BR112019012662A2 - métodos para usar serina proteases termoestáveis - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos para usar serina proteases termoestáveis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODOS PARA USAR SERINA PROTEASES TERMOESTÁVEIS”. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [0001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. n° 62/437340, depositado em 21 de dezembro de 2016, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0002] A listagem de sequências fornecida no arquivo denominado NB40835VVOPCT_SequenceListing_ST.txt com um tamanho de 23 KB, que foi criado em 14 de dezembro de 2016 e que é depositado com o presente documento, está incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.
CAMPO [0003] O campo refere-se a métodos para usar serina proteases termoestáveis.
ANTECEDENTES [0004] Proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas com capacidade para clivar ligações de peptídeo. Proteases evoluíram múltiplas vezes e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação por mecanismos catalíticos completamente diferentes. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, archaea e vírus.
[0005] A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.
[0006] As serina proteases são um subgrupo de carbonil hidrolases que compreende uma classe diversa de enzimas que têm uma ampla
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2/172 gama de especificidades e funções biológicas. Apesar dessa diversidade funcional, o maquinário catalítico de serina proteases foi abordado por pelo menos duas famílias geneticamente distintas de enzimas: 1) as subtilisinas; e 2) serina proteases relacionadas a quimotripsina (por exemplo, tripsina).
[0007] Essas duas famílias de serina proteases ou serina endopeptidases têm mecanismos catalíticos bastante similares. A estrutura terciária dessas duas famílias de enzima une uma tríade catalítica conservada de aminoácidos consistindo em serina, histidina e aspartato.
[0008] Muita pesquisa foi conduzida sobre as serina proteases, devido grandemente a seu uso em aplicações industriais. Trabalho adicional foi focado em condições ambientais adversas (por exemplo, exposição a agentes oxidantes, agentes quelantes, extremos de temperatura e/ou pH) que podem impactar adversamente a funcionalidade dessas enzimas em uma variedade de aplicações.
[0009] Assim, há uma necessidade contínua de desenvolver aplicações em que as proteases podem ser usadas sob condições adversas e retêm ou têm atividade melhorada.
SUMÁRIO [0010] Em uma modalidade, é revelado um método para produzir uma serina protease termoestável que compreende:
(a) transformar um hospedeiro de produção com um construto recombinante que codifica uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) a uma temperatura acima de 37,5°C para aumentar o nível de expressão da serina protease termoestável.
[0011] Em uma segunda modalidade, a serina protease termoestável pode ser opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.
[0012] Em uma terceira modalidade, um sobrenadante de cultura
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3/172 contendo serina protease termoestável é obtido por qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[0013] Em uma quarta modalidade, é revelada uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8, ou 10 em que a dita serina protease termoestável pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta.
[0014] Em uma quinta modalidade, é revelada uma ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 em que a serina protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/t de ração e adicionalmente em que a dita serina protease termoestável pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta.
[0015] Em uma sexta modalidade, é revelada uma composição de aditivo de ração conforme descrito no presente documento que compreende adicíonalmente pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptideo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
[0016] Em uma sétima modalidade, é revelada uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de
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4/172 identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, formação de tablete ou qualquer combinação dos processos acima.
[0017] Em uma oitava modalidade, é revelada uma composição de aditivo de ração granulada da reivindicação 7, em que o diâmetro médio das partículas é maior que 50 microns e menor que 2.000 microns. Ademais, essa composição de aditivo de ração granulada da reivindicação pode estar em uma forma líquida. Além disso, essa forma líquida pode ser adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.
[0018] Em uma nona modalidade, é revelado um método para hidrolisar material que contém amido que compreende:
(a) colocar o material que contém amido em contato com um líquido para formar uma massa; e (b) hidrolisar amido no mingau para formar um liquefeito colocando-se a massa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10. Adicionalmente, o coquetel de enzimas pode compreender adicionalmente pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em alfa-amilase, amiloglucosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase e xilanase.
[0019] Em uma décima modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
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5/172 (a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c), [0020] As etapas (b) e (c) podem ser realizadas sequencialmente ou podem ser realizadas simultaneamente.
[0021] Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente, a adição de uma fonte de nitrogênio (tal como, porém sem limitação, ureia ou amônia) é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17,18,19, ou 20 g de serina protease termoestável/tonelada métrica (MT) de material que contém amido, em que a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 é usada.
[0022] Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente, a adição de uma fonte de nitrogênio (tal como, porém sem limitação, ureia) é eliminada (100% de redução) ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 3,4, 5, ou 6 g de serina protease termoestável/MT de material sólido seco, em que a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 é usada.
[0023] Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente,
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6/172 a adição de uma fonte de nitrogênio, tal como, porém sem limitação, ureia, é eliminada (100% de redução) ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g de serina protease termoestável/MT de material que contém amido, em que a dita serina protease termoestável tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 e, ademais, quando o produto de fermentação é etanol, então, nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária na etapa (c).
[0024] Em uma décima primeira modalidade, há um método para reduzir viscosidade de um material que contém amido liquefeito que compreende colocar uma pasta fluida de material que contém amido em contato com uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10. O contato da protease termoestável descrita no presente documento com a pasta fluida pode ser em combinação com outras enzimas ou a uma pasta fluida que compreende enzimas diferentes da serina protease termoestável descrita no presente documento.
[0025] Em uma décima segunda modalidade, há um método para extrair óleo de uma cultura de semente oleaginosa que compreende:
(a) colocar uma fração de semente oleaginosa que contém óleo em contato com um agente de extração aquoso para formar uma fração de semente oleaginosa de extrato; e (b) separar a fração de semente oleaginosa extraída em uma fase aquosa, uma emulsão de óleo em água e uma fase insolúvel;
(c) colocar a emulsão de óleo em água em contato com pelo menos uma
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7/172 serina protease termoestável que tem peto menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs:3, 8 ou 10, sozinha ou em combinação com uma fosfolipase, sob condições que permitem a atividade enzimática durante tempo suficiente para desestabilizar a emulsão; e (d) separar a emulsão desestabilizante da etapa (c) em uma fase aquosa, uma fase oleosa e uma fase insolúvel para obter óleo a partir da semente oleaginosa.
[0026] Ademais, a fração de semente oleaginosa pode ser de soja, semente de milho, semente de colza, caroço de palma, semente de girassol, semente de açafrão, coco, amendoim, semente de algodão, semente de gergelim, semente de linhaça, semente de papoila, amêndoa, avelã, noz, semente de prímula, semente de uva, semente de cânhamo, semente de groselha negra, semente de framboesa vermelha, semente de cenoura, semente de cominho, semente de mirtilo, semente de oxicoco, semente de salsa, semente de cebola, semente de abóbora, semente de abricó, semente de mostarda, semente de linho, semente de mamona ou jatrofa.
[0027] Além disso, a fração de semente oleaginosa pode compreender uma fração de proteína que é útil como um alimento, ingrediente aiímentar, um aditivo alimentar ou suplemento alimentar.
[0028] Em uma décima terceira modalidade, é revelada uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão que compreende óleo obtido pelo método descrito no presente documento.
[0029] Em uma décima quarta modalidade, é revelado um método para preparar um mosto que compreende:
a) colocar o material que contém amido que compreende uma mistura
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8/172 de grãos moídos em contato com água e uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 para formar uma massa;
b) aquecer lentamente a massa da etapa (a) para converter o amido em açúcares; e
c) separar a massa aquecida da etapa (b) em grão residual e mosto líquido em que a protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 30 g/t de grão moído.
[0030] Ademais, uma alfa-amilase pode ser adicionada na etapa (a) juntamente com a serina protease termoestável.
[0031] Em uma décima quinta modalidade, é revelado um método para hidrolisar pelo menos um subproduto animal ou alimentar que compreende:
(a) colocar o subproduto animal ou alimentar em contato com um líquido; e (b) hidrolisar subproduto animal ou alimentar para formar um liquefeito colocando-se em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0032] Ademais, o subproduto alimentar é material rico em queratina selecionado dentre o grupo que consiste em pena, pelo e lã.
[0033] Em uma décima sexta modalidade, é revelado um método para hidrolisar proteínas em biomassa lignocelulósica que compreende (a) colocar a biomassa em contato com um líquido; e (b) hidrolisar as proteínas na biomassa colocando-se a biomassa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
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85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DAS SEQUÊNCIAS [0034] Figura 1. Mapa físico do plasmídeo pHYT-TceO1961 para a expressão de ME-3 protease em Bacillus subtilis.
[0035] Figura 2. Resposta à dosagem da hidrólise de proteína de ração de soja do milho tratada com ME-3 protease na presença de pepsina e pancreatina.
[0036] Figura 3. Termoestabilidade da ME-3 protease incubada a pH 10.
[0037] Figura 4. Efeito do pH na atividade enzimática de ME-3 protease avaliado entre pH 3,75 e 7,5.
[0038] Figura 5. ME-3 protease sem qualquer revestimento reteve mais do que 70% da atividade após a peletização a 90 °C a 100 °C por 60 segundos, em comparação à massa.
[0039] Figura 6. Plotagem de pressão cumulativa da sacarificação e fermentação simultâneas realizadas em sistema Ankom. A linha cinza claro representa nenhum FERMGEN™ 2,5x, 240 ppm de ureia, nenhuma condição adicionada de ME-3; a linha cinza representa 0,178 SAPU/g DS de FERMGEN™, 600 ppm de ureia, nenhuma condição adicionada de ME-3; e a linha preta representa nenhum FERMGEN™ 2,5x, 240 ppm de ureia mais condição adicionada de ME-3 protease.
[0040] Figura 7. Teor de FAN (mg/l) no mosto após mistura de alta temperatura com ME-3 protease, com o uso de uma mistura de 50% de malte e 50% de milho em um único vaso.
[0041] Figura 8. Alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos das cadeias maduras de WPj317594871 com as proteases de Thermobifída: ME-3, Tfpa e Thpa, e M. thermotole
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10/172 rans_WP_078763344, A. mar/naJWP_091675221, A. hymeniacidon/smWPm069846166, N. trehalosiJAJPJ367965505 e Saccharothrix sp._WP_033441214 [0042] As sequências a seguir cumprem com 37 C.F.R. §§ 1.821 a 1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules) e são coerentes com o Padrão de Organização de Propriedade Intelectual Mundial (WIPO) ST.25 (2009) e as exigências de listagem de sequência da Convenção de Patente Européia (EPC) e as Regras de Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes (PCT) 5.2 e 49.5 (abis) e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e o formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras estabelecidas no Título 37 do C.F.R. § 1.822.
[0043] A SEQ ID NO:1 apresenta a sequência de nucleotídeos de Tce01961n, que codifica a protease ME-3.
[0044] A SEQ ID NO:2 apresenta a sequência de aminoácidos da pré-pró-enzima ME-3 codificada por Tce01961n.
[0045] A SEQ ID NO:3 apresenta a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada, ME-3 (186 aminoácidos).
[0046] A SEQ ID NO:4 apresenta a sequência da sequência de peptídeo de sinalização aprE modificada fundida à sequência de DNA com otimização de códon que codifica a sequência pró-madura da ME-3 protease.
[0047] A SEQ ID NO:5 apresenta a sequência terminadora adicionada após o gene de resistência à tetraciclina com o uso dos sítios SsfEII e EcoRI para produzir o vetor pHYT derivado de pHY300PLK (Takara Bio Inc.).
[0048] A SEQ ID NO:6 apresenta a sequência ligante clonada nos sítios BamHI e H/ndlll de pHY300PLK.
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11/172 [0049] A SEQ ID NO:7 apresenta a sequência de aminoácidos da pré-pró-enzima de Thermobifida fusca Tfpa.
[0050] A SEQ ID NO:8 apresenta a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada, Tfpa (186 aminoácidos).
[0051] A SEQ ID NO:9 apresenta a sequência de aminoácidos da peptidase S1 de Thermobifida halotolerans WPJ368687914, Thpa.
[0052] A SEQ ID NO: 10 apresenta a sequência de aminoácidos a enzima madura completamente processada prevista, peptidase Side Thermobifida halotolerans WPJ368687914 ou Thpa (186 aminoácidos). [0053] A SEQ ID NO: 11 apresenta a sequência de aminoácidos de Nocardiopsis potens WPJ317594871.
[0054] A SEQ ID NO: 12 apresenta a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada prevista, serina protease de Nocardiopsis potens WP_017594871 (185 aminoácidos).
DESCRIÇÃO DETALHADA [0055] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.
[0056] Nessa descrição, diversos termos e abreviações são usados. As seguintes definições se aplicam a não ser que especificamente afirmado de outro modo.
[0057] Os artigos um, uma” e o, “a” que precedem um elemento ou componente são concebidos como não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, “um”, “uma” e “o/a” devem ser lidos como incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente inclui também o plural a não ser que o número se destine obviamente a ser singular.
[0058] O termo “que compreende” significa a presença das caracte
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12/172 rísticas, números inteiros, passos ou componentes afirmados como referidos nas reivindicações, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras suas características, números inteiros, passos, componentes ou grupos. O termo “que compreende” se destina a incluir modalidades englobadas pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. Similarmente, o termo “que consiste essencialmente em” se destina a incluir modalidades englobadas pelo termo “que consiste em”.
[0059] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de 1 a 5” é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas 1 a 4, 1 a 3”, 1 a 2, Ί a 2 e 4 a 5, Ί a 3 e 5 e similares.
[0060] Conforme usado no presente documento em combinação com um valor numérico, o termo cerca de refere-se a uma faixa de +/0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja especificamente definido de outro modo no contexto. Por exemplo, o sintagma valor de pH de cerca de 6 refere-se a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.
[0061] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente escritas no presente documento.
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13/172 [0062] O termo protease significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um microrganismo, por exemplo, um fungo, bactéria ou de uma planta ou animal e que tem a capacidade de catalisar a divagem de ligações de peptídeo em uma ou mais de várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exempio, E.C. 3,4). Os termos protease”, peptidase e proteinase” podem ser usados de forma intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.
[0063] O termo serina protease termoestável significa uma serina protease que é estável ao calor.
[0064] O termo amido refere-se a qualquer material compreendido dos carboidratos polissacarídeos complexos de plantas. Esse termo refere-se a qualquer material à base de plantas incluindo, porém sem limitação, grãos, gramas, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milheto, batata, batata doce e tapioca.
[0065] O termo pasta fluida refere-se a uma mistura de um material que contém amido (por exemplo, milho moído) e um componente aquoso, que pode incluir água, água deionizada ou água de processo (por exemplo, recuo, vapor, condensado) ou qualquer combinação dos mesmos. Os termos pasta fluida e massa podem ser usados de forma intercambiável no presente documento.
[0066] Os termos liquefazer, liquefação, liquefato e variações dos mesmos referem-se ao processo ou produto da conversão de amido em substratos dextrinizados solúveis (por exemplo, polissacarídeos menores).
[0067] Liquefato pode ser referido como massa ou pode também
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 24/195 uim ser chamado de um substrato de amido solúvel ou um substrato liquefeito. Em alguns casos, o mesmo pode ser uma pasta fluida de grãos triturados contendo uma alfa amilase termoestável que foi submetida à liquefação de alta temperatura resultando em um substrato solúvel para sacarificação e fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Alta temperatura é uma temperatura mais alta do que a temperatura de gelatinizaçâo dos polissacarídeos de grãos.
[0068] O termo moído” é usado no presente documento para se referir a um material vegetal que foi reduzido em tamanho, tal como por trituração, esmagamento, fracionamento ou qualquer outro meio de redução de tamanho de partícula A moagem inclui moagem a úmido ou a seco. Moagem a seco refere-se à moagem do grão seco inteiro. Moagem a úmido refere-se a um processo através do qual o grão é primeiro embebido (rriacerado) em água para amolecer o grão.
[0069] O termo hidrólise refere-se a uma reação ou processo químico em que um composto químico é quebrado pela reação com água. As enzimas de digestão de amido hidrolisam amido em unidades menores, isto é, polissacarídeos menores.
[0070] O termo lignocelulósico refere-se a uma composição que compreende tanto lignina quanto celulose. O mesmo pode também conter hemicelulose.
[0071] O termo bíomassa Hgnocelulósica refere-se a qualquer material lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A bíomassa pode também compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. A bíomassa pode ser derivada de uma fonte única, ou a bíomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a bíomassa podería compreender uma mistura de espigas de milho e palha de milho ou uma mistura de grama e folhas. A bíomassa Hgnocelulósica inclui, porém sem limitação, culturas
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15/172 de bioenergia, resíduos agrícolas, refugo sólido municipal, refugo sólido industrial, lodo da fabricação de papel, refugo de jardim, madeira e refugo florestal. Os exemplos de biomassa incluem, porém sem limitação, espigas de milho, resíduos de cultura, tais como cascas de milho, palha de milho, gramíneas (incluindo Miscanthus), palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama de crescimento rápido, papel de refugo, bagaço de cana-de-açúcar, material de sorgo, material de planta de soja, componentes obtidos a partir da moagem de grãos ou do uso de grãos em processos de produção (tais como DDGS: grãos secos destilados com solúveis), árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores, cacho de fruto de palma vazio e cana-energia. O termo cana-energia refere-se à cana de açúcar que é melhorada para uso na produção de energia. A mesma é selecionada para uma porcentagem mais alta de fibras do que o açúcar.
[0072] O termo biomassa lignocelulósica pré-tratada refere-se à biomassa que foi submetida a um tratamento físico, térmico e/ou químico antes da sacarificação. O termo biomassa lignocelulósica pré-tratada com amônia refere-se à biomassa que foi submetida pelo menos a um processo de pré-tratamento que emprega amônia. Em uma modalidade, o pré-tratamento com amônia é um pré-tratamento com baixo teor de amônia em que a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura de biomassa-amônia aquosa em que a concentração de amônia é suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa-amônia aquosa, mas é menor do que cerca de 12 por cento em peso em relação ao peso seco da biomassa, e em que o peso seco da biomassa é pelo menos cerca de 15 por cento em peso de sólidos em relação ao peso da mistura de biomassa-amônia aquosa, conforme revelado na Patente US
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7.932.063, que está incorporada ao presente documento a título de referência. O termo hidrolisado de biomassa lignocelulósica refere-se ao produto que resulta da sacarificação da biomassa lignocelulósica. A bi~ omassa pode também ser pré-tratada ou pré-processada antes da sacarlficação. Os termos sacarificação e sacarificar referem-se ao processo de converter polissacarídeos em monômeros de dextrose com o uso de enzimas. Sacarificação pode se referir à conversão de polissacarídeos em um liquefato. Os produtos de sacarificação são, por exemplo, glicose e outros oligossacarídeos pequenos (baixo peso molecular), tais como dissacarídeos e trissacarídeos.
[0073] O termo SSF refere-se à sacarificação e fermentação simultâneas.
[0074] O termo coquetel de enzimas refere-se a uma mistura ou combinação de pelo menos duas enzimas diferentes, que tomam mais eficiente e eficaz qualquer reação catalítica.
[0075] Os termos fermentação ou fermentar referem-se ao processo de transformar açúcares de material vegetal reduzido em produtos hortifrutícolas como produto de fermentação.
[0076] O termo produto de fermentação significa um produto produzido por um processo incluindo uma etapa de fermentação com o uso de um organismo de fermentação.
[0077] O termo viscosidade significa a resistência de um fluido para fluir, isto é, o atrito interno de um fluido.
[0078] O termo fosfolipase refere-se a uma enzima que hidrolisa fosfolipídeos em ácidos graxos e outras substâncias lipofílicas.
[0079] O termo emulsão refere-se a uma mistura de dois ou mais líquidos que são normalmente imiscíveis (não misturáveis ou não mesclcáveis). Em uma emulsão, um líquido (a fase dispersa) é disperso no outro (fase contínua). Os exemplos de emulsões incluem vinagretes, leite homogeneizado, maionese e similares.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 27/195 /172 [0080] O termo grão pronto para moagem refere-se a grão ou a uma quantidade de grão a ser moída; grão ou farinha moída produzida a partir de uma trituração, O termo mosto refere-se ao escoamento de licor não fermentado após a extração do grão pronto para moagem durante a brassagem.
[0081] O termo massa refere-se a uma pasta fluida aquosa de qualquer material vegetal contendo amido e/ou açúcar, tal como grão pronto para moagem, por exemplo, compreendendo malte de cevada esmagada, cevada esmagada e/ou outro adjunto ou uma combinação dos mesmos, misturados com água para serem posteriormente separados em mosto e grãos gastos.
[0082] O termo cerveja destina-se a compreender qualquer mosto fermentado, produzido por fermentação/brassagem de um material vegetal contendo amido, dessa forma, em particular, também cerveja produzida exclusivamente de malte ou adjunto, ou qualquer combinação de malte e adjunto.
[0083] Cerveja pode ser produzida a partir de uma variedade de material vegetal contendo amido e/ou açúcar, frequentemente grãos de cereal e/ou malte essencialmente pelo menos processo. Acredita-se que os amidos de grão são homopolímeros de glucose em que os resíduos de glicose são ligados por alfa-1,4- ou alfa-1,6-ligações, com a primeira predominando.
[0084] O termo subproduto refere-se a um produto secundário derivado de um processo de fabricação ou reação química. O mesmo não é o produto ou serviço primário sendo produzido.
[0085] Os termos “animal” e “indivíduo” são usados de forma intercambiável no presente documento. Um animal inclui todos os animais não ruminantes (incluindo humanos) e ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, tal como um cavalo ou um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástricos incluem,
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18/172 porém sem limitação, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves domésticas, tais como perus, patos, galinha, frangos de corte, galinhas poedeiras; peixe, tal como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos, tais como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, porém sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antílope asiático.
[0086] O termo “patógeno” conforme usado no presente documento significa qualquer agente causador de doença. Tais agentes causadores podem incluir, porém sem limitação, agentes causadores bacterianos, virais, fúngicos e similares.
[0087] Uma ração e um alimento, respectivamente, significam qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou similares ou componentes de tais refeições destinados ou adequados para serem comidos, tomados, digeridos, por um animal não humano e um ser humano, respectivamente.
[0088] Conforme usado no presente documento, o termo alimento” é usado em um sentido amplo e abrange alimentos e produtos alimentícios para seres humanos, assim como alimentos para animais não humanos (isto é, uma alimentação).
[0089] O termo “ração” é usado com referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos “ração” e “ração de animal são usados de forma intercambiável.
[0090] O termo microrganismo de alimentação direta (DFM), conforme usado no presente documento, é originado de microrganismos de ocorrência natural vivos (viáveis). Um DFM pode compreender um ou mais de tais microrganismos de ocorrência natural, tais como ce
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 29/195 pas bacterianas. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Dessa forma, o termo DFM abrange um ou mais dentre os seguintes: bactérias de alimentação direta, levedura de alimentação direta e combinações das mesmas. [0091] Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidificação e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As Bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonísticos a patógenos. Como as Bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser um tanto sensíveis ao calor, as mesmas não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus.
[0092] O termo “prebiótico” significa um ingrediente alimentar não digestível que afeta beneficamente o hospedeiro por estimulação seletiva do crescimento e/ou da atividade de uma ou um número limitado de bactérias benéficas.
[0093] O termo cultura probiótica, conforme usado no presente documento, define microrganismos vivos (incluindo bactérias ou leveduras, por exemplo) que, quando, por exemplo, ingeridos ou aplicados localmente em números suficientes, afetam de modo benéfico o organismo hospedeiro, isto é, conferindo-se um ou mais benefícios de saúde demonstráveis no organismo hospedeiro. Os probióticos podem melhorar o equilíbrio microbiano em uma ou mais superfícies da mucosa. Por exemplo, a superfície da mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo “probiótico” conforme usado no presente documento abrange também microrganismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imunitário e ao mesmo
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20/172 tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície da mucosa, por exemplo, o intestino. Embora nâo existam limites superiores ou inferiores para ingestão de probióticos, foi sugerido que pelo menos 10® a 1012, preferencialmente, pelo menos 106 a 101°, preferencialmente, 108 a 109 cfu como uma dose diária serão eficazes para alcançar os efeitos benéficos de saúde em um indivíduo.
[0094] O termo “CFU” conforme usado no presente documento significa “unidades formadoras de colônias11 e é uma medida de células viáveis nas quais uma colônia representa um agregado de células derivadas a partir de uma única célula progenitora.
[0095] O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada. Os termos molécula de ácido nucleico isolada, polinucleotídeo isolado e fragmento de ácido nucleico isolado serão usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
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21/172 [0096] O termo purificado conforme aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos denota, de modo geral, um ácido nucleico ou polipeptideo que é essencialmente isento de outros componentes conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na arte (por exemplo, um polipeptideo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda distinta em um gel eletroforético, eluado cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugaçâo de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptideo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é purificado. Um ácido nucleico ou polipeptideo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo enriquecido refere-se a um composto, polipeptideo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.
[0097] Conforme usado no presente documento, o termo ensaio funcional refere-se a um ensaio que fornece uma indicação de uma atividade de proteína. Em algumas modalidades, o termo refere-se a sistemas de ensaio em que uma proteína é analisada por sua habilidade para funcionar em sua capacidade normal. Por exemplo, no caso de uma protease, um ensaio funcional envolve determinar a efetividade da protease para hidrolisar um substrato proteináceo.
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22/172 [0098] Os termos “peptídeos”, “proteínas” e “polipeptídeos” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma proteína ou um polipeptídeo compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneraçâo do código genético. As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguido por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como G087S” ou G87S”. Ao descrever as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L,I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leuclna ou uma isoleucina. Algumas vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina nessa posição.
[0099] Uma pró-sequência ou sequência de pró-peptídeo referese a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo de sinalização e a sequência de protease madura que é necessária para o enovelamento e a secreção adequada da protease; as mesmas são denominadas, às vezes, como chaperonas intramoleculares. A divagem da pró-sequêncla ou da sequência de pró-peptídeo resulta em uma protease ativa madura. Proteases são frequentemente expressas como pró-enzimas.
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23/172 [0100] Os termos sequência de sinalização” e peptídeo de sinalização referem-se a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no terminal N da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exógena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada. [0101] O termo forma madura de uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo refere-se à forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de pró-peptídeo.
[0102] O termo forma precursora” de uma proteína ou um peptídeo refere-se a uma forma madura da proteína que tem uma pró-sequência ligada de modo operacional ao terminal amlno ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência de sinalização ligada de modo operacional ao terminal amino da pró-sequência. O precursor também pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos na atividade pós-transcrição (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou um peptídeo). [0103] O termo tipo selvagem em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo de ocorrência natural refere-se a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos) que seja encontrada na natureza. Inversamente, o termo de ocorrência não natural” refere-se a qualquer coisa que não seja encontrada
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24/172 na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes e sequências de proteínas produzidas no laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem), [0104] Conforme usado no presente documento em relação às posições de resíduo de aminoácido, que corresponde a ou corresponde a” ou corresponde se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou um peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou um peptídeo. Conforme usado no presente documento, região que corresponde, em geral, se refere a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência, [0105] Os termos derivado de e obtido a partir de referem-se a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo refere-se a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características identificadores da proteína em questão.
[0106] O termo aminoácido refere-se à unidade estrutural química básica de uma proteína ou um polipeptídeo. As abreviações usadas no presente documento para Identificar aminoácidos específicos podem usar o código de três letras ou uma letra conforme conhecida na técnica, e, adicionalmente, Xaa ou X pode ser usado para denotar qualquer aminoácido.
[0107] Seria reconhecido por um indivíduo versado na técnica que modificações de sequências de aminoácidos reveladas no presente documento podem ser feitas ao mesmo tempo que se retém a função associada com as sequências de aminoácidos reveladas. Por exemplo, é bastante conhecido na técnica que alterações em um gene que resultam
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25/172 na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado local, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada são comuns. Por exemplo, qualquer aminoácido particular em uma sequência de aminoácidos revelada no presente documento pode ser substituído por outro aminoácido funcionalmente equivalente. Para os propósitos da presente descrição, substituições são definidas como trocas com um dos seguintes cinco grupos:
1. Resíduos ligeiramente polares ou não polares, alifáticos pequenos: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2. Resíduos negativamente carregados, polares e amidas dos mesmos: Asp, Asn, Glu, Gin;
3. Resíduos positivamente carregados, polares: His, Arg, Lys;
4. Resíduos não polares, alifáticos grandes: Met, Leu, He, Vai (Cys); e
5. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.
[0108] Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). Similarmente, espera-se também que mudanças que resultam na substituição de um resíduo negativamente carregado por outro (tal como ácido serina termoestável por ácido glutâmico) ou um resíduo positivamente carregado por outro (tal como lisina por arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, não seria esperado também que as mudanças de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-termlnals e Cterminais da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da habilidade comum na técnica, como está a determinação de manutenção de atividade biológica dos produtos codificados.
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26/172 [0109] O termo com otimização de códon, em referência a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.
[0110] O termo gene refere-se a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (sequências de não codificação 3') à sequência de codificação. Gene nativo refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Geme quimérico” refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas disposta de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Gene endógeno refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene estranho refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.
[0111] O termo sequência de codificação refere-se a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. “Sequências reguladoras adequadas” referem-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5!),
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 37/195 im dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências de iniciação de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de haste-laço.
[0112] O termo ligado de maneira funcional refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação quando o mesmo tem a capacidade para afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequências de codificação podem ser ligadas de maneira funcional às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.
[0113] Os termos sequência reguladora ou sequência de controle são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, operadores e similares. Conforme indicado acima, as sequências reguladoras podem ser ligadas de maneira funcional em orientação senso ou antissenso à sequência de codificação/gene de interesse.
[0114] Promotor ou sequências promotoras referem-se a sequências de DNA que definem onde começa a transcrição de um gene por RNA polimerase. As sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de iniciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser
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28/172 compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas (“promotores induzíveis”).
[0115] As sequências de não codificação 3' referem-se a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de gene, tal como terminação de transcrição.
[0116] O termo transformação, conforme usado no presente documento, refere-se à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente ou pode se integrar no genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos transformados ou recombinantes ou transgênicos ou transformantes.
[0117] O termo recombinante, conforme usado no presente documento, refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram Inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resul
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29/172 tando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos recombinante, transgênico, transformado, geneticamente modificado ou modificado para expressão de gene exógena são usados de forma intercambiável no presente documento.
[0118] Os termos “construto recombinante, construto de expressão, construto de expressão recombinante e cassete de expressão são usados de forma intercambiável no presente documento. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e de codificação que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, pode ser usado um vetor plasmidial. O indivíduo versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O indivíduo versado na técnica também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones etal., (1985) EMBO J4:2411 a 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, dessa forma, que múltiplos eventos são tipicamente rastreados a fim de obter linhagens que exibam o padrão e nível de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada usando ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise
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Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RTPCR), análise de immunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotipica.
[0119] Os termos hospedeiro de produção, hospedeiro e célula hospedeira são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humano ou não humano, em que um construto recombinante pode ser introduzido de modo estável ou temporário a fim de expressar um gene. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não seja idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem durante a propagação.
[0120] O termo porcentagem de identidade” é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado através da comparação de sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. Identidade e similaridade podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); ComputerAnalysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.
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31/172 [0121] Conforme usado no presente documento,% de identidade ou porcentagem de identidade ou PID refere-se à identidade de sequência de proteínas, A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990: e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sei EUA, 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão, O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para sequências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul etal., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas -11; Corte de valor E = 10: Matriz de Pontuação NUC.3.1 (correspondência - 1, não correspondência = -3); Abertura de Lacuna = 5; e Extensão de Lacuna = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos Incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de valor E - 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de lacuna- 11; e Extensão de lacuna =
1. Um valor de percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de referência” que inclui quaisquer lacunas criadas pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Os algoritmos BLAST referem-se à sequência “de referência” como a sequência de consulta.
[0122] Conforme usado no presente documento, proteínas homólogas ou proteases homólogas refere-se a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homo
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32/172 logia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos.
[0123] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de identidade percentual podem ser realizados com o uso do programa Megalign do suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl), o programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) ou o Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et at., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3.497 a 3.500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Os parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de GAP=15, extensão de GAP=0,2, matriz ~ Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína=4 e KTUPLE=1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustespadrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem
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33/172 ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WIND0W=5 e TOP DIAGONALS SAVED=5. As sequências podem também ser alinhadas de modo múltiplo com o uso do programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797).
[0124] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeo e sequências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento como características de certos aspectos. As variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em certas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante em certas modalidades pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função da sequência revelada.
[0125] O termo variante, em relação a um polipeptídeo, refere-se a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selvagem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo variante, em relação a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo do tipo
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34/172 selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência será evidente a partir do contexto.
[0126] Os termos plasmídeo, vetor e cassete referem-se a um elemento extracromossômico que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fago ou nucleotídeos, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas numa construção exclusiva que é capaz de introduzir um polinucleotídeo de interesse numa célula. Cassete de transformação refere-se a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Os termos “cassete de expressão” e “vetor de expressão” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que permitem a expressão daquele gene em um hospedeiro.
[0127] O termo expressão, conforme usado no presente documento, refere-se à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. A expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.
[0128] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do mRNA em um precursor ou proteína madura. Proteína madura refere-se a um polipeptídeo pós-traducionalmente processado, isto é, um a partir do qual quaisquer pré- ou pró-peptídeos presentes no produto de translação primário foram removidos. Proteína precursora refere-se ao produto primário da tradução de mRNA, isto é, com pré- ou
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35/172 pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- e pró-peptídeos podem ser, porém sem limitação, sinais de localização intracelulares. Transformação estável refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto organelares, resultando em herança geneticamente estável. Em contraste, transformação temporária refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados de organismos transgênicos.
[0129] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3’ do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem de ser derivadas assim.
[0130] Regiões de controle de iniciação possíveis ou promotores que podem ser incluídos no vetor de expressão são numerosos e familiares para aqueles indivíduos versados na técnica. Virtualmente qualquer promotor com a capacidade para acionar esses genes é adequado, Incluindo, porém sem limitação, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para
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36/172 a expressão em Saccharomycesy A0X1 (útil para a expressão em Pichiay e /ac, arafí, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac e trc (útil para a expressão em Escherichia coif) assim como os promotores amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para a expressão em Bacillus. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo ou induzível. Um promotor constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor induzível ou reprimível é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou reprimíveis devido a mudanças em fatores ambientais incluindo, porém sem limitação, a disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a presença de metal (ou metais) pesado, a concentração de inibidor (ou inibidores), tensão ou uma combinação dos anteriores, conforme conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis ou reprimíveis são induzíveis ou reprimíveis por fatores metabólicos, tais como o nível de determinadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos ou uma combinação dos anteriores conforme conhecido na técnica. Em uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando Trichoderma reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor de T. reesei nativo, tal como o promotor cbh1 que é depositado no GenBank com o Número de Acesso D86235.
[0131] Os exemplos não limitantes adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, eg!5, xyn1 e xyn2, promotor de gene de fosfatase de ácido reprimível (phoA) de P. chrysogenus (consultar, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 :753 a 756), promotor de PCK1 reprimível de glicose (consultar, por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192:235 a 240), promotor de MET3 reprimível por glicose, induzível por maltose (consultar Liu et al.,
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37/172 (2006), Eukary. Cell, 5:638 a 649), promotor de pKi e promotor de cpd. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes de glicoamilase de A. av/amoríeA niger (consultar, por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2.306 a 2.315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1.581 a 1.585). Ademais, os promotores do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (consultar, por exemplo, o documento EPA 137280AI).
[0132] Os fragmentos de DNA que controlar a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeiro de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.
[0133] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente, nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem ao longo de uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solvente. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e leveduras, possa adequadamente hospedar o vetor de expressão.
[0134] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse de modo que a mesma possa residir de modo intracelular, extracelular ou uma combinação de ambos dentro e fora das células. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.
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38/172 [0135] Certas modalidades da presente descrição referem-se a um método para produzir uma serina protease termoestável que compreende:
(a) transformar um hospedeiro de produção com um construto recombinante que codifica uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) a uma temperatura acima de 37,5 °C para aumentar o nível de expressão da serina protease termoestável.
[0136] Em outro aspecto, a serina protease termoestável pode ser opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.
[0137] Em ainda outro aspecto, um sobrenadante de cultura contendo serina protease termoestável pode ser obtido por qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[0138] A expressão será entendida como incluindo qualquer etapa envolvida na produção de uma serina protease termoestável que inclui, porém sem limitação, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.
[0139] Técnicas para modificar sequências de ácido nucleico que usam métodos de clonagem são bem conhecidas na técnica.
[0140] Um polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável pode ser manipulado em uma variedade de modos para fornecer a expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira de Bacillus. A manipulação da sequência de polinucleotideos antes de sua inserção em um construto de ácido nucleico ou vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do construto de ácido nucleico ou vetor ou da célula hospedeira de Bacillus. As técnicas para modificar sequências
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39/172 de nucleotídeos utilizando métodos de clonagem são bem conhecidas na técnica.
[0141] As sequências reguladoras são definidas acima. As mesmas incluem todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de uma serina protease termoestável. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de nucleotídeos que codifica a serina protease termoestável. Tais sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, um líder, uma sequência de poliadenilação, uma sequência de propeptídeos, um promotor, uma sequência de sinalização e um terminador de transcrição. Sequências reguladoras podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação ou as sequências reguladoras com a região de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica uma serina protease termoestável.
[0142] Um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável pode ser ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle com a capacidade de direcionar a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeiras de Bacillus sob condições compatíveis com as sequências de controle.
[0143] Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável. Tais sequências de controle incluem, porém sem limitação, um líder, um promotor, uma sequência de sinalização e um terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável.
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40/172 [0144] A sequência de controle pode ser uma região promotora apropriada, uma sequência de nucleotideos que é reconhecida por uma célula hospedeira de Bacillus para expressão do polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável. A região promotora contém sequências de controle de transcrição que mediam a expressão de uma serina protease termoestável. A região promotora pode ser qualquer sequência de nucleotideos que mostra a atividade transcrlcional na célula hospedeira de Bacillus de escolha e pode ser obtida a partir de genes que direcionam a síntese de polipeptideos extracelulares ou intracelulares que têm atividade biológica homóloga ou heteróloga à célula hospedeira de Bacillus.
[0145] A região promotora pode compreender um único promotor ou uma combinação de promotores. Quando a região promotora compreende uma combinação de promotores, os promotores estão preferencialmente em tandem. Um promotor da região promotora pode ser qualquer promotor que possa iniciar a transcrição de um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo que tem atividade biológica em uma célula hospedeira de Bacillus de interesse. O promotor pode ser nativo, estranho ou uma combinação dos mesmos à sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo que tem atividade biológica. Tal promotor pode ser obtido a partir de genes que direcionam a síntese de polipeptideos extracelulares ou Intracelulares que têm atividade biológica homóloga ou heteróloga à célula hospedeira de Bacillus.
[0146] Assim, em certas modalidades, a região promotora compreende um promotor obtido a partir de uma fonte bacteriana. Em outras modalidades, a região promotora compreende um promotor obtido a partir de uma bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, porém sem limitação, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococ
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41/172 cus, Clostridium, Geobacillus e Oceanobacillus. As bactérias Gram-negativas incluem, porém sem limitação, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria e Urea plasma.
[0147] A região promotora pode compreender um promotor obtido a partir de uma cepa de Bacillus (por exemplo, Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensisy, ou de uma cepa de Streptomyces (por exemplo, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus).
[0148] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição de urn polinucleotideo que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica nos métodos da presente descrição são os promotores obtidos a partir do operon lac de E. coli, gene de agarase de Streptomyces coe//co/or(dagA), gene de protease alcalina de Bacillus lentus ou Bacillus clausii (aprH), gene de protease alcalina de Bacillus licheniformis (gene de subtilisina Carlsberg), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus subtilis (amyE), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xyiA e xyiB de Bacillus subtilis, gene CrylllA de Bacillus thuríngiensis subsp. tenebfionis (crylllA) ou porções dos mesmos, gene de beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3.727 a 3.731) e gene xylA de Bacillus megaterium (Rygus e Hillen, 1992, J. Bacteriol. 174: 3.049 a 3.055; Kim etaL, 1996, Gene 181: 71 a 76). Outros exemplos são o promotor do promotor de fago bacteriano spo1 e o
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42/172 promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21 a 25). Promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Scientific American, 1980, 242:74 a 94; e em Sambrook, Fritsch e Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, N.Y. [0149] A região promotora pode compreender um promotor que é um promotor consenso que tem a sequência TTGACA para a região -35 e TATAAT para a região -10. O promotor consenso pode ser obtido a partir de qualquer promotor que possa funcionar em uma célula hospedeira de Bacillus. A construção de um promotor consenso pode ser realizada por mutagênese sítio-dirigida com o uso de métodos bem conhecidos na técnica para criar um promotor que conforma mais perfeitamente às sequências consenso estabelecidas para as regiões -10 e -35 dos promotores sigma tipo A vegetativos para Bacillus subtilis (Voskuil etal., 1995, Molecular Microbiology 17: 271 a 279).
[0150] Uma sequência de controle pode também ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, tal como uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira de Bacillus para terminar a transcrição. A sequência terminadora é ligada de modo funcional ao terminal 3' da sequência de nucleotídeos que codifica a serina protease termoestável. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de Bacillus pode ser usado.
[0151] A sequência de controle pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução por uma célula hospedeira de Bacillus. A sequência líder é ligada de maneira funcional à terminação 5’ da sequência de nucleotídeos que direcionada a síntese do polipeptídeo que tem atividade biológica. Qualquer sequência que seja funcional em uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na presente invenção.
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43/172 [0152] A sequência de controle pode também ser uma sequência estabilizante de mRNA. O termo sequência estabilizante de mRNA” é definido no presente documento como uma sequência localizada a jusante de uma região promotora e a montante de uma sequência de codificação de um polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável à qual a região promotora é ligada de maneira funcional, de modo que todos os mRNAs sintetizados da região promotora possam ser processados para gerar transcritos de mRNA com uma sequência estabilizante na extremidade 5' dos transcritos. Por exemplo, a presença de tal sequência estabilizante na extremidade 5’ dos transcritos de mRNA aumenta sua meia-vida (Agaisse e Lereclus, 1994, supra, Hue et a!., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471). A sequência de estabilização/processamento de mRNA é complementar à extremidade 3’ do RNA ribossômico 16S bacteriano. Em certas modalidades, a sequência de estabilização/processamento de mRNA gera essencialmente transcritos de tamanho único com uma sequência de estabilização na extremidade 5’ dos transcritos. A sequência de estabilização/processamento de mRNA é, preferencialmente, uma que é complementar à extremidade 3' do RNA ribossômico 16S bacteriano. Consultar a Patente US número 6.255.076 e a Patente US número 5.955.310.
[0153] O construto de ácido nucleico pode, então, ser introduzido em uma célula hospedeira de Bacillus com o uso de métodos conhecidos na técnica ou daqueles métodos descritos no presente documento para introduzir e expressar uma serina protease termoestável.
[0154] Um construto de ácido nucleico que compreende um DNA de interesse que codifica uma proteína de interesse pode também ser construído similarmente conforme descrito acima.
[0155] Para obter a secreção da proteína de interesse do DNA introduzido, a sequência de controle pode também compreender uma re
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44/172 gião de codificação de peptídeo de sinalização, que codifica uma sequência de aminoácidos ligada à terminação amino de um polipeptideo que pode direcionar o polipeptideo expresso para a trajetória secretória da célula. A região de codificação de peptídeo de sinalização pode ser nativa ao polipeptideo ou pode ser obtida a partir de fontes estranhas. A extremidade 5' da sequência de codificação da sequência de nucleotídeos pode conter inerentemente uma região de codificação do peptídeo de sinalização naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptideo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinalização que é estranha a essa porção da sequência de codificação que codifica que codifica o polipeptideo secretado. A região de codificação de peptídeo sinal estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contém normalmente uma região de codificação de peptídeo sinal. Alternativamente, a região de codificação de peptídeo de sinalização estranha pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinalização natural a fim de obter a secreção aumentada do polipeptideo em relação à região de codificação de peptídeo de sinalização natural normalmente associada à sequência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinalização pode ser obtida a partir de um gene de amilase ou protease de uma espécie de Bacillus. Entretanto, qualquer região de codificação de peptídeo de sinalização com a capacidade para direcionar o polipeptideo expresso à trajetória secretória de uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na presente invenção.
[0156] Uma região de codificação de peptídeo de sinalização eficaz para uma célula hospedeira de Bacillus é a região de codificação de peptídeo de sinalização obtida a partir do gene de amilase maltogênica
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45/172 de Bacillus NCIB 11837, do gene de alfa-amilase Bacillus stearothermophilus, do gene de subtilising de Bacillus licheniformis, o gene de beta-lactamase Bacillus licheniformis, os genes de proteases neutras de Bacillus stearotherrnophiius (nprT, nprS, nprM) e o dele prsA Bacillus subtills.
[0157] Assim, um construto de polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um construto de serina protease termoestável que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (POI) pode ser construído de modo que seja expresso por uma célula hospedeira. Por causa das degenerescências conhecidas no código genético, diferentes polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica podem ser projetados e produzidos com habilidades comuns na técnica. Por exemplo, otimizações de códon podem ser aplicadas para otimizar a produção em uma célula hospedeira particular.
[0158] Os ácidos nucleicos que codificam proteínas de interesse podem ser incorporados em um vetor, em que o vetor pode ser transferido para uma célula hospedeira que usa técnicas de transformação bem conhecidas, tais como aquelas reveladas no presente documento. [0159] O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser transformado em e replicado dentro de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um POI pode ser transformado e replicado em uma célula hospedeira bacteriana como um meio de propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser transformado em um hospedeiro de expressão de Bacillus da descrição, de modo que um ácido nucleico que codifica proteína (por exemplo, um ORF) possa ser expresso como uma proteína funcional.
[0160] Um vetor representativo que pode ser modificado com habilidade rotineira para compreender e expressar um ácido nucleico que codifica um POI é o vetor p2JM103BBI.
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46/172 [0161] Um polinucleotídeo que codifica uma serina protease termoestável ou um POI pode ser ligado de maneira funcional a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolhida e pode ser derivado de genes que codificam proteínas ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira. Os meios de avaliar a atividade/resistência de promotor são rotineiros para o versado na técnica.
[0162] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo comS1 ou um POI da descrição, especialmente em um hospedeiro bacteriano, incluem o promotor do operon lac de E. coli, os promotores de gene dagA ou celA de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotores da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis e similares.
[0163] Um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um POI pode ser um promotor aprE do tipo selvagem, um promotor aprE mutante ou um promotor aprE consenso apresentado na Publicação Internacional n~ PCT W02001/51643. Em certas outras modalidades, um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um POI é um promotor spoVG do tipo selvagem, um promotor spoVG mutante ou um promotor spoVG consenso (Frisby e Zuber, 1991).
[0164] Um promotor para direcionar a transcrição da sequência de polinucleotídeos que codifica uma serina protease termoestável ou a POI é um promotor ribossômico, tal como um promotor de RNA ribossômico ou um promotor de proteína ribossômico. O promotor de RNA
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 57/195 /172 ribossômico pode ser um promotor rm derivado de B. subtilis, mais particularmente, o promotor rrn pode ser um promotor ribossômico rrnB, rrnl ou rrnE de B. subtilis. Em certas modalidades, o promotor de RNA ribossômico é um promotor P2 rrnl de B. subtílís apresentado na Publicação internacional PCT WO2013/086219.
[0165] Um vetor adequado pode compreender adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos habilitando o vetor a se replicar na célula hospedeira. Os exemplos de tais sequências habilitadoras são as origens de replicação de piasmídeos pUC19, pACYCI 77, pUB110, pE194, pAMB, plJ702 e similares.
[0166] Um vetor adequado pode também compreender um marcador selecionávei, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira isolada, tal como os genes da/de B. subtilis ou B. licheniformis', ou um gene que confere resistência a antibióticos, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à canamicina, resistência a cloranfenicol, resistência a tetraciclina e similares.
[0167] Um vetor de expressão adequado inclui tipicamente componentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um elemento que permite a replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção. Os vetores de expressão tipicamente compreendem também sequências de nucleotideos de controle, tais como, por exemplo, promotor, operador, sítio de ligação a ribossoma, sinal de iniciação de tradução e, opcionalmente, um gene repressor, uma ou mais sequências de genes ativadores ou similares.
[0168] Adicionalmente, um vetor de expressão adequado pode compreender adlcionalmente uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos com a capacidade para alvejar a proteína de interesse a uma organela de célula hospedeira, tal como um peroxissoma, ou a um compartimento de célula hospedeira particular. Tal sequência
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48/172 de alvejamento pode ser, por exemplo, a sequência de aminoácidos SKL. Para a expressão sob a direção de sequências de controle, a sequência de ácidos nucleicos da proteína de interesse pode ser ligada de maneira funcional às sequências de controle de uma maneira de modo que a expressão ocorra.
[0169] Protocolos, tal como descrito no presente documento, usados para ligar o construto de DNA que codifica uma proteína de interesse, promotores, terminadores e/ou outros elementos e inserir os mesmos em vetores adequados contendo as informações necessárias para replicação são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
[0170] Uma célula isolada, que compreende um construto de polinucleotídeo ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de um POI. A célula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica o POI, convenientemente integrando o construto (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. A integração é geralmente considerada uma vantagem, na medida em que a sequência de DNA assim introduzida é mais propensa a ser estavelmente mantida na célula. A integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada aplicando-se métodos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Por exemplo, a Publicação Internacional PCT n2W02002/14490 descreve os métodos da transformação de Bacillus, transformantes dos mesmos e bibliotecas dos mesmos. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme descrito acima em conexão com os diferentes tipos de células hospedeiras.
[0171] É, em outras modalidades, vantajoso deletar genes dos hospedeiros de expressão, em que a deficiência de gene pode ser curada por um vetor de expressão. Os métodos conhecidos podem ser usados
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 59/195 m2 para obter uma célula hospedeira bacteriana que têm um ou mais genes inativados. A inativação de gene pode ser realizada por deleção completa ou parcial, por inativação por inserção ou por qualquer outro meio que dê origem a um gene não funcional para seu propósito previsto de modo que o gene seja impedido contra a expressão de uma proteína funcional.
[0172] As técnicas para a transformação de bactérias e cultivo das bactérias são padrão e bem conhecidas na técnica. As mesmas podem ser usadas para transformar os hospedeiros aprimorados da presente invenção para a produção de proteínas recombinantes de interesse. A introdução de um construto ou vetor de DNA em uma célula hospedeira inclui técnicas tais como transformação, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina), incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio, bombardeamento de velocidade alta com microprojéteis revestidos com DNA, transformação biobalística ou biolística e fusão de protoplasto e similares. Os métodos de transformação e expressão para bactérias são também revelados em Brigidi et a/. (1990). Um protocolo de transformação e expressão geral para cepas de Bacillus deletadas de protease é descrito em Ferrari et al. (Patente US número5.264.366).
[0173] Os métodos para transformar ácidos nucleicos em fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp., por exemplo, A. oryzae ou A. niger, H. grisea, H. insolens e T. reeseí, são bem conhecidos na técnica. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito, por exemplo, no documento ri- EP238023. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Trichoderma é descrito, por exemplo, em Steiger et al 2011., Appl. Environ. Microbiol. 77:114 a 121.
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50/172 [0174] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qualquer microrganismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas.
[0175] Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a serina protease termoestável e sua fonte.
[0176] A introdução de um vetor ou construto de DNA em uma célula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, (por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina); incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio; bombardeamento de alta velocidade com microinjetáveis revestidos com DNA e fusão de protoplasto. Os textos básicos revelam métodos gerais que podem ser usados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a edição, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)). Os métodos de transformação da presente invenção podem resultar na integração estável de todo ou parte do vetor de transformação no genoma de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira fúngica filamentosa. Entretanto, a transformação que resulta na manutenção de um vetor de transformação extracromossômico autorreplicante também é contemplada.
[0177] Muitos métodos de transfecção padrões podem ser usados para produzir linhagens celulares de fungos filamentosos e bactérias (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam grandes quantidades da protease. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também USP 6.022.725;
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5VH2
LJSP 6.268.328 e Nevalainen et at., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brig id i, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135 a 138).
[0178] Entretanto, pode ser usado qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolística, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra). Também é de uso o método de transfecção mediado por Agrobacterium descrito na Patente US número6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar o gene.
[0179] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras.
[0180] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer
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52/172 meio convencional adequado para cultivo da célula hospedeira e obtenção da expressão de um polipeptídeo de alfa-glicosidase. Mídias e componentes de mídia adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito em catálogos da American Type Culture Collection).
[0181] Um polipeptídeo de serina termoestável secretado das células hospedeiras pode ser usado, com processamento pós-produção mínimo, como uma preparação de caldo inteiro.
[0182] Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcricionais e/ou pós-translacionais. Um exemplo não limitante de uma modificação pós-transcricional e/ou pós-traducional é recorte ou truncamento de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma serina protease termoestável de um estado inativo ou substancialmente inativo a um estado ativo como no caso de um pró-peptídeo submetido a processamento pós-tradução adicional a um peptídeo maduro que tem a atividade enzimática. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tomar um polipeptídeo de serina protease termoestável madura e remover adicionalmente os aminoácidos de terminal N ou C para gerar formas truncadas da serina protease termoestável que retêm atividade enzimática.
[0183] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações pós-transcricionais ou pós-traducionais que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.
[0184] Em algumas modalidades, uma lipase e/ou uma fitase pode ser adicionada a qualquer etapa do processo de fermentação.
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53/172 [0185] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um microrganismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica que resulta na expressão de uma serina protease termoestável.
[0186] A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo o cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batelada alimentada ou de estado sólido) em fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a alfa-glicosidase seja expressa ou isolada. O termo caldo de fermentação inteiro gasto é definido no presente documento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo caldo de fermentação inteiro gasto também abrange biomassa celular que foi Usada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.
[0187] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de uma serina protease termoestável. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG ou soforose.
[0188] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado para fermentar a cepa fúngica transformada ou derivada conforme descrito acima. Em algumas modalidades, as células fúngicas são cultivadas em batelada ou condições de fermentação contínua.
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54/172 [0189] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado. Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.
[0190] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma batelada em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fermentação. Tipicamente, o metabólito e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática até uma fase logarítmica de crescimento elevado e finalmente até uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou retida. Deixadas não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morreriam. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pelo volume de produção de produto. Uma variação adequada no sistema de batelada padrão é o sistema de fermentação em batelada alimentada”. Nessa variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiría o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases
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55/172 residuais, tal como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.
[0191] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, embora a concentração celular, medida por turvação de mídia, seja mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de estado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de mícrobiología industrial.
[0192] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de serina protease termoestável da invenção.
[0193] Após a fermentação, é obtido um caldo de fermentação e as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais
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56/172 de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma soiução de serina protease termoestável. Fiitração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.
[0194] Algumas vezes pode ser desejável concentrar uma solução ou caldo que compreende um polipeptídeo alfa-glicosidase para otimizar a recuperação. O uso de caldo ou soluções não concentradas aumentaria tipicamente o tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.
[0195] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os exemplos de métodos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.
[0196] A solução ou caldo que contém serina protease termoestável pode ser concentrada até o momento em que a atividade de enzima da solução ou caldo que contém polipeptídeo de serina protease termoestável estar em um nível desejado.
[0197] A concentração pode ser realizada com o uso, por exemplo, de um agente de precipitação, tal como um agente de precipitação de haleto metálico. Os agentes de precipitação de haleto metálico incluem, mas sem limitação, cloretos metálicos alcalinos, brometos metálicos alcalinos e mesclas de dois ou mais desses haletos metálicos.
[0198] Haletos metálicos exemplificativos incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e mesclas de dois ou mais desses haletos metálicos. O agente de precipitação de
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57/172 haleto metálico, cloreto de sódio, pode ser também usado como um conservante. Para a recuperação de escala de produção, os polipeptídeos de serina protease termoestável podem ser enriquecidos ou parcialmente purificados conforme descrito de modo geral acima com a remoção de células através de floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou purificada por microfiltração seguida por concentração por ultrafiltração com o uso de membranas e equipamentos disponíveis. Contudo, para algumas aplicações, a enzima não precisa ser enriquecida ou purificada e toda a cultura de caldo pode ser lisada e usada sem tratamento adicional. A enzima pode então ser processada, por exemplo, em grânulos.
[0199] As serina proteases termoestáveis podem ser isoladas ou purificadas em uma variedade de formas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Métodos de purificação padrões incluem, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbico, cromatofocalização, exclusão imunológica e de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), microfiltração de extração, cristalização e separação de duas fases. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser purificada com o uso de uma antiproteína padrão de coluna de anticorpo de interesse. As técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em combinação com a concentração de proteína, também são úteis. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessário variará dependendo do uso da proteína de interesse. Em alguns casos, nenhuma purificação será necessária.
[0200] Os ensaios para detectar e medir a atividade enzimática de uma enzima são bem conhecidos. Vários ensaios para detectar e medir
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58/172 a atividade de proteases (tais como os polipeptídeos de serina protease termoestável descritos no presente documento) também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em particular, ensaios estão disponíveis para medir atividade de protease que têm base na liberação de peptídeos solúveis em ácido de caseína ou hemoglobina, medida como absorbância a 280 nm ou colorimetricamente com o uso do método Folin e hidrólise da azocaseína marcada com tintura, medida como absorbância entre 440 a 450 nm [0201 ] Outros ensaios exemplificativos envolvem a solubilização de substratos cromogênicos (Consultar, por exemplo, Ward, Proteinases, em Fogarty (edição), Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, Londres, [1983], páginas 251 a 317). Um método de ensaio de detecção de protease com o uso de caseína de isoclanato de fluoresceína altamente marcada como o substrato, uma versão modificada do procedimento descrito por Twining [Twining, S.S., (1984) Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes Anal. Biochem. 143:30 a 34] pode ser também usado.
[0202] Outros ensaios exemplificativos incluem, mas sem limitação: divagem de caseína em peptídeos solúveis em ácido tricloroacético que contêm resíduos de tirosina e triptofano, seguidos pela reação com reagente Folin-Ciocalteu e detecção colorimétrica de produtos a 660 nm, divagem de substratos de peptídeo de FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) bruscamente arrefecidos internamente seguidos pela detecção de produto com o uso de um fluorômetro. A Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) é a transferência não radioativa de energia de um fluoróforo (ou doador) excitado para uma molécula (ou aceitante) bruscamente arrefecido adequado. FRET é usada em uma variedade de aplicações que incluem a medição de atividade de protease com substratos, em que o fluoróforo
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59/172 é separado do extintor por uma sequência de peptideos curta que contém o local de divagem de enzima. Proteólise do peptideo resulta na fluorescência quando o fluoróforo e extintor são separados. Referências adicionais numerosas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica fornecem métodos adequados (Consultar, por exemplo, Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7.911 a 7.925 [1983]; Christianson etal., Anal. Biochem. 223:119 a 129 [1994]; e Hsia et al., Anal Biochem. 242:221 a 227 [1999]).
[0203] Em ainda outro aspecto, é revelada uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mlstura, alimento ou produto de grão que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 ou sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta. [0204] Pelo menos um DFM pode compreender pelo menos um microrganismo viável, tal como uma cepa bacteriana viável ou uma levedura viável ou fungos viáveis. Preferencialmente, o DFM compreende pelo menos uma bactéria viável.
[0205] É possível que o DFM possa ser uma cepa bacteriana de formação de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido por ou conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Assim, o termo microrganismo viável conforme usado no presente documento pode incluir esporos microbianos, tais como endósporos ou conidia. Alternativamente, o DFM na composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode não compreender ou pode não conter esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conidia.
[0206] O microrganismo pode ser um microrganismo ocorrendo naturalmente ou pode ser um microrganismo transformado.
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60/172 [0207] Um DFM conforme descrito no presente documento pode compreender microrganismos de um ou mais dentre os seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos. [0208] Preferencialmente, o DFM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas das seguintes Bacillus spp.: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis e Bacillus amyloliquefaciens.
[0209] O gênero Bacillus, conforme usado no presente documento, inclui todas as espécies dentro do gênero Bacillus, conforme conhecido por aqueles indivíduos versados na técnica, incluindo, porém sem limitação, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. ha~ lodurans, B. megaterlum, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a ser submetido a reorganização taxonômica. Assim, entende-se que o gênero inclui espécies que foram reclassificadas, incluindo, porém sem limitação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que agora é nomeado ’’Geobacillus stearothermophilus” ou Bacillus polymyxa, que é agora Paenibacillus polymyxa”. A produção de endosporos resistentes sob condições ambientais estressantes é considerada o atributo de definição do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recentemente nomeados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibaclllus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Fllobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, e Virgibacillus.
[0210] Em outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguintes Lactococcus spp.: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e suas combinações.
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61/172 [0211] O DFM pode ser adicionalmente combinado com os seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchnerí, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sake!, Lactobacillus reuterl, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus piantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobaciilus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasserl, Lactobacillus johnsonli e Lactobacillus jensenii e combinações de qualquer um dos mesmos.
[0212] BifidobacteriaEm ainda outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium iongum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenuiatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum e combinações de qualquer uma das mesmas.
[0213] Podem ser mencionadas as bactérias das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyioliquefaciens, Bacillus pumiiis, Enterococcus , Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobaciilus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobaciilus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e suas combinações.
[0214] Um micróbio de alimentação direta descrito no presente documento que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser do
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62/172 mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.
[0215] Alternativamente, um DFM pode ser combinado com um ou mais dos produtos ou os microrganismos contidos naqueles produtos revelados no documento número WO2012110778 e resumidos conforme o seguinte: cepa de Bacillus subtilis 2084 n° de acesso NRRI B50013, cepa de Bacillus subtilis LSSAO1 n° de acesso NRRL B-50104 e cepa de Bacillus subtilis 15A-P4 ATCC n° de acesso PTA-6507 (disponíveis junto à Enviva Pro®, (anteriormente conhecida como Avicorr®); cepa de Bacillus subtilis C3102 (disponível junto à Calsporin®); cepa de Bacillus subtilis PB6 (disponível junto à Clostat®); Bacillus pu~ mills (8G-134); Enterococcus NCIMB 10415 (SF68) (disponível junto à Cylactin®); cepa de Bacillus subtilis C3102 (disponível junto à Gallipro® & GalliproMax®); Bacillus licheniformis (disponível junto à Gallipro®Tect®); Enterococcus e Pediococcus (disponível junto à Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococcus disponível junto à Protexin®); cepa de Bacillus subtilis QST 713 (disponível junto à Proflora®); Bacillus amyloliquefaciens CECT-5940 (disponível junto à Ecobiol® & Ecobiol® Plus); Enterococcus faecium SF68 (disponível junto à Fortiflora®); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (disponível junto à BioPlus2B®); bactérias de ácido lático 7 Enterococcus faecium (disponível junto à Lactiferm®); cepa de Bacillus (disponível junto à CSI®); Saccharornyces cerevisiae (disponível junto à Yea-Sacc®); Enterococcus (disponível junto à Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarlus (disponível junto à Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (disponível junto à Biacton®); Enterococcus (disponível junto à Oralin E1707®); Enterococcus (2 cepas), Lactococcus lactis DSM 1103(disponivel junto à Probios-pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminis (disponível junto à
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Sorbiflore®); Bacillus subtilis (disponível junto à Animavit®); Enterococcus (disponível junto à Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (disponível junto à Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (disponível junto à ActiSaf® (anteriormente BioSaf®)); Saccharomyces cerevisiae NCYC Sc47 (disponível junto à Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (disponível junto à Miya-Gold®); Enterococcus (disponível junto à Fecinor e Fecinor Plus®); Saccharomyces cerevisiae NCYC R-625 (disponível junto à InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (disponível junto à BioSprint®); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (disponível junto à Provita®); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (disponível junto à PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (disponível junto à Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM 1-1012 (disponível junto à TOYOCERIN®), ou outros DFMs, como Bacillus lichenlformls e Bacillus subtilis (disponível junto à BioPlus® YC) e Bacillus subtilis (disponível junto à GalliPro®).
[0216] O DFM pode ser combinado com Enviva® PRO que é comercialmente disponível a partir de Danisco A/S. Enviva Pro® é uma combinação de Bacillus cepa 2084 Número de Acesso NRRI B-50013, Bacillus cepa LSSAO1 Número de Acesso NRRL B-50104 e Bacillus cepa 15A-P4 ATCC Número de Acesso PTA-6507 (conforme ensinado no documento US número 7.754.469 B - incorporado no presente documento a título de referência).
[0217] Também é possível combinar o DFM descrito no presente documento com uma levedura dos gêneros: Saccharomyces spp.
[0218] Preferencialmente, o DFM descrito no presente documento compreende microrganismos que sâo geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) e são preferencialmente aprovados por GRAS.
[0219] Uma pessoa versada na técnica estará prontamente ciente
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64/172 de espécies e/ou cepas específicas de microrganismos dentro dos gêneros descritos aqui que são usadas nas indústrias alimentar e/ou agrícola e que são geralmente consideradas adequados para consumo animal.
[0220] Em algumas modalidades, é Importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Isto é particularmente o caso quando a ração é peletizada. Portanto, em outra modalidade, o DFM pode ser um microrganismo termotolerante, tal como bactérias termotolerantes,„que incluem, por exemplo, Bacillus spp.
[0221] Em outros aspectos, pode ser desejável que o DFM compreenda uma bactéria de produção de esporo, como Bacilli, por exemplo, Bacillus spp. Os Bacilli têm capacidade para formar endósporos estáveis quando as condições para o crescimento não são favoráveis e são muito resistentes ao calor, pH, umidade e desinfetantes.
[0222] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de microrganismo patogênico (como Clostridium periringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser antipatogênico. O termo antipatogênico, conforme usado no presente documento, significa que o DFM neutraliza um efeito (efeito negativo) de um patógeno.
[0223] Conforme descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o seguinte ensaio ENSAIO DE DFM pode ser usado para determinar a adequação de um microrganismo para ser um DFM. O ensaio de DFM, conforme usado no presente documento, é explicado em maiores detalhes no documento sob o n° US2009/0280090. Para evitar qualquer dúvida, o DFM selecionado como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico) de acordo com o ENSAIO DE DFM mostrado no presente documento é um DFM adequado para o uso de acordo com a presente descrição, isto é, na composição de aditivo de ração de acordo com a presente descrição.
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65/172 [0224] Os tubos foram semeados, cada um, com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) de um agrupamento representativo.
[0225] O sobrenadante de um DFM potencial, desenvolvido de maneira aeróbíca ou anaeróbica, é adicionado aos tubos semeados (exceto para o controle a qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubados. Após incubação, a densidade óptica (OD) do controle e tubos tratados com sobrenadante foi medida para cada patógeno.
[0226] As colônias de cepas (DFM potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qualquer sobrenadante) podem ser, então, classificadas como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico). Dessa forma, o ensaio de DFM, conforme usado no presente documento, é explicado em maiores detalhes no documento sob o n° US2009/0280090.
[0227] De preferência, um patógeno representativo nesse ensaio de DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostridium, como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coll e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacterspp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é conduzido com um ou mais dentre Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coll, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, mais preferencialmente, Clostridium perfringens.
[0228] Os DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais das seguintes bactérias e são descritos no documento WO2013029013: cepa de Bacillus subtilis 3BP5 n° de acesso NRRL B-50510, cepa de Bacillus subtilis 918 n° de acesso de ATCC NRRL B-50508 e cepa de Bacillus subtilis 1013 n° de Acesso de ATCC NRRL B-50509.
[0229] Os DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e veículo (ou veículos) (quando usados) e podem ser adicionados a um
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66/172 misturador de fita ou pá e misturados durante cerca de 15 minutos, apesar de o tempo poder ser aumentado ou diminuído. Os componentes são misturados de modo que uma mistura uniforme das culturas e veículos resulte. O produto final é preferencialmente um pó apto a fluir, seco. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser, então, adicionado à alimentação para animal ou uma prémistura de alimentação, adicionado à água de um animal, ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente documento.
[0230] A inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ser em proporções que variam de 1% a 99% e, de preferência, de 25% a 75%.
[0231] As dosagens adequadas do DFM em alimentação para animal podem se situar na faixa de cerca de 1x103 CFU/g de alimentação a cerca de 1x1010 CFU/g de alimentação, adequadamente entre cerca de 1x104 CFU/g de alimentação a cerca de 1x108 CFU/g de alimentação, adequadamente entre cerca de 7,5x104 CFU/g de alimentação a cerca de 1x107 CFU/g de alimentação.
[0232] Em outro aspecto, o DFM pode ser dosado em substância de ração em mais de cerca de 1x103 CFU/g de ração, adequadamente mais que cerca de 1x104 CFU/g de ração, adequadamente mais que cerca de 5x104 CFU/g de ração, ou adequadamente mais que cerca de 1x105 CFU/g de ração.
[0233] O DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração de cerca de 1x103 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, de preferência, 1x105 CFU/g de composição a cerca de 1x1013 CFU/g de composição, mais de preferência, entre cerca de 1x106 CFU/g de composição a cerca de 1x1012 CFU/g de composição e, com máxima preferência, entre cerca de 3,75x107 CFU/g de composição a cerca de 1x1011 CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM
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67/172 pode ser dosado em uma composição de aditivo de ração em mais que cerca de 1x105 CFU/g de composição, de preferência, mais que cerca de 1x106 CFU/g de composição, e com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição de aditivo de ração em mais que cerca de 2x105 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 2x106 CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 3,75x107 CFU/g de composição.
[0234] Uma composição de aditivo de ração para uso na ração de animal pode compreender uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, usada ou sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta e pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptideo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
[0235] Em ainda outro aspecto, é revelada uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta, em que a composição de aditivo
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68/172 de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, formação de tablete ou qualquer combinação dos processos acima.
[0236] Ademais, as partículas da composição de aditivo de ração granulada podem ter um diâmetro médio maior do que 50 microns e menor do que 2.000 microns.
[0237] A composição de aditivo de ração pode ser uma forma líquida, e a forma líquida pode também ser adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.
[0238] As rações animais podem incluir material vegetal tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um destes materiais vegetais ou fontes de proteína vegetal para aves domésticas, porcos, ruminantes, aquacultura e animais de estimação. É contemplado que os parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingesta de ração e eficácia de ração, mas também uniformidade aprimorada, concentração de amônia reduzida no alojamento de animais e, consequentemente, bem-estar e situação de saúde dos animais aprimorados, serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, o “desempenho do animal” pode ser determinado pela eficácia de alimentação e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de alimentação e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma alimentação (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digestive! ou energia metabolizável em uma alimentação e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade do animal de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou pela resposta imunológica do sujeito.
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69/172 [0239] Preferencialmente desempenho animal” é determinado por eficiência de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de ração.
[0240] Por desempenho animal melhorado pretende-se que signifique eficiência de ração melhorada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão de ração reduzida e/ou digestibilidade melhorada de nutrientes ou energia em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio melhorada e/ou por habilidade aprimorada para evitar os efeitos negativos de entente necrótica e/ou por uma resposta imunológica melhorada no assunto resultante do uso de composição de aditivo de ração da presente invenção na ração em comparação com a ração que não compreendem uma dita composição de aditivo de ração.
[0241] Preferencialmente, por desempenho animal melhorado pretende-se que signifique eficiência de rações aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão de ração reduzida. Conforme usado no presente documento, o termo “eficácia da ração” referese à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.
[0242] Por eficiência de ração aumentada” pretende-se que signifique o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção em resultados de ração em um ganho de peso aumentado por unidade de absorção de ração em comparação com uma ração de animal sem uma dita composição de aditivo de ração estar presente.
[0243] Conforme usado no presente documento, o termo “razão de conversão da ração” refere-se à quantidade de ração alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada.
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70/172 [0244] Uma razão de conversão da ração aprimorada significa uma razão de conversão da ração mais baixa.
[0245] Por “razão de conversão alimentar mais baixa” ou “razão de conversão alimentar aperfeiçoada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração em alimentação resulta em uma quantidade de alimentação mais baixa que é necessária para ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de alimentação necessária para aumentar o peso do animal pela mesma quantidade quando a alimentação não compreende a dita composição de aditivo de ração.
[0246] A digestibilidade de nutriente conforme usado no presente documento significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao sujeito e o que sai nas fezes do sujeito, ou entre o que é administrado ao sujeito e o que permanece no digerido em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.
[0247] A digestibilidade de nutrientes como usada aqui pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excreções durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não seja absorvido pelo animal, e permite que o investigador calcule a quantidade de nutriente que desapareceu no trato gastrointestinal inteiro ou um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração, ou como unidades de massa de nutriente digestive! por unidades de massa na ração.
[0248] A digestibilidade de nutrientes como usada aqui abrange a
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71/172 digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.
[0249] A digestibilidade de energia conforme usado no presente documento significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta do digerido restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo. Energia metabolizável como usada aqui se refere à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e energia metabolizável pode ser medida como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou no digerido presente em segmento especificado do trato gastrointestinal usando os mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções apropriadas para excreção de nitrogênio para se calcular a energia metabolizável da ração.
[0250] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento podem melhorar a digestibilidade ou utilização de hemicelulose dietétlca ou fibra em um sujeito. Em algumas modalidades, o indivíduo é um porco.
[0251] Retenção de nitrogênio, conforme usado no presente documento, significa a capacidade de um indivíduo para reter nitrogênio a partir da dieta como massa corporal. Ocorre um equilíbrio de nitrogênio negativo quando a excreção de nitrogênio excede a ingestão diária e é frequentemente visto quando o músculo está sendo perdido. Um equilíbrio de nitrogênio positivo está frequentemente associado ao crescimento dos músculos, particularmente, em animais em crescimento.
[0252] A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a Ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado por meio da coleta total de excreção e urina durante um período de tempo. É entendido
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72/172 que o nitrogênio excretado inclui proteína nâo digerida da ração, secreções proteicas endógenas, proteína microbiana e nitrogênio urinário.
[0253] O termo sobrevivência conforme usado no presente documento significa o número de sujeitos ainda vivos. O termo sobrevivência aperfeiçoada pode ser uma outra maneira de dizer mortalidade reduzida.
[0254] O termo rendimento da carcaça conforme usado no presente documento significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo de abate comercial ou experimental. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido para alimento, com a cabeça, entranhas, parte dos membros, e penas ou pele removidos. O termo rendimento da carne conforme usado no presente documento significa a quantidade de carne comestível como uma porção do peso corporal vivo, ou a quantidade de uma carne especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo.
[0255] Um ganho de peso aumentado refere-se a um animal que tem peso corporal aumentado na ração ao ser alimentado com ração que compreende uma composição de aditivo de ração em comparação com um animal que é alimentado com uma ração sem uma dita composição de aditivo de ração estar presente.
[0256] O termo animal conforme usado no presente documento inclui todos os animais ruminantes e não ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, tal como um cavalo ou um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástricos incluem, mas não estão limitados a, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves domésticas tais como perus, patos, galinha, frangos de corte, galinhas poedeiras; peixe tal como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos tais como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, mas sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras,
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73/172 ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antílope asiático.
[0257] No presente contexto, pretende-se que o termo alimento para animais de estimação seja compreendido para significar um alimento para um animal doméstico como, mas sem limitação, cachorros, gatos, gerbos, hamsters, chinchiias, ratos extravagantes, porquinhos da índia; aves de estimação, como canários, periquitos e papagaios; répteis de estimação, como tartarugas, lagartos e cobras; e animais de estimação aquáticos, como peixe tropical e sapos.
[0258] Os termos composição de ração de animal, ração, alimento para animais e forragem são usados intercambiavelmente e podem compreender um ou mais materiais aiimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.
[0259] As serina proteases termoestáveis descritas no presente documento ou uma composição de aditivo de ração pode ser usada como ou na preparação de uma ração. Os termos composição de aditivo de ração e composição de enzima são usados de modo intercambiável no presente documento.
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74/172 [0260] A ração pode estar na forma de uma solução ou como um sólido ou como um semissólido dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
[0261] Quando usada como, ou na preparação de, uma ração, tal como ração funcional, a enzima ou composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser usada em conjunção com um ou mais dentre: um transportador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, pode ser mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptideo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
[0262] Em uma modalidade preferencial, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar um alimento para animais. O termo “componente de ração” conforme usado no presente documento significa toda ou parte da composição de ração. Parte do alimento para animais pode significar um constituinte do alimento para animais ou mais do que um constituinte do alimento para animais, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo “componente de ração” engloba uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. Preferenclalmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma sua pré-mistura, uma ração de composto ou uma sua pré-mistura. Uma composição de aditivo de ração pode ser
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75/172 misturada por adição com uma ração de composto, um componente de ração de composto ou a uma pré-mistura de uma ração de composto ou a uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.
[0263] Qualquer alimento para animais descrito no presente documento pode compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmida (particularmente torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente Grãos Secos de Destilaria à base de milho (cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.
[0264] O termo forragem conforme usado no presente documento significa qualquer alimento que seja proporcionado a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por sl próprio). A forragem engloba plantas que foram cortadas. Ademais, forragem inclui silagem, alimentações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.
[0265] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas dentre: milho (mais) alfafa (luzerna), cevada, comichão, brassicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga
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76/172 (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, festuca, bromus, painço, aveia, sorgo, sojas, árvores (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legumes. [0266] O termo “ração de composto” significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. As rações de composto podem ser combinadas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.
[0267] As rações de composto podem ser rações completas que proporcionam todos os nutrientes diários requeridos, concentrados que proporcionam uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que proporcionam somente micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.
[0268] Os principais ingredientes usados em ração de composto são os grãos de ração que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.
[0269] Adequadamente, uma pré-rriistura denominada aqui pode ser uma composição composta por microingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são usualmente composições adequadas para combinação em rações comerciais. [0270] Em uma modalidade, o alimento para animais compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.
[0271] Em uma modalidade, o componente de alimentação pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o alimento para animais compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.
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77/172 [0272] Um alimento para animais descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.
[0273] Por exemplo, um alimento para animais pode conter entre cerca de 5 a cerca de 40% de DDGS de milho. Para aves, o alimento para animais pode conter, em média, entre cerca de 7 a 15% de DDGS de milho. Para suínos (porcos), o alimento para animais pode conter, em média, 5 a 40% de DDGS de milho. O mesmo pode conter milho como um único grão, em tal caso, o alimento para animais pode compreender entre cerca de 35% a cerca de 80% de milho.
[0274] Nos gêneros alimentícios que compreendem grãos misturados, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, o alimento para animais pode compreender pelo menos 10% de milho.
[0275] Adicional ou alternativamente, um alimento para animais pode também compreender pelo menos um material de ração rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras para proporcionar um alimento para animais rico em fibras. Os exemplos de materiais de ração ricos em fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, alimentação de milho com glúten, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, favas e algodão. Em um aspecto, o alimento para animais conforme descrito no presente documento compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de alimentação rico em fibras selecionado dentre o
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78/172 grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente cDDGS, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), particularmente cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, o alimento para animais da presente invenção compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de alimentação rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.
[0276] A ração pode ser um ou mais dos seguintes: uma ração de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.
[0277] O termo ração conforme usado no presente documento engloba, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, tal como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, tal como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.
[0278] A ração de animal pode também incluir um alimento para peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutrientes, elementos vestigiais e vitaminas necessários para manter o peixe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais se
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79/172 afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixe maior ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns alimentos para peixes contêm também aditivos, tais como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor de peixe ornamental.
[0279] Em ainda outro aspecto, a ração de animal engloba alimento para pássaros. O alimento para pássaros inclui alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).
[0280] Conforme usado no presente documento, o termo colocado em contato refere-se à aplicação direta ou indireta de uma enzima serina protease termoestável (ou composição que compreende serina protease termoestável) a um produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material compreendendo a composição de aditivo de ração, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, pulverização da composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é preferencialmente misturada com o produto (por exemplo, alimento para animais). Altemativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de um alimento para animais. Para algumas aplicações é importante que a composição seja tornada disponível na ou à superfície de um produto a ser afetado/tratado. Isto permite que a composição confira um benefício de desempenho.
[0281] Em alguns aspectos, as serina proteases termoestáveis descritas são usadas para o pré-tratamento de alimento ou ração. Por
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80/172 exemplo, a ração que tem 10 a 300% de umidade é misturada e incubada com as proteases a 5 a 80°C, preferencialmente a 25 a 50°C, mais preferencialmente entre 30 e 45°C por 1 min a 72 horas sob condições aeróbicas ou 1 dia a 2 meses sob condições anaeróbicas. O material pré-tratado pode ser alimentado diretamente aos animais (denominado alimentação líquida). O material pré-tratado pode também ser peletizado a vapor em temperaturas elevadas de 60 a 120°C. As proteases podem ser impregnadas em material de ração ou alimentício por um revestidor a vácuo.
[0282] As serina proteases termoestáveis (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) podem ser aplicadas a intercalar, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, alimento para animais ou ingredientes crus de um alimento para animais) com uma quantidade controlada da dita enzima.
[0283] De preferência, a composição de aditivo de ração será termicamente estável para tratamento térmico de até cerca de 70°C; até cerca de 85°C; ou até cerca de 95°C. O tratamento térmico pode ser realizado por até cerca de 1 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minutos. O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 75% dos componentes de enzima e/ou DFM que estavam presentes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada estão ainda presentes/ativos após resfriar até a temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% do componente de protease e/ou DFM compreendendo uma ou mais cepas bacterianas que estavam presentes e ativos no aditivo antes do aquecimento até à temperatura especificada estão ainda presentes e ativos após resfriar até a temperatura ambiente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição de aditivo de ração é homogeneizada para produzir um pó.
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81/172 [0284] Alternativamente, a composição de aditivo de ração é formulada a grânulos conforme descrito no documento W02007/044968 (denominados como grânulos TPT) incorporado ao presente documento a título de referência.
[0285] Em outra modalidade preferencial, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é termotolerância melhorada, estabilidade no armazenamento melhorada e proteção contra outros aditivos de ração tendo de outro modo efeito adverso na pelo menos uma protease e/ou DFM compreendendo uma ou mais cepas bacterianas. Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade na água maior do que 0,25 ou umidade constante maior do que 60% a 20°C. Preferencialmente, o revestimento de sal compreende Na2SO4.
[0286] O método de preparação de uma composição de aditivo de ração pode também compreender o passo adicional de peletização do pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura compreendendo o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.
[0287] Um método de preparo de serina proteases termoestáveis (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) pode compreender também a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura compreendendo o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.
[0288] Opcionalmente, o passo de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou etapa de condicionamento, antes da formação
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82/172 dos péletes. A mistura compreendendo o pó pode ser colocada em um condicionador, p.ex., um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100 °C, temperaturas típicas seriam 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de residência pode ser variável de segundos a minutos e mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será compreendido que as serina proteases termoestáveis (ou composição que compreende as serina proteases termoestáveis) descritas no presente documento são adequadas para adição a qualquer material de ração apropriado.
[0289] Será entendido pela pessoa versada que diferentes animais exigem diferentes alimentos para animais, e até o mesmo animal pode exigir diferentes alimentos para animais, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.
[0290] Opcionalmente, o alimento para animais pode também conter minerais adicionais tais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, o alimento para animais é uma mistura de farinha de milho e soja.
[0291] O alimento para animais é tipicamente produzido em moinhos de ração nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar trituradas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. O alimento para animais pode ser depois produzido como um mingau ou péletes; estes últimos envolvem tipicamente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um nível alvo e depois a ração é passada através de uma fieira para produzir péletes de um tamanho particular. É permitido que os péletes resfriem. Subsequentemente, podem ser adicionados aditivos líquidos, tais como gordura e enzima. A produção de alimento para animais pode também en
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83/172 volver um passo adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização, em particular por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.
[0292] O alimento para animais pode ser um alimento para animais para um animal monogástrico, tal como aves (por exemplo, frango de corte, poedeira, reprodutores de frangos de corte, peru, pato, ganso, galinha d'água) e suínos (todas as categorias de idade), um ruminante, tal como gado (por exemplo, vacas ou touros (incluindo bezerros)), cavalos, ovelha, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixes (por exemplo, peixe agástrico, peixe gástrico, peixe de água doce, tais como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa koi, peixe marinho, tal como badejo, e crustáceos, tais como camarões, mexilhões e vieiras). Preferencialmente, o alimento para animais é para aves.
[0293] A composição de aditivo de ração e/ou o alimento para animais que compreende a mesma podem ser usados de qualquer forma adequada. A composição de aditivo de alimentação pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou suas alternativas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bólus, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.
[0294] Em algumas aplicações, as composições de aditivo de ração podem ser misturadas com ração ou administradas na água potável.
[0295] Uma composição de aditivo de ração que compreende misturar por adição uma protease conforme ensinado no presente documento com um veículo, diluente ou excipiente e (opcionalmente) embalagem aceitável de ração.
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84/172 [0296] O alimento para animais e/ou a composição de aditivo de alimentação podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. As composições assim derivadas podem ser denominadas no presente documento como uma pré-mistura.
[0297] Em algumas modalidades, serina protease termoestável pode estar presente na substância de ração na faixa de 1 ppb (parte por bilhão) a 10 % (p/p) com base em proteína enzimática pura. Em algumas modalidades, a protease está presente na substância de ração na faixa de 1 a 100 ppm (partes por milhão). Uma dose preferencial pode ser de 1 a 20 g de serina protease termoestável por tonelada de produto de ração ou composição de ração ou uma dose final de 1 a 20 ppm de serina protease termoestável no produto final.
[0298] Preferencialmente, a serina protease termoestável que está presente na substância de ração deve ser de pelo menos cerca de 200 PU/kg ou pelo menos cerca de 300 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 400 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 500 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 600 PU/kg de ração, pelo menos cerca de 700 PU/kg de ração, pelo menos cerca de 800 PU/kg de ração, pelo menos cerca de 900 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 1.000 PU/ kg de ração, ou pelo menos cerca de 1.500 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 2.000 PU/kg de ração ou pelo menos cerca de 2.500 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 3.000 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 3.500 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 4.000 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 4.500 PU/kg de ração, ou pelo menos cerca de 5.000 PU/kg de ração.
[0299] Em outro aspecto, a serina protease termoestável pode estar presente na substância de ração em menos que cerca de 60.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 70.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 80.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 90.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 100.000 PU/kg
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85/172 de ração, ou em menos que cerca de 200.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 60.000 PU/kg de ração, ou em menos que cerca de 70.000 PU/kg de ração.
[0300] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.
[0301] Será compreendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera 2,3 microgramas de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) de um substrato de caseína por minuto em pH 10,0 a 50°C. Isso pode ser mencionado como o ensaio para determinar 1 PU.
[0302] Formulações que compreendem qualquer uma das serina proteases termoestáveis e composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer modo para assegurar que a formulação compreende enzimas ativas. Tais formulações podem ser como um líquido, um pó seco ou um grânulo. Preferencialmente, a composição de aditivo de ração está em uma forma líquida adequada para secagem por aspersão em um pélete de ração.
[0303] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos por aqueles indivíduos versados na técnica, tal como, granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, aspersão em leito fluidizado.
[0304] As serina proteases termoestáveis e composições descritas no presente documento podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do calor e pode ser considerado termoprotetor.
[0305] A composição de aditivo de alimentação descrita no presente documento pode ser formulada a um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento n2W02007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência).
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86/172 [0306] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, o agente ativo do grânulo que retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade depois de condições selecionadas a partir de uma ou mais de a) um processo de peletização de ração, b) um pré-tratamento de ração aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada, e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura à base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado a partir de minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares de redução, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de ração ou mistura a base de ração ácida ou básica.
[0307] No que diz respeito ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material hidratante por umidificação que constitui pelo menos 55% p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento hidratante por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento hidratante por umidificação pode ser entre 25% e 60% p/p do grânulo e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% p/p do grânulo. O revestimento hidratante por umidificação pode ser selecionado de sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado de polímeros, gomas, soro do leite e amido.
[0308] O grânulo pode ser produzido usando um processo de peletizaçâo de ração e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C durante até vários minutos, tal como entre 85°C e 95°C.
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87/172 [0309] A composição de aditivo de alimentação pode ser formulada em um grânulo para alimentação animal que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira de umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade de água menor do que 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.
[0310] O grânulo pode ter um revestimento de barreira de umidificação selecionado de polímeros e gomas e o material hidratante por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento hidratante por umidificação pode ser entre 25% e 45% p/p do grânulo e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 10% p/p do grânulo.
[0311] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido a vapor que pode ser conduzido entre 85°C e 95°C por até alguns minutos.
[0312] Altemativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, preferencialmente tal consumo líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol. [0313] Também, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato veículo, tal como trigo triturado, por exemplo.
[0314] Em uma modalidade, a composição de aditivo de alimentação pode ser formulada como uma pré-mistura. A título de exemplo apenas, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de alimentação, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.
[0315] Em uma modalidade, o microrganismo de alimentação direta (DFM) e/ou serina proteases termoestáveis formuladas com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de pelo
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88/172 menos uma de maltodextrlna, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na^SCh, Talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarose, propilenoglicol, 1,3propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, acetato, fosfato, metabissulfeto de cálcio, metabissulfeto, formiato e misturas dos mesmos.
[0316] Em outra modalidade, é revelado um método para hidrolisar material que contém amido que compreende:
(a) colocar o material que contém amido em contato com um líquido para formar uma massa; e (b) hidrolisar amido no mingau para formar um liquefeito colocando-se a massa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0317] Ademais, o coquetel de enzimas pode compreender pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em alfaamilase, amiloglucosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase e xilanase.
[0318] Quaisquer dessas enzimas podem ser usadas em uma quantidade que varia de 0,5 a 500 microgramas/g de ração ou matériaprima.
[0319] Alfa-amilases (alfa-1,4-glucano-4-glucano-hidrolase, EC
3.2.1.1.) hidrolisam ligações de alfa-1,4-glícosídicas Internas em amido, amplamente e aleatoriamente para produzir dextranos de peso molecular menor. Esses polipeptideos são usados, inter alia, em processamento de amilasese em produção de álcool. Quaisquer alfa-amilases podem ser usadas, por exemplo, aquelas descritas na Patente US número 8.927.250 e 7.354.752.
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89/172 [0320] Amiloglucosidase catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-Dglicose terminalmente 1,4-ligados sucessivamente a partir das extremidades de nâo redução de malto-oligo- e polissacarideos com a liberação de betaD-glicose. Qualquer amiloglicosidase pode ser usada.
[0321] Fitase refere-se a uma proteína ou polipeptideo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de fitato para (1) mio-lnositol e/ou (2) mono-, di~, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos do mesmo e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas que têm atividade catalítica conforme definido na Comissão de Enzima EC número 3.1.3.8 ou EC número 3.1.3.26. Qualquer fitase pode ser usada, tal como descrito nas Patentes US número 8.144.046, 8.673.609 e 8.053.221.
[0322] Pululanase (EC 3.2.1.41) é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima amilolítica que degrada pululano (um polímero de polissacarídeo que consiste em unidades de maltotriose, também conhecidas como alfa-1,4-; alfa-1,6-glucano. Portanto, é um exemplo de uma enzima desramificação. Pululanase também conhecido como pululan-6~ glucano-hidrolase. Pululanases são geralmente secretadas por uma espécie de Bacillus. Por exemplo, Bacillus deramificans (Patente US número 5.817.498; 1998), Bacillus acidopullulyticus (Patente Européia número 0 063 909) e Bacillus naganoensis (Patente US número 5.055.403). Enzimas que têm atividade de pululanase usadas comercialmente são produzidas, por exemplo, a partir de espécies de Bacillus (nome comercial OPITMAX® 1-100 de DuPont-Genencor e Promozyme® D2 junto à Novozymes). Outros exemplos de enzimas de desramificação incluem, mas sem limitação, iso-amilase a partir de Sulfolobus solfatarícus, Pseudomonas sp. e pululanase termoestável a partir de Fervidobacterium nodosum (e.f., WO2010/76113). A iso-amilase a partir de Pseudomonas sp. está disponível como enzima purificada de Megazyme International. Qualquer pululanase pode ser usada.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 100/195 [0323] Glucanases são enzimas que quebram um glucano, um polissacarídeo produzido a partir de diversas subunidades de glicose. Na medida em que realizam hidrólise da ligação glicosídica, as mesmas são hidrolases.
[0324] Enzimas beta-glucanase (EC 3.2.1.4) digerem fibra. Isso ajuda na quebra de paredes de planta (celulose).
[0325] Celulases são quaisquer das diversas enzimas produzidas por fungos, bactérias e protozoários que catalisam celulólise, a decomposição de celulose e de alguns polissacarídeos relacionados. O nome também é usado para qualquer mistura de ocorrência natural ou complexo de várias de tais enzimas que atuam em série ou sinergicamente para decompor material celulósico. Quaisquer celulases podem ser usadas.
[0326] Xilanase (EC 3.2.1.8) é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, aquelas que quebram hemicelulose, um dos principais componentes de paredes celulares de planta. Quaisquer xilanases podem ser usadas.
[0327] Amido ou amilum é um carboidrato polimérico que consiste em um grande número de unidades de glicose unidades por ligações glicosídicas O amido pode ser hidrolisado em carboidratos mais simples por ácidos, várias enzimas ou uma combinação dos dois.
[0328] Na indústria, o amido é convertido em açúcares, por exemplo, por maltagem, e fermentado para produzir etanol na fabricação de cerveja, uísque e biocombustível.
[0329] Qualquer material que contém amido adequado pode ser usado. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Os exemplos de materiais que contêm amido incluem, porém sem limitação, grãos inteiros, milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijões ou misturas dos mesmos ou amidos derivados dos mesmos ou
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91/172 cereais. O material de partida pode ser um sólido seco, tal como, porém sem limitação, um sólido seco de uma ração ou alimento para animais conforme descrito no presente documento. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos ou milho e cevada. Os materiais que contêm amido usados para produção de etanol são milho ou trigo. O amido é inicialmente coletado de grãos de planta com o uso de uma moagem a úmido, uma moagem a seco ou um processo de trituração a seco. [0330] Um substrato que compreende material vegetal é reduzido ou moído por métodos conhecidos na técnica. O material vegetal pode ser obtido a partir de: trigo, milho, centeio, sorgo (milo), arroz, painço, cevada, triticale, mandioca (tapioca), batata, batata-doce, beterrabas, cana-de-açúcar e legumes, tais como soja e ervilhas. O material vegetal preferencial inclui milho, cevada, trigo, arroz, milo e combinações dos mesmos. O material vegetal pode incluir variedades híbridas e variedades geneticamente modificadas (por exemplo, milho transgênico, cevada ou sojas que compreendem genes heterólogos).
[0331] Qualquer parte da planta contendo amido pode ser usada para produzir o liquefeito, incluindo, porém sem limitação, partes de planta, tais como folhas, caules, cascos, cascas, tubérculos, espigas, grãos e similares. Os grãos inteiros preferenciais incluem milho, trigo, centeio, cevada, sorgo e combinações dos mesmos. Em outras modalidades, o amido pode ser obtido a partir de grãos de cereal fracionados incluindo fibra, endosperma e/ou componentes germinativos. Os métodos para fracionar material vegetal, tal como milho e trigo, são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o material vegetal obtido a partir de diferentes fontes pode ser misturado em conjunto (por exemplo, milho e milo ou milho e cevada). Os métodos de moagem são bem conhecidos na técnica e referência é feita a The Alcohol Textbook: A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol
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Industries3a ED. K.A. Jacques etaL, Eds, (1999) Nottingham University Press. Consultar os Capítulos 2 e 4.
[0332] Em algumas modalidades, o material vegetal, reduzido por moagem ou outros meios, será combinado com uma solução resultando em uma pasta fluida que compreende substrato de amido. Em algumas modalidades, a pasta fluida pode incluir uma corrente lateral do processamento de amido, tal como recuo. Em algumas modalidades, a pasta fluida compreenderá 15 a 55% ds (por exemplo, 20 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40% e 20 a 35%). Em algumas modalidades, a pasta fluida pode compreender 10% a 60% de recuo. A pasta fluida que compreende o material vegetal reduzido pode ser submetida a um processo de liquefação em que uma alfa amilase pode ser adicionada durante a etapa de liquefação. Isso resulta em um liquefeito. Para produzir o liquefeito, uma única dose ou dose dividida de uma alfa amilase pode ser adicionada à pasta fluida. Uma pessoa versada na técnica pode determinar prontamente a dosagem eficaz da alfa amilase a ser usada nos processos de liquefação.
[0333] A quantidade de alfa amilase usada para liquefação é uma quantidade eficaz para causar a liquefação de uma maioria do amido. Em outras modalidades, a quantidade é eficaz para permitir a liquefação de mais do que 40% do amido, incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%. Em algumas modalidades, a faixa será 0,05 a 50 AAU/g de ds (unidades de alfa-amilase por grama de sólidos secos (por exemplo, ração ou alimento para animais, tal como milho), também 0,1 a 20 AAU/gDS e também 1,0 a 10 AAU/gDS. Em modalidades adicionais, a dosagem de alfa amilase estará na faixa de 0,01 a 10,0 kg/tonelada métrica (MT) de ds; também 0,05 a 5,0 kg/MT de ds; e também 0,1 a 4,0 kg/MT de ds.
[0334] Uma alfa amilase pode ser adicionada a uma temperatura de 0 a 30°C abaixo da temperatura de gelatinização de amido do amido
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93/172 granular do material vegetal reduzido. Essa temperatura pode ser 0 a 25°C, 0 a 20°C, 0 a 15°C e 0 a 10°C abaixo da temperatura de gelatinização de amido. Esse valor específico variará e dependerá do tipo de grão que compreende a pasta fluida, por exemplo, a temperatura de gelatinização de amido do milho é geralmente mais alta do que a temperatura de gelatinização de amido do centeio ou trigo. Em algumas modalidades, a temperatura estará entre 45 a 80°C, também entre 50 a 75°C, também entre 50 a 72°C e, em algumas modalidades, a temperatura estará abaixo de 68°C; abaixo de 65 °C, abaixo de 62°C, abaixo de 60°C e também abaixo de 55°C. Em outras modalidades, a temperatura estará acima de 40°C, acima de 45°C, acima de 50°C e acima de 55°C. Em algumas modalidades preferenciais, a temperatura da incubação estará entre 58 a 72°C e também entre 60 a 68°C.
[0335] Em algumas modalidades, a pasta fluida será mantida a uma faixa de pH de cerca de 3,0 a menos do que 6,5, também a uma faixa de pH de 4,0 a menos do que 6,2, também a uma faixa de pH de cerca de 4,5 a menos do que 6,0 e, preferencialmente, a uma faixa de pH de cerca de 5,0 a 6,0 (por exemplo, cerca de 5,4 a 5,8), e o grão moído na pasta fluida entrará em contato com a composição de enzima por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, 5 min a 3 h; 15 min a 2,5 h e 30 min a 2 h). Em uma etapa adicional, o substrato incubado será liquefeito expondo-se o substrato incubado a um aumento na temperatura, tal como 0 a 55°C acima da temperatura de gelatinização de amido. (Por exemplo, 65°C a 120°C, 70°C a 110°C, 70°C a 90°C) por um período de tempo de 2 minutos a 8 horas (por exemplo, 2 minutos a 6 h, 5 minutos a 4 horas e, preferencialmente, 1 h a 2 h) a um pH de cerca de 4,0 a 6,5. Em algumas modalidades, a temperatura pode ser elevada a uma temperatura a entre cerca de 85 a 90°C e uma única dose de alfa amilase pode ser usada. Se a temperatura for elevada
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 104/195 acima de 90 a 105°C, uma segunda dose de alfa amilase pode ser adicionada após a temperatura retomar ao normal· Em uma modalidade adicional, a temperatura pode ser elevada a entre cerca de 105 e 140°C e uma dose dividida de alfa amilase pode ser usada com uma parte sendo adicionada após a elevação da temperatura e a outra parte adicionada após a temperatura ter sido reduzida a pelo menos abaixo de 105°C, incluindo abaixo de 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92 e 91 °C, mas, preferencialmente, abaixo de 90°C. Em algumas modalidades, o liquefeito resultante é resfriado antes da sacarificação. [0336] O liquefeito obtido acima pode ser colocado em contato com uma glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida (tal como FERMGEN™, DuPont ou AP1 junto à CTE Global) em uma dose única ou uma dose dividida contanto que uma razão desejada de enzimas seja mantida. Assim, uma dose dividida significa que a dose total na razão desejada é adicionada em mais do que uma porção, incluindo duas porções ou três porções. Em uma modalidade, uma porção da dose total é adicionada no começo e uma segunda porção é adicionada a um tempo especificado no processo. Em uma modalidade, pelo menos uma porção da dose é adicionada no começo da sacarificação (ou SSF) para começar o processo de sacarificação. Em uma modalidade, cada enzima na composição enzimática pode ser adicionada ao liquefeito separadamente, mas simultaneamente ou próximo o suficiente no tempo de modo que a razão de atividade seja mantida. Alternativamente, a composição de mescla de enzimas que compreende uma glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida pode ser adicionada durante uma ou ambas dentre a sacarificação e a fermentação. A razão entre a glicoamilase, uma alfa amilase estável ao ácido e uma protease fúngica ácida é, preferencialmente, cerca de 1:1,5:0,1 a cerca de 1:8:1 e, mais preferencialmente, cerca de 1:2:0,2 a 1:5: 0,6, conforme medido por GAU:SSU:SAPU.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 105/195 [0337] A sacarificação ou processo SSF compreende tipicamente a adição de ureia ou amônia usada como uma fonte de nitrogênio para ο organismo hospedeiro (tai como, porém sem limitação, levedura). Em plantas de etanol comerciais, a adição da fonte de nitrogênio (tal como ureia) durante a sacarificação ou SSF está tipicamente na faixa entre 200 a 1.000 ppm, tal como pelo menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 até 1.000 ppm de ureia. Outra fonte de nitrogênio rica em uma planta de etanol são as proteínas de milho presentes no miolo do milho. Essa fonte de nitrogênio é tornada disponível para o organismo de fermentação quando o mesmo é hidrolisado em fragmentos menores como pequenos peptídeos e aminoácidos.
[0338] Conforme descrito no presente documento, foi revelado surpreendente e inesperadamente que, quando uma serina protease termoestável, tal como ME3, está presente durante a etapa de liquefação de um método para produzir produtos de fermentação a partir de materiais que contêm amido, a necessidade de adicionar uma fonte de nitrogênio durante o processo de sacarificação ou SSF é reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou completamente eliminada (100% de redução). Isso indica que uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8, ou 10 (tal como, porém sem limitação, ME-3 descrita no presente documento) pode hidrolisar proteínas do milho a tal grau que a mesma permite que o organismo de fermentação use as proteínas do milho como uma fonte de nitrogênio. Consequentemente, menos ureia ou nenhuma ureia pode ser adicionada à SSF. A forte redução ou eliminação de uma fonte de nitrogênio permite que a planta funcione a um custo mais baixo.
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96/172 [0339] Ademais, isso indica que a presença de uma protease diferente de uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 (tal como, porém sem limitação, ME-3 descrita no presente documento) no processo de fermentação pode não ser necessária.
[0340] O processo de sacarificação pode durar 12 a 120 horas. Entretanto, é comum realizar uma sacarificação por 30 minutos a 2 horas e, então, concluir a sacarificação durante a fermentação. Algumas vezes isso é denominado sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é comumente executada a temperaturas de 30 a 65 °C e, tipicamente, a pH de 3,0 a 5,0, incluindo 4,0 a 5,0. A sacarificação pode resultar na produção de açúcares fermentáveis.
[0341] Em algumas modalidades, os açúcares fermentáveis são submetidos à fermentação com mícrorganismos de fermentação. A etapa de contato e a etapa de fermentação podem ser realizadas simultaneamente no mesmo vaso de reação ou sequencialmente. Em geral, os processos de fermentação são descritos em The Alcohol Textbook 3a ED, A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, Reino Unido.
[0342] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente usar açúcares fermentáveis (dextrina, por exemplo, glicose) como um alimento para animais de fermentação em fermentações microbianas sob condições de fermentação adequadas para obter produtos finais, tais como álcool (por exemplo, etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido succínico, ácido lático), álcoois de açúcar (por exemplo, glicerol), intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, gluconato, DKG, KLG) aminoácidos (por exemplo, lisina), proteínas (por exemplo,
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97/172 anticorpos e fragmento dos mesmos).
[0343] Os açúcares fermentáveis podem ser fermentados com uma levedura a temperaturas na faixa de 15 a 40°C, 20 a 38°C e também 25 a 35°C; a uma faixa de pH de pH 3,0 a 6,5; também pH 3,0 a 6,0; pH 3,0 a 5,5, pH 3,5 a 5,0 e também pH 3,5 a 4,5 por um período de tempo de 5 horas a 120 horas, preferencialmente, 12 a 120 e mais preferencialmente de 24 a 90 horas para produzir um produto de álcool, preferencialmente, etanol.
[0344] As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de 104 a 1012 e, preferencialmente, de 107a 1010 contagens de levedura viável por ml de caldo de fermentação. A fermentação incluirá adicionalmente a um microrganismo de fermentação (por exemplo, levedura) nutrientes, opcionalmente, ácido e enzimas adicionais. Em algumas modalidades, adicionalmente ás matérias-primas descritas acima, o meio de fermentação conterá suplementos incluindo, porém sem limitação, vitaminas (por exemplo, biotina, ácido fólico, ácido nicotínico, riboflavina), cofatores e macro e micronutrientes e sais (por exemplo, (NH4)2SO4: K2HPO4; NaCI; MgSO4: H3BO3; ZnCI2; e CaCI2).
[0345] Em algumas modalidades preferenciais, 0 material vegetal moido inclui cevada, milo, milho e combinações dos mesmos, e as etapas de contato e fermentação são conduzidas simultaneamente a uma faixa de pH de 3,5 a 5,5, uma faixa de temperatura de 30 a 45°C e por um período de tempo de 48 a 90 h, em que pelo menos 50% do amido é solubilizado.
[0346] Um produto final de um processo de fermentação pode ser um produto de álcool, por exemplo, etanol. Outros produtos finais podem ser os coprodutos de fermentação, tais como grãos secos de destilaria (DDG) e grão seco de destilaria mais solúveis (DDGS), que podem ser usados como uma ração de animal.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 108/195 [0347] Uso de um microrganismo de fermentação apropriado conforme conhecido na técnica, os produtos finais de fermentação podem incluir, sem limitação, glicerol, 1,3~propanodiol, gluconato, 2-ceto~D~gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulônico, ácido succíníco, ácido láctíco, aminoácidos e derivados dos mesmos.
[0348] Os exemplos de organismos de fermentação são microrganismos etanologênicos ou microrganismos que produzem etanol, tais como bactérias etanologênicas que expressam álcool desidrogenase e piruvato desidrogenase e que podem ser obtidas a partir de Zymomonas moblis (Consultar, por exemplo, os documentos n2 USP 5.000.000; USP 5.028.539, USP 5.424.202; USP 5.514.583 e USP 5.554.520). Em modalidades adicionais, os microrganismos etanologênicos expressam xilose redutase e xilitol desidrogenase, enzimas que convertem xilose em xilulose. Em modalidades adicionais, a xilose isomerase é usada para converter xilose em xilulose. Em modalidades particularmente preferenciais, um microrganismo com a capacidade para fermentar tanto pentoses quanto hexoses em etanol é utilizado. Por exemplo, em algumas modalidades, o microrganismo pode ser um microrganismo natural ou não geneticamente modificado ou, em outras modalidades, o microrganismo pode ser um microrganismo recombinante.
[0349] Os microrganismos de fermentação incluem, porém sem limitação, cepas bacterianas de Bacillus, Lactobacillus, E. coll, Erwinia, Pantoea (por exemplo, P. citrea), Pseudomonas e Klebsiella (por exemplo K. oxytocá). (Consultar, por exemplo, os documentos n2 USP 5.028.539, USP 5.424.202 e WO 95/13362). Bacillus é um microrganismo de fermentação preferencial. O microrganismo de fermentação usado na etapa de fermentação dependerá do produto final a ser produzido.
[0350] O microrganismo que produz etanol pode ser um microrganismo fúngico, tal como Trichoderma, uma levedura e, especificamente,
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Saccharomyces, tais como cepas de S. cerevisiae (USP 4.316.956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e inclui, porém sem limitação, FALI (Levedura de Fleischmann), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), (Ethanol Red, Fermentis, França), (SYNERXIA® Thrive, Dupont), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China).
[0351] Por exemplo, quando o ácido láctico é o produto final desejado, um Lactobacillus sp. (L casei) pode ser usado; quando glicerol ou
1,3-propanodiol são produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e quando 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-Lgulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o microrganismo de fermentação. A lista enumerada acima são apenas exemplos e uma pessoa versada na técnica estará ciente de vários microrganismos de fermentação que podem ser apropriadamente usados para obter um produto final desejado.
[0352] O produto final pode ser separado e/ou purificado a partir do meio de fermentação. Os métodos para separação e purificação são conhecidos, por exemplo, submetendo-se a mídia a extração, destilação e cromatografia de coluna. Em algumas modalidades, o produto final é identificado diretamente submetendo-se o meio à análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
[0353] A massa pode ser separada, por exemplo, por centrifugação na fase líquida e fase sólida e os produtos finais, tais como álcool e sólidos, recuperados. O álcool pode ser recuperado por meios, tais como destilação e desidratação por peneira molecular ou ultrafiltração. [0354] Em algumas modalidades, o uso de uma composição ou mescla de enzimas de acordo com a invenção em um método de produção de etanol resultará em um rendimento de etanol que é maior do que 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, e22% (v/v). [0355] Opcionalmente, após a fermentação, álcool (por exemplo,
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100/172 etanol) pode ser extraído, por exemplo, por destilação. Etanol pode ser usado para combustível, etanol portátil ou industrial.
[0356] Em outra modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
(a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c).
[0357] Em ainda outro aspecto, esse método pode ser conduzido em que as etapas (b) e (c) são realizados sequencial ou simultaneamente.
[0358] Surpreendentemente, foi revelado surpreendente e inesperadamente que, quando uma serina protease termoestável, tal como ME-3, está presente durante a etapa de fermentar materiais que contêm amido, a necessidade de adicionar uma fonte de nitrogênio durante o processo de sacarificação ou SSF é reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou completamente eliminada (100% de redução). Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente, a adição de uma fonte de nitrogênio (tal como, porém sem limitação) ureia ou amônia é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g de serina protease termoestável/tonelada métrica (MT) de material que contém amido, em que a dita serina protease termoestável que tem pelo
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101/172 menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 é usada. Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente, a adição de uma fonte de nitrogênio (tal como, porém sem limitação) ureia ou amônia é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 3, 4, 5 ou 6 g de serina protease termoestável/MT de material sólido seco, em que a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 é usada. Acredita-se que, quando as etapas (b) e (c) são realizadas sequencialmente, uma redução ou eliminação similar de uma fonte de nitrogênio na etapa (b) pode ser observada.
[0359] Quando as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente, a adição de uma fonte de nitrogênio, tal como, porém sem limitação, ureia ou amônia é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g de serina protease termoestável/MT de material que contém amido, em que a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 é usada e, ademais, quando o produto de fermentação é etanol, então, nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária na etapa (c).
[0360] Conforme descrito no presente documento, o uso de uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID
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NOs: 3, 8 ou 10 em um método para produzir produtos de fermentação a partir de material que contém amido pode levar a benefícios adicionais, tais como um nível aumentado de proteína bruta, um nível aumentado de gordura hidrolisada com ácido, um nível diminuído de glicerol (formação de glicerol mais baixa), uma taxa de produção de etanol mais rápida e um rendimento de etanol aumentado. Um nível aumentado de gordura hidrolisada é indicativo de recuperação de óleo aumentada. Glicerol é um subproduto de baixo valor da fermentação que usa alguma parte do carbono disponível. A redução de glicerol indica o uso mais eficaz do carbono e um nível de glicerol reduzido indica menos estresse na levedura. Ademais, qualquer redução na produção de glicerol permite que o carbono flua para produtos de valor superior, tais como etanol, e pode levar à viscosidade reduzida.
[0361] Em uma modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
(a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c), em que a gordura hidrolisada com ácido dos materiais obtidos no final da fermentação é aumentada, em comparação aos materiais obtidos no final de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8
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103/172 ou 10.
[0362] Em uma modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
(a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c), em que o produto de fermentação (tal como, porém sem limitação, etanol) é produzido a uma taxa mais rápida, em comparação a materiais obtidos no final de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0363] Em uma modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
(a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c),
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104/172 em que o rendimento de produto de fermentação (tal como, porém sem limitação, etanol) é mais alto, em comparação ao rendimento de produto de fermentação de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0364] Em uma modalidade, é revelado um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
(a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c), em que os níveis de glicerol dos materiais obtidos no final da fermentação são diminuídos, em comparação aos materiais obtidos no final de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0365] Os produtos de fermentação contemplados adiante podem incluir álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol; polióis, tais como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgânicos, tais como, ácido cítrico,
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105/172 ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucônico e similares; antibióticos, tais como, penicilina e tetraciclina; enzimas, vitaminas e hormônios.
[0366] Em outra modalidade, o produto de fermentação pode ser etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol para beber, tal como álcool neutro potável; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria de álcool consumível, tal como cerveja e vinho, indústria de laticínios (por exemplo, laticínios fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. Os tipos de cerveja podem compreender cervejas do tipo Ale, cervejas do tipo Stout, cervejas do tipo Porter, cervejas do tipo Lager, amargas, licores de malte, happoushu, cerveja com alto teor alcoólico, cerveja com baixo teor alcoólico, cerveja com baixo teor calórico ou cerveja light. Quando etanol é o produto de fermentação, o mesmo pode ser usado como um combustível, que é tipicamente mesclado com gasolina.
[0367] O processamento de amido em glicose geralmente consiste em duas etapas, e essas etapas incluem a liquefação do amido e a sacarificação do amido liquefeito. As etapas adicionais podem incluir (a) purificação e isomerização quando o produto final desejado é uma dextrose ou frutose purificada ou (b) fermentação e destilação quando o produto final desejado é, por exemplo, um álcool (por exemplo, etanol). [0368] Um objetivo do processo de liquefação de amido é converter uma pasta fluida de grânulos de polímero de amido em uma solução de dextrinas de comprimento de cadeia mais curta de baixa viscosidade. Isso é uma etapa importante para a manipulação conveniente do equipamento industrial usado nos processos de conversão de amido. Comumente, o amido é liquefeito pelo uso de bioconversão enzimática e de alta temperatura. Por exemplo, um processo de liquefação enzimática comum envolve adicionar uma alfa amilase bacteriana termoestável (por exemplo, SPEZYME® PRIME e SPEZYME® FRED, SPEZYME®
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ETHYL, SPEZYME® RSL, SPEZYME® CL, SPEZYME® HT-WB junto à Danlsco U.S., Inc, Genencor Division ou TERMAMYL SC, TERMAMYL SUPRA ou TERMANYL 120L junto à Novozymes) a uma pasta fluida que compreende um substrato incluindo amido e ajustar o pH a entre
5,5 a 6,5 e a temperatura a mais do que 90°C. SPEZYME® RSL , SPEZYME® CL e SPEZYME® HT-WB podem ser adicionados a uma dose comercial relevante que varia de pelo menos 0,05 a 5 kg/tonelada métrica (MT) de material que contém amido, tal como pelo menos cerca de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 kg/tonelada métrica (MT) ou qualquer dose entre as mesmas. O amido é liquefeito e, então, submetido a enzimas de sacarificação. Tipicamente, a sacarificação (no caso do processamento de carboidrato) ocorre na presença de enzimas glicoamilase, tais como glicoamilase de Aspergillus niger (por exemplo, OPTIDEX L-400, DISTILLASE® SSF, DISTILLASE® CS, Spirizyme Fuel, Spirizyme Achieve) a um pH mais ácido do que o pH da etapa de llquefação.
[0369] Após a fermentação ou SSF, o produto de fermentação pode ser separado do meio de fermentação. A massa (pasta fluida) pode ser destilada para extrair o produto de fermentação desejado, por exemplo, etanol. Alternativamente, os produtos hortifruticolas de fermentação desejados podem ser extraídos do meio por técnicas de filtragem por micro ou membrana. O produto de fermentação pode também ser recuperado por extração ou outro método bem conhecido na técnica.
[0370] A produção de açúcares fermentáveis da biomassa lignocelulósica exige que a biomassa seja tratada para liberar açúcares, tais como glicose, xilose e arabinose dos polissacarídeos da biomassa. A biomassa lignocelulósica pode ser tratada por qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica para produzir açúcares fermentáveis em um hidrolisado. A biomassa pode ser pré-tratada com o uso de tratamento físicos, térmicos ou químicos ou uma combinação dos
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107/172 mesmos e enzimaticamente sacarificada. Os métodos de pré-tratamento termoquímicos incluem explosão de vapor ou métodos para dilatar a bíomassa para liberar açúcares (consultar, por exemplo, os documentos n2 WO2010113129; WO2010113130, ambos os quais são incorporados a título de referência). Sacarificação química pode também ser usada. Tratamentos físicos podem ser usados para a redução de tamanho de partícula antes do tratamento químico adicional. Os tratamentos químicos incluem tratamento com base, tal como com base forte (amônia ou NaOH), 5 ou tratamento ácido (documentos n2 US8545633, WO2012103220, incorporados a título de referência).
[0371] Por exemplo, a biomassa pode ser pré-tratada com amônia (documentos n2 US 20080008783, US 7932063, US7781191, US 7998713, US7915017, todos os quais são incorporados a título de referência).
[0372] Esses tratamentos liberam açúcares poliméricos da biomassa. O pré-tratamento pode ser um pré-tratamento com baixo teor de amônia em que a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa em que a concentração de amônia é suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa-amônia aquosa, mas é menor do que cerca de 12 por cento em peso em relação ao peso seco da biomassa. Nas modalidades, o peso seco da biomassa é pelo menos cerca de 15 por cento em peso de sólidos em relação ao peso da mistura de biomassa-amônia aquosa, conforme revelado na Patente US número 7.932.063, que está incorporada ao presente documento a título de referência.
[0373] A sacarificação, que converte açúcares poliméricos em açúcares monoméricos, pode ser por tratamentos enzimáticos ou químicos. A biomassa pré-tratada é colocada em contato com um consórcio de
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108/172 enzima de sacarificaçâo sob condições adequadas para produzir um hidrolisado de biomassa lignocelulósica que compreende açúcares fermentáveis. Antes da sacarificaçâo, a biomassa pré-tratada pode ser colocada ao teor de umidade desejado e tratada para alterar o pH, composição ou temperatura de modo que as enzimas do consórcio de enzimas de sacarificaçâo sejam ativas.
[0374] O pH pode ser alterado através da adição de ácidos em forma sólida ou líquida. Alternativamente, dióxido de carbono (CO2), que pode ser recuperado da fermentação, pode ser utilizado para reduzir o pH. Por exemplo, CO2 pode ser coletado de um fermentador e fornecido ao espaço livre de produto de pré-tratamento no tanque de vaporização ou borbulhado através da biomassa pré-tratada se o líquido adequado estiver presente durante o monitoramento do pH, até o pH desejado ser alcançado. A temperatura é colocada a uma temperatura que é compatível com a atividade de enzima de sacarificaçâo, conforme notado abaixo. Tipicamente, as condições adequadas podem incluir temperatura de cerca de 40°C a cerca de 50°C e pH entre cerca de 4,8 a cerca de 5,8.
[0375] A sacarificaçâo enzimática de biomassa celulósica ou lignocelulósica tipicamente faz uso de uma composição ou mescla enzimática para quebrar a celulose e/ou hemicelulose e produzir um hidrolisado contendo açúcares, tais como, por exemplo, glicose, xilose e arabinose. As enzimas de sacarificaçâo são revisadas em Lynd, L. R., etal. (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66:506 a 577, 2002).
[0376] Uma mescla de enzima de sacarificaçâo pode ser usada que incluem uma ou mais glicosidases. As glicosidases hidrolisam as ligações de éter de di, oligo e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimas EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com o Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995, Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [em
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Eur. J. Biochem., 223:1 w 5, 1994; Eur. J. Biochem., 232:1 w 6, 1995; Eur. J. Biochem., 237:1 w5, 1996; Eur. J. Biochem., 250:1 w6, 1997; e Eur. 15 J. Biochem., 264:610 a 650 1999, respectivamente]) do grupo geral hidrolases [0377] (EC 3.). As glicosidases úteis na sacarificaçâo podem ser categorizadas pelos componentes de biomassa que as mesmas hidrolisam. As glicosidases úteis na sacarificaçâo podem incluir glicosidases que hidrolisam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobio-hidrolases, b-glicosidases), glicosidases que hidrolisam hemicelulose (por exemplo, xllanases, endoxilanases, exoxilanases, b~xilosidases, arabino-xilanases, manases, galactases, pectinases, glicuronidases) e glicosidases que hidrolisam amido (por exemplo, amilases, a-amilases, b-amilases, glicoamilases, a-glucosidases, isoamilases). Adicionalmente, pode ser útil adicionar outras atividades ao consórcio de enzimas de sacarificaçâo, tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC3.1.1 .x e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1 .x) ou feruloil esterases (EC 3.1.1.73) para promover a liberação de polissacarídeos de outros componentes da biomassa. É conhecido na técnica que microrganlsmos que produzem enzimas que hidrolisam polissacarídeo frequentemente exibem uma atividade, tal como uma capacidade para degradar celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou um grupo de enzimas que têm diferentes especificidades de substrato. Assim, uma celulase de um microrganismo pode compreender um grupo de enzimas, uma ou mais ou todas as quais podem contribuir para a atividade de degradação de celulose.
[0378] As preparações de enzima disponíveis comercialmente ou não, tais como celulase, podem compreender inúmeras enzimas dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Muitas enzimas glicosil hidrolase e composições das mesmas que são úteis para sacarificaçâo sâo reveladas nos documentos n--- WO 2011/038019
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110/172 ou WO 2012/125937, incorporados ao presente documento a título de referência. As enzimas adicionais para sacarificação incluem, por exemplo, glicosil hidrolases que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre uma porção química carboidrato e uma não carboidrato.
[0379] As enzimas adequadas podem incluir enzimas de famílias de Glicosídeo hidroiase, tais como as famílias GH3, GH5, GH 6, GH 7, GH10, GH11, GH39, GH43, GH51 e GH 61. GHs são um grupo de enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre uma porção química carboidrato e uma não carboidrato. As famílias de GHs foram classificadas com base na similaridade de sequência e estão disponíveis n banco de dados de enzimas Ativas em Carboidrato (CAZy) (Cantarei et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37 (Database issue):D233-238).
[0380] Essas enzimas têm a capacidade de atuar em vários substratos e são eficazes no processo de sacarificação. As enzimas da família de Glicosídeo hidroiase 3 (GH3) têm várias atividades conhecidas: b-glicosidase (EC:3.2.1.21); b-xilosidase (EC:3.2.1.37); N-aceil bglicosaminidase (EC:3.2.1.52); glucan b-1,3-glicosidase (EC:3.2.1.58); celodextrinase (EC:3.2.1.74); exo-1,3-1,4-glicanase (EC:3.2.1); e b~ga~ lactosidase (EC 3.2.1.23). As enzimas da família Glicosídeo hidroiase 39 (GH39) têm uma atividade de -L-iduronidase (EC:3.2.1.76) ou bxilosidase (EC:3.2.1.37).
[0381] As enzimas da família Glicosídeo hidroiase 43 (GH43) têm as seguintes atividades: L-25 a-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); bxilosidase (EC 3.2.1.37); endoarabinanase (EC 3.2.1.99); e galactan
1,3-b-galactosidase (EC 3.2.1.145). As enzimas da família Glicosídeo hidroiase 51 (GH51) têm atividade de L-a-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) ou endoglucanase (EC 3.2.1.4). A família Glicosídeo hidroiase
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111/172 (GH10) é descrita, por exemplo, em Schmidt et 30 a/., 1999, Biochemistry 38:2.403 a 2.412 e Lo Leggio et al., 2001, FEBS Lett 509: 303 a 308) e a família Glicosídeo hidrolase 11 (GH11) é mais completamente descrita em Hakouvainen et al., 1996, Biochemistry 35:9.617 a 9.624. As enzimas adequadas podem incluir as enzimas da família glicosídeo hidrolase 61 (GH61) que foram reclassificadas em Família de Atividade Auxiliar 9 (AA9; cazypedia.org) e podem ser denominadas enzimas GH61 no presente documento. Conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente nQ US2014/0106408, as enzimas adequadas podem incluir EG4 (tais como de Trichoderrna reesei e variantes do mesmo, conforme descrito, por exemplo, nos documentos n~ WO201517256A1, WO201517255A1, WO201517254A1, incorporados a título de referência), Fv3A, Fv51 A e/ou Fv43D (tais como de Fusarium vertlcilloides conforme descrito, por exemplo, no documento n~ US2014/016408, incorporado a título de referência). As enzimas adequadas podem incluir, por exemplo, as enzimas reveladas nas Publicações de Pedido PCT > W003/027306, W0200352118_A2, W0200352054_A2, W0200352057JK2, W0200352055_A2,
W0200352056..A2, W0200416760...A2, WO9210581...A1,
WO200448592_A2, W0200443980J\2, WO200528636_A2,
W0200501065__A2, W02005/001036, W02005/093050,
W0200593073..A1, W0200674005...A2, W02009/149202,
WO2011/038019, W02010/141779, WO2011/063308,
WO2012/125951, WO2012/125925, WO2012125937,
WO/2011/153276, WO2014/093275, WO2014/070837,
WO2014/070841, WO2014/070844, WO2014/093281,
WO2014/093282, WO2014/093287, WO2014/093294,
WO2015/084596 ou WO2016/069541, incorporadas ao presente documento a título de referência.
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112/172 [0382] As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente. Tais enzimas incluem, por exemplo, celulase SPEZYME® CP, xilanase Multifect®, Accelerase® 1500, Accellerase® DUET, Accellerase® TrioTM, ® CS (from DuPont), DISTILLASE® SSF e Novozyme188 (Novozymes). DISTILLASE® SSF pode ser dosada a uma dose relevante comercial de 0,06 a 0,08% em peso de enzima/peso como é o milho. A dose real exigida dependerá das condições da fermentação: tempo, pH inicial e os níveis de sólidos. A enzima DISTILLASE® CS pode ser adicionada a uma dose relevante comercial de 0,055 a 0,075% em p/p (amido, base sólida seca). Isso corresponde a um nível de 0,375 a 0,50 kg de DISTILLASE® CS/MT de grão ’tal como é'. Enzimas adicionais podem ser adicionadas, tais como, porém sem limitação, trealase. [0383] Adicionalmente, as enzimas de sacarificação podem ser fornecidas como preparações brutas de um extrato celular ou um caldo de célula inteira. As enzimas podem ser produzidas com o uso de microrganismos recombinantes que foram geneticamente modificados para expressar uma ou mais enzimas de sacarificação. Por exemplo, uma preparação de proteína H3A que pode ser usada para a sacarificação da biomassa lignocelulósica pré-tratada é uma preparação bruta de enzimas produzidas por uma cepa geneticamente modificada de Trichoderma reesei, que inclui uma combinação de celulases e hemicelulases e é descrita no documento n2 WO 2011/038019, que é incorporado ao presente documento a título de referência.
[0384] Será entendido que, nas modalidades em que o material de biomassa lignocelulósica pré-tratada é colocado em contato com uma enzima acetamidase, a enzima pode ser introduzida com ou separada do consórcio de enzimas de sacarificação.
[0385] Tratamentos de sacarificação química podem ser usados e são conhecidos por uma pessoa versada na técnica, tais como o tratamento com ácidos minerais incluindo HCI e H2SO4 (documentos n2
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US5580389, WO2011002660, incorporados a título de referência). Açúcares, tais como glicose, xilose e arabinose, são liberados pela sacaríficação da biomassa iignocelulósica e esses açúcares monoméricos fornecem uma fonte de carboidrato para um biocatalisador usado em um processo de fermentação. Os açúcares estão presentes em um hidrolisado de biomassa que é usado como o meio de fermentação. O meio de fermentação pode ser composto apenas de hidrolisado ou pode incluir componentes adicionais ao hidrolisado, tais como sorbitol ou manitol, a uma concentração final de cerca de 5 mM conforme descrito no documento n2 US 7.629.156, que é incorporado ao presente documento a título de referência. O hidrolisado de biomassa pode constituir pelo menos cerca de 50% do meio de fermentação. Nas modalidades, cerca de 10% do volume final do caldo de fermentação é inóculo de semente contendo o microrganismo de fermentação.
[0386] O meio de fermentação que compreende o hidrolisado de biomassa Iignocelulósica colocado em contato com um microrganismo de fermentação é fermentado em um vaso de fermentação, que é qualquer vaso que retenha o meio de fermentação e pelo menos um biocatalisador, e tem válvulas, respiros e/ou portas usados para gerenciar o processo de fermentação. Qualquer microrganismo que produz um produto-alvo que utiliza glicose e preferencialmente também xilose, ou naturalmente ou através de engenharia genética, pode ser usado para a fermentação dos açúcares fermentáveis no hidrolisado de biomassa lignocelulósica. Os produtos-alvo que podem ser produzidos por fermentação incluem, por exemplo, ácidos, álcoois, alcanos, alcenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Os álcoois Incluem, porém sem limitação, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol, manitol e sorbitol. Os ácidos podem incluir ácido acético, ácido fórmlco,
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114/172 ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido 3hidroxipropriônico, ácido fumárico, ácido mateico e ácido levulínico 5. Os aminoácidos podem incluir ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, iisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Os produtos-alvo adicionais incluem metano, etileno, acetona e enzimas industriais.
[0387] A fermentação de açucares no hidrolisado de biomassa lignoceluiósica em produtos-alvo pode ser executada por um ou mais microrganismos apropriados que têm a capacidade de crescer em meio contendo hidrolisado de biomassa, em fermentações de múltiplas etapas ou etapa única. Os microrganismos adequados podem ser selecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e levedura. Os microrganismos adequados podem ser microrganismos do tipo selvagem ou microrganismos recombinantes e podem incluir, por exemplo, organismos que pertencem aos gêneros de Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridiums. Os exemplos típicos de microrganismos adequados incluem Escherichia coll, Zymomonas mobilis, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Pichia stipitis recombinantes. Para crescer bem e ter alta produção de produto em um caldo de fermentação de hidrolisado de biomassa lignocelulósica, um microrganismo pode ser selecionado ou geneticamente modificado para ter tolerância mais alta a inibidores presentes no hidrolisado de biomassa, tal como acetato. Por exemplo, o biocatalisador pode produzir etanol como um produto-alvo, tal como a produção de etanol por Zymomonas mobilis ou produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae. As cepas de Zymomonas mobilis e Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas adequadas
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115/172 são conhecidas na técnica, por exemplo, conforme descrito nos documentos US 8.247.208 e US 8.669.076, ambos incorporados ao presente documento a título de referência.
[0388] A fermentação é executada com condições apropriadas para o microrganismo particular usado. Ajustes podem ser feitos para condições tais como pH, temperatura, teor de oxigênio e mistura. As condições para fermentação de levedura e biocatalisadores bacterianos são bem conhecidas na técnica. Adicionalmente, a sacarificação e fermentação podem ocorrer ao mesmo tempo no mesmo vaso, denominadas sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Adicionalmente, a sacarificação parcial pode ocorrer antes de um período de sacarificação e fermentação concomitantes em um processo chamado HSF (sacarificação e fermentação híbridas).
[0389] Para as fermentações em grande escala, tipicamente uma cultura menor (cultura de semente) do microrganismo de fermentação é primeiramente cultivada. A cultura de semente é adicionada ao meio de fermentação como um inóculo tipicamente na faixa de cerca de 2% a cerca de 20% do volume final. Tipicamente, a fermentação pelo microrganismo de fermentação produz um caldo de fermentação contendo o produto-alvo produzido pelo organismo. Por exemplo, em um processo de etanol, o caldo de fermentação pode ser uma cerveja contendo de cerca de 6% a cerca de 10% de etanol. Adicionalmente ao produto-alvo, o caldo de fermentação contém água, solutos, sólidos do meio de hidrolisado e do metabolismo de biocatalisador de açucares no meio de hidrolisado, assim como o próprio biocatalisador. O produto-alvo pode ser isolado do caldo de fermentação produzindo um caldo esgotado, que pode ser chamado de vinhaça integral. Por exemplo, quando etanol é o produto, o caldo é destilado, tipicamente com o uso de uma coluna de cerveja, para gerar uma corrente de produto de etanol e uma vinhaça integral. A destilação pode ser usando quaisquer condições conhecidas
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116/172 por uma pessoa versada na técnica incluindo à pressão atmosférica ou reduzida. O etanol destilado é adicionalmente passado através de uma coluna de retificação e peneira molecular para recuperar um produto de etanol.
[0390] O produto-alvo pode ser alternativamente removido em uma etapa posterior, tal como de uma fração sólida ou líquida após a separação do caldo de fermentação.
[0391] É possível adicionar uma alfa-amilase durante a liquefação juntamente com a serina protease termoestável descrita no presente documento. Opcionalmente, uma enzima que gera uma fonte de carboidrato, tal como uma glicoamilase, e/ou opcionalmente uma pululanase. Qualquer alfa-amilase pode ser usada.
[0392] Alfa-amilases e pululanases são descritas acima.
[0393] A biomassa para a produção de bioetanol de segunda geração precisa de pré-tratamento antes da submissão à hidrólise de enzima para produzir açúcar fermentável. A biomassa é usualmente pré-tratada a temperaturas mais altas do que 100 °C sob condições alcalinas ou ácidas (DUNSON eía/., TREATMENT OF BIOMASS TO OBTAIN FERMENTABLE SUGARS. W02006110901 (A2) — 19/10/2006).
[0394] Proteases termoestáveis e termoativas como as serina proteases termoestáveis descritas no presente documento podem ser usadas em tais processos para hídrolisar qualquer proteína presente na biomassa, para fornecer um etanologênio com aminoácidos e nutrientes de peptídeo e para reduzir a viscosidade da pasta fluida de biomassa. A biomassa pré-tratada sob condições alcalinas, tal como com amônio diluído (W02006110901), é especialmente adequada para hidrólise com as ditas serina proteases termoestáveis devido a seu alto pH.
[0395] Assim, em ainda outro aspecto, é revelado um método para hídrolisar proteínas em biomassa lignocelulósica que compreende (a) colocar a biomassa em contato com um líquido; e
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117/172 (b) hidrolisar as proteínas na biomassa colocando-se a biomassa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0396] Em outra modalidade, é revelado um método para reduzir viscosidade de um material que contém amido liquefeito que compreende colocar uma pasta fluida de material que contém amido em contato com uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0397] Em outra modalidade, é revelado um método para extrair óleo de uma cultura de semente oleaginosa que compreende:
(a) colocar uma fração de semente oleaginosa que contém óleo em contato com um agente de extração aquoso para formar uma fração de semente oleaginosa de extrato; e (b) separar a fração de semente oleaginosa extraída em uma fase aquosa, uma emulsão de óleo em água e uma fase insolúvel;
(c) colocar a emulsão de óleo em água em contato com pelo menos uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, sozinha ou em combinação com uma fosfolipase, sob condições que permitem a atividade enzimática durante tempo suficiente para desestabilizar a emulsão; e (d) separar a emulsão desestabilizante da etapa (c) em uma fase aquosa, uma fase oleosa e uma fase insolúvel para obter óleo a partir da semente oleaginosa.
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118/172 [0398] Ademais, a fração de semente oleaginosa pode ser de soja, semente de milho, semente de colza, caroço de palma, semente de girassol, semente de açafrão, coco, amendoim, semente de algodão, semente de gergelim, semente de linhaça, semente de papoila, amêndoa, avelã, noz, semente de prímula, semente de uva, semente de cânhamo, semente de groselha negra, semente de framboesa vermelha, semente de cenoura, semente de cominho, semente de mirtilo, semente de oxicoco, semente de salsa, semente de cebola, semente de abóbora, semente de abricó, semente de mostarda, semente de linho, semente de mamona ou jatrofa.
[0399] A fração de semente oleaginosa pode compreender uma fração de proteína que é útil como um alimento, ingrediente alimentar, um aditivo alimentar ou suplemento alimentar.
[0400] Claramente, o óleo derivado de planta pode ser preparado com o uso do processo descrito no presente documento.
[0401] Adicionalmente, uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão pode compreender o óleo descrito no presente documento.
[0402] Os lipídios derivados de planta, particularmente óleos, são uma fonte principal de lipídios para o processamento de alimentos e para alimento industrial para animais. Mais recentemente, os mesmos são de interesse e uso como alternativas para produtos petroquímicos para combustíveis. Os lipídios vegetais podem ser derivados de uma ou mais partes de uma planta, arbusto ou árvore. Em várias plantas, a raiz, caule, cortiça, folhas, flores, sementes, frutas ou outras partes podem servir como uma fonte de óleo. Tais lipídios podem ser extraídos mecanicamente, por exemplo, através da aplicação de pressão externa, ou quimicamente, por exemplo, através de processos de extração com solvente aquoso ou orgânico ou processos de combinação.
[0403] Os óleos obtidos a partir de plantas de semente oleaginosa
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119/172 são conhecidos por seus usos em aiimento e produtos alimentícios, assim como para sabões, detergentes, loções, lubrificantes, inseticidas, pinturas, revestimentos, tintas e outros produtos de consumo ou industriais. Embora a vasta maioria de óleos de sementes oleaginosas seja extraída com um processo de extração com solvente orgânico, alguns são agora extraídos através de extração aquosa.
[0404] Processos aquosos para extrair óleos de sementes oleaginosas têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Consultar Freitas et at., Fett/Lipid99: 333 a 337, 1997: e Caetano et al., La Rivista Italiana Delle Sostanze Grasse 79: 165 a 169, 2002. Tanto Freitas etal. Quanto Caetano et al. Fornecem uma combinação de extrusão e tratamento com protease para extrair óleos em processos aquosos. As etapas do processo aquoso são inerentemente mais seguras do que as etapas de extração com solvente orgânico e, consequentemente, o investimento de arranque inicial no equipamento capital é substancialmente menos para processos de extração aquosa.
[0405] Conforme usado no presente documento, uma emulsão compreende um sistema pelo menos temporariamente estável que compreende uma mistura física de pelo menos dois materiais, não completamente miscíveis ou solúveis um ao outro. As emulsões preferenciais, conforme usado no presente documento, não se separam prontamente quando as mesmas são deixadas em repouso não perturbadas e podem permanecer misturadas por períodos de tempo consideráveis. As mesmas permanecerão preferencialmente estáveis por períodos de tempo prolongados, tais como mais do que cerca de 1,2, 4, 8, 12 ou 24 horas ou até mesmo mais.
[0406] Embora os sistemas de emulsão possam compreender sólidos, líquidos e gases, preferencialmente, as emulsões para uso no presente documento compreendem pelo menos uma fase de lipídio e uma fase aquosa, ambas as quais estão no estado líquido. Uma fase em uma
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120/172 emulsão é contínua, ao mesmo tempo que a outra fase é dispersa e, assim, descontínua à outra. Por exemplo, uma emulsão de “óleo em água tem uma fase descontínua de óleo dispersa em uma fase aquosa contínua, ao mesmo tempo que uma emulsão de “água em óleo tem uma fase aquosa descontínua dispersa em uma fase de lipídio ou óleo contínua. Em um sentido prático, a fase descontínua consiste em pequenas gotículas dispersas em e contidas dentro da outra fase. A fase descontínua é, assim, algumas vezes chamada de fase interna e, por analogia, a fase contínua é algumas vezes chamada de fase externa. Sob determinadas circunstâncias, uma emulsão pode inverter, isto é, as fases contínuas e descontínuas podem mudar de papéis, por exemplo, uma emulsão de óleo em água torna-se uma emulsão de água em óleo ou vice-versa.
[0407] Os termos “óleo em água e “água em óleo conforme usado no presente documento são apenas descritivos para ajudar a entender qual das fases é contínua e qual é dispersa em um determinado sistema de emulsão; esses termos não se destinam a limitar a emulsão literalmente a óleo e água. A “água ou fase aquosa pode conter um ou mais solutos, tais como sais, e qualquer número de outros compostos solúveis ou parcialmente solúveis. Similarmente, o óleo ou fase lipídica pode conter uma ampla variedade de lipídios ou compostos solúveis em lipídio.
[0408] Conforme usado no presente documento, óleo denota qualquer uma dentre um grupo de gorduras (ou lipídios) que permaneça líquida à temperatura ambiente. Óleo vegetal conforme usado no presente documento denota quaisquer tais óleos que são obtidos de qualquer tecido de uma planta. Óleos vegetais são também denominados no presente documento alternativamente como “óleos derivados de planta. Em certas modalidades, óleos vegetais são comestíveis, ao
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121/172 mesmo tempo que, em outras modalidades, os mesmos não são necessariamente comestíveis. Alguns óleos podem ser apropriada e seguramente usados para aplicação externa a um animal, tal como um ser humano, ao mesmo tempo que outros óleos podem ser completamente não comestíveis e também não seguros para uso externo em um animal. Tais óleos podem, todavia, ser valiosos para uso em processo industrial, como lubrificantes, produtos de limpeza ou polimento ou simplesmente como alimento para animais para produzir outras composições ou produtos que exigem um lipídio como uma matéria-prima. Por exemplo, alguns lipídios são úteis como combustíveis ou suplementos de combustível. Há interesse presentemente significativo em fontes biológicas ou renováveis de combustíveis, tais como combustíveis inflamáveis, por exemplo, lipídios para uso em biodiesel.
[0409] Semente oleaginosa conforme usado no presente documento refere-se a qualquer semente contendo óleo, noz, miolo ou similares produzidos por uma planta. Todas tais plantas, assim como suas sementes, nozes ou miolos, são contempladas para uso no presente documento. Por exemplo, o National Sustainable Agriculture Information Service lista os seguintes como fontes de óleo para usos alimentícios, especiais ou industriais: amêndoas, semente de abricó, abacate, semente de faia, uva-do-monte, groselha negra, borragem, castanha do pará, calendula, semente de alcarávia, castanha de caju, semente de mamona, semente de frutas cítricas, cravo-da-índia, cacau, café, copra (coco seco), coentro, semente de coco, semente de algodão, fruto do sabugueiro, prímula, semente de uva, amendoim, avelã, semente de cânhamo, jojoba, semente de linho, noz de macadâmia, macis, semente de melão, semente de mostarda, semente de nim, semente de níger, noz moscada, caroço de palma, maracujá, noz-pecã, pistache, semente de papoila, semente de abóbora, semente de colza, semente de framboesa, pimenta vermelha, cinorródio, semente de borracha, semente de
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122/172 cártamo, espinheiro marítimo, semente de gergelim, soja, eufórbio, urtiga, semente de girassol, planta tropho, semente de tomate ou noz. São também úteis no presente documento várias plantas relacionadas e de semente oleaginosa cujo teor de óleo é de interesse para uso como combustível, tal como combustível ecológico, biodiesel ou similares. Tais plantas incluem, porém sem limitação, jatrofa (por exemplo Jatropha curcas, J. mahafalensis e cultivares dos mesmos); Elaeis guineensis (por exemplo, Palma de óleo), Aleurites fordii (árvore de óleo de fungue ou árvore de óleo de madeira), Ricinus communis (árvore de mamona), Copaifera langsdorfii (copaiba), e Pongammia pinnata (árvore de óleo Honge ou árvore Pongam e cultivares das mesmas).
[0410] Uma fração contendo óleo ou fração contendo lipídio conforme usado no presente documento refere-se à semente oleaginosa ou alguma porção ou parte da mesma, entretanto, obtida. Em modalidades preferenciais, a fração contendo óleo compreenderá todo ou pelo menos uma maior parte do óleo (ou gordura ou teor de lipídios) da semente oleaginosa. Em outras modalidades, uma etapa antes do processamento pode remover pelo menos alguma parte ou até mesmo a maior parte do óleo da semente oleaginosa antes da obtenção da fração. Assim, por exemplo, em certas modalidades, com o uso de soja como a fonte de semente oleaginosa, a fração compreende farinha de soja ou flocos de soja. Preferencialmente, a farinha ou flocos obtidos são graxos como esse termo é entendido na técnica. Entretanto, isso não exclui o uso dos processos fornecidos no presente documento com, por exemplo, frações parcialmente desengorduradas, tais como farinha de soja ou flocos de soja. Fatores econômicos podem fornecer motivação comercial para usar frações contendo pelo menos uma maior parte da gordura, entretanto, não há nenhuma barreira técnica para usar as frações de processos reveladas que compreendem menos do que uma maior parte da gordura da semente oleaginosa inteira.
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123/172 [0411] Para certas modalidades, a fração contendo óleo é uma fonte principal do óleo alimentício ou Industrial. Presentemente, soja, semente de milho, semente de algodão e semente de colza, assim como semente de girassol, cártamo, semente de linho e amendoim são preferenciais como fontes de óleos alimentícios.
[0412] Conforme usado no presente documento, um solvente aquoso compreende pelo menos água. Os solventes aquosos tipicamente compreendem outros componentes, tais como sais, compostos de tamponamento, moléculas pequenas e mais. Qualquer número e concentração de componentes adicionais pode estar presente desde que o solvente aquoso seja uma solução ou suspensão substancialmente homogênea em água. Esse solvente aquoso, com os componentes adicionais como uma solução ou suspensão substancialmente homogênea, é algumas vezes denominado no presente documento extratante aquoso por conveniência e para distinguir o mesmo do solvente por si, por exemplo, água. Os dois termos são sinônimos conforme definido no presente documento. Preferencialmente, todos os componentes presentes estão em solução verdadeira no extratante aquoso ou solvente aquoso. Um solvente aquoso é distinguido de um solvente orgânico em que, em vez de água como o solvente, o termo solvente orgânico refere-se à maioria dos outros solventes que são compostos orgânicos e contêm átomos de carbono. Os solventes orgânicos são mais voláteis e potencialmente explosivos do que os solventes aquosos. Tipicamente, a extração de solvente orgânico de óleos refere-se a qualquer processo usado para remover um óleo de sementes oleaginosas através do contato direto com um solvente orgânico, tal como n-hexano ou outros hexanos.
[0413] Conforme observado acima, os métodos ou processos são fornecidos para desestabilizar uma emulsão que compreende uma fase oleosa e uma fase aquosa. A emulsão é derivada de, ou produzida em,
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124/172 uma extração com solvente aquoso de um lipidio de uma semente oleaginosa. A emulsão é colocada em contato com pelo menos uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, sozinha ou em combinação com uma fosfolipase, sob condições que permitem a atividade enzimática durante tempo suficiente para desestabilizar a emulsão.
[0414] Em outro aspecto, a serina protease termoestável pode ser usada em combinações com pelo menos uma fosfolipase. Embora tais atividades enzimáticas de qualquer fonte, tal como animal, vegetal ou microbiana, sejam contempladas para uso no presente documento, a atividade enzimática compreende preferencialmente uma atividade de fosfolipase de um pâncreas de mamífero, Streptamyces violaceoruber, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Em uma modalidade, a atividade de fosfolipase é de pâncreas porcino.
[0415] A fase aquosa é uma fase contínua e a fase oleosa pode ser uma descontínua, isto é, a emulsão é uma emulsão de óleo em água.
[0416] Os processos para separar óleo das fases aquosas são conhecidos na técnica. Frequentemente, os mesmos envolvem gravidade ou, mais preferencialmente, forças em excesso da gravidade, por exemplo, forças aplicadas através de meios físicos, tais como centrifugação. Em uma modalidade, as emulsões são centrifugadas em um processo em batelada. Em várias modalidades, as condições para separação podem incluir ajustar a emulsão após o tratamento com enzima a uma temperatura preferencial, por exemplo, por aquecimento. Em outra modalidade, a centrifugação contínua é preferencial para separar o óleo da fase aquosa. Os processos contínuos podem ser preferenciais em rela
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125/172 ção a operações em grande escala e são bem adequados para manipular material pelo vaso completo, por exemplo, de silos, tanques, depósitos ou similares, ou até mesmo em séries conectadas de tais vasos. [0417] Esse processo pode aprimorar o rendimento de óleo da emulsão. A pessoa versada na técnica saberá como monitorar o rendimento em uma variedade de bases. Geralmente, as comparações de rendimento são feitas comparando-se, por exemplo, o rendimento de óleo (por exemplo, em uma % de rendimento máximo teórico com base no teor de óleo da emulsão não tratada) com o uso dos processos revelados no presente documento ao rendimento de uma extração aquosa que não usa a etapa de colocar a emulsão em contato com a atividade enzimática. Outras bases de rendimento podem ser usadas, por exemplo, uma melhora da recuperação de óleo com o uso dos processos revelados no presente documento versus um processo de controle.
[0418] A emulsão pode ser colocada em contato com pelo menos uma atividade enzimática que compreende pelo menos uma atividade de serina protease termoestável conforme descrito no presente documento ou sozinha ou em combinação com uma fosfolipase. Embora tais atividades enzimáticas de qualquer fonte, tal como animal, vegetal ou microbiana, sejam contempladas para uso no presente documento, a atividade enzimática compreende preferencialmente uma atividade de fosfolipase de um pâncreas de mamífero, Streptomyces violaceoruber, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Em uma modalidade, a atividade de fosfolipase é de pâncreas porcino.
[0419] Várias atividades de fosfolipase provaram ser úteis para desestabilizar emulsão em conformidade com os processos revelados no presente documento. As fosfolipases para os propósitos no presente documento incluem, porém sem limitação, fosfolipases A (incluindo A1 e A2), B (também denominada algumas vezes lisofosfolipase), C e D. As fosfolipases são uma classe de enzimas que hidrolisam fosfolipídios,
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126/172 tais como fosfatidHcoiina ou fosfatidiietanolamina. Dentro da classe de enzimas fosfolipase estão cinco subclasses principais, A1, A2, B, C e D fosfolipases.
[0420] A1 fosfolipases (E.C. 3.1.1.32) hidrolisam preferencialmente as ligações de éster sn1 dos fosfolipídios, tais como fosfatidHcoiina ou fosfatidiietanolamina, para render 1 -lisofosfolipídios mais ácidos carboxílicos. Tipicamente, as A1 fosfolipases exigem cálcio como um cofator. A1 fosfolipases geralmente exibem especificidade mais ampla do que as A2 fosfolipases.
[0421] A2 fosfolipases (E.C. 3.1.1.4) hidrolisam preferencialmente as ligações de éster sn2 dos fosfolipídios, tais como fosfatidHcoiina ou fosfatidiietanolamina, para render 2-lisofosfolipídios mais ácidos carboxílicos. Adicionalmente aos fosfolipídios, A2 fosfolipases mostram alguma especificidade para hidrólise de derivados de colina e fosfatídeos. Tipicamente, as A2 fosfolipases exigem cálcio como um cofator.
[0422] B fosfolipases (E.C. 3.1.1.5) são também conhecidas como lisofosfolipases. As mesmas hidrolisam preferencialmente as ligações de éster sn1 de 2-lisofosfolipídios para render glicerofosfatídeos mais ácidos carboxílicos. B fosfolipases também hidrolisarão as ligações de éster sn2 de 1-lisofosfolipídios.
[0423] C fosfolipases (E.C. 3.1.4.3) hidrolisam preferencialmente as ligações de fosfato dos fosfolipídios, tais como fosfatidilcolína ou fosfatidiletanolamina, para render os diacilgliceróis e fosfatos de colina correspondentes. Adicionalmente à hidrólise de fosfolipídios, C fosfolipases também atuarão em lisofosfolipídios.
[0424] D fosfolipases (E.C. 3.1.4.4) hidrolisam preferencialmente a ligação de fosfato dos fosfolipídios, tais como fosfatidHcoiina ou fosfatidiletanolamina, para render os ácidos fosfatídicos e colina correspondentes. Adicionalmente à hidrólise de fosfolipídios, D fosfolipases também atuarão em lisofosfolipídios.
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127 /172 [0425] As fosfolipases podem ser usadas individualmente ou em combinação ou misturas de uma ou mais atividades de classificações E.C. Iguais ou diferentes e de fontes iguais ou diferentes. Preparações de enzima brutas ou parcialmente purificadas contendo uma ou mais atividades de fosfolipase são adequadas para uso em algumas modalidades no presente documento. As fontes comerciais de fosfolipases são também adequadas para uso no presente documento. Por exemplo, a Genencor-A Danisco Division (Rochester, NY) oferece as fosfolipases lisoMax® e G-ZYME® G999, de fontes bacteriana e fúngica, respectivamente. A fosfolipase C está comercialmente disponível, por exemplo, junto à Sigma (St. Louis, MO).
[0426] C fosfolipases (E.C. 3.1.4.3) hidrolisam preferencialmente as ligações de fosfato dos fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, para render os diacilgliceróis e fosfatos de colina correspondentes. Adicionalmente à hidrólise de fosfolipídios, C fosfolipases também atuarão em lisofosfolipídios.
[0427] D fosfolipases (E.C. 3.1.4.4) hidrolisam preferencialmente a ligação de fosfato dos fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, para render os ácidos fosfatídicos e colina correspondentes. Adicionalmente à hidrólise de fosfolipídios, D fosfolipases também atuarão em lisofosfolipídios.
[0428] A fração de semente oleaginosa contendo óleo compreende células e o processo compreende adicionalmente a etapa de rompimento das células antes do contato da fração de semente oleaginosa com um extratante aquoso. Os métodos presentemente preferenciais de romper células incluem a aplicação de força mecânica. A extrusão é um método conveniente de romper células em sementes contendo óleo. Tal uso de extrusoras é conhecido na técnica, por exemplo, extrusoras de rosca única e de rosca dupla são, portanto, úteis. A pessoa versada
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128/172 na técnica pode determinar prontamente os parâmetros para romper células em sementes oleaginosas medindo-se a recuperação ou rendimento de óleo, enquanto varia os parâmetros de extrusão, tais como velocidade, tempo de trânsito, pressão, temperatura, pH e similares. Outros métodos para romper células incluem tratamento químico e/ou enzimático, adicionalmente aos métodos mecânicos adicionais, tais como pressionamento, rolamento, abrasâo, sonicação e outros.
[0429] A emulsão de óleo em água pode ser colocada em contato com a atividade enzimática que compreende peio menos uma serina protease termoestável ou sozinha ou em combinação com fosfolipase. [0430] Esse processo pode incluir uma etapa de centrifugação para uma ou ambas as etapas de separação. A pessoa versada na técnica entenderá o uso de centrifugação para separar fases de diferentes densidades, tais como as fases oleosa e aquosa presentes na emulsão do processo fornecido.
[0431] É possível ajustar o pH a entre cerca de 3,5 a cerca de 5 antes da etapa de separação. Tal ajuste pode ajudar a desestabilizar a emulsão em uma variedade de modos. Sem limitar o processo a qualquer teoria de operação, um ajuste de pH pode ajudar a precipitar uma ou mais proteínas, as ditas proteínas talvez envolvidas na estabilização da emulsão. Alternativamente, as mesmas minimizam a diferença de carga em grupos que retardam ou impedem a fase descontínua de coalescer ou agregar. Os ajustes de pH podem também funcionar permitindo-se que as enzimas funcionem melhor no processo de desestabilização - por exemplo, permitindo que a enzima e o substrato se associe mais rapidamente, melhorando a catálise real, ou ajudando o produto a difundir ou sair mais rapidamente do sítio ativo, acionando, assim, a conversão do substrato no produto.
[0432] O pH da emulsão de óleo em água pode ser ajustado entre cerca de 3,5 e cerca de 5. Há uma ampla variedade de métodos para
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129/172 afetar o ajuste de pH - incluindo, porém sem limitação, a adição de HCI, ou outros ácidos, incluindo ácidos orgânicos ou sais dos mesmos. Para usos alimentícios, tais ácidos são preferencialmente ingredientes alimentícios ou geralmente reconhecidos como seguros para uso em alimentos pelas entidades reguladoras apropriadas.
[0433] Em alguns casos, pelo menos uma atividade de fosfolipase ou uma atividade de protease no extratante aquoso separa com a emulsão de óleo em água na primeira etapa de separação. A enzima sobrevivente ou de cosseparação (fosfolipase ou protease) é algumas vezes referida no presente documento como atividade de transporte. A atividade de transporte está presente com a emulsão de óleo em água e desestabiliza essa emulsão quando fornecida com condições adequadas para atividade, por um tempo adequado. Tal processo de fornecer enzima suficiente inicialmente, então, empregar condições de processo adequadas para fornecer atividade de transporte na etapa posterior pode facilitar a recuperação de óleo permitindo-se a adição de uma etapa para bastar para o processo inteiro. A pessoa versada na técnica pode determinar prontamente se atividade enzimática suficiente foi transportada para a emulsão de óleo em água.
[0434] A fração de semente oleaginosa obtida pode ser de soja, semente de milho, semente de colza, caroço de palma, semente de girassol, semente de açafrão, coco, amendoim, semente de algodão, semente de gergelim, semente de linhaça, semente de papoila, amêndoa, avelã, noz, semente de prímula, semente de uva, semente de cânhamo, semente de groselha negra, semente de framboesa vermelha, semente de cenoura, semente de cominho, semente de mirtilo, semente de oxicoco, semente de salsa, semente de cebola, semente de abóbora, semente de abricó, semente de mostarda, semente de linho ou semente de mamona. Conforme discutido acima, várias espécies consideradas
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130/172 úteis ou potencialmente úteis para biodiesel e usos relacionados a combustível similares incluindo, por exemplo, jatrofa, palma de óleo, árvore de óleo de tungue ou óleo de madeira, árvore de mamona, copaiba e árvore de óleo honge e quaisquer cultivares de qualquer um dos anteriores são também contemplados para uso no presente documento. [0435] Em outro aspecto, a fração de semente oleaginosa compreende uma fração de proteína que é útil como um alimento, um ingrediente alimentar, um aditivo alimentar ou um suplemento alimentar. É algumas vezes ou até mesmo frequentemente o caso em que a fração de proteína da semente oleaginosa é mais valiosa do que a fração de óleo. Um benefício antecipado dos processos de extração aquosa é que os mesmos deixam o resíduo extraído em um estado nativo ou mais funcional, por exemplo, as proteínas não são desnaturadas ou retêm maior funcionalidade através do contato com o solvente aquoso; isso é valioso ao processador de alimentos. Para uso ou como alimento ou como ração, ou outro uso, os processos fornecidos no presente documento permitem a recuperação de uma fração de proteína que não foi exposta a solventes orgânicos potencialmente perigosos ou nocivos. Como tais, as proteínas são menos propensas a serem desnaturadas e podem ainda ter melhor aceitação do consumidor dentre certos grupos de consumidores.
[0436] As composições de proteína preparadas pelos métodos descritos no presente documento são também fornecidas, assim como produtos alimentícios, produtos de consumo e alimento industrial para animais que compreendem uma proteína preparada pelos métodos ou processos revelados no presente documento.
[0437] A fração de semente oleaginosa pode compreender flocos de soja ou farina de soja. É preferencial que a fração de semente oleaginosa sejam flocos graxos ou farinha graxos. A pessoa versada na técnica entenderá que graxo” é um termo da técnica em funcionamento
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131/172 com frações de semente oleaginosa, tais como de soja e milho. Graxo está em um sentido oposto a desengordurado - em que essencialmente todos os lipídios são removidos, por exemplo, dos flocos de soja, da farinha de soja ou do germe de miiho. A pessoa versada na técnica entenderá que os processos fornecidos no presente documento são compatíveis não apenas com frações graxas, mas também com frações parciaimente desengorduradas da semente oleaginosa - que sejam flocos, farelo, germe, farinha ou similares.
[0438] Pode ser possível melhorar o rendimento de óleo da semente oleaginosa em comparação a este de uma extração com solvente aquoso que não usa a etapa de colocar a emulsão em contato com a atividade enzimática. Em uma modalidade mais preferencial, as abordagens de recuperação de óleo que obtiveram com uma extração com solvente orgânico.
[0439] Em ainda outro aspecto, óleos derivados de planta são fornecidos, os ditos óleos preparados por qualquer um dos processos descritos no presente documento. Em uma modalidade, o óleo é substancialmente isento de proteínas, fosfolipídios ou impurezas aquosas. São também fornecidos produtos alimentícios que compreendem o óleo.
[0440] Em outra modalidade, é descrito um método para preparar um mosto que compreende:
a) colocar o material que contém amido que compreende uma mistura de grãos moídos em contato com água e uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 para formar uma massa;
b) aquecer lentamente a massa da etapa (a) para converter o amido em açúcares; e
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c) separar a massa aquecida da etapa (b) em grão residual e mosto líquido, em que a protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 30 g/t de grão moído, tal como pelo menos 1,2,3, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 g/t de grão moído.
[0441 ] Adicionalmente, a alfa-amllase pode ser adicionada na etapa (a) juntamente com a serina protease termoestável.
[0442] A produção de mosto tipicamente implica colocar uma mistura de grão moído em contato com água, e, no processo descrito no presente documento, uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs:3, 8, ou 10 é adicionada em uma cuba de massa para formar uma massa. A protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 30 g/t de grão moído, tal como pelo menos 1, 2, 3, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 g/t de grão moído.
[0443] Em outro aspecto, uma alfa-amilase pode ser adicionada juntamente com a serina protease termoestável.
[0444] Durante a massa, as enzimas presentes convertem os amidos (carboidratos de cadeia longa) no grão em moléculas menores ou açúcares simples (mono, di e trissacarídeos.) Esse processo de conversão é chamado de sacarlficação. O resultado do processo de brassagem é líquido ou mosto rico em açúcar, que é, então, coado através do fundo da cuba de massa em um processo conhecido como clarificação, isto é, separação. Antes da separação, a temperatura de massa pode ser elevada até cerca de 75 a 78 °C (conhecido como mashout)
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133/172 para liberar mais amido e reduzir a viscosidade da massa. Água adicional pode ser salpicada nos grãos para extrair açúcares adicionais (um processo conhecido como pulverização).
[0445] Proteases podem ser adicionadas durante o processo de sacarificação para liberar a fonte de nitrogênio das proteínas presentes no mosto. As análises de controle de qualidade de Fabricação de Cerveja Padrão incluem o teste para nitrogênio do grupo amino livre (FAN). Isso permite uma estimativa da concentração de aminoácidos individuais e peptideos pequenos que podem ser utilizados pela levedura durante a fermentação de cerveja para o crescimento e proliferação celular. A inclusão de matérias-primas não malte como adjuntos no processo de fabricação de cerveja aumenta as exigências para teor de FAN mais alto no mosto para garantir o processo de fermentação apropriado.
[0446] Conforme descrito no presente documento, uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 (tal como, porém sem limitação, ME-3 descrita no presente documento) facilitou uma produção dependente de dose de nitrogênio do grupo alfa-amino livre (FAN) no mosto.
[0447] Em outra modalidade, é descrito um método para hidrolisar pelo menos um subproduto animal ou alimentar que compreende:
(a) colocar o subproduto animal ou alimentar em contato com um líquido; e (b) hidrolisar subproduto animal ou alimentar para formar um liquefeito colocando-se em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
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134/172 [0448] O subproduto alimentar pode ser um material rico em queratina selecionado dentre o grupo que consiste em pena, pelo e lã.
[0449] As proteínas podem ser hidrolisadas em polipeptídeos e oil·gopeptídeos de comprimento adequado e aminoácidos livres ou por hidrólise química ou por hidrólise enzimática. As preparações de hidrolisados de proteína podem ser usadas em nutrição humana, por exemplo, como ingredientes em bebidas energéticas, produtos de nutrição esportivos e de controle de peso, como uma fonte de nutrição para idosos e pacientes com baixo peso e na indústria do sabor. A proteína pode ser derivada de plantas ou animais.
[0450] Em muitos estabelecimentos, subprodutos são criados juntamente com o alimento sendo processado. Os subprodutos podem ser dispendiosos para descartar e apresentam um fluxo de receitas potencial.
[0451] Os exemplos de subprodutos de alimento humano que podem ser usados para alimento de animais incluem produtos de grão (cascos, farelo, germe, farinha de glúten, farinha grosseira e farinha); sêmea de trigo gerada durante o processamento de trigo em farinha; cascas, crostas, bagaço, polpa, refugo ou outro material similar gerado a partir do processamento de frutas ou vegetais para consumo por seres humanos; alimento para seres humanos, tais como batatas chips, biscoitos, pão, produtos de pastelaria e massa, que não é adulterado e é seguro para uso como alimento animal, mas não é aceitável como alimento para seres humanos por razões de qualidade, tais como tamanho errado, formato, cor ou textura.
[0452] Os subprodutos animais são carcaças e partes de carcaças de matadouros, abrigos de animais, zoológicos e veterinárias e produtos de origem animal não destinados ao consumo por seres humanos, incluindo refugo de refeição (todo alimento de refugo de restaurantes, ins
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135/172 talações de refeição, cozinhas centrais, matadouros e cozinhas domésticas). Os exemplos de subprodutos de produtos animais incluem, porém sem limitação, farinha de sangue (de operações de matadouro), farinha de subproduto de ave, colágeno e gelatina (da pele e outras partes fervidas de gado abatido), penas (do processamento de aves), farinha de penas (do processamento de aves), lanolina (da limpeza de lã), couro, estrume, farinha de carne e ossos (da transformação de ossos e miúdos de animais) e similares.
[0453] A serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 descrita no presente documento pode ser usada para remover proteínas de animais e sua subsequente degradação ou descarte, tal como, por exemplo, penas, pele, pelo e couro. Em alguns casos, a imersão da carcaça do animal em uma solução que compreende uma serina protease termoestável descrita no presente documento pode agir para proteger a pele de danos em comparação com a imersão tradicional em água escaldante ou no processo de depenagem. Em uma modalidade, as penas podem ser aspergidas com uma serina protease termoestável descrita no presente documento sob condições adequadas para digerir ou iniciar a degradação da plumagem. Em algumas modalidades, a variante pode ser usada em combinação com um agente oxidante.
[0454] Em algumas modalidades, a remoção de óleo ou gordura associada a penas brutas pode ser auxiliada com o uso da serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 descrita no presente documento. Em algumas modalidades, uma ou mais homólogos e/ou variantes de ME-3 (serina protease termoestável)
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136/172 descritas no presente documento sâo usadas em composições para limpar as penas, assim como para higienizar e desidratar parcialmente as fibras. Em ainda outras modalidades, a serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 descrita no presente documento encontra uso na recuperação de proteína da plumagem.
[0455] Os exemplos não limitantes de composições e métodos revelados no presente documento incluem:
[0456] 1. Um método para produzir uma serina protease termoestável que compreende:
(a) transformar um hospedeiro de produção com um construto recombinante que codifica uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) a uma temperatura acima de 37,5°C para aumentar o nível de expressão da serina protease termoestável.
[0457] 2. O método da modalidade 1, em que a serina protease termoestável é opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.
[0458] 3. Sobrenadante de cultura que contém serina protease termoestável obtido pelo método das modalidades 1 ou 2.
[0459] 4. Uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, em que a dita serina protease termoestável pode ser
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137/172 usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta.
[0460] 5. Ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3, 8 ou 10 em que a serina protease termoestável está presente em uma quantidade de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g/t de ração e adicionalmente em que a dita serina protease termoestável pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta.
[0461] 6. A composição de aditivo de ração da modalidade 4 para uso em ração de animal que compreende adicionalmente 10 e pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissuifeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
[0462] 7. Uma composição de aditivo de ração granulada para uso em ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microrganismo de alimentação direta, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que
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138/172 consiste em granulação de alto cisalhamento, granulaçâo em tambor, extrusâo, esferon ização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersâo, atomização por disco giratório, coacervação, formação de tablete ou qualquer combinação dos processos acima.
[0463] 8. Uma composição de aditivo de ração granulada da modalidade 7, em que o diâmetro médio das partículas é maior que 50 microns e menor que 2.000 microns.
[0464] 9. A composição de aditivo de ração da modalidade 7, em que a dita composição é em uma forma líquida.
[0465] 10. A composição de aditivo de ração da modalidade 9, em que a dita composição é em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersâo em um pélete de ração.
[0466] 11. Um método para hidrolisar material que contém amido que compreende:
(a) colocar o material que contém amido em contato com um líquido para formar uma massa; e (b) hidrolisar amido no mingau para formar um liquefeito colocando-se a massa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0467] 12. O método da modalidade 11, em que o coquetel de enzimas compreende adicionalmente pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em alfa-amilase, amlloglucosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase e xilanase.
[0468] 13. Um método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido que compreende:
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139/172 (a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
(b) sacarificar o produto da etapa (a);
(c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c).
[0469] 13b. O método da modalidade 13, em que as etapas (b) e (c) são realizadas sequencialmente.
[0470] 14. O método da modalidade 13, em que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.
[0471] 15. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que a adição de uma fonte de nitrogênio (tal como, porém sem limitação, ureia ou amônia) é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g de serina protease termoestável/MT de material que contém amido que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0472] 15b. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que a adição de uma fonte de nitrogênio é eliminada ou reduzida em pelo menos 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com o uso de pelo menos 3, 4, 5 ou 6 g de serina protease termoestável/MT de sólido seco que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0473] 15c. O método da modalidade 15b, em que a fonte de nitrogênio é selecionada dentre o grupo que consiste em ureia e amônia.
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140/172 [0474] 15d. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que os níveis de gordura hidrolisada com ácido dos materiais obtidos no final da fermentação são aumentados, em comparação aos materiais obtidos no final de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0475] 15e. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que o produto de fermentação (tal como, porém sem limitação, etanol) é produzido a uma taxa mais rápida, em comparação a uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0476] 15f. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que o rendimento de produto de fermentação (tal como, porém sem limitação, etanol) é mais alto, em comparação ao rendimento de produto de fermentação de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0477] 15h. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que os níveis de glicerol dos materiais obtidos no final da fermentação são diminuídos, em comparação aos materiais obtidos no final de uma fermentação de controle que não compreende a dita serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
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141/172 [0478] 16. O método da modalidade 15, em que, quando o produto de fermentação é etanol, então, nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária na etapa (c) mediante o uso de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 g de serina protease termoestável/t de material que contém amido que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0479] 17. Um método para reduzir viscosidade de um material que contém amido liquefeito que compreende colocar uma pasta fluida de material que contém amido em contato com uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0480] 18. Um método para extrair óleo de uma cultura de semente oleaginosa que compreende:
(a) colocar uma fração de semente oleaginosa que contém óleo em contato com um agente de extração aquoso para formar uma fração de semente oleaginosa de extrato; e (b) separar a fração de semente oleaginosa extraída em uma fase aquosa, uma emulsão de óleo em água e uma fase insolúvel;
(c) colocar a emulsão de óleo em água em contato com pelo menos uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs:3, 8 ou 10, sozinha ou em combinação com pelo menos uma fosfolipase, sob condições que permitem a atividade enzimática durante tempo suficiente para desestabilizar a emulsão; e (d) separar a emulsão desestabilizante da etapa (c) em uma fase aquosa, uma fase oleosa e uma fase insolúvel para obter óleo a partir
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142/172 da semente oleaginosa.
[0481] 19. O método da modalidade 19, em que a fração de semente oleaginosa é de soja, semente de milho, semente de colza, caroço de palma, semente de girassol, semente de açafrão, coco, amendoim, semente de algodão, semente de gergelim, semente de linhaça, semente de papoila, amêndoa, avelã, noz, semente de prímula, semente de uva, semente de cânhamo, semente de groselha negra, semente de framboesa vermelha, semente de cenoura, semente de cominho, semente de mirtilo, semente de oxicoco, semente de salsa, semente de cebola, semente de abóbora, semente de abricó, semente de mostarda, semente de linho, semente de mamona ou jatrofa.
[0482] 20. O processo da modalidade 18, em que a fração de semente oleaginosa compreende uma fração de proteína que é útil como um alimento, ingrediente alimentar, um aditivo alimentar ou suplemento alimentar.
[0483] 21. Um óleo derivado de planta preparado pelo processo da modalidade 18.
[0484] 22. Uma ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão que compreende o óleo da modalidade 21.
[0485] 23. Um método para preparar um mosto que compreende:
a) colocar o material que contém amido que compreende uma mistura de grãos moídos em contato com água e uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 para formar uma massa;
b) aquecer lentamente a massa da etapa (a) para converter o amido em açúcares; e
c) separar a massa aquecida da etapa (b) em grão residual e mosto
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143/172 líquido em que a protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 30 g/t de grão moído.
[0486] 24. O método da modalidade 23, em que pelo menos uma alfa-amilase é adicionada na etapa (a) juntamente com a serina protease termoestável.
[0487] 25. Um método para hidrolisar pelo menos um subproduto animal ou alimentar que compreende:
(a) colocar o subproduto animal ou alimentar em contato com um líquido; e (b) hidrolisar subproduto animal ou alimentar na massa para formar um liquefeito colocando-se em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
[0488] 26. O método da modalidade 25, em que o subproduto alimentar é material rico em queratina selecionado dentre o grupo que consiste em pena, pelo e lã.
[0489] 27. Um método para hidrolisar proteínas em biomassa lignocelulósica que compreende (a) colocar a biomassa em contato com um líquido; e (b) hidrolisar as proteínas na biomassa colocando-se a biomassa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
EXEMPLOS [0490] A não ser que definido de outro modo aqui, todos os termos
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144/172 técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um perito na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et at., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, Nova iorque (1994) e Hate & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionam a um perito um dicionário geral de muitos dos termos usados com esta descrição.
[0491] A descrição é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados somente a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, um perito na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a vários usos e condições.
EXEMPLO 1
Serina protease ME-3 de Thermobifida cellulosllytlca DSM 44535 [0492] Thermoblflda cellulosllytlca DSM 44535, uma cepa bacteriana obtida a partir do Instituto Leibniz DSMZ-Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (Braunschweig, Alemanha), foi selecionada como uma fonte potencial para enzimas úteis em várias aplicações industriais. O genoma inteiro dessa cepa foi sequenciado com o uso de sequenciamento ILLUMINA® por tecnologia de síntese. O sequenciamento de genoma e conjunto dos dados de sequência foi realizado por BaseClear (Leiden, Países Baixos). As sequências de contíguas foram anotadas por BioXpr (Namur, Bélgica).
[0493] Um dos genes identificados desse modo em Thermobiflda cellulosllytlca DSM 44535, TceÕ1961n (SEQ ID NO:1), codifica uma protease, designada ME-3, que mostrou homologia a serina proteases de outras bactérias. A sequência de nucleotídeos de Tce01961n, que codifica a protease ME-3, é apresentada como SEQ ID NO:1. A sequência
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145/172 de aminoácidos da pré-pró-enzima ME-3 codificada por Tce01961n é apresentada como SEQ ID NO:2. Na terminação N, a pré-pró-enzima ME-3 tem um peptídeo de sinalização com um comprimento previsto de 27 resíduos (aminoácidos 1 a 27 na SEQ ID NO:2) conforme determinado com o uso de SignalP (Emanuelsson et al. (2007) Nature Protocols, 2: 953 a 971). A presença de uma sequência de peptídeo de sinalização indica que essa serina protease é uma enzima secretada. Como outras serina proteases, a enzima tem uma pró-sequência, com um comprimento previsto de 162 resíduos (aminoácidos 28 a 189 na SEQ ID NO:2). A previsão de pró-sequência foi baseada no conhecimento da junção pró-madura em proteases homólogas, tais como Celulomonadina (Shaw et al., (2007) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Common 63: 266 a 269) e Protease A de Thermobifida fusca (Kelch BA & Agard DA (2007) J Mol Biol. 370:784 a 795).
[0494] A sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada, ME-3 (186 aminoácidos), é representada na SEQ ID NO:3. EXEMPLO 2
Expressão Heteróloga da ME-3 protease [0495] A ME-3 protease foi produzida em Bacillus subtilis com o uso de um cassete de expressão que consiste no promotor de B. subtilis aprE, uma sequência de peptídeos de sinalização de S. subtilis aprE modificada, uma sequência com otimização de códon que codifica a sequência pró-madura de ME-3 protease e um terminador BPN!.
[0496] A sequência da sequência de peptídeo de sinalização aprE modificada fundida à sequência de DNA com otimização de códon que codifica a sequência pró-madura da ME-3 protease é representada na SEQ ID NO:4. O cassete de expressão de ME-3 foi clonado no vetor bifuncional de replicação pHYT e transformado em uma cepa de B. subtilis adequada.
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146/172 [0497] O vetor pHYT foi derivado de pHY300PLK (Takara Bio Inc.) adicionando-se um terminador após o gene de resistência à tetraciclina com o uso dos sítios BstEII e EcoRI (a sequência terminadora é apresentada como SEQ ID NO:5). O sítio H/ndlll em pHY300PLKfoi também removido com o uso de um Iigante clonado nos sítios BamHI e H/ndlll (a sequência Iigante é apresentada como SEQ ID NO:6). Um mapa do vetor pHYT para expressão da ME-3 protease (pHYT-TceO1961) é mostrado na Figura 1.
[0498] Para produzir ME-3 protease, uma bandeja de 96 poços contendo 150 μΙ de caldo de soja de triptona (TBS) + 15 ppm de tetraciclina em cada poço foi inoculada com um transformante de B. subtilis contendo pHYT-TceO1961. A bandeja de 96 poços foi incubada de um dia para o outro a 37 °C, 200 rpm em um incubador de agitação. 30 μΙ dessa (pré-)cultura de um dia para o outro foram adicionados a um ponto em uma bandeja de 24 poços contendo 3 ml de meio semidefinido enriquecido (com base em tampão de MOPs, com ureia como a principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono, e suplementado com 1% de soytone) suplementado com CaCh 5 mM e 25 ppm de tetraciclina. A bandeja de 24 poços foi incubada a 32°C, 200 rpm por 48 horas.
[0499] A cultura foi coletada por centrifugaçâo a 4.500 rpm por 20 minutos. O sobrenadante resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm para produzir um sobrenadante sem célula. O sobrenadante continha ME-3 protease (confirmado por SDS-PAGE) e essa fração foi adicionalmente usada para ensaios e, em alguns casos, foi adicionalmente purificada conforme descrito abaixo.
[0500] ME-3 protease foi purificada incubando-se o sobrenadante sem célula por 1 hora a 70 °C em uma batelada de água.
[0501] O sobrenadante incubado foi centrifugado a 5.100 g por 10 minutos e subsequentemente filtrado através de um filtro de 0,22 um.
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Azida 0,02% foi adicionada, e a amostra teve o tampão trocado com o uso de tubos de ultrafiltraçâo de 20 ml Viva spin de 10.000 MWCO (Sartorius). A centrifugação foi realizada a 5 a 10% do volume original e tampão HEPES 25 mM pH 7,0, CaCb 1 mM, azida 0,02% foi adicionada a um volume final de 20 ml. Essa etapa foi repetida 3 vezes e finalmente a amostra foi recuperada do tubo de ultrafiltraçâo e tampão HEPES 25 mM pH 7,0, CaCb 1 mM, azida 0,02% foi adicionada para obter o volume final desejado.
[0502] O efeito da temperatura na expressão de ME-3 protease foi avaliado. A cepa de B. subtilis contendo cassete de expressão de ME-3 foi cultivada em 2 ml de caldo LB a 37°C por 8 h sob seleção de antibiótico. Uma alíquota de 100 μΙ dessa pré-cultura foi adicionada a um frasco com chicanas de 125 ml contendo 10 ml de meio semidefinido enriquecido (com base em tampão de MOPs, com ureia como a principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono, e suplementado com 1% de soytone) suplementado com antibióticos. Os frascos foram incubados por 2 dias a 37°C ou 42°C com misturação giratória constante a 250 rpm. O sobrenadante de cultura foi recuperado por centrifugação (20.000 g por 1 min) e usado para a quantificação de ME-3 protease com o uso do substrato Suc-AAPF-pNA conforme descrito no Exemplo 3 abaixo.
[0503] A concentração da ME-3 protease foi calculada com o uso da curva padrão gerada com o uso de enzima purificada. O rendimento médio de ME-3 protease (3 réplicas) das culturas cultivadas a 37°C e 42°C é registrado na Tabela 1 abaixo. Conforme mostrado, um aumento de aproximadamente 50% no rendimento de ME-3 protease foi obtido quando as células foram cultivadas a 42°C em comparação a 37°C.
Tabela 1. Níveis de expressão relativa de ME-3 serina protease em Bacillus subtilis cultivado a 37 ou 42°C.
37°C 42°C
Rendimento de ME-3 (ppm) 54Q±74 807±86
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EXEMPLO 3
Atividade de ME-3 Protease in Vitro
Efeito de ME~3 em Ração de Milho e Soja na Presença de Pepsina e Pancreatina
1. Tratamento com enzima de ração de milho e soja.
[0504] A farinha de ração de milho e soja (composição mostrada na Tabela 2) foi peneirada até um tamanho das partículas menor do que 212 pm e suspensa em água até pasta a 10% (p/p) e o pH ajustado até pH 3.138 μΙ dessa pasta fluida foram adicionados a cada poço na placa de 96 poços MTP. Uma amostra de 20 μΙ de ME-3 protease preparada em acetato 50 mM pH 3 foi adicionada, então, 10 μΙ de pepsina porcina (Sigma, P7000, preparada a 800 U/ml em água) foram adicionados. A placa foi incubada a 40°C por 45 min na incubadora de agitação de mícroplaca iEMS (iEMS) a 1.150 rpm. Então, 34 μΙ de pancreatina porcina (Sigma P7545, preparada como 0,463 mg/ml em bicarbonate de Na 1 M) foram adicionados, e a placa foi incubada a 40°C por 60 minutos na iEMS a 1.150 rpm. Em seguida, a placa foi centrifugada a 5°C, 4.000 rpm por 15 min, 20 μΙ de sobrenadante foram transferidos para novas placas (placa coming n° 3641 não ligante) contendo 180 μ! de água em cada poço até uma diluição de 10x.
2. Grau de medição de hidrólise de proteína [0505] O grau de hidrólise (DH) de proteína é baseado na reação de grupos amino primários com orto-ftaldialdeído (ensaio OPA) conforme descrito por P.M. Nielsen, D. Petersen e C. Dambmann. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science. 66 (2001) 642 a 646. Esse ensaio OPA foi usado para determinar a extensão da hidrólise.
3. Medição de atividade catalítica com o uso do substrato AAPF em solução [0506] Para medir a atividade catalítica da protease, o substrato
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Suc-AAPF-pNA (Sigma, S-7388) foi usado. A atividade foi medida da seguinte forma: 5 μΙ de sobrenadante contendo enzima, 50 μΙ de MesNaOH 0,2 M (pH 6,0), 50 μΙ de água ou 55 μΙ de água (branco), 5 μΙ de Suc-AAPF-pNA (20 mg/ml) foram adicionados a uma metade da área inferior da microplaca de 96 poços (Costar 3695, Corning Inc. NY, EUA). A extensão da hidrólise foi seguida a 410 nm por até 20 min.
4. Medições de atividade catalítica em extratos de ração [0507] Para o ensaio de recuperação de ME-3 no processo de pe~ letização de ração, antes do ensaio, amostras de ração foram trituradas com o uso de um moinho de laboratório Perten com uma seleção de tamanho de partícula <0,75 pm. 5 gramas da ração triturada foram dissolvidos em 50 ml de solução de Tris 0,1 M pH 10 contendo 1% (em p/v) de SDS e centrifugados. O sobrenadante foi filtrado e usado para a detecção da atividade de protease com o uso do substrato AAPF-pNA e do método descrito acima. A composição de ração milho e soja conforme apresentado na Tabela 2 foi derivada da seguinte referência: Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IPs isomers with dietary protein and Iron and inhibition of pepsin. S. Yu,
A. Cowieson, C. Gilbert, P. Plumstead e S. Dalsgaard. J. Anim. Sci. 90 (2012) 1.824 a 1.832, Supplementary Information.
Tabela 2. Composição de ração de milho e soja
Ingrediente Quantidade, %
Milho 60,01
Farinha de soja 31,52
Óleo de soja 4,00
Sal 0,40
DL-Metionina 0,20
Calcário 1,16
Fosfato Dicálcico 1,46
Vitamina e mistura mineral 1,25
Ό508] Os resultados do tratamento de ração de milho e soja com
ME-3 protease a diferentes concentrações (500, 1.000, 1.500 ppm) na
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150/172 presença das enzimas pepsina e pancreatina são apresentados abaixo na Figura 2.
EXEMPLO 4
TermoestabHídade da ME-3 protease a vários pHs [0509] Alíquotas de ME-3 protease foram incubadas por 60 segundos em Tris 0,1 M pH 10 contendo CaCh 5 mM e Triton X-100 0,005%, em uma placa de 96 poços MTP a temperaturas na faixa de 72°C a 95°C. A placa foi resfriada até 4°C, e a atividade catalítica foi medida a 37°C com o uso do substrato AAPF-pNA com o uso do método descrito no Exemplo 3. Os resultados são apresentados na Figura 3. Conforme pode ser visto na Figura 3, ME-3 retém cerca de 80% de atividade a 90°C a pH 10. Em outros experimentos, nenhum efeito de EDTAfoi detectado (os dados não são apresentados). A estabilidade térmica de ME-3 foi também medida a pH 4,5 e pH 5,5 com o uso de acetato 0,1 M. Foi constatado que, após a incubação a 85,5°C por 10 min, a enzima ME-3 retém cerca de 85% de atividade a pH 4,5 e 5,5, durante a incubação a 100°C por 5 min, a atividade residual a pH 5,5 é cerca de 65%. EXEMPLO 5
Perfil de pH da ME-3 Protease [0510] O efeito do pH na atividade de ME-3 protease foi avaliado entre pH 3,75 e 7,5. Dois tampões de estoque foram usados para gerar essa faixa de pH: tampão de citrato 0,1 M e tampão de fosfato 0,2 M, ambos contendo 0,05% (em p/v) de Tween-80. A atividade catalítica da enzima foi medida a 40°C com o uso do ensaio de substrato AAPF-pNA descrito no Exemplo 3, e os resultados são apresentados na Figura 4. A estabilidade da ME-3 protease a um pH baixo foi também estudada. Foi constatado que, após 30 min de incubação a pH 2,5, a enzima reteve 90% da atividade em relação a esta medida a pH 5,0 (dados não mostrados). EXEMPLO 6
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Estabilidade de peletização de ME-3 protease diretamente asperglda na ração [0511] A estabilidade da ME-3 protease durante a peletização da ração de animal foi avaliada medindo-se o percentual de recuperação de atividade enzimática após o procedimento. A peletização da ração foi realizada a diferentes temperaturas no Instituto Tecnológico Dinamarquês (Kolding, Dinamarca) de acordo com procedimentos operacionais padrão. A enzima ME-3 sem revestimento foi diluída em 600 ml de água e, então, aspergida diretamente em 120 kg de ração. Essa amostra de ração com ME-3 aspergida foi peletizada a 90, 95 ou 100°C por 60 segundos. Para a determinação da estabilidade de protease após esse procedimento, os péletes foram triturados com o uso de um moinho de laboratório Perten e extraídos em 50 ml de solução de Tris 0,1 M pH 10 contendo 1% (em p/v) de SDS a 22°C por 20 min. O extrato foi centrifugado e filtrado através de papel filtro. O filtrado foi, então, usado para determinar a atividade catalítica de ME-3 com o uso do ensaio de substrato de AAPF-pNA descrito no Exemplo 3. Conforme mostrado na Figura 5, a enzima ME-3 sem qualquer revestimento retém mais do que 70% da atividade após a peletização a 90°C a 100°C por 60 segundos. EXEMPLO 7
Avaliação da ME-3 Protease na Líquefação e Sacarificação e Fermentação Simultâneas de Amido [0512] O efeito da ME-3 protease foi testado em protocolos de liquefação e sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de milho em escala laboratorial conforme descrito abaixo. Miolos do milho (Arie Blok Animal Nutrition, NL-3440 AA Woerden, Artnr: 3777) foram moídos com o uso de uma máquina de trituração Retsch ZM200 com as configurações: tela de 3 mm, 10k rpm. A farinha de milho moída foi usada para gerar 2 kg de pasta fluida a 32,0% de sólidos secos adicionando-se uma mistura 1:1 de água de torneira/água desmineralizada à farinha. O pH
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152/172 foi ajustado até 5,5 com H2SO4 e, posteriormente, SPEZYME® RSL (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi dosado a uma dose comercial relevante. Subsequentemente, a ME-3 protease foi adicionada a uma concentração final de 5 ug/g de DS e a mistura de 2 kg foi incubada a 85°C por duas horas sob agitação constante com 0 uso de um misturador suspenso. Uma amostra de controle foi gerada adicionando-se nenhuma protease à liquefação. Após a incubação, a amostra de milho tratada (Liquefeito) foi coletada e usada em experimentos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) subsequentes, e as alíquotas foram também analisadas por exclusão de tamanho por HPLC para determinar a extensão da liquefação de milho.
[0513] Análise de viscosidade durante a liquefação de milho. Miolos do milho (Arie Blok Animal Nutrition, NL-3440 AA Woerden, Artnr: 3777) foram moídos com 0 uso de uma máquina de trituração Retsch ZM200, configurações: tela de 3 mm, 10k rpm. A farinha de milho moída foi usada para gerar uma pasta fluida de milho com 32% de sólidos secos de 25 gramas adicionando-se uma mistura 1:1 de água de torneira/água desmineralizada à farinha. O pH foi ajustado a 5,5 com ácido sulfúrico e, posteriormente, SPEZYME® CL (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi adicionada a uma dose relevante comercial. Para essa pasta fluida, a ME-3 protease foi adicionada a uma concentração final de 10 microgramas/grama de sólido seco (ug/g de DS). Como uma amostra de controle, não houve nenhuma protease adicionada. As amostras foram incubadas em um analisador de viscosidade rápido (Perten Instruments, RVA4500, configurações: 160 rpm) por 1 hora 85°C e, posteriormente, a temperatura foi rebaixada até 32°C. Após 15 minutos a 32°C, os níveis de viscosidade finais médios do último minuto de incubação foram tomados e 0 resultado é mostrado na Tabela 3.
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Tabela 3. Níveis de viscosidade final de uma liquefação com e sem ME-3 protease.
Viscosidade final (cP)
SPEZYME CL sozinho (sem controle de protease) 2102
SPEZYME CL + ME-3 1641
Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) [0514] O pH das amostras de liquefeito (com e sem protease adicionada à reação de liquefação) foi ajustado a 4,8 e DISTILLASE® SSF (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase fúngica, uma glicoamilase fúngica e uma protease fúngica ácida) foi adicionado a uma dose relevante comercial. Posteriormente, 0,1% em p/p de levedura seca ativa (Ethanol Red, Fermentis, França) foi adicionada. Uma amostra de 50 gramas dessa mistura foi aliquotada em vasos de SSF. Zero ou 0,178 SAPU/g DS de FERMGEN™ 2,5x (produto comercial DuPont contendo uma protease fúngica ácida) e várias quantidades de ureia (0, 200 e 600 ppm) foram adicionados. Os experimentos foram realizados em duplicata. As incubações de fermentação foram realizadas com o uso de dois métodos diferentes descritos abaixo.
[0515] Método de SSF 1. Os vasos de fermentação foram incubados a 32°C em um banho de água com agitação magnética a 300 rpm apiicada. As amostras foram coletadas em quatro pontos de tempo diferentes (5 h, 22 h, 29 h e 46 horas). Essas amostras foram analisadas quanto à concentração de etanol com o uso de separação e quantificação de HPLC conforme descrito abaixo.
[0516] As condições de execução de HPLC (Agilent Technologies série 1200) foram da seguinte forma: coluna Phenomenex Rezex™ RFQ-Fast Acid H+ retida a 80°C, execução a fluxo isocrático de 1,0 ml/min de solvente de H2SO4 0,01 N, um volume de injeção de 10 μΙ e um tempo de execução de eluição de 5,3 min. A detecção de índice de refração foi usada para quantificação de etanol, e os resultados são mostrados na Tabela 4.
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Tabeía 4. Rendimentos de etano! de SSF (% em v/v) obtidos com várias quantidades de ureia, com e sem ME-3 protease durante a etapa de iiquefação de müho.
Tempo (horas)
Enzima de íi- quefação ME-3 (ug/gDS) FERMGEN™ 2,Sx, (SAPU/g DS) Ureia (ppm) 5 22 29 48
SPEZYME RSL 0 0,178 600 1,4 12,4 15,5 17,8
SPEZYME RSL 0 0,178 200 1,4 9,8 12,9 16,9
SPEZYME RSL 0 0,178 0 1,2 8,2 11,1 15
SPEZYME RSL 5 0,178 0 1,2 12 15,8 17,8
SPEZYME RSL 5 0,178 200 1,4 12,9 16,8 17,7
Ό517] A Tabela 4 mostra que se a dose de urela for reduzida de 600 para 200 ppm (equivalente a uma redução de dose de urela de 67%), a taxa de formação de etanol pela liquefação de enzimas, tais como SPEZYME RSL, é mais lenta. Quando a ME-3 protease foi adicionada à mistura de liquefação incluindo SPEZYME RSL, a taxa de fermentação é comparável a uma obtida quando 600 ppm de ureia foram incluídas. Além disso, a adição de ME-3 à mistura de liquefação incluindo SPEZYME RSL rendeu esse mesmo rendimento de etanol quando zero ou apenas 200 ppm de ureia foram usadas em vez disso. Portanto, a adição de ME-3 durante a liquefação permite uma redução significativa ou eliminação na exigência de ureia.
[0518] Método de SSF 2. Os vasos de fermentação foram incubados a 32°C em um banho de água e agitação magnética a 300 rpm foi aplicada. A pressão cumulativa foi registrada ao longo do tempo com o uso do Sistema de Produção de Gás ANKOM RF (ANKOM Technology, Macedon, Nova Iorque, EUA) que fornece uma facilidade para usar o método para monitorar e medir a produção de gás. A produção de gás (CO2) é uma medida para a produção de etanol. As taxas de produção de gás são mostradas na Figura 6. A figura 6 mostra as plotagens de pressão cumulativa da sacarificação e fermentação simultâneas realizadas em sistema Ankom. Na linha cinza está a condição de controle em que 600 ppm de ureia e 0,178 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5x foram adicionados à fermentação, e nenhuma ME-3 foi usada na liquefação.
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A linha cinza claro mostra os rendimentos de etanol com o uso de 240 ppm de ureia e nenhum FERMGEN™ 2,5x adicionado à fermentação e nenhuma ME-3 foi usada na liquefação. A linha preta mostra os rendimentos de etanol quando a ME-3 protease foi adicionada à liquefação e a fermentação foi realizada com 240 ppm de ureia e nenhuma adição de FERMGEN™ 2,5x. Conforme pode ser observado, mesmo com uma dose de ureia 60% mais baixa e nenhuma protease FERMGEN™ adicionada à fermentação, quando ME-3 protease foi adicionada à liquefação, o rendimento de etanol foi aprimorado em comparação às condições de controle.
[0519] Detecção de hidrólise de proteína de farinha de milho por análise por HPLC do milho das amostras de liquefação. Para avaliar a hidrólise de proteína pela ME-3 protease, exclusão de tamanho por HPLC foi usada para quantificar a solubilização de proteína de milho. As amostras de final de liquefação foram centrifugadas a 13.000 rpm por 5 minutos e 200 ul de sobrenadante foram filtrados através de um filtro de 0,22 um. Uma alíquota de 5 ul desse filtrado foi injetada em uma HPLC (Agilent Technologies série 1200), em um Waters BEH125Â, coluna de 1,7 um/300 mm; e execução a 0,4 ml/min. Tampão de operação: NaPCU 25 mM pH 6,8, NaCI 0,1 Μ. A área total entre o tempo de retenção 7 min a 10 min foi integrada, Detecção: OD220nm.
[0520] Os resultados da detecção por HPLC dos peptídeos nas amostras de liquefação são mostrados na Tabela 5, como a área sob a curva integrada com tempo de retenção entre 7 a 10 minutos para amostras tratadas com e sem ME-3 protease. Os resultados de hidrólise de proteína mostrados na Tabela 5 indicam que, quando ME-3 é adicionada na liquefação, um aumento nos níveis de peptídeos solúveis foi observado.
Tabela 5. Detecção por HPLC de peptídeos em amostras de liquefação.
Amostra Área sob a curva relativa
SPEZYME RSL 13,908
SPEZYME RSL + ME-3 35,990
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EXEMPLO 8
Uso de ME-3 Protease para Produção de Nitrogênio do Grupo Amino Livre em Brassagem de Alta Temperatura [0521] As análises de controle de qualidade de Fabricação de Cerveja Padrão incluem o teste para nitrogênio do grupo amino livre (FAN). Isso permite uma estimativa da concentração de aminoácidos individuais e peptideos pequenos que podem ser utilizados pela levedura durante a fermentação de cerveja para o crescimento e proliferação celular. A inclusão de matérias-primas não malte como adjuntos no processo de fabricação de cerveja aumenta as exigências para teor de FAN mais alto no mosto para garantir o processo de fermentação apropriado. A protease ME-3 foi testada na operação de brassagem com 50% de malte do tipo Pilsner (malte do tipo Pilsner; Fuglsang Denmark, Lote 13.01.2016) e 50% de grão pronto para moagem de milho (Benntag Nordic; Nordgetreide GmBH Lübec, Alemanha, Lote: 02.05.2016.), com o uso de uma ração entre água e grão pronto para moagem de 4,0:1. O malte do tipo Pilsner foi moído com um moinho de malte Buhler Miag (configuração de 0,5 mm).
[0522] Farinhas grosseiras de mais (1,5 g), Malte (malte do tipo pilsner moído, 1,5 g) e água de torneira (12,0 g) foram misturados em copos Wheaton (recipientes de vidro Wheaton com tampa) pré-incubados com 12,0 g de água de torneira com pH ajustado a pH 5,4 com ácido sulfúrico
2,5 M e aquecidos até 70°C. ME-3 protease foi adicionada com base em ppm de proteína ativa (no total 0,5 ml) e água como controle sem enzima. Uma dose comercialmente relevante de alfa-amilase (Amylex® 5T, produto comercial DuPont) foi aplicada a todas as amostras para facilitar a liquefação. Copos Wheaton foram colocados em um banho seco (estação Thermo Scientific Stem) com agitação magnética e o programa de brassagem a seguir foi aplicado; mantidos a 70°C por 30 mi
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157/172 nutos; aquecidos até 95°C por 12,5 minutos aumentando-se a temperatura com 2°C/minuto; mantidos a 95°C por 17,5 minutos; resfriados até 70°C por 15 minutos e mantidos a 70°C por 30 minutos e, finalmente, aquecidos até 79°C por 15 minutos e amassados. Uma amostra de 10 ml foi transferida para tubos Falcon e fervida a 100°C por 20 minutos para garantir a inativação de enzima completa. Os grãos gastos foram separados do mosto por centrifugação em uma centrífuga Multifuge X3R (Heraeus) a 4.500 rpm por 30 minutos a 10°C.
[0523] O sobrenadante foi coletado para análise de Nitrogênio do Grupo Alfa Amino livre (FAN). O teor de FAN (mg/litro) foi medido no mosto com o método internacional EBC 8.10 para a determinação do teor de nitrogênio do grupo amino livre do mosto por colorimetria (aplicando um Espectrofotômetro Genesys 10S UV-Vis) com o uso de ninidrina. Conforme mostrado na Figura 7, a ME-3 protease facilitou uma produção dependente de dose de nitrogênio do grupo alfa-amino livre (FAN) no mosto.
EXEMPLO 9
Extração de óleo da semente oleaginosa com o auxílio da ME-3 protease [0524] Sementes de amendoim em lâminas, descascadas e trituradas (Arachis hypogaea) foram suspensas em 2 ml de Tris-HCI 0,1 M contendo CaCb 5 mM (pH 8,0) e incubadas a 60°C com agitação a 1.180 ppm por 3 h para imitar o processo de extração de óleo. No final da extração, o sobrenadante de óleo e água foi coletado a 4.000 rpm por 15 min com o uso de uma centrífuga de bancada. O sobrenadante coletado foi tratado com ME-3 protease para hidrolisar as proteínas particionadas na emulsão de óleo e água. Em suma, uma alíquota de 120 μΙ do sobrenadante foi misturada com quantidades crescentes de ME-3 (3,7 pg de proteína/μΙ de solução de estoque) protease: 0, 1, 3, 5 e 10 μΙ e foi incubada a 60°C e agitação de 1.180 rpm por 1 h (n=2). No final
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158/172 do período de incubação, a mistura de reação foi resfriada até 0°C e 20 μΙ de cada amostra foram retirados para medir a turvação a 600 nm. Os resultados são mostrados na Tabela 6, e os mesmos mostram que a adição de ME-3 protease reduziu a turvação da amostra.
Tabeía 6, Efeito de ME-3 na hidróiise de proteínas na extração de óieo de amendoim.
dose de ME-3 (μ!)
0 1 3 5 10
Absorbância a 600 nm 0,377 0,288 0,244 0,248 0,286
Percentual (%) de redução na turvação 0 23,6 35,3 34,2 24,1
Ό525] Esse aumento na turvação da mistura de reação é atribuído à hidrólise de proteínas na emulsão de proteína de óleo. É bem conhecido que o óleo vegetal pode ser extraído com solventes orgânicos como hexano, mas o risco de incêndio e explosão é alto. A extração de óleo vegetal com solução aquosa a uma temperatura reduzida pode evitar esses riscos, mas a formação de emulsão de água e óleo é um desafio já que é difícil separar o óleo livre da fase de água. O uso de proteases para hidrolisar o material vegetal ou parede de célula de semente de planta para liberar mais óleo aprisionado, e também as partes de proteína na emulsão de água e óleo aumenta o rendimento de óleo (conforme descrito no pedido de patente nQ US2010227042).
[0526] O uso de uma protease termoestável como ME-3 é mais compatível para o processo de extração de óleo de alta temperatura de planta e algas do que aquelas proteases reveladas na patente n--US2010227042 que são menos termoestáveis. Lipases incluindo fosfolipases podem também ser usadas no processo, mas a vantagem de usar uma protease termoestável é que a mesma hidrolisa proteínas de planta incluindo aquelas que podem causar alergenicidade e Inibidores proteináceos que afetam negativamente a digestão, produzindo, assim, um produto mais desejável.
EXEMPLO 10
Hidrólise de queratina com ME-3 protease
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159/172 [0527] A avaliação de hidrólise de queratina por ME-3 protease foi realizada conforme descrito abaixo. ME-3 protease (3,7 mg de prateína/mi) dosada a 0, 5 μΙ, 10 μΙ e 20 μΙ foi adicionada a uma suspensão de 2 ml de 1% (em p/p) de queratina de lã (K0044, Tokyo Chemical Industry Co. Ltd) suspensa em Tris-HCI 0,1 M contendo CaCb 5 mM (pH 8,0) e 0,1 ml de cisteína (0,1 M). As reações foram realizadas a 60°C com agitação a 1.180 rpm por 3 h (n=3). No final do período de incubação, as mistura de reação foram centrifugadas a 10.000 rpm por 20 min. O sobrenadante foi removido, e o precipitado foi seco e ponderado para determinar a quantidade de lã hidrolisada. Os resultados são mostrados na Tabela 7 e indicam que quantidades crescentes de ME-3 protease hidrolisam efetivamente a queratina de lã.
Tabela 7. Uso de ME-3 para a hidrólise de queratina de !ã.
Dose de Enzima ME-3 (μί)
0 5 10 20
Peso residual de queratina de lã (mg) 20,07 11,97 10,03 8,77
Porcentagem (%) de hidrólise 0 40,3 50,0 55,5
[0528] Materiais ricos em queratina incluindo pena de ave, pelo de mamífero e lã são proteínas altamente reticuladas que são notoriamente difíceis de hidrolisar com enzimas. Certas proteases podem hidrolisar alguns desses materiais de queratina a algum grau, tal como pena (Pedersen eta/., Comparison of four feed proteases for improvement of nutritive value of poultry feather meal. J. Anim. Sci. 2012, Volume 90 n-?Suplemento_4, páginas 350 a 352). Entretanto, nenhuma das protease anteriormente avaliadas são eficientes, e nenhuma pode hidrolisar queratina de lã devido a sua instabilidade nas temperaturas elevadas.
[0529] A eficiência observada para a ME-3 protease hidrolisar o material de lã de queratina pode ser devido a sua tolerância à alta temperatura, já que proteínas de queratina desdobram mais prontamente a uma temperatura mais alta. Adicionalmente, o processo atuai para produzir farinha de penas para ração de animal e alimento para animais de
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160/172 estimação envolve usualmente o tratamento de penas (com alto teor de queratina) com alta temperatura para exterminar possíveis patógenos e desnaturar as proteínas das penas. A ME-3 protease podería ser usada sozinha ou em combinação com o tratamento por alta temperatura das penas (conforme descrito na patente de número US2015197783). EXEMPLO 11
Uso da ME-3 protease para hidrolisar proteínas na biomassa [0530] A biomassa para a produção de bioetanol de segunda geração ou outros propósitos exige um pré-tratamento antes de ser submetida à hidrólise de enzima para produzir açúcares fermentáveis. A biomassa é usualmente pré-tratada a temperaturas elevadas, tipicamente mais altas do que 100°C, ou sob condições ácidas ou alcalinas (conforme descrito no Pedido de Patente W02006110901, WO2014202716).
[0531] Uma protease termoestável, tal como ME-3, pode ser usada em tal processo para hidrolisar as proteínas presentes na biomassa a fim de fornecer os organismos de fermentação, tais como etanologênio com aminoácidos adicionais e nutrientes de peptideo, e também reduzir a viscosidade da pasta fluida de biomassa para aumentar sua fluidez. Biomassa pré-tratada alcalina, tal como pré-tratamento de amônia diluída (conforme descrito na patente W02006110901), seria especialmente adequada para o tratamento com ME-3 para gerar esses nutrientes devido pH mais alto ideal da ME-3. Para avaliar o efeito de ME-3 sob essas condições, palha de milho (63% de sólidos) pré-tratada com amônia diluída e suspensa em água deionizada a 10% (em p/v) foi usada. O pH dessa pasta fluida foi 8,25. A pasta fluida foi distribuída em 12 tubos cada um contendo 4 ml de pasta fluida. ME-3 protease (3,7 mg/ml) foi dosada a 0, 1,5, 10, 15 e 25 μΙ (n=2). As amostras foram misturadas e a reação foi realizada a 60°C por 4 h. As amostras foram, então, centrifugadas, e o sobrenadante coletado foi filtrado através de filtro de 0,45 pm e diluído 10 vezes em água. As amostras foram usadas para medir
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161/172 os grupos amino livres das proteínas e aminoácidos, reagindo-se 20 ul da amostra diluída com reagente OPA conforme descrito no Exemplo 3. A extensão da hidrólise de proteína do tratamento de biomassa por ME3 é mostrada na Tabela 8. A partir da Tabela 8, pode ser visto que os grupos amino livres, conforme indicado pelo valor OPA, aumentaram com a adição de ME-3.
Tabeia 8. Uso da ME-3 para hidroiisar proteínas na biomassa
dose de ME-3, μί 0 1 5 10 15 25
OPA 340 nm (média) 0,431 0,449 0,491 0,483 0,485 0,541
Desvio padrão 0,017 0,016 0,016 0,019 0,035 0,059
CV 4,0 3,5 3,2 4,0 7,2 11,0
Porcentagem (%) 100 104 114 112 112 125
EXEMPLO 12
Homólogos de ME-3 Protease [0532] Uma pesquisa BlastP com ME-3 protease (SEQ ID NO:3) contra os bancos de dados nr e pat em NCBI revelou homólogos de ME3 protease em duas outras espécies de Thermobifida: Thermobifida fusca e Thermobifida halotolerans.
[0533] Um homólogo presente em Thermobifida fusca, Tfpa, foi primeiramente descrito por Kelch,B.A. e Agard,D.A. (2007) J. Mol. Biol. 370: 784 a 795. O número de acesso de Tfpa no NCBI (PDB ID) é 2PFE. Os números de acesso WP_011290931, WPJ)16188200 e SCV75185 são proteínas idênticas (cadeias maduras). O número de acesso de proteína do NCBI do homólogo de ME-3 protease em Thermobifida halotolerans (Thpa) é WPJ368687914. A sequência de aminoácidos da prépró-enzima de Thermobifida fusca Tfpa é apresentada como SEQ ID NO:7. Na terminação N, a pré-pró-enzima Tfpa tem um peptídeo de sinalização com um comprimento previsto de 31 resíduos (aminoácidos 1 a 31 na SEQ ID NO:7). A pró-sequência de Tfpa tem um comprimento de 151 resíduos (aminoácidos 32 a 182 na SEQ ID NO:7), e a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada, Tfpa (186 aminoácidos), é representada na SEQ ID NO:8.
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162/172 [0534] A sequência de aminoácidos da peptidase S1 de Thermobifida halotolerans WPJ368687914, Thpa, é apresentada como SEQ ID NO:9. Com base nos alinhamentos com ME-3 protease e a pré-pró-enzima Tfpa, a sequência de WP_068687914 parece não ter parte do peptideo de sinalização N-terminal. O peptideo de sinalização parcial previsto corresponde a 15 resíduos (aminoácidos 1 a 15 na SEQ ID NO:9). A pró-sequência prevista de Thermobifida halotolerans WP_068687914 tem um comprimento de 152 resíduos (aminoácidos 16 a 167 na SEQ ID NO:9). A sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada, Thermobifida halotolerans WP_068687914, Thpa (186 aminoácidos), é representada na SEQ ID NO:10.
[0535] Homólogos adicionais da ME-3 protease que foram encontrados pela pesquisa BLAST P do banco de dados NCBI que está fora do gênero Thermobifida incluem as seguintes S1 proteases: protease de Nocardiopsis potens (WP_017594871), Marinactinospora thermotolerans (WPJ378763344.1), Amycolatopsis marina (WPJ391675221.1), Actinoalloteichus hymeniacidonis (WPJ369846166.1), Nocardiopsis trehalosi (\NP_QQ79Q55Q5A), Saccharothrix sp. NRRL B-16314 (WPJ333441214.1). As porcentagens de identidade de sequência através de todas as sequências de enzima madura foram calculadas e são mostradas na Tabela 9.
[0536] A sequência de aminoácidos de Nocardiopsis potens WPJ317594871 é apresentada como SEQ ID NO:11. O peptideo de sinalização previsto tem 29 aminoácidos de comprimento. A pró-sequência prevista da protease de Nocardiopsis potens WP_Q17594871 tem um comprimento de 161 aminoácidos, e a sequência de aminoácidos da enzima madura completamente processada prevista, serina protease de Nocardiopsis potens WP_017594871 (185 aminoácidos), é representada na SEQ ID NO:12.
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Tabela 9. Porcentagem de identidade de sequência dentre as várias proteases homóiogas à ME-3. Organismo de origem e o número de acesso são listrados nos cabeçalhos de linha e coluna.
ώ CO ÍN 1 3 CO £ O 03 CO CO CD I i cn c: CU o o Cü 3 CO CD CO 1 <S> co CU á o o È CD É Z) 4.0 í i Π5 c: ccs E < GO m Ϊ cn cz o a z (O <D § CO σ> CO I 1 c o .s § Ξ < CD UÒ CD CO σ> 8 |! ‘cn o KJ ZZ CD Z Saccharothrix sp. WP 033441214
ME-3 100 87,6 83,2 69,8 69,4 67 66,1 66,7 66,3
T fusca WP_ 011290931 87,6 100 82,7 70,4 68,9 69,1 65,1 67,2 64,1
T halotolerans WP. 068687914 83,2 82,7 100 64,9 67,2 63,3 64 63,3 63,6
M. thermotolerans_WP_.078763344 69,8 70,4 64,9 100 65,9 72,2 67,6 72,2 65,4
A. marina_WP_091675221 69,4 68,9 67,2 65,9 100 68,1 69,4 65,4 86,6
N. potens_.WP_.017594871 67 69,1 63,3 72,2 68,1 100 71,9 76,2 63,9
A. hymeniacidonis_WP_069846166 66,1 65,1 64 67,6 69,4 71,9 100 66,1 66,8
N. trehalosi_WP_067965505 66,7 67,2 63,3 72,2 65,4 76,2 66,1 100 65,9
Saccharothrix sp._WP_033441214 66,3 64,1 63,6 65,4 86,6 63,9 66,8 65,9 100
Ό537] Um alinhamento múltiplo de sequências das sequências de aminoácidos maduras para ME-3 (SEQ ID NO:3), Tfpa (SEQ ID NO:8), Thpa (SEQ ID NO: 10), N. potensJ/VPJ) 17594871 (SEQ ID NO: 12), Ma~ rínactinospora thermotoierans WPJ378763344 (aminoácidos 197 a 381); Amycolatopsis marina WP.091675221 (aminoácidos 193-435); Actinoalloteichus hymeniacidonis WPJ369846166 (aminoácidos 201 a 385); Nocardiopsis trehalosi WP__067965505 (aminoácidos 191 a 375); e Saccharothrix sp. NRRL B-16314 WP...033441214 (aminoácidos 191 a 437) é mostrado na Figura 8. As sequências foram alinhadas com parâmetros padrão com o uso do programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797).
EXEMPLO 13
Efeito da ME-3 protease na digestibihdade de matéria seca de miiho in vitro e produção de gás na fermentação ruminal
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164/172 [0538] Os efeitos da ME-3 protease foram avaliados na digestibilidade de matéria seca (DMD), produção de gás, digestibilidade de amido e pH em um sistema de fermentação em batelada in vitro com o uso de milho dentado como substrato (moído a 4 mm). A eficácia de enzima foi avaliada em três doses (0,25, 0,5 e 0,75 mg/g de substrato de ração) em três execuções separadas com quatro réplicas por dose de enzima em cada execução. A efetividade da ME-3 foi determinada no padrão de fermentação ruminal após a incubação do conteúdo ruminal tamponado com substrato e enzima em frascos de soro de 160 ml por 7 h a 39°C.
[0539] Os experimentos foram baseados no protocolo estabelecido e publicado anteriormente (Adesogan, A.T., Krueger, N.A., e Kim, S.C. 2005. Anim. Feed Sci. Technol. 123: 211 a 223). O milho dentado utilizado neste sistema de fermentação de lote in vitro tinha 88,8% de matéria seca (MS), 9,3% de proteína bruta (PB), 3,2% de fibra em detergente ácido (FDA), 8,3% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (FDNa), 76,9% de carboidratos não fibrosos (CNF), 88,0% de nutrientes digestíveis totais (NDT). O milho dentado moído (4 mm) foi pesado em 6 replicações por rodada nos sacos de filtro F57 (ANKOM Technology, Macedon, NY).
[0540] Antes da colocação nos frascos, a amostra de enzima foi diluída em 0,1 M de tampão citrato-fosfato (pH 6,0) e adicionada a 0,5 g de milho dentado moído em sacos F57 (Krueger, N. A. e A. T. Adesogan. 2008. Anim. Feed Sci. Tech. 145: 84 a 94; Goering, Η. K. e P. J. Van Soest. 1970. Agric. Handbook No. 379. ARS USDA, Washington, DC, página 20). As bolsas de filtro F57 foram vedadas com um Uline Tabletop Poly Bag Sealer (Impulse® tipo AIE-200) e colocados imediatamente nos recipientes de fermentação (frascos de soro de 160 ml). Frascos em branco que consistem em apenas um saco de filtro, bem
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165/172 como controles contendo apenas milho dentado moído sem enzima foram também incluídos. Fluido ruminal foi aspirado representativamente de três vacas leiteiras, Holstein lactantes e ruminalmente canuladas 2 a 3 h após o consumo de ração total misturada (TMR). A composição de ingrediente TMR alimentada às vacas leiteiras fistulizadas com base na matéria seca consistia de 38,2% de silagem de milho, 27,3% de milho com casca moído, 14,5% de farinha de soja com 44% de proteína bruta, 9,1% de polpa cítrica, 4,5% pré-mistura de engorda em confinamento, 4,0% de feno de alfafa em mela florescência, 1,8% de suplemento energético (MS Specialty Nutrition, Dundee, IL), 0,5% de Novasil (BASF, Alemanha), 100% no total.
[0541] O fluido ruminal coletado foi filtrado através de quatro camadas de morim antes de misturar com saliva artificial pré-aquecida (39 °C). A composição da saliva artificial incluiu uma solução micromineral de CaCIz^HzO, MnCl2-4H2O, COCI2 6H2O, FeCl2-6H2O: uma solução macromineral de Na2HPO4-12H2O, KHsPCU MgSO4-7H2O; uma solução tampão de (NH^HCCh e NaHCOs; uma solução de peptona tripticase (Tryptone, Sigma-Aldrich, Louise St, MO, E.U.A.); resazurina (indicador de oxirredução) e uma solução de redução contendo cisteína HCI, 1 Μ NaOH, Na2S-9H2O e água destilada. A proporção de volume entre 0 fluido ruminal e a saliva artificial é de 1:2. O fluido ruminal tamponade (52 ml) foi adicionado a frascos de soro de 160 ml contendo os sacos de filtro e os frascos foram fechados com rolhas de borracha e selados com selos de alumínio. Os frascos foram incubados por 7 h a 39°C em um incubador de ar forçado. No final da incubação, os sacos de filtro contendo os resíduos foram secos no forno a 60°C durante 48 h, e pesados para quantificar a DMS. A pressão de gás dentro das garrafas foi medida com um transdutor de pressão e posteriormente convertida em volume de gás em 7 h de incubação. Foi utilizada a seguinte fórmula para a conversão da pressão de gás para volume de gás:
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Volume de gás (ml) = (pressão de gás (psi) * 4,8843) + 3,1296 [0542] A equação foi formulada com base nas condições do experimento, utilizando frascos de soro de 160 ml e é utilizada para todos os experimentos da Tabela 10 e 11.
[0543] Análise estatística: Para os experimentos descritos neste Exemplo, os dados coletados foram analisados utilizando-se o procedimento GLIMMIX do SAS (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Os experimentos foram concebidos como projeto de bloco completamente aleatorizado, onde cada rodada foi considerada um bloco. A dose foi usada como efeito fixo no modelo quando a enzima foi testada a diferentes doses. A variável de resposta incluiu DMS in vitro e produção de gás. A rodada foi considerada um fator aleatório. Os efeitos fixos do modelo incluíram o tempo de amostragem para os parâmetros de fermentação medidos em diferentes horas de pós-incubação. O procedimento UNIVARIATE do SAS foi utilizado para testar os resíduos de valores atípicos e normalidade antes das análises finais serem realizadas. Os efeitos do tratamento foram declarados significativos a P< 0,05, enquanto quaisquer tendências foram definidas a 0,05 < P < 0,10.
[0544] Os resultados mostrados na Tabela 10 abaixo indicam que, sob as condições de fermentação ruminal in vitro, a protease ME-3 teve a capacidade para promover produção de gás e DMD de uma maneira em resposta à dosagem.
Tabela 10. Efeitos da enzima exógena (ME-3) suplementada em diferentes doses na digestibilidade de matéria seca in vitro, produção de gás, níveis de pH e digestibilidade de amido com o uso de grão de miiho dentado como substrato.
Variáveis ME-3 como mg/g do substrato de ração Estatísticas
Dose de ME-3 0 0,25 0,50 0,75 SE Valor p
DMD, % 13,9C 16,4b 17,8ab 18,7b 0,60 <0,01
Produção de gás, ml 8,77b 11,9a 12,7a 12,8a 0,44 <0,01
pH 6,67 a 6,44b 6,38b 6,42b 0,06 <0,01
Digestibilidade de amido, % 21,4 20,8 23,5 23,7 2,26 0,74
a~cAs médias dentro c e uma inha com diferentes sobrescritos diferem
(P< 0,05).
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EXEMPLO 14
Avaliação adicional da ME-3 Protease como uma Protease de Liquefação [0545] Estudos de liquefação-SSF foram realizados em que a serina protease termoestável, ME-3, foi adicionalmente testada em liquefaçâo e sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de milho em escala laboratorial. Farinha de milho moída de uma planta de etanol comercial foi usada para gerar uma pasta fluida a 33% de sólidos secos adicionando-se uma mistura 6:4 em p/p de água de torneira:recuo de uma planta de etanol comercial à farinha. O pH foi ajustado até 5,1 com H2SO4 e, posteriormente, SPEZYME® HT-WB (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi dosado a uma dose comercial relevante. A mistura foi incubada a 85°C por 20 minutos. Posteriormente, a pasta fluida foi fervida por 10 minutos a 100°C e subsequentemente resfriada por 10 minutos a 85°C. Outra dose de SPEZYME® HT-WB foi adicionada, e, além disso, a ME-3 protease foi adicionada a uma concentração final de 3, 4, 5 ou 6 ug/gDS. A liquefação foi estendida por mais 2 horas sob agitação constante com 0 uso de um misturador suspenso. Uma amostra de controle foi gerada adicionando-se nenhuma protease à liquefaçâo. Após a incubação, a amostra de milho tratada (liquefeito) foi coletada e usada em um experimento de SSF subsequente.
[0546] O pH das amostras de liquefeito (com e sem ME-3 protease adicionada à reação de liquefaçâo) foi ajustado a 4,8 e uma alfa amilase fúngica, uma glicoamilase fúngica e uma trealase fúngica foram adicionadas a uma dose relevante a cada vaso de SSF contendo 98 gramas de liquefeito. Posteriormente, 2 ml de uma cultura de levedura propagada (SYNERXIA® Thrive, Dupont) foram adicionados e, subsequentemente, ureia e FERMGEN™ 2,5x (produto comercial DuPont contendo
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168/172 uma protease fúngica ácida) foram adicionados a diferentes concentrações conforme indicado na Tabela 11. Os experimentos foram realizados em quadruplicata.
[0547] Os vasos de fermentação foram incubados a 32°C em uma incubadora de ar forçado a 150 rpm. As amostras foram coletadas em cinco pontos de tempo diferentes (16 h, 24 h, 40 h, 48 h e 54 horas). Essas amostras foram analisadas quanto à concentração de etanol, concentração de glicerol, gordura hidrolisada com ácido e análise de proteína bruta conforme descrito abaixo.
[0548] Para a determinação da concentração de etanol e glicerol, as amostras de fermentação foram centrifugadas por 3 minutos 12.000 g. 50 ul de H2SO4 1 N foram adicionados a 500 ul de sobrenadante e deixados à temperatura ambiente por 5 minutos. A amostra foi diluída 11x em água destilada e filtrada através de um filtro de 0,2 pm antes da análise por HPLC. As condições de executado de HPLC (Thermo Scientific UltiMate 3000) foram da seguinte forma: Ácido Orgânico Phenomenex® Rezex™ (ROA), coluna de 300 x 7,80 mm mantida a 65°C, executada a fluxo isocrático de 0,7 ml/min de solvente de H2SO4 0,01 N, volume de injeção de 20 μΙ, e tempo de execução de 23 min. A detecção de índice de refração foi usada para quantificação de etanol e glicerol. Os resultados são mostrados na Tabela 11 (glicerol) e Tabela 12 (etanol).
[0549] Materiais de final de fermentação foram também analisados em Midwest Laboratories (13611 B Street Omaha, Nebraska 68144) quanto à gordura hidrolisada com ácido (0 método AOAC 954.02 foi usado com as seguintes exceções: tubos de éter etílico e éter PET de 15 ml em vez de vasos de 25 ml, e tubos digí em vez de tubos mojonnier) e análise de proteína bruta (protocolo AOAC 990.03). Os resultados são mostrados na Tabela 11.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 179/195
169/172 [0550] A análise do material obtido a partir do final da fermentação revelou que o tratamento com ME-3 resultou em níveis mais altos de proteína bruta e gordura hidrolisada com ácido, o último sugerindo rendimento de óleo de milho potencialmente mais alto em uma planta de etanol. Adicionalmente, os níveis de glicerol revelaram ser mais baixos para liquefeitos tratados com ME-3, o que é percebido como positivo na indústria em combinação com o rendimento de etanol mais alto.
[0551] A Tabela 11 mostra os resultados de medir os níveis de gordura hidrolisada com ácido, proteína bruta e glicerol no final da fermentação (54 horas) obtidos com o uso de diferentes doses de ME-3. ND indica não determinado.
Tabela 11. Efeito da adição de ME-3 protease à liquefação no teor de giicerol, proteína e gordura residual.
Concentração de ureia (ppm) Concentração de ME-3 (ug/gDS) Gordura Hidrolisada com Ácido (% em peso seco) Proteína Bruta (% em peso seco) % em P/V de Gliceroi
600 0 11,5 16,8 1,55 (+/-0,01)
240 3 ME-3 12,3 17 1,51 (+/-0,02)
240 4 ME-3 ND ND 1,49 (+/-0,02)
240 5 ME-3 ND ND 1,47 (+/-0,01)
240 6 ME-3 12,4 19,4 1,48 (+/-0,01)
Ό552] O rendimento de etanol foi também determinado (conforme descrito no Exemplo 7) e os resultados mostram que, quando ME-3 foi adicionada em várias concentrações durante a liquefação e SSF subsequentes, um efeito de resposta à dosagem claro e uma taxa mais rápida de produção de etanol foram observados, conforme relatado na Tabela
12. Ademais, foi constatado que os níveis de etanol no final da fermentação (54 horas, Tabela 12) foram ligeiramente mais altos para os liquefeitos tratados com ME-3.
Tabeía 12. Rendimento de etano!
Condição horas % em V/V de Etano!
600 ppm de ureia - 0,07 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X 16 8,29 (+/-0,22)
3 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 16 8,44 (+/-0,21)
4 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 16 8,75 (+/-0,1)
5 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 16 8,93 (+/-0,11)
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 180/195
170/172
| 6 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 16 9,14 (+/-0,07)
!
| 600 ppm de ureia - 0,07 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X 24 11,8 (+/-0,06)
i 3 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 24 12,16 (+/-0,08)
| 4 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 24 12,6 (+/-0,14)
| 5 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 24 12,89 (+/-0,09)
| 6 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 24 13,13 (+/-0,05)
!
1 600 ppm de ureia - 0,07 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X 40 15,7 (+/-0,1)
| 3 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 40 15,78 (+/-0,08)
i 4 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 40 15,96 (+/-0,08)
| 5 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 40 16,13 (+/-0,03)
| 6 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 40 16,12 (+/-0,07)
| 600 ppm de ureia - 0,07 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2,5X 48 16,16 (+/-0,09)
| 3 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 48 16,24 (+/-0,07)
| 4 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 48 16,34 (+/-0,07)
i 5 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 48 16,47 (+/-0,06)
| 6 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 48 16,43 (+/-0,08)
!
1 600 ppm de ureia - 0,07 SAPU/gDS de FERMGEN™ 2.5X 54 16,29 (+/-0,05)
i 3 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 54 16,4 (+/-0,05)
| 4 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 54 16,44 (+/-0,06)
| 5 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 54 16,41 (+/-0,05)
i 6 ug/gDS de ME3 - 240 ppm de ureia 54 16,41 (+/-0,06)
[0553] Em outro estudo, a dosagem de ME-3 foi c uplicada durante
a líquefação. Foi constatado que SSF subsequentes poderíam ser realizadas com o uso da protease de SSF a um nível normal sem a necessidade de qualquer ureia. Assim, foi constatado que não apenas toda ureia podería ser substituída, mas a taxa de formação de etanol assim como o rendimento de etanol final (medido em 53 horas) foram aumen tados em comparação ao controle conforme mostrado na Tabela 13.
Tabeia 13. Efeito de ME-3 protease no rendimento de etanol quando adicionada duas vezes durante a etapa de íiquetaçâo.
Tempo de sacarificaçâo (h)
ME-3 (ug/gDS) Ureia (ppm) FERMGEN™ (SAPU/gDS) 24 30 47 53
0 600 0,07 12,6 15,1 15,4 15,7
3 240 0 12,6 15,1 15,6 15,7
6 0 0,07 12,8 15,4 16,1 16,4
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171/172 [0554] Nesse estudo, miolos do milho (Arie Blok Animal Nutrition, NL-3440 AA Woerden, Artnr: 3777) foram moídos com o uso de uma máquina de trituração Retsch ZM200 com as configurações: tela de 3 mm, 10k rpm. A farinha de milho moída foi usada para gerar uma pasta fluida a 32,64% de sólidos secos adicionando-se uma mistura 1:1 de água de tomeira/recuo de uma planta de etanol comercial à farinha. O pH foi ajustado até 5,5 com H2SO4 e, posteriormente, SPEZYME® RSL (produto comercial DuPont contendo uma alfa amilase bacteriana) foi dosado a uma dose comercial relevante. Subsequentemente, a ME-3 protease foi adicionada a uma concentração final de 0, 3 ou 6 ug/g de DS e a mistura foi incubada a 85°C por duas horas sob agitação constante com 0 uso de um misturador suspenso. Uma amostra de controle foi gerada adicionando-se nenhuma protease à liquefaçâo. Após a incubação, a amostra de milho tratada (liquefeito) foi coletada e usada em um experimento de SSF subsequente.
[0555] O pH das amostras de liquefeito (com e sem ME-3 protease adicionada à reação de liquefaçâo) foi ajustado a 4,8 e uma alfa amilase fúngica, uma glicoamilase fúngica e uma trealase fúngica foram adicionadas a uma dose relevante a cada vaso de SSF contendo 98 gramas de liquefeito. Posteriormente, 2 ml de uma cultura de levedura propagada (SYNERXIA® Thrive, Dupont) foram adicionados e, subsequentemente, ureia e FERMGEN™ 2,5x (produto comercial DuPont contendo uma protease fúngica ácida) foram adicionados a diferentes concentrações conforme indicado na Tabela 13. Os experimentos foram realizados em duplicata.
[0556] Os vasos de fermentação foram incubados a 32°C em uma incubadora de ar forçado a 150 rpm. As amostras foram coletadas em quatro pontos de tempo diferentes (24 h, 30 h, 47 h e 53 horas). Essas amostras foram analisadas quanto à concentração de etanol com 0 uso de separação e quantificação de HPLC conforme descrito abaixo.
Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 182/195
172/172 [0557] As amostras de fermentação foram centrifugadas por 7 minutos 15.000 g. O sobrenadante foi diluído 11x em H2SO4 0,01 N e filtrado através de um filtro de 0,22 pm antes da análise por HPLC. As condições de execução de HPLC (Agilent Technologies série 1200) foram da seguinte forma: coluna Phenomenex Rezex™ RFQ-Fast Acid H+ retida a 80°C, execução a fluxo isocrático de 1,0 ml/min de solvente de H2SO4 0,01 N, um volume de injeção de 10 μΙ e um tempo de execução de eluição de 5,3 min. A detecção de índice de refração foi usada para quantificação de etanol, e os resultados são mostrados na Tabela
13.

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produzir um serina protease termoestável, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) transformar um hospedeiro de produção com um construto recombinante que codifica uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10; e (b) cultivar o hospedeiro de produção da etapa (a) a uma temperatura acima de 37,5°C para aumentar o nível de expressão da serina protease termoestável.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a serina protease termoestável é opcionalmente recuperada do hospedeiro de produção.
  3. 3. Sobrenadante de cultura, caracterizado pelo fato de que contém serina protease termoestável obtido pelo método, como definido na reivindicação 1 ou 2.
  4. 4. Ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão, caracterizada pelo fato de que compreende um serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, em que a dita serina protease termoestável pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.
  5. 5. Ração de animal, caracterizado pelo fato de que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, em que a serina protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 20 g/t de ração e adicíonalmente em que a dita serina protease termoestável pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta.
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    2/6
  6. 6. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para uso em ração de animal que compreende adicionalmente 10 e pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propllenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.
  7. 7. Composição de aditivo de ração granulada caracterizada pelo fato de que é para uso em ração de animal que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10, usada sozinha ou em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta, em que a composição de aditivo de ração granulada compreende partículas produzidas por um processo selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração de leito fluidizado, revestimento por pulverização de leito fluidizado, secagem por pulverização, secagem por congelamento, compressão, resfriamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, formação de tablete ou qualquer combinação dos processos acima.
  8. 8. Composição de aditivo de ração granulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas é maior que 50 microns e menor que 2.000 microns.
  9. 9. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição é em uma forma líquida.
    Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 185/195
    3/6
  10. 10. Composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita composição é em uma forma líquida adequada para a secagem por aspersão em um pélete de ração.
  11. 11. Método para hidrolisar material que contém amido caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) colocar o material que contém amido em contato com um líquido para formar uma massa; e (b) hidrolisar amido no mingau para formar um liquefeito colocando-se a massa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o coquetel de enzimas compreende adicionalmente pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em alfa-amilase, amiloglucosidase, fitase, pululanase, beta-glucanase, celulase e xilanase.
  13. 13. Método para produzir produtos de fermentação a partir do material que contém amido caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) liquefazer o material que contém amido com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10;
    (b) sacarificar o produto da etapa (a);
    (c) fermentar com um organismo adequado; e (d) opcionalmente, recuperar o produto produzido na etapa (c).
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) são realizadas simultaneamente.
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    4/6
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a adição de uma fonte de nitrogênio é eliminada ou reduzida em pelo menos 60% com o uso de 1 a 20 g de serina protease termoestável/t de material que contém amido que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs:3, 8 ou 10.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que, quando o produto de fermentação é etanol, então, nenhuma enzima proteolítica ácida é necessária na etapa (c) mediante o uso de 1 a 20 g de serina protease termoestávei/t de material que contém amido que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
  17. 17. Método para reduzir a viscosidade de um material, caracterizado pelo fato de que contém amido liquefeito que compreende colocar uma pasta fluida de material que contém amido em contato com uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
  18. 18. Método para extrair óleo de uma cultura de semente oleaginosa, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) colocar uma fração de semente oleaginosa que contém óleo em contato com um agente de extração aquoso para formar uma fração de semente oleaginosa de extrato; e (b) separar a fração de semente oleaginosa extraída em uma fase aquosa, uma emulsão de óleo em água e uma fase insolúvel;
    (c) colocar a emulsão de óleo em água em contato com pelo menos uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs:3, 8 ou 10, sozinha ou em combinação com pelo menos uma fosfolipase, sob condições que permitem a atividade enzimática durante tempo suficiente para desestabilizar a emulsão; e (d) separar a emulsão desestabilizante da etapa (c) em uma
    Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 187/195
    5/6 fase aquosa, uma fase oleosa e uma fase insolúvel para obter óleo a partir da semente oleaginosa.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fração de semente oleaginosa é de soja, semente de milho, semente de colza, caroço de palma, semente de girassol, semente de açafrão, coco, amendoim, semente de algodão, semente de gergelim, semente de linhaça, semente de papoila, amêndoa, avelã, noz, semente de prímula, semente de uva, semente de cânhamo, semente de groselha negra, semente de framboesa vermelha, semente de cenoura, semente de cominho, semente de mirtilo, semente de oxicoco, semente de salsa, semente de cebola, semente de abóbora, semente de abricó, semente de mostarda, semente de linho, semente de mamona ou jatrofa.
  20. 20. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fração de semente oleaginosa compreende uma fração de proteína que é útil como um alimento, ingrediente alimentar, um aditivo alimentar ou suplemento alimentar.
  21. 21. Óleo derivado de planta caracterizado pelo fato de que é preparado pelo processo, como definido na reivindicação 18.
  22. 22. Ração, alimento para animais, composição de aditivo de ração, pré-mistura, alimento ou produto de grão, caracterizado pelo fato de que compreende o óleo, como definido na reivindicação 21.
  23. 23. Método para preparar um mosto, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) colocar o material que contém amido que compreende uma mistura de grãos moídos em contato com água e uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10 para formar uma massa;
    b) aquecer lentamente a massa da etapa (a) para converter o amido em açúcares; e
    Petição 870190069869, de 23/07/2019, pág. 188/195
    6/6
    c) separar a massa aquecida da etapa (b) em grão residual e mosto líquido em que a protease termoestável está presente em uma quantidade de 1 a 30 g/t de grão moído.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma alfa-amilase é adicionada na etapa (a) juntamente com a serina protease termoestável.
  25. 25. Método para hidrolisar pelo menos um subproduto animal ou alimentar, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) colocar o subproduto animal ou alimentar em contato com um líquido; e (b) hidrolisar subproduto animal ou alimentar na massa para formar um liquefeito colocando-se em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o subproduto alimentar é material rico em queratina selecionado dentre o grupo que consiste em pena, pelo e lã.
  27. 27. Método para hidrolisar proteínas em biomassa lignocelulósica, caracterizado pelo fato de que compreende (a) colocar a biomassa em contato com um líquido; e (b) hidrolisar as proteínas na biomassa colocando-se a biomassa em contato com um coquetel de enzimas que compreende uma serina protease termoestável que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 3, 8 ou 10.
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