordo com ascondições listadas abaixo. Para as medidas de acetato total (inclui o acetatopresente como ácido acético e acetamida), a amostra acidificada foiautoclavada por 1 hora a 121 0C; a acetamida foi convertida quantitativamentea ácido acético durante esta etapa. Após a autoclave, a amostra foi deixadapara resfriar. A amostra foi então passada através de um filtro de 0,2 μητι emuma ampola de amostra e analisada de acordo com as condições listadasabaixo. As concentrações de ácido acético e acetamida foram determinadas apartir das curvas padrão geradas para cada um.

- Fase móvel: H2SO4 a 0,01 N, 0,2 pm filtrado e desgaseificado

- Velocidade de fluxo: 0,6 mL/ minuto

- Temperatura da coluna: 55 a 65 0C

- Temperatura do detector: o mais próximo possível datemperatura da coluna

- Detector: índice de refração

- Tempo da Corrida: 60 minutos

- Coluna: coluna Biorad Aminex HPX-87H com coluna guardacorrespondente

Os resultados para as 3 diferentes condições de tratamentoprévio analisadas são mostradas na Tabela 9. para cada caso, todos os gruposacetila foram solubilizados para o ácido acético ou a acetamida.

Tabela 9

Conversão dos Grupos Acetila na Biomassa em Acetamida Durante oTratamento Prévio

DWB, peso seco da biomassa. (a porcentagem é calculada comrelação ao peso total da mistura de amônia aquosa na biomassa)

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Utilizando uma concentração de amônia de 6%, próximo a metadedos grupos acetila foram convertidos a acetamida, o que é não inibitório para ocrescimento do biocatalisador conforme mostrado no Exemplo 11.

Exemplo 11

Efeito da Acetamida ε do Ácido Acético no Crescimento de Zymomonas

Para testar a toxicidade da acetamida e do ácido acético, a cepa deZ mobilis 8b (descrito no Exemplo 9) foi cultivada na meio de fermentação em pH6,0 com e sem acetamida ou ácido acético. O meio de fermentação foi composto de10 g/ L de extrato de levedura, 2 g/ L de KH2PO4, 70 g/ L de glicose, 40 g/ L dexilose e 0,1 M de tampão MES. O Z mobilis 8b foi cultivado em frascos de agitaçãode Erlenmeyer embaçado de 25 mL rotacionados a 150 rpm a 30 0C em meio nãosuplementado (controle), meio suplementado com 6 g/ L de acetamida ou meiosuplementado com 7,2 g/ L de ácido acético. Conforme mostrado na Figura 1, apresença de acetamida não possui a influencia na taxa de crescimento ou nadensidade final de Z mobilis, enquanto que a presença de ácido acético resultouem uma taxa de crescimento reduzida e menor rendimento celular (conformemedido pela massa celular seca).

Exemplo 12

Tratamento Prévio do Bagaço em Alta Concentração de Biomassa. AltaTemperatura ε Muito Pouca Amônia. ε Sacarificação em Baixa ε AltaConcentração

O PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), com nenhum meiode atrito, foi carregado com 1,27 cm de bagaço moído (370 g, base em pesoseco). Este bagaço da cana de açúcar era a NIST Reference Material RM8491, do clone da cana de açúcar H65-7052, originalmente obtido pela HawaiiSugar Planters Association, sub-estação Kunia, Oahu, HU. Ele foi moído emum moinho Wiley para passar através de uma malha de 2 mm, com as finas(+74 malha) removidas. O PEHReator foi resfriado a 4 0C pela rotação emcontato com gelo na superfície externa. Um vácuo foi aplicado ao recipiente dereação e foi injetada a solução de hidróxido de amônio diluído, que foipreviamente resfriado em uma sala fria a 4 0C e passada através do tuboimerso em banho de água gelada, para fornecer uma concentração de amôniade 4 g/100 g de peso seco da biomassa e um peso seco da concentração dabiomassa de 45g/ 100 g da mistura de amônia aquosa da biomassa total. Orecipiente de reação carregado com amônia e bagaço foi resfriado a 4 0C pelaaplicação de gelo à superfície do recipiente de reação giratório, e rotacionado a4 0C por 30 min. Neste tempo, os conteúdos foram transferidos para o reator depistola de vapor que é descrito nos Métodos Gerais. Uma vez que o reator depistola de vapor foi carregado com a mistura de bagaço de amônia, atemperatura foi aumentada a 145 0C e a mistura foi mantida nestatemperatura por 20 min. No final do tempo de tratamento prévio, o bagaçofoi descarregado do reator de pistola de vapor através de um moldecircular de 1 polegada em um tanque fhash. Uma amostra de bagaçotratado previamente foi subseqüentemente sacarificação em um frasco deagitação e outra amostra (cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificaçãono PEHReator. A sacarificação no frasco de agitação foi realizada em 5%de peso seco da biomassa com relação ao peso da mistura de associaçãode enzima de sacarificação da biomassa tratada previamente, enquanto asacarificação no PEHReator foi realizada a 30% do peso seco da biomassarelativa ao peso total da mistura de associação de enzima de sacarificaçãoda biomassa tratada previamente. A temperatura foi mantida a 50 0C.

Para a sacarificação do PEHReator, cerca de 476 g (cerca de 163 gde peso seco) de biomassa tratada previamente e 22 cilindros de atrito decerâmica foram adicionados ao recipiente de reação. O pH foi ajustado a 5,0 - 5,5com ácido cítrico sólido. O reator foi mantido dentro de uma câmara de incubaçãocontrolada a 50 0C e rotacionada axialmente a 19 rpm. O bagaço também foisacarificação a 5% em peso seco da biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzima de sacarificação da biomassa tratadapreviamente em um frasco de agitação. Todas as sacarificações foram feitas com28,4 mg/g de celulose Spezyme CP® celulase e 28,4 mg/g de celulose Multifect®xilanase a 50 0C e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos dados na Tabela 1 abaixosão a liberação como porcentagem do rendimento teórico.

Tabela 10

Rendimentos Seguindo o Tratamento Prévio ε a Sacarificação do Bagaço

<table>table see original document page 43</column></row><table>ND: não determinado

Os resultados demonstraram que o tratamento prévio do bagaçocom concentração muito baixa de amônia permite a liberação substancialmentede açúcar quando comparado ao controle não tratamento prévio, e que asacarificação em alta concentração de biomassa seca no PEHReator é muitoeficaz na liberação de açúcares.

Exemplo 13

Tratamento Prévio da Serragem de Choupo Amarelo em AltaConcentração de Biomassa. Alta Temperatura ε Muito Baixa de Amônia. εSacarificação a Baixa ε Alta Concentração

O PEHReator1 sem o meio de atrito, foi carregado com serragemde choupo amarelo (596 g, base em peso seco; adquirido da Sawmiler Inc.,Haydenville, OH). Foi aplicado um vácuo ao recipiente do reator e a solução dehidróxido de amônio diluído foi injetada para fornecer uma concentração deamônia de 6g/ 100 g em peso seco de biomassa e um peso seco deconcentração de biomassa de 44 g/ 100 g da mistura de amônia aquosa dabiomassa. O recipiente do reator carregado com amônia e serragem de choupoamarelo foi trazido a 4 0C conforme descrito no Exemplo 12, e rotacionando a 40C por 30 min. Neste tempo, os conteúdos foram transferidos para o reator depistola de vapor. Uma vez que o reator de pistola de vapor foi carregado com amistura de amônia-choupo, a temperatura foi aumentada para 145 0C e amistura foi mantida na temperatura por 20 minutos. No final do tempo detratamento prévio, a serragem de choupo amarelo foi descarregada do reatorde pistola de vapor através de um molde circular de 1 polegada em um tanqueflash. Uma amostra de serragem de choupo amarelo tratada previamente foisacarificada subseqüentemente conforme descrito no Exemplo 12 em umfrasco de agitação, e outra amostra foi sacarificada no PEHReator. Asacarificação do frasco de agitação foi realizada a 5% em peso seco debiomassa relativa ao peso total da mistura de associação de enzima desacarificação de biomassa tratada previamente, enquanto que a sacarificaçãodo PEHReator (utilizando cerca de 279 g em peso seco de serragem tratadapreviamente) foi realizada a 30% em peso seco de biomassa com relação aopeso total da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassatratada previamente. A serragem de choupo amarelo não tratado previamentetambém foi sacarificada a 5% em peso seco da biomassa com relação ao pesototal da mistura de associação de enzima de sacarificação de biomassa tratadapreviamente em um frasco de agitação. Todas as sacarificações foram feitascom 28,4 mg/ g de celulose de Spezyme CP® celulase e 24,8 mg/ g de celuloseMultifect® xylanase a 50 0C e pH 5,5 por 96 horas. Os rendimentos dados naTabela 11 abaixo são a liberação ou cada açúcar como uma porcentagem dorendimento teórico.

Tabela 11

Rendimentos seguindo o Tratamento Prévio ε a Sacarificação da Serragemde Choupo Amarelo

<table>table see original document page 45</column></row><table>

ND: não determinado

Os resultados demonstraram que o tratamento prévio daserragem de choupo amarelo com concentração muito baixa de amôniapermite a liberação substancial de açúcar quando comparado ao controle nãotratamento prévio, e que a sacarificação em alto peso seco de biomassa noPEHReator é mais eficaz na liberação de açúcares do que o frasco de mistura.

Exemplo 14

Produção de Etanol pela Fermentação de Levedura em Hidrolisado apartir de Biomassa de Espiga de Milho Sacarificada ε Tratada Previamentecom Muito Pouco Amônia

O hidrolisado gerado a partir do tratamento prévio e dasacarificação da espiga de milho foi utilizada para produzir etanol pelafermentação da levedura. O hidrolisado foi gerado pelo tratamento prévio depedaços de espiga no reator de pistola de vapor. A primeira biomassa daespiga de milho foi carregada no PEHReator (descrito nos Métodos Gerais), foiaplicado vácuo, e foi injetada uma solução de hidróxido de amônio diluído parafornecer uma concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g em peso secoda biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 30 g em pesoseco da biomassa/ 100 g da mistura de amônia aquosa da biomassa total. Orecipiente do reator carregado de amônia e espiga de milho foi rotacionado a 40C por 30 min. Os conteúdos foram transferidos ao reator de pistola de vapor(descritos nos Métodos Gerais), a temperatura foi aumentada a 145 0C, e amistura foi mantida na temperatura por 20 min. O material da pistola de vaporfoi descarregado em um tanque flash, e o vácuo foi mantido no tanque flash paraauxiliar a remoção de amônia. Após o ajuste do pH, a biomassa tratadapreviamente foi sacarificada a 30 g em peso seco da biomassa/100 g da mistura deassociação de enzima de sacarificação de biomassa tratada previamente com 28,4mg/ g de celulose Spezyme CP® celulase e 10,1 mg de proteína ativa/ g deassociação de enzima de celulose que consiste em β-glucosidase, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase por 72 horas a 50 0C e pH 5,5.

Este hidrolisado foi utilizado como uma fonte de açúcarfermentável para a conversão a etanol pelo tipo selvagem de Saccharomycescerevisiae nos frascos de agitação. O hidrolisado foi utilizado a 10% (v/v) deforça, com o balanço sendo o meio aquoso consistindo em 10 g/ L de extratode levedura e 20 g/ L de peptona. As leveduras foram cultivadas em 50 ml_ demeio em um frasco embaçado de 250 mL. As culturas foram incubadas a 30 0Ccom agitação a 250 rpm por 24 horas. A quantidade de etanol produzida foimedida por HPLC conforme descrito no Exemplo 9 e os resultados dos frascosem duplicata estão listados na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12

Utilização do Substrato ε Formação do Produto pela Fermentação comLevedura

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Exemplo 15

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração deBiomassa Seca com Muito Pouco Amônia

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston1NJ, EUA), seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com umamalha de 1,9 cm padrão US. Aproximadamente 805 g de espigas fracionadasforam carregadas no PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de7%. A atmosfera no recipiente do reator era descarregada 5 vezes comnitrogênio antes do carregamento. O reator, com nenhum meio de atrito, foiaquecido previamente a 75 0C antes do inicio do experimento, sem rotação.

Quando a temperatura dentro do recipiente do reator estabilizou a 75 0C, omecanismo de rolamento da incubadora foi ligado e a rotação foi ajustada a 19rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amônia diluída parafornecer uma concentração de amônia de 6 g de amônia/100 g em peso secode biomassa e uma concentração de sólidos de 50 g em peso seco debiomassa/ 100 g em peso total da mistura de amônia da biomassa foi entãobombeada dentro do reator. O etanol a 1 g/100 g de peso seco da biomassafoi adicionado à solução. A solução de amônia foi bombeada através de umaalça aquecida em um banho de água aquecida a cerca de 75 0C fabricadoutilizando um reator Parr de 2 galões. A solução de hidróxido de amônia diluídae aquecida foi injetada em uma lança de injeção dentro do recipiente do reatore pulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. O reator foimantido a 75 0C por 2 horas enquanto gira a 19 rpm. No final deste tempo, umvácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30 min pararemover a amônia e diminuir a temperatura dos conteúdos do reator a cerca de50 0C. O dióxido de carbono foi então injetado no reator para aliviar o vácuo e oreator foi pressurizado a 103 kPa de pressão no indicador e mantido napressão por 30 min a 50 0C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e foi adicionadoo meio de atrito. O pH dos conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeçãode tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8 utilizando a lança de injeção paraaumentar a força de tampão de ácido cítrico a cerca de 75 mM, mais a adiçãode monoidrato de ácido cítrico. Nem toda a amônia foi retirada na etapa devácuo nem neutralizada com CO2. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentrodo reator seguindo o aquecimento a 50 0C e então os conteúdos foramdeixados para equilibrar ao incubar o reator a 50 0C e 19 rpm por 1 hora. Ainjeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lançade injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampãonas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesseacima de 5,5, então o monoidrato de ácido cítrico sólido adicional eraadicionado e o reator era incubado com mistura a 50 0C por 1 hora adicional.Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez queo pH desejado era atingido, 12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e5 mg de proteína ativa por grama de associação de enzima de celulose queconsistia em β-glucosidade, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foramcarregadas dentro do reator. O reator permaneceu na incubadora a 50 0C e 19rpm por 72 horas. Seguindo esses tratamento prévio e sacarificação, orendimento do monômero de glicose era de 62,0% e o rendimento domonômero de xilose era de 31,0%. O rendimento de glicose total era de 75,2%e a xilose total era 80,3%.

Exemplo 16

Tratamento Prévio da Espiga de Milho em Maior Concentração de Sólidoscom Muito Pouco Amônia ε Condições Alternadas

As espigas de milho inteiras processadas com um moinho martelo(10 polegadas de moinho martelo, Glen Mills Inc., Clifton, NH) para passar atravésde uma malha de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espiga de milho foram carregadasdentro do PEH Reator. O teor de umidade nas espigas era de cerca de 7%.

Também foram adicionados 22 cilindros de atrito de cerâmica (3,2 cm de diâmetro χ3,2 cm de comprimento; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH), ao reator.

O reator foi aquecido previamente a 95 0C antes de iniciar o experimento, semrotação. Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes deiniciar e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do recipiente do reatorestabilizou a 95 0C1 o mecanismo de rolamento na incubadora foi ligado e a rotaçãofoi ajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxido de amôniadiluída para fornecer uma concentração de amônia de 6 g de amônia/ 100 g empeso seco de biomassa e uma concentração de sólidos de 50 g em peso seco debiomassa/ 100 g em peso total da mistura de amônia - biomassa foi entãobombeada dentro do reator. A solução de amônia foi bombeada através de umaalça aquecida em um banho de água aquecida utilizando um reator Parr de 2galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada em umalança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nas espigasfracionadas que giram e rolam no reator. O reator foi mantido a 95 0C por 2 horasenquanto girava a 19 rpm. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foiaplicado ao vaso do reator por 30 min para remover a amônia e diminuir atemperatura dos conteúdos do reator a cerca de 50 0C. O dióxido de carbono foientão injetado no reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa depressão no indicador e mantido na pressão por 30 min a 50 0C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH dosconteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de tampão de ácido cítrico a 1 Ma pH 4,8, em que o monoidrato de ácido cítrico foi adicionado e dissolvido. Otampão de ácido cítrico foi injetado dentro do reator seguindo o aquecimento a 500C e então os conteúdos foram deixados para equilibrar ao incubar o reator a 50 0Ce 19 rpm por 1 hora. A injeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é giradoutilizando a lança de injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniformedo tampão nas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acimade 5,5, então o monoidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e o reatorera incubado com mistura a 50 0C por 1 hora adicional. Este processo foi repetidoaté que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido,12,9 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por gramade associação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidade, xilanase, β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro do reator. O reatorpermaneceu na incubadora a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo essestratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose era de50,7% e o rendimento do monômero de xilose era de 35,7%. Os rendimentos deglicose e xilose totais eram de 71,7% e 89,8%, respectivamente.Exemplo 17

Tratamento Prévio da Espiga de Milho com Muito Pouco Amônia ε BaseAdicional

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 0,95cm, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9 cmpadrão US. Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foram carregadasno PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%. O reator foiaquecido previamente a 95 0C antes do inicio do experimento, sem rotação.

Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reator antes do inícioe o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do recipientereestabilizou a 95 0C1 o mecanismo de rolamento da incubadora foi ligada e arotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidade apropriada de solução de hidróxidode amônia para fornecer uma concentração de amônia de 3,2 g de amônia/100g em peso seco de biomassa e NaOH para fornecer uma concentração de 1,9g de NaOH/ 100 g em peso seco da biomassa enquanto mantém aconcentração de sólidos de 30 g em peso seco de biomassa/ 100 g de pesototal da mistura de biomassa-amônia foi então bombeada dentro do reator. Aamônia e a solução de base adicional foram bombeadas através de uma alçaaquecida em um banho de água fabricada utilizando um reator Parr de 2galões. A solução de hidróxido de amônia diluída e aquecida foi injetada pormeio de uma lança de injeção dentro do recipiente do reator e pulverizada nasespigas fracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo a injeção, o vácuono recipiente foi aliviado para pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95 0Cpor 30 min, então a temperatura foi diminuída a 85 0C onde ela foi mantida por4 horas. No final deste tempo, um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao vasodo reator por 30 min para remover a amônia e diminuir a temperatura dosconteúdos do reator a cerca de 50 0C. O dióxido de carbono foi então injetadono reator para aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressãono indicador e mantido na pressão por 30 min a 50 0C.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH detodos os conteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela injeção de cerca de 75 mLde tampão de ácido cítrico a 1 M a pH 4,8, no qual o monoidrato de ácidocítrico foi adicionado e dissolvido. O tampão de ácido cítrico foi injetado dentrodo reator seguindo o aquecimento a 50 0C e então os conteúdos foramdeixados para equilibrar ao incubar o reator a 50 0C e 19 rpm por 1 hora. Ainjeção de tampão de ácido cítrico enquanto o reator é girado utilizando a lançade injeção permitiu uma pulverização e distribuição mais uniforme do tampãonas partículas de espiga tratadas previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesseacima de 5,5, então o monoidrato de ácido cítrico sólido adicional eraadicionado e o reator era incubado com mistura a 50 0C por 1 hora adicional.

Este processo foi repetido até que o pH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez queo pH desejado era atingido, 28,4 mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e28,4 mg / g de celulose Multifect foram carregados no reator. O reatorpermaneceu na incubadora a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose erade 56,1% e o rendimento do monômero de xilose era de 39,5%. Osrendimentos de glicose e xilose total eram de 82,8% e 84,2%, respectivamente.

Esses valores são as médias dos dois experimentos.

Exemplo 18

Tratamento Prévio à Temperatura Ambiente ε com Muito Pouco Amônia

As espigas de milho inteiras processadas com uma britadeira demaxilas (motor de 2,2 kW) com um espaçador de mandíbula de cerca de 3/8 depolegadas, seguido por um delumper (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.),seguido pela seleção com uma malha Sweco equipado com uma malha de 1,9cm padrão US. Aproximadamente 460 g de espigas fracionadas foramcarregadas no PEHReator. O teor de umidade nas espigas era cerca de 7%.

Também foram adicionados ao reator 22 cilindros de atrito cerâmico (3,2 cm dediâmetro χ 3,2 cm de comprimento; E.R. Advanced Ceramics, East Palestine,OH, EUA). Um vácuo (cerca de 85 kPa) foi aplicado ao recipiente do reatorantes do início e o recipiente foi selado. Quando a temperatura dentro do reatorreestabilizou a temperatura ambiente (22 a 26 0C), o mecanismo de rolamentoda incubadora foi ligada e a rotação foi ajustada a 19 rpm. A quantidadeapropriada de solução de hidróxido de amônia diluída para fornecer umaconcentração de amônia de 4 g de amônia/100 g em peso seco de biomassa eenquanto mantém uma concentração de sólidos de 30 g em peso seco debiomassa/ peso total da mistura de biomassa-amônia foi então bombeadadentro do reator. A amônia e a solução de hidróxido de amônia diluída foraminjetadas ρ or meio de uma alça de injeção em um recipiente do reator epulverizada nas espigas fracionadas que giram e rolam no reator. Seguindo ainjeção, o vácuo em cada recipiente foi aliviado para pressão atmosférica. Oreator foi mantido a temperatura ambiente (22 a 26 0C) por 24 horas. No finaldeste tempo, um vácuo (cerca de 81 kPa) foi aplicado ao vaso do reator por 30min para remover a amônia. O dióxido de carbono foi então injetado no reatorpara aliviar o vácuo e o reator foi pressurizado a 103 kPa de pressão noindicador e mantido na pressão por 30 min a temperatura ambiente.

Seguindo isto, o reator foi despressurizado aberto e o pH dosconteúdos foi ajustado a cerca de 5,5 pela adição de monoidrato de ácidocítrico seguido por aquecimento a 50 0C e então foram deixados para equilibrarao incubar o reator a 50 0C e 19 rpm por. O reator foi removido do incubador,aberto e o pH de uma amostra foi determinado. Se o pH estivesse acima de5,5, então o monoidrato de ácido cítrico sólido adicional era adicionado e oreator era incubado com mistura a 50 0C. Este processo foi repetido até que opH estivesse a cerca de 5,5. Uma vez que o pH desejado era atingido, 12,9mg/ g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por gramade associação de enzima de celulose que consistia em β-glucosidade, xilanase,β-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregadas dentro do reator. O reatorpermaneceu na incubadora a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Seguindo essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento do monômero de glicose erade 41,7% e o rendimento do monômero de xilose era de 25,4%. Osrendimentos de glicose e xilose totais eram de 50,1% e 53,2%,respectivamente. Esses valores eram as médias dos 2 experimentos.

Claims (35)

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL,caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) colocar a biomassa em contato com uma solução aquosa quecompreende amônia, em que a amônia está presente em uma concentração pelomenos suficiente para manter o pH alcalino da mistura de a mônia aquosa ebiomassa, mas em que dita amônia está presente a menos do que cerca de 12%em peso com relação ao peso seco da biomassa, e ainda em que o peso seco dabiomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15%em peso com relação ao peso da mistura de amônia aquosa e biomassa;(b) colocar o produto da etapa (a) em contato com umaassociação de enzima de sacarificação sob condições apropriadas paraproduzir açúcares fermentáveis; e(c) colocar o produto da etapa (b) sob condições apropriadas defermentação em contato com um biocatalisador adequado para produzir etanol.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o biocatalisador apropriado é selecionado a partir do grupoque consiste em bactéria, fungo filamentoso e levedura.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o biocatalisador apropriado é um microorganismo do tiposelvagem, mutante ou recombinante, selecionado a partir do grupo queconsiste em Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia,Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostrídium.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o biocatalisador apropriado é selecionado a partir do grupoque consiste em Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillusstearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis recombinantes.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o biocatalisador apropriado é o Zymomonas mobilisrecombinante.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as etapas (b) e (c) são realizadas concomitantemente.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o pH da mistura de amônia aquosa e biomassa é superior a 8.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é aplicado vácuo à biomassa antes de colocar a biomassa emcontato com uma solução aquosa que compreende amônia.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentraçãode sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 80%.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito peso seco da biomassa está em uma alta concentraçãode sólidos de pelo menos cerca de 15% a cerca de 60%.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita amônia está presente a menos do que cerca de 10% empeso com relação ao peso seco da biomassa.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que dita amônia está presente a cerca de 6% empeso ou menos com relação ao peso seco da biomassa.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste emculturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais,resíduos sólidos industriais, resíduos de quintais, resíduos de madeira e desilvicultura.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo que consiste emgrama do gênero Panicum, resíduos de papéis, lodo da fabricação de papéis,grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, forragem de milho, gramas,trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço dacana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos do processamento de grãos,árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos emoitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste espigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço dacana de açúcar, serragem, grama do gênero Panicum, palha de trigo, feno,palha de cevada, palha de arroz e gramas.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste espigas de milho, forragem de milho, serragem e bagaço da cana deaçúcar.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a amônia é selecionada a partir do grupo que consiste em gásamônia, hidróxido de amônio, uréia e suas combinações.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura de cerca de 4 0Ca cerca de 200 0C.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperatura decerca de 75 0C a cerca de 150 0C.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em uma temperaturamaior do que cerca de 90 0C a cerca de 150 0C.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempo de até cercade 25 horas.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada em um período de tempode até cerca de 8 horas.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 6,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção de amônia da etapa (a)é removida antes da etapa (b).

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a amônia da etapa (a) é reciclada.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o contato da etapa (b) é em peso seco da concentração debiomassa de pelo menos cerca de 15%.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as etapas (a), (b) ou (a) e (b) são repetidas pelo menos uma vez.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a adição de pelo menos um plastificante,agente amaciante ou suas combinações na etapa (a).

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que pelo menos um plastificante, agente amacianteou suas combinações é selecionado a partir do grupo que consiste em polióis,ésteres de polióis, éteres de glicol, acetamida, etanol e etanolaminas.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda a aplicação de energia antes ou durante aetapa (a), antes ou durante a etapa (b), ou uma combinação dos mesmos.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que dita energia é selecionada a partir do grupo queconsiste em moagem, compressão, trituração, despedaçamento, corte,refinação em disco, ultra-som e microondas.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o dióxido de carbono da fermentação é utilizado para ajustar opH da mistura de tratamento prévio antes da sacarificação.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma glicosidase.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em glicosidasesde hidrólise de celulose, glicosidases de hidrólise de hemicelulose, glicosidasesde hidrólise de amido, peptidases, lipases, Iigninases e estearases de feruloíla.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita associação de enzima de sacarificação compreende pelomenos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em celulases,endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glucosidases, xilanases,endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabinoxilanases, manases,galactases, pectinases, glucuronidases, amilases, a-amilases, β-amilases,glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é realizada em uma temperatura de cerca de 15 0Ca cerca de 100 0C e em um pH de cerca de 2 a cerca de 11.