CN101155925A - 处理生物质以获得乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了利用生物催化剂生产乙醇的方法,所述生物催化剂能发酵从已处理过的生物质获得的糖。糖通过在高固体浓度和低氨浓度的条件下预处理生物质,随后糖化而获得。
Description
本申请要求2005年4月12日递交的美国临时申请60/670437号的利益。
政府权利的声明
本发明是由于美国政府扶持而作出的,受能源部门授予的合同号04-03-CA-70224的约束。政府在本发明中享有一定的权利。
发明领域
本发明提供了利用由处理生物质得来的可发酵糖来生产乙醇的方法。特别地,通过在高固体和低氨浓度的条件下预处理生物质,及随后的糖化作用获得糖,该糖被用于发酵,该发酵通过使用产乙醇生物催化剂进行。
发明背景
纤维素和木素纤维素(lignocellulosic)原料及废物,例如农业残留物、木材、森林废物、来自纸制造的淤渣、城市和工业固体废物,为生产化学药品、塑料制品、燃料和饲料提供了潜在的大量的能再生原料。由碳水化合物聚合物组成的纤维素和木素纤维素原料及废物,一般通过许多化学手段、机械手段和酶手段来处理,以释放出主要的己糖和戊糖,它们随后可发酵成有用的产品,其中所述碳水化合物聚合物包含纤维素、半纤维素、葡聚糖和木质素。
使用预处理方法使得糖化作用酶更容易接触纤维素和木素纤维素原料的碳水化合物聚合物。标准的预处理方法先前主要是在高温下使用强酸;但是,由于高能量消耗、高设备花费、高预处理催化剂回收费用和与糖化作用酶的不相容性,正在开发替代的方法,例如酶催化预处理,或在更温和的温度下使用酸或碱,在此温度时,预处理期间生物质碳水化合物聚合物的水解减少,需要改良的酶系统来糖化纤维素和半纤维素。
许多利用碱的预处理方法已被推荐。Gould(Biotech.and Bioengr.(1984)26:46-52)公开了一种利用过氧化氢(H2O2)预处理木质纤维素生物质的方法。该处理方法在H2O2与底物的重量比至少为0.25时最有效率。
Teixeira,L.,等(Appl.Biochem.and Biotech.(1999)77-79:19-34)公开了一系列的利用化学计算量的氢氧化钠和氢氧化铵,并使用很低的生物质浓度预处理生物质的方法。溶液和生物质的比例为14∶1。
Elshafei,A.等(Bioresource Tech.(1991)35:73-80)研究了使用NaOH预处理玉米秸秆。
Kim,T.和Y.Lee(Bioresource Technology(2005)96:2007-2013)报导了使用大量氨水预处理玉米秸秆。
专利申请WO2004/081185论述了水解木素纤维素的方法,包括在中等温度、压力和pH条件下,将木素纤维素与化学药品接触;所述化学药品可以是碱,例如碳酸钠或氢氧化钾,pH为约9到约14。
美国专利5,916,780和6,090,595号描述了一种预处理方法,其中评价了阿拉伯糖基木聚糖与总的非淀粉()多糖(AX/NSP)的特定比例,并使用该比例来选择原料。
为成为经济上经得起竞争的方法,从可再生资源生物质中生产燃料的商业方法,需要使用少量的化学药品水解木素纤维素生物质中的碳水化合物来提供高浓度、高收率(yields)的糖,以提供低毒性可发酵糖的来源,所述糖通过生产燃料的生物催化剂而被使用。
发明概述
本发明提供利用生物质生产乙醇的方法。本发明的方法包括使用相对于生物质干重较低浓度的氨预处理相对高浓度的生物质。预处理后,所述生物质用糖化作用酶聚生体处理,以产生可发酵糖。随后该糖与可发酵该糖并产生乙醇的生物催化剂接触。在本发明的一个实施方式中,所述方法包括:
a)将生物质与含有氨的水溶液接触,其中氨的存在浓度为至少足够维持所述生物质-氨水混合物的碱性pH的浓度,但其中所述氨的存在量相对生物质干重小于约12%(重量),且进一步地,其中所述生物质的干重形成相对所述生物质-氨水混合物重量至少约15%(重量)的高固体浓度;
b)将步骤(a)的产物与糖化作用酶聚生体在适当的条件下接触,以生产可发酵糖;和
c)将步骤b)的产物与合适的生物催化剂在合适的发酵条件下接触,以生产乙醇。
附图简述
图1显示了存在或不存在乙酰胺和乙酸时运动发酵单孢菌8b(已在美国专利申请公布2003/0162271A1,实施例IV,VI和XII中描述)的生长。
发明详述
申请人明确地将所有引用文献的全部内容合并到此公开中。此外,当量、浓度或其他数值或参数作为范围、优选范围或一列较高优选值和较低优选值给出时,要理解为明确地公开了由任何一对任何较高范围界限或优选值和任何较低范围界限或优选值组成的所有的范围,无论范围是否单独公开。当此文引用数值范围时,除非另作说明,该范围预期包括其端点,以及该范围内的所有整数和分数。申请人并不期望本发明的范围局限于界定范围时列举的特定值。
本发明以以下方式提供利用生物质生产乙醇的方法:来源于生物质的糖随后被用作微生物生长的碳源,该微生物可使乙醇作为其新陈代谢的产物。通过使用相对生物质干重较低浓度的氨预处理相对高浓度的生物质,以从生物质中释放出糖。随后,氨处理过的生物质用糖化作用酶聚生体消化,以生产可发酵糖。该糖是用于微生物生长的发酵底物,或用作可生产乙醇(乙醇原(ethanologen))的生物催化剂的发酵底物。
定义:
在此公开中,使用了许多术语。现提供以下的定义:
术语“可发酵糖”指可在发酵过程中被微生物用作碳源的寡糖和单糖。
术语“木素纤维素的”指含有木质素和纤维素的组合物。木素纤维素原料也可含有半纤维素。
术语“纤维素的”指含有纤维素的组合物。
生物质的“干重”是指已除去或基本上已除去所有水的生物质的重量。干重通常根据American Society for Testing and Materials(ASTM)标准E1756-01(测定生物质中总固体量的标准测试方法)测量,或根据Technical Association of the Pulp and Paper Industry,Inc.(TAPPI)标准T-412om-02(纸浆、纸和纸板中的湿度)测量。
“可来源于生物质”的乙醇是通过以下方法生产出的乙醇,即,生物被水解以释放可发酵糖,而该可发酵糖通过使用至少一种生物催化剂而被发酵,以生产乙醇。
术语“增塑剂”和“软化剂”指导致沿着聚合物链或聚合物链间的分子间粘合力减少的材料。这样的材料可用来,例如,减少结晶度,或断裂木质素和非木质素碳水化合物纤维(例如纤维素或半纤维素)间的键。
术语“糖化作用”指从多糖生产可发酵糖。
“生产可发酵糖的合适的条件”指例如PH、介质的组成和温度等条件,在该条件下糖化作用酶是有活性的。
“合适的发酵条件”指支持通过生物催化剂增加和产生乙醇的条件。这样的条件可包括pH、营养和其他介质成分、温度、大气和其他因素。
术语“预处理的生物质”意味着在糖化作用前已经经受预处理的生物质。
“生物质”指任何纤维素或木素纤维素原料,且包括含有纤维素,并任选地进一步含有半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质也可含有额外的成分,例如蛋白质和/或脂质。根据本发明,生物质可来自于单一来源(source),或者生物质可包含来自于不止一个来源的混合物;例如,生物质可含有玉米穗轴和玉米秸秆的混合物,或草和树叶的混合物。生物质包括,但不限于,生物能作物、农业残留物、城市固体废物、工业固体废物、来自纸制造的淤渣、场地废物、树林和森林废物。生物质的例子包括,但不限于,谷粒、玉米穗轴、作物残余例如谷皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秆、大麦、大麦秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、由谷物加工获得的成分、树、树枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和矮树、蔬菜、水果、花和厩肥。在一个实施方式中,对本发明有用的生物质包括具有相对高的碳水化合物值、相对致密和/或相对容易收集、转移、储存和/或操作的生物质。在本发明的一个实施方式中,有用的生物质包括玉米穗轴、玉米秸秆和甘蔗渣。
为本发明的目的,“含有氨的水溶液”指在水介质中使用氨气(NH3);含有铵离子(NH4 +)的化合物,例如氢氧化铵或硫酸铵;一旦降解就释放出氨的化合物,例如尿素;以及它们的组合。
用于本方法中的氨的浓度,最低限度的浓度为足够维持所述生物质-氨水混合物的pH为碱性,且最大限度为相对生物质干重小于约12%(重量)。此低浓度的氨足够用于预处理,且所述低浓度也可相对生物质干重少于约10%(重量)。相对生物质干重为6%的很低浓度,或更低浓度的氨,也可用于预处理。碱性意味着pH大于7.0。特别合适的是,生物质-氨水混合物的pH大于8。在一个实施方式中,氨的存在相对生物质干重少于约10%(重量)。特别合适的是,氨相对生物质干重少于约6%(重量)。
用于本方法的氨具有超过其他碱的优势。氨分为液相和气相。气态氨可比液体碱更容易地扩散穿过生物质,导致在更低浓度下更有效的预处理。此文实施例10中,氨也显示通过氨解作用而与生物质中乙酰基酯(acetyl esters)的水解相竞争,形成乙酰胺。对某些生产乙醇的发酵生物体,例如运动发酵单孢菌来说(此文实施例11中证实),乙酰胺比乙酸盐的毒性更低。所以,乙酰基酯转化成乙酰胺而不是乙酸,降低了除去乙酸的需要。使用氨也减少了在用氮源发酵期间补充生长培养基的需求。另外,氨是廉价的原料,所以提供了经济的方法。氨也可在预处理期间或预处理之后被再循环(recycle)到所述预处理反应器中,所以能提供更经济的方法。例如,在预处理之后,当温度降到适合糖化时,氨气可被释放,可任选地在真空下被释放,且可被再循环。在连续法中,氨可被连续地再循环。
根据本方法,含有氨的水溶液可任选地包含至少一种额外的碱,例如氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙。所述至少一种额外的碱的添加量和铵结合起来形成的总碱量,相对生物质干重少于约20%(重量)。优选地,第二种碱加上氨的总量少于约15%(重量)。额外的碱可被用于,例如,中和生物质中的酸、为糖化作用酶提供金属离子,或为发酵生长培养基提供金属离子。
在本方法中,生物质干重的初始浓度为所述生物质-氨水混合物重量的至少约15%到最大约80%。更合适地,所述生物质干重的浓度为所述生物质-氨水混合物重量的约15%到约60%。保持所述生物质-氨水混合物中生物质的高百分比,以使得为用于发酵而将由预处理的生物质的糖化作用产生的糖进行浓缩的需求最小化。生物质的高浓度也减少了预处理材料的总体积,使该方法更经济。
可直接使用得自所述来源的生物质,或者可对所述生物质施加能量以减小尺寸、增加暴露出的表面积,和/或增加氨以及该方法第二步中使用的糖化作用酶对存在于所述生物质中的纤维素、半纤维素、和/或寡糖的可利用性。可用于减小尺寸、增加暴露表面积、和/或增加氨以及糖化作用酶对存在于所述生物质中的纤维素、半纤维素、和/或寡糖的可利用性的能量手段包括,但不限于,研磨、压碎、碾磨、撕碎、切碎、盘式精制(disc refining)、超声和微波。可在预处理之前或期间、糖化作用之前或期间,或同时在上述时间内,施加能量。
用氨溶液预处理生物质在任何合适的容器中进行。通常,该容器是可经受压力、具有加热机构、且具有混合内容物的机构的容器。商业上可获得的容器包括,例如,Zipperclave反应器(AutoclaveEngineers,Erie,PA)、Jaygo反应器(Jaygo Manufacturing,Inc.,Mahwah,NJ)和蒸汽枪反应器(在一般性方法中描述;Autoclave Engineers,Erie,PA)。也可使用具有相似性能的大型反应器。或者,所述生物质和氨溶液可在一个容器中混合,随后转移到另一个反应器中。此外,生物质可在一个容器中预处理,随后进一步在另一个反应器例如蒸汽枪反应器(在一般性方法中描述;Autoclave Engineers,Erie,PA)中处理。
在将所述生物质与含有氨的水溶液接触之前,可对含有所述生物质的容器施加真空。通过由气孔抽空生物质中的空气,可使氨较好地穿透进入所述生物质。施加真空的时间长短和施加到生物质的负压量将取决于生物质的类型,且可根据经验确定,以实现所述生物质的最佳预处理(通过糖化作用后可发酵糖的产量来测定)。
生物质与含氨水溶液的接触可发生在约4℃到约200℃的温度。生物质与氨在4℃初始接触,在此温度进行浸渍,发现与未预处理的天然生物质相比,增加了糖化作用效率。在另一个实施方式中,所述生物质的接触在约75℃到约150℃的温度进行。在另一个实施方式中,所述生物质的接触在高于90℃到约150℃的温度进行。
生物质与含氨水溶液的接触进行长达约25小时。可进行更长的预处理时间,但由于实践和经济的原因,可优选更短的时间。通常的氨接触处理时间约为8小时或更少。更长的时间能提供以下好处,即减少应用能量以分解生物质的需要,所以,可优选长达约25小时的时间。
在一个实施方式中,所述预处理过程可在相对高的温度进行相对较短的时间,例如在约100℃到约150℃时预处理约5分钟到约2小时。在另一个实施方式中,所述预处理过程可在更低温度下进行相对长的时间,例如在约75℃到约100℃时预处理约2小时到约8小时。在另一个实施方式中,所述预处理过程可在室温(约22-26℃)下进行约24小时的更长的时间。也可使用其他介于这些温度和时间之间的温度和时间。
对于所述预处理过程,温度、预处理时间、氨浓度、一种或多种额外碱的浓度、生物质浓度、生物质类型和生物质粒径都是相关的。所以,这些变量可以按需要调整,以获得用来和糖化作用酶聚生体接触的最佳产物。
可在所述预处理过程(即步骤(a))中添加增塑剂、软化剂,或它们的组合,例如多元醇(例如,甘油、乙二醇),多元醇的酯(例如甘油单乙酸酯),乙二醇醚(例如二甘醇),乙酰胺,乙醇和乙醇胺。增塑剂可作为氨水溶液的成分、作为单独的溶液,或作为干燥成分被加入。
所述预处理反应可在任何合适的容器中进行,例如间歇式反应器或连续反应器。本领域的技术人员将认识到在更高温度下(高于100℃),需要压力容器。所述合适的容器可装备例如叶轮的装置,用于搅动所述生物质-氨水混合物。反应器设计已在Lin,K.-H.,和VanNess,H.C.(在Perry,R.H.和Chilton,C.H.(eds),化学工程师手册,5th版(1973)第4章,McGraw-Hill,NY)中论述过。所述预处理反应可以分批法进行,或以连续法进行。
本领域的技术人员都熟知氮源是在发酵期间微生物生长所必需的;所以,在预处理期间使用氨提供了氮源,并减少或消除了对发酵期间使用的生长培养基补充氮源的需要。如果预处理产物的pH超过了糖化作用酶有活性时的pH,或者超过了适合发酵期间微生物生长的范围,可利用酸来降低pH。用来达到理想pH的酸的量可导致形成一定浓度的抑制糖化作用酶或抑制微生物生长的盐。为了减少达到理想pH所需酸的量,和减少在该预处理过程中NH3的原料花费,氨气可从所述预处理反应器中排出并再循环。通常,至少一部分氨被除去,其减小了pH,但留下了一些氮,提供此营养用于后续的发酵。
为了从生物质中获得足够量的糖,所述生物质可用氨水溶液预处理一次或多次。同样地,糖化作用反应可进行一次或多次。预处理过程和糖化作用过程如果需要都可以重复,以获得更高收率的糖。为分别地或共同地评估所述预处理过程和糖化作用过程的效果,可确定从起始生物质中获得的糖的理论收率并与测定的收率比较。
糖化作用
在预处理之后,产物含有氨、部分降解的生物质和可发酵糖的混合物。在进一步处理之前,可通过施加真空从预处理过的生物质中去掉氨。去掉氨降低了pH,所以可用更少的中和用的酸来获得对糖化作用和发酵理想的pH。这导致了在预处理混合物中较低的盐含量(load)。通常残余一些氨,需要其为发酵提供氮源。
随后,所述预处理混合物进一步在存在糖化作用酶聚生体时被水解,以在水解产物中释放出寡糖和/或单糖。糖化作用酶和生物质处理方法在Lynd,L.R.,等(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66:506-577)中已有综述。在一个优选实施方式中,含有可溶性和不溶性成分的整个预处理混合物被用于糖化作用反应中。
在另一个实施方式中,在糖化作用前,含有氨和已溶解的糖的水成部分(aqueous fraction)可以和剩余在混合物中的不溶性微粒分离开来。用于从不溶性部分分离可溶性部分的方法,包括但不限于,倾析和过滤。所述不溶性微粒可被再循环到预处理反应器中。所述不溶性微粒可任选地用水溶剂(例如水)洗涤,以在被再循环到所述预处理反应器前除去吸附的糖。所述不溶性部分随后,如上述预处理一样,可用氨水溶液进行另外的处理,随后使用糖化作用酶聚生体糖化。在糖化之前,所述可溶性部分也可使用合适的方法,例如蒸发,而被浓缩。
在糖化之前,所述预处理产物可被处理以改变pH、组成或温度,以便糖化作用酶聚生体的酶将是有活性的,从而为生产可发酵糖提供合适的条件。可通过添加固体或液体形式的酸来改变pH。作为选择,二氧化碳(CO2)可被用来降低pH,CO2可从发酵中回收。例如,CO2可从发酵罐收集,并且可例如通过鼓泡进料到预处理产物中,同时监控pH,直到达到理想的pH。温度可被控制在适合糖化作用酶活性的温度,如以下所描述的。可加入在糖化作用中使用的酶的活性所需的任何辅因子。
所述糖化作用酶聚生体包含一种或多种主要选自“糖苷酶”的酶,但并不排除其他酶,其中所述糖苷酶水解二糖、寡糖和多糖的醚键,并属于一般类“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(EnzymeNomenclature 1992,Academic Press,San Diego,CA with Supplement 1(1993),Supplement 2(1994),Supplement 3(1995,Supplement 4(1997)and Supplement 5[分别见于Eur.J.Biochem.(1994)223:1-5,Eur.J.Biochem.(1995)232:1-6,Eur.J.Biochem.(1996)237:1-5,Eur.J.Biochem.(1997)250:1-6,和Eur.J.Biochem.(1999)264:610-650])中。用于本方法中的糖苷酶可通过它们水解的生物质成分来加以分类。用于本方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如,纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如,木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、乳蛋白酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如,淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。另外,向所述糖化作用酶聚生体中加入其他活性物可能是有用的,例如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木质素酶(ligninases)(EC 1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73),以帮助从生物质的其他成分中释放出多糖。本领域的技术人员熟知,产生多糖水解酶的微生物通常表现出例如降解纤维素的活性,其通过几种或一组具有不同底物专一性的酶催化。所以,来自微生物的“纤维素酶”可能含有一组酶,所有这些酶都可能对纤维素降解行为起作用。商业或非商业的酶制剂,例如纤维素酶,可含有多种酶,这基于为获得该酶所使用的纯化方案。所以,本方法的糖化作用酶聚生体可包含酶活性,例如“纤维素酶”,但应认识到,此活性可由不止一种酶引起。
糖化作用酶可从商业上获得,例如SpezymeCP纤维素酶(Genencor International,Rochester,NY)和Multifect木聚糖酶(Genencor)。另外,糖化作用酶可通过生物学方法生产,包括使用重组微生物。
本领域的技术人员将知道如何确定用于聚生体中的酶的有效量,以及如何调节条件以达到最佳酶活性。本领域的技术人员也将知道,如何使聚生体内所需酶活性的等级最优化,以在选择的条件下获得既定预处理产物的最佳糖化作用。
优选地,在或接近最适合所述糖化作用酶的温度和pH下进行所述糖化作用反应。用于本方法中糖化作用酶聚生体的最适温度为约15℃到约100℃之间。在另一个实施方式中,最适温度为约20℃到约80℃之间。最适pH可在约2到约11之间。在另一个实施方式中,用于本方法中糖化作用酶聚生体的最适pH在约4到约10之间。
糖化作用可进行约几分钟到约120小时的时间,且优选从约几分钟到约48小时。反应时间将取决于酶的浓度和比活,以及所用的底物和环境条件,例如温度和pH。本领域的技术人员将很容易地确定用于特定底物和糖化作用酶聚生体的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化作用可分批式或以连续法进行。糖化作用也可在一个步骤中完成,或者在多个步骤中完成。例如,糖化作用所需的不同酶可能表现出不同的最适pH或最适温度。可在一种温度和pH下用酶进行一次处理,其后用不同的酶在不同的温度和/或pH下,进行第二次或第三次(或更多次)处理。另外,可在相同pH和/或温度,或不同的pH和温度,已有顺序的步骤用不同的酶处理,例如使用在较高pH和温度时稳定且更有活性的半纤维素酶之后,使用在较低pH和温度时具有活性的纤维素酶。
在糖化作用后,来自生物质的糖的溶解程度,可通过测定单糖和寡糖的释放监控。测定单糖和寡糖的方法是本领域技术人员熟知的。例如,还原性糖的浓度可使用1,3-二硝基水杨酸(DNS)分析来确定(Miller,G.L.,Anal.Chem.(1959)31:426-428)。作为选择,糖可如此文一般性方法部分所述,通过使用合适的柱的HPLC法来测定。
从生物质中释放出的可发酵糖可被合适的微生物使用以生产乙醇。在糖化作用后,但在发酵之前,所述糖化作用混合物可通过例如蒸发作用被浓缩,以增加可发酵糖的浓度。任选地,糖化作用产物中的液体可与固体以分批法或连续法分离开来。任选地,在发酵前,所述液体或全部糖化作用产物可被灭菌。根据发酵期间使用的微生物和糖化作用期间使用的pH,可调节pH到适合发酵的程度。另外,所述糖化作用混合物可被补充以微生物生长所需的额外营养素。添加物可包括,例如,酵母抽提物、特殊氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和微量元素。也包括生产由特定生物催化剂产生的特定产物所需的成分,例如维持质粒的抗生素或酶催化反应中所需的辅因子。另外也包括额外的糖,以增加糖的总浓度。所述糖化作用混合物可用作发酵液的成分,例如,组成最终培养基的约100%到约10%之间。通过调节用于生物催化剂增加和产生乙醇的这些类型的因子来达到合适的发酵条件。
也可根据对发酵微生物有用的条件调节温度和/或顶空气体。发酵可以是好氧的或厌氧的。发酵可在糖化作用之后进行,或通过同时的糖化和发酵(SSF)而与糖化作用同时进行。SSF可保持由糖化作用产生的糖处于低水平,从而减少对所述糖化作用酶的潜在的产物抑制,减小污染微生物的糖可利用性,并提高预处理生物质转化为单糖和/或寡糖的转化率。
糖发酵成乙醇可通过一种或多种合适的生物催化剂以单个或多个步骤的发酵来进行。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母菌的微生物。生物催化剂可为野生型微生物或重组微生物,且包括埃希氏菌属、发酵单孢菌属()、酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属和梭菌属。在另一个实施方式中,生物催化剂可选自重组大肠埃希氏菌、运动发酵单孢菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭菌、热解糖梭菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)和毕赤酵母。
用于发酵以产生乙醇的生物催化剂已被描述,且其他生物催化剂可发现,通过突变产生,或通过重组手段制造。可利用本方法生产出的可发酵糖的任何生物催化剂,都可通过本方法中的发酵而用来制造乙醇。
通过产溶剂梭菌将碳水化合物发酵成乙醇丙酮和丁醇(ABE发酵)已是熟知的(Jones和Woods(1986)Microbiol.Rev.50:484-524)。在US 5192673描述了利用丙酮丁醇梭杆菌的突变株生产丁醇、丙酮和乙醇的发酵方法。在US 6358717描述了使用拜氏梭菌突变株生产丁醇、丙酮和乙醇。大肠杆菌的基因修饰菌株也被用作生物催化剂来生产乙醇(Underwood等,(2002)Appl.Environ.Microbiol.68:6263-6272)。在US 2003/0162271A1中描述了运动发酵单孢菌的基因修饰菌株,其提高了乙醇产量。
将生物质预处理和糖化成可发酵糖,其后使糖发酵成乙醇在本文实施例9举例说明,其例示了利用运动发酵单孢菌作为生物催化剂,从预处理的玉米穗轴生产乙醇的过程。
利用生物催化剂在发酵中产生的乙醇可利用本领域已知的各种方法来回收。可通过离心、过滤、微量过滤和纳米膜过滤技术而将产物与其他发酵成分分离。可通过离子交换、溶剂萃取或电渗析提取产物。可使用絮凝剂帮助分离产物。一个具体实施例中,对于ABE发酵,可利用本领域的已知方法,将生物生产的(bioproduced)乙醇与发酵培养基分离(参见例如,Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-648(1998),Groot等,Process.Biochem.27:61-75(1992)以及其中的参考文献)。例如,可通过离心、过滤、倾析等等,将固体从发酵培养基中除去。随后,可利用例如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气体反萃取、膜蒸发或全蒸发的方法,将乙醇从发酵培养基中分离。
实施例
一般性方法和材料
下面的缩写被使用:
“HPLC”是高效液相色谱法,“C”是摄氏度,“kPa”是千帕斯卡,“m”是米,“mm”是毫米,“kW”千瓦,“μm”是微米,“μL”是微升,“mL”是毫升,“L”是升,“min”是分,“mM”是毫摩尔每升,“cm”是厘米,“g”是克,“kg”是千克,“wt”是重量,“hr”是小时,“temp”或“T”是温度,“theoret”是理论上的,“pretreat”是预处理,“DWB”是生物质干重。
硫酸、氢氧化铵、乙酸、乙酰胺、酵母抽提物、2-吗啉代乙磺酸(MES)、磷酸钾、葡萄糖、木糖、胰化胨、氯化钠和柠檬酸从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得。
预处理反应器
Zipperclave反应器
4升的Zipperclave反应器(Autoclave Engineers,Erie,PA)是间歇式压力容器,其装备有2.5升的用于装填生物质的Hastelloy桶和用于混合生物质的搅拌器。所述反应器容器环绕有电加热器,其被控制在所需的预处理温度。直接蒸汽注入也可用来快速地使生物质达到预处理温度。调节并控制蒸汽压力以维持所需的预处理温度。由加热Zipperclave反应器的顶板、容器和桶的外部而形成的蒸汽冷凝液排到位于桶和反应器内壁间的蓄水池中,以防止预处理浆料的过度稀释。
Jaygo反应器
Jaygo反应器是由HastelloyC-22合金制造的130升(约51cm直径×91cm长)的卧式桨型反应器(Jaygo Manufacturing,Inc.,Mahwah,NJ)。该反应器装备有蒸汽套,可加热到约177℃(862kPa)。也可直接注入蒸汽以快速地将生物质升温到预处理温度。调节并控制蒸汽压力以维持所需的预处理温度。众多的进出口可供注入其他溶剂和热液体。
蒸汽枪反应器分批消化系统
4升的蒸汽枪反应器(Autoclave Engineers,Erie,PA)是有蒸汽套的反应器,由102mm长的schedule 80Hastelloy管组成,通过两个球阀封闭。额外的电加热器可放置在反应器的所有暴露的、无套的表面,并控制在预处理设定点温度。直接蒸汽注入也可用来快速地将生物质升温到预处理温度。调节并控制蒸汽压力以维持所需的预处理温度。反应器的底部颈缩到51mm。所有的预处理原料都从反应器底部的可置换模具(die)排出,并被收集在0.21m3的尼龙(Hotfill)袋内,该尼龙袋支撑在厚壁的、有套的和冷却的闪蒸罐中。
盘式精制机
盘式精制机是Sprout Waldron型30.5cm的精制机(Andritz,Inc.,Muncy,PA),其装备有11kW的马达。固定台和旋转台的间距是可变的。进料螺旋速度也是可变的,从0到88rpm。精制机的入口用六个注射口改进,以允许引入蒸汽、热水或其他刚好在旋转精制机台之前的尾气和尾液。精制机装备有平台(plates)(Durametal,Corp.,Tulatin,OR),其为Ni-Hard材料的D2A506式或Ni-Hard材料的18034-A式。
预处理和酶促水解反应器(PEHR)
9L的PEHR(在NREL,Golden,CO建造;参见同时待审的US专利申请CL3447)具有约15cm×51cm的不锈钢反应容器和用于引入处理反应物的注射喷枪。所述注射喷枪利用回转接头与在容器一端的盖子上的进出口连接,其具有另一个用于容器通道的进出口。四个挡板沿容器壁的长度延伸,且垂直地附在容器壁上。挡板和在容器中自由漂浮的二十二个3.2×3.2cm的陶瓷研磨介质柱体(cylinder)(E.R.Advanced Ceramics,East Palestine,OH)在当所述容器旋转时,对生物质和反应物施加机械混合,促进反应物被生物质吸收。PEHR反应器被置于Bellco细胞产生辊装置(Bellco Cell-ProductionRoller Apparatus)上(Bellco Technology,Vineland,NJ),该装置可提供旋转机构,并且具有辊装置的反应器被容纳在提供热量的温度控制室中。可通过将外部设备(external sources)与盖上的连有喷枪的进出口相连,对反应容器施加真空和压力。
分析方法
纤维素定量
每个起始生物质样品中的纤维素量都利用本领域熟知的方法测定,例如ASTM E1758-01“通过HPLC测定碳水化合物的标准方法”。
糖、乙酰胺、乳酸和乙酸含量的测定
在糖化液里的可溶性糖(葡萄糖、纤维二糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)、乙酰胺、乳酸和乙酸通过HPLC(Agilent Model 1100,Agilent Technologies,Palo Alto,CA)、利用Bio-Rad HPX-87P柱和Bio-Rad HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)以及适当的保护柱来测定。测定样品的pH,如果需要则用硫酸调节到5-6。样品随后通过0.2μm注射器过滤器,直接进入HPLC管形瓶。HPLC运行条件如下:
Biorad Aminex HPX-87P(用于碳水化合物):
注入体积:10-50μl,取决于浓度和检测器的限度
流动相:HPLC级水,0.2μm过滤并脱气
流速:0.6ml/分
柱温:80-85℃,保护柱温度<60℃
检测器温度:尽可能地与主柱中的温度相近
检测器:折光率检测器
运行时间:35分钟数据采集时间加上15分钟的运行后时间(postrun)(对于后洗脱化合物可能的调整)
Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物、乙酰胺、乳酸、乙酸和乙醇)
注入体积:5-10μl,取决于浓度和检测器的限度
流动相:.01N硫酸,0.2μm过滤并脱气
流速:0.6mL/分
柱温:55℃
检测器温度:尽可能地与柱的温度相近
检测器:折光率检测器
运行时间:25-75分钟数据采集
运行后,样品中的每种化合物的浓度都从标准曲线中测定。
实施例1
在高生物质浓度、高温下预处理秸秆以及氨浓度的比较
在引入生物质进料(charge)之前,通过将蒸汽循环至反应器中并排气几次,而将Zipperclave反应器的容器和顶板预先加热到目标预处理温度。在预处理之前,形成于预热期间的冷凝液通过真空抽吸被除去。Hastelloy桶装有0.635-cm(1/4-in.)研磨的秸秆(100g,基于干重计)并被插入预热的反应器中。当向容器内部和生物质进料施加真空(约85kPa)时,反应器搅拌器被设为20rpm。使用喷雾式喷嘴将氢氧化铵溶液靠近容器的底部注入,所述氢氧化铵溶液的浓度根据需要,使得相对于生物质-氨水混合物的重量计算,以干重计的生物质的浓度为30%重量,并达到如表1所示的所需的氨浓度()。测试样品的最终氨浓度相对生物质的干重为12%,同时最终氨浓度相对生物质的干重为35%的样品被用来作对照。当生物质进料的温度达到50℃,从靠近反应器的底部引入蒸汽,以使生物质进料流动,并升高生物质进料的温度至140℃或170℃。在预处理结束时,通过排气冷凝器(vent condenser)使反应器压力降低,并在打开反应器和回收预处理的生物质之前,施加真空(约85kPa)3分钟,以降低温度并从所述预处理浆料中除去额外的氨。
总共,含有0.5g纤维素(基于初始原料组分)的未洗涤的预处理浆料以最终体积50mL加入到125mL的摇瓶中。因为酶对高pH环境的敏感性,所以在加入酶之前,加入乙酸(10-100μl)来滴定氨-预处理生物质的pH到5.0。通过添加50mM的柠檬酸盐缓冲液来控制糖化作用期间的pH在5.0,且维持温度在50℃。SpezymeCP纤维素酶(Genencor International,Rochester,NY)按表1所列的对于每种样品的浓度加入。在96hr的糖化作用后,根据一般性方法中描述的糖测定方案来确定所产生的糖化液中的糖含量。96hr后的糖释放量显示在表2中。本实验的对照是1)未处理的玉米秸秆,其产生葡萄糖理论产量的23%(使用56mg纤维素酶/g纤维素)和2)蒸汽(140℃)预处理的玉米秸秆,其产生葡萄糖理论产量的40%(使用56mg纤维素酶/g纤维素);对照样品没有测定木糖。
表1:从经过96hr糖化作用的预处理玉米秸秆中释放出的糖
DWB:生物质干重
氨(g/100gDWB) | 预处理温度(℃) | 预处理时间 | 纤维素酶(mg/g纤维素) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
35 | 170 | 5min | 56 | 68.0 | 60.0 |
12 | 170 | 5min | 56 | 58.5 | 45.3 |
12 | 170 | 5min | 11 | 40.8 | 27.1 |
35 | 140 | 5min | 56 | 54.5 | 41.5 |
12 | 140 | 5min | 56 | 53.0 | 31.4 |
12 | 140 | 5min | 11 | 38.9 | 17.1 |
12 | 140 | 15min | 56 | 62.4 | 49.6 |
12 | 140 | 15min | 11 | 41.7 | 33.6 |
这些结果显示,使用12%的氨,在140℃预处理15分钟,其后糖化,比使用35%的氨,在140℃预处理5分钟释放出更多的葡萄糖和木糖。所以,可通过少量增加预处理时间而体现出使用较低浓度氨的优势。
实施例2
在高生物质浓度、低温和很低氨浓度时预处理秸秆
Jaygo反应器装有0.635cm的研磨秸秆(13kg,基于干重计)。向容器施加真空(67.7kPa),并注入稀释的氢氧化铵溶液,使得氨浓度为6.2g氨/100g生物质干重,且以干重计的生物质相对生物质-氨水混合物总重量的浓度为30%(重量)。解除真空,对所述套管施加蒸汽以加热所述秸秆至100℃。浸湿的秸秆在此温度保持8hr并以32rpm持续混合,随后让其冷却过夜,同时继续混合所产生的浆料。
总共,含有0.5g纤维素(基于初始原料组分)的未洗涤的预处理浆料以50mL的最终体积被加入到125mL的摇瓶中。因为酶对高pH环境的敏感性,所以在加入酶之前,如果需要,则加入乙酸(10-100μl)来滴定氨-预处理生物质的pH到5.0。通过添加50mM的柠檬酸盐缓冲液来控制糖化作用期间的pH在5.0,且维持温度在50℃。SpezymeCP纤维素酶(Genencor International,Rochester,NY)被加到56mg/g纤维素。在96hr的糖化作用后,根据一般性方法中描述的糖测定方案来确定所产生的糖化液中的糖含量并显示在表2中。
表2.从96hr时预处理的玉米秸秆中释放的糖
氨(g/100gDWB) | 预处理温度(℃) | 预处理时间 | 纤维素酶(mg/g纤维素) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
6.2 | 100 | 8hr | 56 | 63.9 | 44.8 |
此结果显示这些很低的氨浓度和低温预处理条件,(预处理8hr的时间)和使用12%的氨在140℃预处理15分钟一样有效。
实施例3
在高生物质浓度、低温和很低氨浓度时预处理穗轴,随后进行
高生物质浓度的糖化
完整或断裂的玉米穗轴(约13kg,基于干重计)被装入Jaygo反应器中。穗轴经过装备有平台C-2975的盘式精制机(参见一般性方法)而被断裂。所产生的断裂穗轴通过1.27cm的筛子。任何留下的穗轴都再次通过具有0.5cm的更小间距的盘式精制机。对容器施加真空,并注入稀释的氢氧化铵溶液,以提供表3中指定的最终需要的氨浓度(2%或6%)和干生物质浓度(30%或40%)。解除真空,且向所述套管施加蒸汽以加热穗轴(当浸湿时),对于完整穗轴样品加热至93℃,对于断裂穗轴样品加热到85℃。短时增大搅拌器速度(最大到96rpm),以增加加热速度。浸湿的穗轴在此温度保持4或8hr并以32rpm持续混合,随后在继续混合下让其冷却过夜。
在从反应器中除去预处理生物质之前,使所述反应器处于90℃时的真空下,以从预处理生物质中除去氨。在糖化作用前,用固体柠檬酸调节预处理穗轴生物质的pH至5.5。大约10kg的预处理完整穗轴在Jaygo反应器中于50℃糖化。约1400g的预处理断裂穗轴被加入到PEHR反应器中,连同22个陶瓷研磨柱体(3.2cm直径×3.2cm长;E.R.Advanced Ceramics,East Palestine,OH),进行糖化作用。28mg/g(未处理秸秆中的)纤维素的Spezyme CP加上28mg/g纤维素的Multifect Xylanase的酶混合物被用于每个糖化反应中。在每次糖化作用开始时,相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量,最终的以干重计的生物质浓度为30%。PEHR反应器以19rpm轴向旋转同时维持50℃的温度。根据一般性方法中的糖测定方案来确定所产生的糖化液中的糖含量。96hr后的糖释放量显示在表3中。
表3.在糖化期间使用高浓度生物质(以干重计)从预处理玉米穗轴中释放出的糖
DWB生物质干重(百分比是相对混合物的总重量计算的)
原料 | 预处理时间(hr) | 预处理温度(℃) | 氨(g/100gDWB) | DWB(预处理) | DWB(糖化) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
完整穗轴 | 8hr | 93 | 6 | 40% | 30% | 54.4 | 46.1 |
断裂穗轴 | 4hr | 85 | 2 | 30% | 30% | 42.1 | 19.1 |
实施例4
在高生物质浓度、高温和很低氨浓度预处理穗轴,其后进行高
生物质浓度糖化
断裂玉米穗轴(13kg,基于干燥品计算)被装进Jaygo反应器中。在所述反应器被抽真空后,具有合适浓度的氢氧化铵溶液被泵入所述反应器中,并在室温下以32rpm混合,以提供2%的氨和30%的生物质干重浓度。容器中的容纳物随后通过低压套管蒸汽(jacket steam)加热到95℃。一旦反应器达到95℃,使用直接蒸汽注入加热反应器中的容纳物至145℃。当反应器达到145℃时,利用套管蒸汽和一些直接注入的蒸汽使反应器容纳物在此温度保持20分钟。20分钟后,通过所述排气口对所述反应器抽真空并开启撕碎马达5分钟。1hr后,开启冷却水使其进入所述套管。Jaygo反应器中的容纳物被冷却至33℃到37℃之间;随后使用CO2使反应器加压到138kPa。使加压的CO2气压维持30分钟。反应器容纳物的最终温度在27℃到31℃之间。浸湿的/预处理的生物质的pH约为7.5。
从Jaygo反应器中移去预处理的生物质并转移到PEHR反应器中糖化,其中糖化作用开始时,相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量,最终的以干重计的生物质浓度为30%。随后用固体柠檬酸调节pH至5.5,且如实施例3中描述的,材料用28mg/g纤维素的Spezyme CP和28mg/g(未处理穗轴中的)纤维素的MultifectXylanase消化。所产生糖化液中的糖含量根据一般性方法中的糖测定方案来确定。96hr消化后的糖释放量显示在表4中。
表4.在糖化作用期间利用高浓度生物质(以干重计)从预处理玉米穗轴中释放出的糖
原料 | 预处理时间(hr) | 预处理温度(℃) | 氨(g/100gDWB) | DWB(预处理) | DWB(糖化) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
断裂穗轴 | 20分钟 | 145 | 2 | 30% | 30% | 35.9 | 45.4 |
实施例5
添加增塑剂的预处理
完整穗轴如实施例3中所描述的,在100℃于Jaygo反应器中预处理8hr,其中,相对生物质-氨水混合物的总重量,以干重计的生物质浓度约为30%,氨相对生物质干重为2%(重量),加入相对生物质干重为3%(重量)的甘油作为增塑剂。预处理之后,所产生材料的pH用固体柠檬酸调节到5。预处理的穗轴随后如实施例3中描述的一样被消化。使用28mg/g(未处理秸秆中的)纤维素的Spezyme CP加上28mg/g(未处理穗轴中的)纤维素的Multifect Xylanase的酶混合物。96hr的消化后,葡萄糖浓度为92.3g/L且木糖浓度为54.4g/L。
实施例6
预处理的生物质的盘式精制
用具有低浓度氨(12%)或对比氨浓度(35%)的不同样品,采用表5所列的温度、时间和酶条件,以实施例1中描述的方式预处理秸秆。如实施例3中所述,用具有很低氨浓度(3%或6%)的不同样品,并用表5所列其他条件,预处理完整穗轴。预处理之后,样品通过SproutWaldron盘式精制机。固定台和旋转台的间距设为0.254mm(0.010英寸)且进料螺旋速度为7rpm。精制后的原料如实施例2中描述的一样被糖化且所产生的糖化液中的糖含量根据一般性方法中的糖测定方案来确定。96hr的糖化作用结果如表5所示。结果显示通过在糖化作用前盘式精制,获得了更好的可消化性,或使用更低的酶浓度是有效的。
表5.在糖化前经过盘式精制的预处理原料的可消化性
原料 | 预处理时间 | 预处理温度(℃) | 氨(g/100gDWB) | 纤维素酶(mg/g纤维素) | 添加的木聚糖酶(mg/g纤维素) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
秸秆 | 5mm | 170 | 35 | 56 | 0 | 87.3 | 72.5 |
秸秆 | 5min | 140 | 35 | 56 | 0 | 76.9 | 59.4 |
秸秆 | 5min | 170 | 12 | 56 | 0 | 58.8 | 39.9 |
秸秆 | 5min | 170 | 12 | 28 | 28 | 68.4 | 62.3 |
秸秆 | 5min | 140 | 12 | 56 | 0 | 69.1 | 48.6 |
秸秆 | 5min | 140 | 12 | 11 | 0 | 52.6 | 31.5 |
秸秆 | 15min | 140 | 12 | 56 | 0 | 61.8 | 40.1 |
秸秆 | 15min | 140 | 12 | 28 | 28 | 66.7 | 54.1 |
秸秆 | 8hr | 100 | 6 | 56 | 0 | 79.9 | 59.6 |
穗轴 | 8hr | 93 | 6 | 56 | 0 | 82.4 | 51.7 |
穗轴 | 8hr | 93 | 6 | 28 | 28 | 83.1 | 58.6 |
穗轴 | 8hr | 100 | 2 | 56 | 0 | 68.0 | 38.5 |
穗轴 | 8hr | 100 | 2 | 28 | 28 | 81.0 | 57.3 |
实施例7
预处理生物质的蒸汽枪处理
如实施例1描述的,利用以下条件在Jaygo反应器中预处理秸秆:相对生物质-氨水混合物的总重量为30%的生物质干重;相对DWB为6%(重量)的氨;100℃;预处理8hr。如实施例3描述的,利用以下条件在Jaygo反应器中预处理穗轴:相对生物质-氨水混合物的总重量为40%的生物质干重;相对DWB为6%(重量)的氨;93℃;预处理8hr。每种预处理的生物质的样品被独立地装入4L的蒸汽枪反应器中。预处理的材料在通过模具(die)释放之前在170℃处理5min,或在140℃处理20min。所产生的材料如实施例2中描述的一样被糖化。结果在下表6中给出。结果显示,在糖化作用前的蒸汽枪处理提高了葡萄糖的释放量。
表6.蒸汽枪处理后的预处理材料的可消化性
原料 | 蒸汽枪温度(℃) | 蒸汽枪时间(min) | 纤维素酶(mg/g纤维素) | 添加的木聚糖酶(mg/g纤维素) | 葡萄糖释放量(%theoret) | 木糖释放量(%theoret) |
秸秆 | 170 | 5 | 56 | 0 | 77.5 | 37.5 |
秸秆 | 170 | 5 | 28 | 28 | 82.5 | 64.4 |
秸秆 | 140 | 20 | 56 | 0 | 73.4 | 43.4 |
秸秆 | 140 | 20 | 28 | 28 | 82.2 | 66.9 |
穗轴 | 170 | 5 | 28 | 28 | 70.7 | 47.4 |
穗轴 | 170 | 5 | 11 | 11 | 49.1 | 38.9 |
穗轴 | 140 | 20 | 28 | 28 | 55.7 | 39.0 |
穗轴 | 140 | 20 | 11 | 11 | 32.9 | 24.0 |
实施例8
用氨再循环的预处理模型
用Aspen模型(Aspen Technologies,Cambridge,MA,version 12.1)研究两种预处理方案的氨再循环的优点:低温(85℃)、长停留时间(4hr)和高温(130℃)、短停留时间(20min)。在每个模型中,在预处理反应器后有一连串的三个在连续降低的压力下操作的闪蒸罐,提供氨再循环装置。当原料流进入每个罐中,由于压力的减少,其分成蒸汽部分和液体部分。蒸汽部分被再循环到预处理中,而液体部分继续进入该方法的下一步。假设氨相对DWB为2%(重量),生物质干重相对预处理中生物质-氨水混合物的总重量约为27%,每种方法中提供的新鲜的氨和来自再循环流的氨显示在表7中。在两种模型中,闪蒸罐以相同方式操作,以便使氨再循环也相同。对于这两种方案,多于一半的所需氨是通过再循环来提供的,减少了新鲜氨的需求和费用。
表7.预处理中氨的再循环-Aspen模型结果
高T/短停留时间 | 低T/长停留时间 | |||
氨进入到预处理的流速(kg/hr) | 占预处理中总氨的百分数 | 氨进入到预处理的流速(kg/hr) | 占预处理中总氨的百分数 | |
新鲜NH3 | 518.6 | 43.5% | 520.2 | 43.7% |
来自第1闪蒸罐 | 371.2 | 31.2% | 374.4 | 31.4% |
来自第2闪蒸罐 | 137.2 | 11.5% | 135.4 | 11.4% |
来自第3闪蒸罐 | 164.1 | 13.8% | 161.2 | 13.5% |
总计 | 1191.2 | 100% | 1191.2 | 100% |
实施例9
从经低浓度氨预处理并经糖化的穗轴生物质中生产乙醇,并与
经高浓度氨预处理并经糖化的秸秆比较
如实施例3中描述,穗轴水解产物是通过在Jaygo反应器中,用相对生物质干重为6%(重量)的氨,在生物质干重相对生物质-氨水混合物总重量的浓度为40%(重量)时,在93℃预处理完整穗轴8hr而产生的。预处理之后,通过在真空下加热反应器到90℃来除去氨。随后用硫酸调节预处理生物质的pH到5。预处理生物质在Jaygo反应器中、在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为30%时,在50℃、pH 5时,用28mg/g纤维素的Spezyme纤维素酶和28mg/g纤维素的Multifect木聚糖酶来糖化168hr。所产生的水解产物用于在Sixfors发酵罐(INFORS AG,Switzerland)中的运动发酵单孢菌8b的发酵。运动发酵单孢菌8b是运动发酵单孢菌的菌株,其已被基因工程化,以提供提高的、超过野生型的乙醇产量,且在美国专利申请公布2003/0162271A1(实施例IV,VI和XII)中描述过。穗轴水解产物含有78g/L葡萄糖、51g/L木糖、6g/L乙酰胺和7g/L的乙酸。穗轴水解产物在40%和80%的浓度下使用,培养基中其余物质为由酵母抽提物和KH2PO4组成的浓缩水介质,其中酵母抽提物和KH2PO4的量使得它们在最终浆料中的浓度分别约5g/L和2g/L。另外,在40%水解产物浆料中,加入葡萄糖和木糖,其量足以使葡萄糖和木糖的浓度达到80%水解产物浆料中相同的水平。发酵在37℃进行。发酵罐中的搅拌为100rpm,并通过添加2N KOH保持pH在5.5。结果显示在表8中。糖和乙醇按一般性方法中描述的进行分析。
为了对比,如实施例1中所述的,秸秆水解产物是通过在Zipperclave反应器中,用相对生物质干重为35%(重量)的氨、在生物质干重相对生物质-氨水混合物总重量的浓度约为30%(重量)时,在170℃预处理秸秆5分钟而产生的。预处理的生物质,在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为30%时、在50℃、pH 5时,用224mg/g纤维素的Spezyme CP纤维素酶来进行酶促消化,以为发酵测试产生高糖浓度水解产物。所产生的水解产物包含88g/L葡萄糖、52g/L木糖、9g/L乙酸和15g/L乳酸。为乙醇生产,运动发酵单孢菌8b依靠40%或80%(v/v)水解产物浆料而发酵。剩余的体积由含有酵母抽提物、KH2PO4和MES缓冲剂的浓缩的水介质组成,酵母抽提物、KH2PO4和MES缓冲剂的量使得它们在最终浆料中的浓度分别为约10g/L、2g/L和0.1M。另外,在40%水解产物浆料中,加入的葡萄糖和木糖的量足以使葡萄糖和木糖的浓度达到80%水解产物浆料中相同的水平。发酵在30℃和pH6时,在25ml摇瓶中,以20ml的工作体积进行。使搅动维持在150rpm。关于穗轴水解产物发酵样品的分析和结果在表8中给出。
表8.穗轴和秸秆水解产物的发酵中糖利用和乙醇产量
秸秆(120hr终点) | 穗轴(72hr终点) | |||
40%水解产物 | 80%水解产物 | 40%水解产物 | 80%水解产物 | |
使用的葡萄糖 | 100% | 97% | 99% | 97% |
使用的木糖 | 90% | 16% | 96% | 57% |
产生的乙醇 | 77% | 53% | 98% | 87% |
这些结果显示,从用低浓度氨预处理的穗轴水解产物发酵产生乙醇要比用高浓度氨预处理秸秆并发酵产生乙醇更有效率。
实施例10
在预处理期间乙酰胺的形成
分析由按实施例3和实施例4中描述的方法预处理的穗轴得到的样品,来确定生物质中乙酰基团的归宿。按以下方法,检验预处理液(除去不溶性固体的预处理混合物)中乙酸和乙酰胺的含量。用H2SO4(72%)调节每个样品的pH到约3。为测定乙酰胺,样品通过0.2μm的过滤器并根据以下列出条件用HPLC来分析。为测定总乙酸基(包括以乙酸和乙酰胺形式存在的乙酸基),酸化的样品在121℃高压灭菌1hr;乙酰胺在此步骤中定量地(quantitatively)转化成乙酸。高压灭菌后,让样品冷却。随后,样品通过0.2μm过滤器进入样品瓶并根据以下列出的条件分析。乙酸的浓度和乙酰胺的浓度从各自的标准曲线上确定。
流动相:0.01N H2SO4,0.2μm过滤并脱气
流速:0.6mL/min
柱温:55-65℃
检测器温度:尽可能与柱温接近
检测器:折光率检测器
运行时间:60min
柱:Biorad Aminex HPX-87H柱及相应保护柱
3种不同的预处理条件分析的结果显示在表9中。每种情况中,所有的乙酰基基团都以乙酸或乙酰胺形式溶解。
表9.在预处理期间,生物质中的乙酰基团向乙酰胺的转变
DWB,生物质干重。(百分数是相对生物质-氨水混合物的总重量计算出来的)
原料 | 预处理时间(hr) | 预处理温度(℃) | 氨(g/100gDWB) | DWB(预处理) | 液体中回收的初始乙酰基份数 | 以乙酰胺形式回收的乙酰基的份数 | 以乙酸形式回收的乙酰基的份数 |
完整穗轴 | 8hr | 93 | 6 | 40% | 100% | 44% | 56% |
断裂穗轴 | 4hr | 85 | 2 | 30% | 90% | 10% | 90% |
断裂穗轴 | 20min | 145 | 2 | 30% | 99% | 9% | 91% |
利用6%的氨浓度,接近一半的乙酰基团被转化成乙酰胺,如实施例11中显示的,其对生物催化剂的生长无抑制性。
实施例11
乙酰胺和乙酸对运动发酵单孢菌生长的影响
为测试乙酰胺和乙酸的毒性,使运动发酵单孢菌菌株8b(在实施例9中已描述)在pH6.0、具有或没有乙酰胺或乙酸的发酵培养基中生长。发酵培养基包含10g/L酵母抽提物、2g/L KH2PO4、70g/L葡萄糖、40g/L木糖和0.1M MES缓冲剂。运动发酵单孢菌8b分别在无补充物的培养基(对照)、补充有6g/L乙酰胺的培养基、补充有7.2g/L乙酸的培养基中,在30℃,在以150rpm旋转的25mL带挡板的Erlenmeyer摇瓶(baffled Erlenmeyer shake flasks)中生长。如图1所示,乙酰胺的存在对运动发酵单孢菌的生长速度或最终密度没有影响,但是乙酸的存在导致生长速度减小和细胞收率的降低(以细胞干重测定)。
实施例12
在高生物质浓度、高温和很低浓度的氨时预处理甘蔗渣,并以
低和高浓度进行糖化
没有研磨介质的PEHR反应器(在一般性方法中描述过),装有碾磨成1.27cm的甘蔗渣(370g,基于干重计)。这种甘蔗渣是NIST参比材料(Reference Material)RM8491,来自甘蔗克隆(clone)H65-7052,最初从夏威夷含糖种植者协会Kunia分会(Hawaii Sugar PlantersAssociation,Kunia substation,Oahu,HI)获得。它在Wiley研磨机中被碾磨,以通过2mm的筛子,除去精细物质(fines)(+74目)。PEHR反应器容器通过与外表面的冰接触旋转而冷却到4℃。对反应器容器施加真空,并注入稀释的氢氧化铵溶液,使得氨浓度为4g/100g生物质干重,生物质干重浓度为45g/100g总生物质-氨水混合物,其中所述氢氧化铵溶液在4℃的冷室中预先冷却并流过浸没在冰水浴中的管道。装有氨和甘蔗渣的反应器容器通过在旋转的反应器容器的表面使用冰而冷却到4℃,并在4℃旋转30min。此时,容纳物被转移到在一般性方法中已描述过的蒸汽枪反应器中。所述蒸汽枪反应器装有氨-甘蔗渣混合物后,将温度升高到145℃,且所述混合物在此温度维持20分钟。在预处理时间结束时,甘蔗渣通过1-in圆形模具(circular die)从所述蒸汽枪反应器中排放至闪蒸罐中。预处理甘蔗渣的样品随后在摇瓶中糖化,另一样品(大约163g干重)在PEHR反应器中糖化。摇瓶糖化作用在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为5%时进行,而PEHR反应器糖化作用在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为30%时进行。温度维持在50℃。
对于PEHR反应器糖化作用,约476g(~163g干重)预处理的生物质和22个陶瓷研磨柱体(cyclinders)被加入到所述反应器容器中。用固体柠檬酸将pH调节到5.0-5.5。所述反应容器被保持在培养室(incubator chamber)之内,所述培养室被控制在50℃且以19rpm轴向旋转。未预处理的甘蔗渣也在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为5%的条件下,在摇瓶中糖化。所有的糖化作用都是在50℃、pH 5.5时,用28.4mg/g纤维素的Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素的Multifect木聚糖酶糖化96hr。下表10给出的收率是以理论收率的百分数形式给出的释放量。
表10.甘蔗渣预处理和糖化作用后的收率
未预处理5%糖化 | 预处理的5%DWB糖化 | 预处理的30%DWB糖化 | |
单体葡萄糖 | 0.5% | 16.6% | 23.3% |
总葡萄糖 | ND | ND | 36.4% |
单体木糖 | 1.3% | 15.6% | 17.2% |
总木糖 | ND | ND | 37.4% |
ND:未测定
结果证实,与未预处理对照相比,用很低浓度氨预处理甘蔗渣得到大量糖释放,且在PEHR反应器中的干生物质浓度高时,糖化作用在释放糖方面是很有效的。
实施例13
在高生物质浓度、高温和很低浓度氨时预处理黄杨锯末,并以
低和高浓度进行糖化
无研磨介质的PEHR反应器,装有黄杨锯末(596g,基于干重计;从Sawmiller Inc.,Haydenville,OH购得)。对反应器容器施加真空,且注入稀释的氢氧化铵溶液,使得氨浓度为6g/100g生物质干重,生物质干重浓度为44g/100g总生物质-氨水混合物。装有氨和黄杨锯末的反应器容器,如实施例12中所述的方法达到4℃,并在4℃旋转30min。此时,容纳物被转移到蒸汽枪反应器中。所述蒸汽枪反应器装有氨-黄杨混合物后,将温度升高到145℃,且所述混合物在此温度维持20分钟。在预处理时间结束时,黄杨锯末通过1-in圆形模具从所述蒸汽枪反应器中排放入闪蒸罐中。如实施例12中描述的,预处理黄杨锯末的样品随后在摇瓶中糖化,另一样品在PEHR反应器中糖化。摇瓶糖化作用在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为5%时进行,而PEHR反应器糖化作用(使用~279g干重预处理锯末)在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为30%时进行。未预处理的黄杨锯末也在生物质干重相对预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的总重量为5%时,在摇瓶中糖化。所有的糖化作用都是在50℃、pH 5.5时,用28.4mg/g纤维素的Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素的Multifect木聚糖酶糖化96hr。下表11给出的收率是以理论收率的百分数形式给出的每种单糖的释放量。
表11.黄杨锯末预处理和糖化作用后的产量
未预处理 | 预处理的 | 预处理的 |
5%DWB糖化 | 5%DWB糖化 | 30%DWB糖化 | |
单体葡萄糖 | 2.7% | 11.1% | 20.6% |
总葡萄糖 | ND | ND | 30.0% |
单体木糖 | 0% | 17.9% | 18.9% |
总木糖 | ND | ND | 40.2% |
ND:未测定
结果证实,与未预处理对照相比,用很低浓度氨预处理黄杨锯末得到大量糖释放,且在PEHR反应器中的高生物质干重时的糖化作用在释放糖方面比在摇瓶中更有效。
实施例14
通过酵母发酵由经很低浓度氨预处理并经糖化的穗轴生物质得
到的水解产物来生产乙醇
从穗轴的预处理和糖化作用产生的水解产物被用来通过酵母发酵生产乙醇。通过在蒸汽枪反应器中预处理穗轴碎块产生水解产物。第一份穗轴生物质被装在PEHR反应器(已在一般性方法中描述)中,施加真空,并注入稀释的氢氧化铵溶液,使得氨浓度为4g氨/100g生物质干重,生物质干重浓度为30g生物质干重/100g总生物质-氨水混合物。装有氨和穗轴的反应器容器在4℃旋转30min。容纳物被转移到蒸汽枪反应器中(已在一般性方法中描述),温度升高到145℃,且所述混合物在此温度维持20分钟。来自蒸汽枪中的原料被卸到闪蒸罐中,且维持闪蒸罐上的真空以帮助除去氨。调节pH后,预处理生物质在30g生物质干重/100g预处理生物质-糖化作用酶聚生体混合物的浓度下,在50℃、pH 5.5时,用28.4mg/g纤维素的Spezyme CP纤维素酶和10.1mg活性蛋白/g纤维素的酶聚生体糖化72hr,其中酶聚生体由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶组成。
此水解产物用作可发酵糖的来源,用于在摇瓶中通过野生型酿酒酵母而转化成乙醇。水解产物以10%(v/v)浓度使用,其余物质为由10g/L酵母抽提物和20g/L蛋白胨组成的水介质。酵母在250mL的带挡板的瓶中的50ml的培养基中培养。培养物在30℃培养,且以250rpm摇晃24小时。产生的乙醇的量,如实施例9中所述,通过HPLC测定,来自完全相同的烧瓶的结果列在下表12中。
表12.用酵母发酵的底物利用和产物形成
时间零点时的液体 | 摇瓶1,24hr | 摇瓶2,24hr | |
葡萄糖(g/L) | 13.9 | 1.3 | 0.9 |
乙醇(g/L) | 0 | 4.1 | 4.3 |
葡萄糖使用 | 0 | 91% | 94% |
实施例15
在更高干生物质浓度时用很低浓度氨预处理穗轴
完整玉米穗轴用颌式破碎机(2.2kW马达)处理,颌间距(jawspacing)约0.95cm,其后用破碎机(delumper)处理(1.5kW马达,FranklinMiller Inc.,Livingston,NJ),其后用装配有1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛来筛分。约805g的断裂穗轴被装入PEHR反应器中。穗轴中的含湿量约为7%。在装入前,反应器容器中的空气用氮冲洗5次。没有研磨介质的反应器在开始试验之前,在不旋转的情况下被预先加热到75℃。当反应器容器中的温度稳定在75℃时,开启培养箱中的滚动机构并调整转速到19rpm。随后向反应器泵入合适量的稀释的氢氧化铵溶液,所述合适量使得氨浓度为6g氨/100g生物质干重,固体浓度为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物的总重量。乙醇也以1g/100g生物质干重而加入到所述溶液中。氨溶液通过加热到~75℃的水浴中的加热回路(heated loop)而被泵入,该水浴利用2加仑的Parr反应器制成。加热的稀释氢氧化铵溶液通过注射喷枪被注入到所述反应器中且喷洒在断裂穗轴上,所述断裂穗轴在反应器中旋转并翻滚。反应器在75℃维持2hr,同时以19rpm转动。该时间结束时,对所述反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨并使反应器容纳物的温度降低到约50℃。随后向反应器中注入二氧化碳以解除真空,且使用CO2将所述反应器加压到103kPa计示压力并在此压力下、在50℃时保持30min。
在此之后,使反应器压力降低,打开反应器并加入研磨介质。通过使用注射喷枪注入1M、PH 4.8的柠檬酸缓冲液,以增加所述柠檬酸缓冲液浓度至~75mM,并通过添加柠檬酸一水合物,调节容纳物的pH到约5.5。不是所有的氨都在真空步骤中被除去,也不是所有的氨都被CO2中和。在反应器被加热到50℃后,所述柠檬酸缓冲液被注入到反应器中,随后通过将反应器在50℃和19rpm的条件下温育1小时,来让容纳物达到平衡。在旋转反应器时,使用注射喷枪注入柠檬酸缓冲液,让所述缓冲液在预处理的穗轴颗粒上的喷洒和分布更均匀。将反应器从培养箱中移出,打开并测定样品的pH。如果pH大于5.5,那么就添加额外的固体柠檬酸一水合物,且反应器在50℃再混合温育1小时。重复此过程直到pH约为5.5为止。一旦达到理想的pH,向反应器中加入12.9mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白/g纤维素的由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶组成的酶聚生体。所述反应器在50℃和19rpm条件下在培养箱中保持72hr。在此预处理和糖化作用后,单体葡萄糖收率为62.0%且单体木糖的收率为31.0%。总葡萄糖收率为75.2%且总木糖收率为80.3%。
实施例16
在更高固体浓度时,用很低浓度氨和供替换的条件(alternate
condition)预处理穗轴
完整玉米穗轴用锤磨机(10英寸锤磨机,Glen Miils Inc.,Clifton,NH)处理,以通过1.27cm的筛子。约805g的断裂穗轴被装入PEHR反应器中。穗轴中的含湿量约为7%。22个陶瓷研磨柱体(3.2cm直径×3.2cm长;E.R.Advanced Ceramics,East Palestine,OH)也被加入到反应器中。在开始试验前,在不旋转的情况下反应器被预先加热到95℃。在开始前,对反应器容器施加真空(约85kPa),并密封所述容器。当反应器容器中的温度稳定在95℃时,开启培养箱中的滚动机构(rolling mechanism)并调整转速到19rpm。随后向反应器泵入合适量的稀释的氢氧化铵溶液,所述合适量使得氨浓度为6g氨/100g生物质干重,固体浓度为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物的总重量。氨溶液通过在沸水浴中的加热回路而被泵入,该水浴利用2加仑的Parr反应器制成。加热的稀释氢氧化铵溶液通过注射喷枪被注入到所述反应器中且喷洒在断裂穗轴上,所述断裂穗轴在反应器中旋转并翻滚。反应器在95℃维持2hr,同时以19rpm转动。在该时间结束时,对所述反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨并使反应器容纳物的温度降低到约50℃。随后向反应器中注入二氧化碳以解除真空,且所述反应器被加压到103kPa计示压力并在此压力下、在50℃时保持30min。
在此之后,使反应器压力降低,打开反应器并通过使用注射喷枪注入加有柠檬酸一水合物并溶解在其中的PH 4.8的1M柠檬酸缓冲液来调节容纳物的pH到约5.5。在反应器被加热到50℃后,所述柠檬酸缓冲液被注入到反应器中,随后通过在50℃和19rpm的条件下将反应器温育1小时,来让容纳物达到平衡。在旋转反应器时,使用注射喷枪注入柠檬酸缓冲液,让所述缓冲液在预处理的玉米穗轴颗粒上的喷洒和分布更均匀。将反应器从培养箱中移出,打开并测定样品的pH。如果pH大于5.5,那么就添加额外的固体柠檬酸一水合物,且反应器再在50℃混合温育1小时。重复此过程直到pH约为5.5为止。一旦达到理想的pH,向反应器中加入12.9mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白/g纤维素的由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶组成的酶聚生体。所述反应器在50℃和19rpm条件下,在培养箱中保持72hr。在此预处理和糖化作用后,单体葡萄糖收率为50.7%且单体木糖的收率为35.7%。总葡萄糖收率和总木糖收率分别为71.7%和89.8%。
实施例17
用很低浓度的氨和额外的碱预处理穗轴
完整玉米穗轴用颌间距约0.95cm的颌式破碎机(2.2kW马达)处理,其后用破碎机(delumper)处理(1.5kW马达,Franklin Miller Inc.),其后用装配有1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛来筛分。约460g的断裂穗轴被装入PEHR反应器中。穗轴中的含湿量约为7%。在开始试验前,在不旋转的情况下反应器被预先加热到95℃。在开始前,对反应器容器施加真空(约85kPa),并密封所述容器。当反应器容器中的温度重新稳定(re-stabilize)在95℃时,开启培养箱中的滚动机构并调整转速到19rpm。随后向反应器泵入合适量的氢氧化铵溶液,所述合适量使得氨浓度为3.2g氨/100g生物质干重,并加入合适量的NaOH,使得NaOH的浓度为1.9g NaOH/100g生物质干重,并维持固体浓度为30g生物质干重/100g生物质-氨混合物的总重量。氨和额外的碱溶液通过沸水浴中的加热回路而被泵入,该水浴利用2加仑的Parr反应器制成。加热的稀释氢氧化铵溶液通过注射喷枪被注入到所述反应器容器中且喷洒在断裂穗轴上,所述断裂穗轴在反应器中旋转并翻滚。在注入之后,容器上的真空被缓解到大气压力。反应器在95℃维持30分钟,随后温度被降低到85℃并维持4hr。在该时间结束时,对所述反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨并使反应器容纳物的温度降低到约50℃。随后向反应器中注入二氧化碳以解除真空,且所述反应器被加压到103kPa计示压力并在此压力下、在50℃时保持30min。
在此之后,使反应器压力降低,打开反应器并通过注入约75ml的加有柠檬酸一水合物并溶解在其中的pH 4.8的1M柠檬酸缓冲液来调节容纳物的pH到约5.5。在反应器被加热到50℃后,所述柠檬酸缓冲液被注入到反应器中,随后通过将反应器在50℃和19rpm的条件下温育1小时,来让容纳物达到平衡。在旋转反应器时,使用注射喷枪注入柠檬酸缓冲液,让所述缓冲液在预处理的玉米穗轴颗粒上的喷洒和分布更均匀。将反应器从培养箱中移出,打开并测定样品的pH。如果pH大于5.5,那么就添加额外的固体柠檬酸一水合物,且反应器再在50℃混合温育1小时。重复此过程直到pH约为5.5为止。一旦达到理想的pH,向反应器中加入28.4mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor)和28.4mg/g纤维素的Multifect。所述反应器在50℃和19rpm条件下,在培养箱中保持72hr。在此预处理和糖化作用后,单体葡萄糖收率为56.1%且单体木糖的收率为39.5%。总葡萄糖收率和总木糖收率分别为82.8%和84.2%。这些值是2次试验的平均值。
实施例18
室温和很低浓度氨的预处理
完整玉米穗轴用颌间距约3/8英寸的颌式破碎机(2.2kW马达)处理,其后用破碎机(delumper)处理(1.5kW马达,Franklin Miller Inc.),其后用装配有1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛来筛分。约460g的断裂穗轴被装入PEHR反应器中。穗轴中的含湿量约为7%。22个陶瓷研磨柱体(3.2cm直径×3.2cm长;E.R.Advanced Ceramics,East Palestine,OH)也被加入到反应器中。在开始前,对反应器容器施加真空(约85kPa),并密封所述容器。当反应器容器中的温度重新稳定在室温(22-26℃)时,开启培养箱中的滚动机构并调整转速到19rpm。随后向反应器泵入合适量的稀释的氢氧化铵溶液,所述合适量使得氨浓度为4g氨/100g生物质干重且同时维持固体浓度为30g生物质干重/生物质-氨混合物的总重量。稀释的氢氧化铵溶液通过注射喷枪被注入到所述反应器中且喷洒在断裂穗轴上,所述断裂穗轴在反应器中旋转并翻滚。在注入之后,每个容器上的真空都被缓解到大气压力。反应器在室温(22-26℃)维持24hr。在该时间结束时,对所述反应器容器施加真空(约81kPa)30分钟以除去氨。随后向反应器中注入二氧化碳以解除真空,且使用CO2将所述反应器加压到103kPa计示压力,并在此压力下、在室温时保持30min。
在此之后,使反应器压力降低,打开反应器,并通过在加热到50℃后添加柠檬酸一水合物来调节容纳物的pH到约5.5,随后通过在50℃和19rpm的条件下温育反应器来让容纳物达到平衡。将反应器从培养箱中移出,打开并测定样品的PH。如果pH大于5.5,那么就添加额外的固体柠檬酸一水合物,且反应器在50℃混合温育。重复此过程直到pH约为5.5为止。一旦达到理想的pH,向反应器中加入12.9mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白/g纤维素的由β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶组成的酶聚生体。所述反应器在50℃和19rpm条件下,在培养箱中保持72hr。在此预处理和糖化作用后,单体葡萄糖收率为41.7%且单体木糖的收率为25.4%。总葡萄糖收率和总木糖收率分别为50.1%和53.2%。这些值是2次试验的平均值。
Claims (35)
1.一种生产乙醇的方法,所述方法包括:
a)将生物质与含有氨的水溶液接触,其中所述氨的浓度至少足够维持所述生物质-氨水混合物的碱性pH,但其中所述氨的量相对生物质干重小于约12%重量,而且其中所述生物质的干重形成相对所述生物质-氨水混合物重量至少约为15%重量的高固体浓度;
b)将步骤(a)的产物与糖化作用酶聚生体在适当的条件下接触,以生产可发酵糖;和
c)将步骤b)的产物与合适的生物催化剂在合适的发酵条件下接触,以生产乙醇。
2.权利要求1的方法,其中所述合适的生物催化剂选自细菌、丝状真菌和酵母。
3.权利要求1的方法,其中所述合适的生物催化剂是选自埃希氏菌属、发酵单孢菌属、酵母菌属、假丝酵母属、毕赤酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属和梭菌属的野生型、突变型或重组微生物。
4.权利要求1的方法,其中所述合适的生物催化剂选自重组大肠埃希氏菌、运动发酵单孢菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母。
5.权利要求1的方法,其中所述合适的生物催化剂是重组运动发酵单孢菌。
6.权利要求1的方法,其中步骤(b)和(c)同时进行。
7.权利要求1的方法,其中所述生物质-氨水混合物的pH大于8。
8.权利要求1的方法,其中在将所述生物质与含有氨的水溶液接触之前,对所述生物质施加真空。
9.权利要求1的方法,其中所述生物质的干重形成至少约15%到约80%的高固体浓度。
10.权利要求9的方法,其中所述生物质的干重形成至少约15%到约60%的高固体浓度。
11.权利要求1的方法,其中所述氨的量相对于生物质干重少于约10%重量。
12.权利要求11的方法,其中所述氨的量相对于生物质干重约为6%重量或更少。
13.权利要求1的方法,其中生物质选自生物能作物、农业残留物、城市固体废物、工业固体废物、场地废物、树林和森林废物。
14.权利要求1的方法,其中生物质选自柳枝稷、废纸、造纸产生的淤渣、谷粒、玉米穗轴、谷皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秆、干草、大麦、大麦秆、稻草、甘蔗渣、高梁、大豆、由谷物加工获得的成分、树、树枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和矮树、蔬菜、水果、花和厩肥。
15.权利要求14的方法,其中生物质选自玉米穗轴、玉米秸秆、谷皮、甘蔗渣、锯末、柳枝稷、小麦秆、干草、大麦秆、稻草和草。
16.权利要求15的方法,其中生物质选自玉米穗轴、玉米秸秆、锯末和甘蔗渣。
17.权利要求1的方法,其中氨选自氨气、氢氧化铵、尿素以及它们的组合。
18.权利要求1的方法,其中在约4℃到约200℃的温度下进行(a)。
19.权利要求18的方法,其中在约75℃到约150℃的温度下进行(a)。
20.权利要求19的方法,其中在90℃以上到约150℃的温度下进行(a)。
21.权利要求1的方法,其中(a)进行长达约25小时的时间。
22.权利要求21的方法,其中(a)进行长达约8小时的时间。
23.权利要求1或6的方法,其中在(b)之前,至少除去一部分(a)中的氨。
24.权利要求23的方法,其中来自(a)的氨被再循环。
25.权利要求1的方法,其中(b)的接触是在生物质以干重计的浓度至少为约15%时进行的。
26.权利要求1的方法,其中(a)、(b)或(a)和(b)至少重复一次。
27.权利要求1的方法,所述方法进一步包括在(a)中添加至少一种增塑剂、软化剂或它们的组合。
28.权利要求27的方法,其中所述至少一种增塑剂、软化剂或它们的组合选自多元醇、多元醇的酯、乙二醇醚、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。
29.权利要求1的方法,所述方法进一步包括在(a)之前或在(a)期间,在(b)之前或在(b)期间,或同时在上述时间内,施加能量。
30.权利要求29的方法,其中所述能量选自研磨、压碎、碾磨、撕碎、切碎、盘式精制、超声和微波。
31.权利要求1的方法,其中来自发酵的二氧化碳被用于在糖化作用前调节预处理混合物的pH。
32.权利要求1的方法,其中所述糖化作用酶聚生体包含至少一种糖苷酶。
33.权利要求1的方法,其中所述糖化作用酶聚生体包含至少一种选自以下的酶:纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶、淀粉水解糖苷酶、肽酶、脂肪酶、木质素酶和阿魏酸酯酶。
34.权利要求1的方法,其中所述糖化作用酶聚生体包括至少一种选自以下的酶:纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、乳蛋白酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶。
35.权利要求1的方法,其中(b)在约15℃到约100℃的温度下,并且pH为约2到约11时进行。
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