MX2007006260A - Hidrolisis enzimatica de biomasas que tienen un contenido elevado de materia seca (dm). - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la licuefaccion y sacarificacion de biomasas que contienen polisacaridos, que tienen un Contenido de materia seca relativamente alto. La presente invencion combina la hidrolisis enzimatica con un tipo de mezcla que se basa en el principio de la gravedad, lo cual da la seguridad de que las biomasas son sometidas a fuerzas mecanicas, principalmente fuerzas de corte y de desgarramiento. Ademas, la presente invencion se refiere a la utilizacion adicional de dichas biomasas procesadas, por ejemplo para la fermentacion subsiguiente en bio etanol, biogas, carbohidratos especiales para comida y nutrientes, asi como tambien material de carga de carbono para procesarlo en plasticos y productos quimicos.

Description

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE BIOMASAS QUE TIENEN UN CONTENIDO ELEVADO DE MATERIA SECA (DM) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la licuefacción y sacarificación de biomasas que contienen polisacáridos, que tienen un contenido elevado de materia seca y que poseen, preferiblemente, fibras y partículas con un promedio de tamaño grande. Además, la presente invención se refiere a la utilización adicional de dichas biomasas procesadas, por ejemplo para la fermentación subsiguiente en bio-etanol, carbohidratos especiales para nutrientes y comidas, así como también material de carga de carbono para procesarlo para plásticos y químicos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Numerosos procedimientos industriales y agrícolas, por ejemplo, operaciones municipales, procesamiento de nutrientes y comida e ingeniería forestal, generan biomasas, desechos y sub-productos que contienen azúcares poliméricos, por ejemplo en forma de almidón, celulosa y hemicelulosa. Los agronegocios e industrias químicas, así como también las organizaciones públicas tienen un gran interés en el desarrollo de procedimientos para convertir dichas biomasas en matepales de un valor superior. Por lo tanto, a modo de ejemplo, dichas biomasas podrían convertirse potencialmente en bioetanol, bíogás o productos químicos, usando microorganismos y/o enzimas hidrolíticas. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos conocidos actualmente no han alcanzado una práctica comercial a gran escala debido a su elevado costo de producción, a su gran demanda de energía y por lo tanto por la incertidumbre inherente de la factibilidad económica.

Además de ser importantes como comida y nutrientes, los carbohidratos de biomasas pueden usarse como materiales de carga para una gran cantidad de procesos industriales. Un producto bien conocido en forma de polímeros es el papel, donde la celulosa es el componente principal. Sin embargo, cuando se procesan en forma de oligómeros y monómeros, los carbohidratos constituyen un importante material de carga para una variedad de procesos industriales. Tal como se describirá en forma detallada, son necesarios para una variedad de procesos microbianos, pero además pueden usarse como material de carga para, por ejemplo, el procesamiento enzimático para la obtención de carbohidratos especiales, para comida y nutrientes, por ejemplo trehalosa. Además, los oligómeros y monómeros pueden sustituir los petroquímicos para procesar plásticos y químicos orgánicos. Además los carbohidratos pueden usarse como portadores de hidrógeno en la hidrogenación catalítica. Por consiguiente, es evidente que si puede lograrse una fuente de carbohidratos económica y abundante para procedimientos industriales, esto podría tener un potencial económico sustancial. El almidón es el carbohidrato de almacenamiento que se encuentra más cuantiosamente en las plantas y ocurre en forma de granulos, los cuales difieren notablemente en tamaño y características físicas de especie a especie. Los granulos de almidón son generalmente bastante resistentes a la penetración tanto del agua como de enzimas hidrolíticas, debido a la formación de enlaces de hidrógeno dentro de la misma molécula y con otras moléculas colindantes. Sin embargo, estos enlaces de inter- e intra- hidrogeno, pueden debilitarse a medida que se eleva la temperatura de la suspensión. Cuando se calienta una suspensión acuosa de almidón, los enlaces de hidrogeno se debilitan, se absorbe el agua, y los granulos de almidón se hinchan. Este proceso se denomina comúnmente gelatinización, debido a que la solución formada tiene una consistencia gelatinosa, altamente viscosa. Químicamente, el almidón es un polímero natural de glucosa, que generalmente es insoluble, pero dispersable en agua a temperatura ambiente y está constituido por una unidad repetitiva similar a la de la celulosa y está ligado conjuntamente por enlaces glucosídicos a-1 ,4 y a-1, 6, en oposición a los enlaces ß-1 ,4 glucosídicos para la celulosa. Las unidades forman un componente de cadena lineal, denominado amilosa, o bien un componente de cadena ramificada, denominado amilopectina. La mayor parte de las semillas, granos y tubérculos de plantas contiene aproximadamente 20-25% de amilosa. Pero algunas, tales como por ejemplo el almidón de guisante, tienen 60% de amilosa y ciertas especies de maíz tienen 80% de amilosa. Las variedades céreas de granos, tales como arroz, tienen un contenido de amílosa bajo. Aparte del almidón, los tres constituyentes principales en la biomasa de plantas son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina, que se denominan comúnmente con el término genérico, lignocelulosa. Las biomasas que contienen polísacáridos como término genérico, incluyen tanto a las biomasas de almidón como a las lignocelulósicas. La celulosa, hemicelulosa y lignina están presentes en cantidades distintas en diferentes plantas y en diferentes partes de la planta y están íntimamente asociadas para formar el esqueleto estructural de la planta. La celulosa es un homopolisacárido compuesto enteramente por D-glucosa ligada conjuntamente con enlaces ß-1,4-glucosídicos y con un grado de polimerización de hasta 10.000. La estructura lineal de la celulosa permite la formación tanto de enlaces de hidrogeno intra- como intermoleculares, lo cual da como resultado la agregación de cadenas de celulosa en micro fibrillas. Las regiones con micro fibrillas con orden elevado, se denominan cristalinas y con regiones menos ordenadas se denominan amorfas. Las micro fibrillas se ensamblan en fibrillas, las cuales forman luego las fibras de celulosa. La estructura parcialmente cristalina de celulosa junto con la disposición microfíbrilar, provee celulosa de alta resistencia a la tracción, convierte a la celulosa en insoluble en la mayor parte de solventes, y es parcialmente responsable de la resistencia de la celulosa contra la degradación microbiana, es decir la hidrólisis enzimátíca. La hemicelulosa es un polisacárido heterogéneo complejo compuesto por una variedad de residuos monoméricos: D-glucosa, D-galactosa, D-mannosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico y ácido 4-O-metil-D-glucurónico. La hemicelulosa tiene un grado de polimerización por debajo de 200, tiene cadenas secundarlas y puede estar acetilado. En maderas blandas, tales como de abeto, pino y picea, el galactoglucomannano y el arabino-4-O-metil-glucuronoxilano son las fracciones de hemicelulosa principales. En maderas duras, tales como de abedul, álamo temblón, álamo blanco o roble, el 4-O-acetil-glucuronoxilano y glucomannano son los constituyentes principales de la hemicelulosa. Los pastos tales como arroz, trigo, avena y grama tienen hemicelulosa compuesta principalmente por glucuronoarabinoxilano. La lignina es una red compleja formada por la polimerización de Unidades fenil propano y constituye la fracción no- polisacarídica más abundante de lignocelulosa. Los tres monómeros en la lignina son alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílíco y alcohol sinaptílico, y muy frecuentemente están unidos a través de enlaces éter arilgliceril- arílicos. La lignina está ligada a la hemicelulosa e incorpora los carbohidratos, ofreciendo de esta manera protección contra la degradación microbiana y química. Tal como se manifestó anteriormente, las biomasas procesadas podrían convertirse potencialmente en bioetanol o productos químicos, mediante el uso de microorganismos y/o enzimas hidrolíticas, o bien los carbohidratos de las biomasas procesadas podrían usarse como material de carga para una variedad de procedimientos industriales, por ejemplo en procedimientos enzimáticos para la obtención de carbohidratos especiales para comida y nutrientes o como sustitutos para petroquímícos en la producción de plásticos y productos químicos orgánicos. Además, el procesamiento de carbohidratos de biomasas, de acuerdo con la presente invención, puede combinarse con la separación y fraccionamiento de los componentes que no son de carbohidrato. Un uso particularmente preferido de un procedimiento de acuerdo con la presente invención es una parte integrada de un procedimiento para la producción de bio-etanol. La producción de bio-etanol a partir de bíomasas que contienen polisacáridos, pueden dividirse en tres etapas: 1 ) pre-tratamiento, 2) hidrólisis de los polisacáridos en carbohidratos fermentables 3) y fermentación de los carbohidratos.

Se requiere el pretratamiento cuando la hidrólisis subsiguiente (por ejemplo hidrólisis enzimática) de los polisacáridos requiere la descomposición de una estructura, que por otra parte es protectora (por ejemplo lignina) de los materiales de plantas. Se conocen varias técnicas de pre-tratamiento. Para cereales y granos, este pre-tratamiento puede tener la forma de una simple molienda en seco para que las superficies se tornen accesibles, pero para las biomasas lignocelulósicas se necesitan también procedimientos térmicos y/o químicos. Una biomasa que contiene polisacáridos que consisten, por ejemplo, en almidón refinado, no requiere dichos métodos de pre-tratamíento antes del procedimiento enzimático. Los procedimiento de pre- tratamiento pueden estar basados en hidrólisis acida, explosión por vapor, oxidación, extracción con álcali o etanol, etc. Una característica común de las técnicas de pre-tratamiento es que, en combinación con la acción de posibles reactivos agregados, aprovechan el ablandamiento y aflojamiento de los materiales de las plantas que se produce a temperaturas por arriba de 100°C. A continuación del pre-tratamiento, la etapa siguiente en la utilización de biomasas que contienen polisacáridos para la producción de bio-etanol u otros bioquímicos, es la hidrólisis del almidón, celulosa o hemicelulosa liberados, dentro de azúcares fermentables. Si se efectúa enzimáticamente, se requieren una gran cantidad de enzimas diferentes, con modos de acción diferentes. Las enzimas pueden agregarse externamente o bien los microorganismos que se desarrollan en la biomasa pueden proveerlos. La celulosa es hidrolizada en glucosa mediante celulasas carbohidrolíticas. La comprensión prevaleciente del sistema celulolítico divide las celulasas en tres clases; exo-1 ,4-ß-D-glucanasas o celobiohidrolasas (CBH) (EC 3.2.1.91), que disocian las Unidades de celobiosa de los extremos de las cadenas de celulosas; endo-1 ,4-ß-D-glucanasas (EG) (EC 3..2.1.4), que hidrolizan los enlaces ß-1 ,4-glucosídicos al azar en la cadena de celulosa; 1 ,3-ß-D-glucosidasa (EC 3.2.2.21) que hidrolizan la celobiosa a glucosa y que disocian también Unidades glucosa de celooligosacáridos. Los diferentes azúcares de la hemicelulosa son liberados por las hemicelulasas. El sistema hemicelulítico es más complejo que el sistema celulótico debido a la naturaleza heteróloga de la hemicelulosa. El sistema involucra entre otras, a la sendo-1 ,4-ß-D-xilanasas (EC 3.2.1.8), que hidrolizan los enlaces internos en la cadena xilano; 1 ,4- ß -D-xilosidasas (EC 3.2.1.37), que atacan a los xilooligosacáridos del extremo no reductor y liberan xilosa; endo 1 ,4-ß-D-mannanasas (EC 3.2.1.78), que disocian los enlaces internos; 1 ,4-ß-D-mannosidasas mannanasas (EC 3.2.1.25), que disocian los mannooligosacáridos a mannosa. Los grupos secundarios son removidos mediante una variedad de enzimas; a-D-galactosidasas (EC 3.2.1.22), a-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55), a -Dglucuronídasas (EC 3.2.1.139), cinnamoil esterasas (EC 3.2.2.-), acetil xilan esterasas (EC 3.1.1.6) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73). Las enzimas más importantes que se usan en la hidrólisis de almidón son las alfa-amilasas (1 ,4-a-d-glucan glucanohidrolasas, (EC 3.2.1.1 ). Estas son hidrolasas endo-activas que disocian los enlaces 1,4-a-d-glucosídicos y pueden sobrepasar, pero no hidrolizar los puntos de ramificación 1, 6-a If a- D-g lucos id i cos. Sin embargo, también las glicoamílasas exo-activas tales como beta-amílasa (EC 3.2.1.2) y la pululanasa (EC 3.2.1 .41 ) pueden usarse para la hidrólisis de almidón. El resultado de la hidrólisis de almidón es principalmente glucosa, maltosa, maltotirosa, a-dextrina y cantidades variadas de oligosacáridos. Cuando se usa un hidrolizado a base de almidón para la fermentación, puede ser ventajoso agregar enzimas proteolíticas. Dichas enzimas pueden prevenir la floculación del microorganismo y pueden generar amino ácidos disponibles para el microorganismo. En combinación con el pretratamiento e hidrólisis enzimática de las biomasas lignocelulósicas, se ha hallado que el uso de enzimas oxidatívas puede tener también un efecto positivo sobre la hidrólisis general, así como también sobre la viabilidad de los microorganismos empleados para, por ejemplo, la fermentación subsiguiente. La razón para este efecto es el entrecruzamiento oxidativo de ligninas y otros inhibidores fenólicos causado por enzimas oxidativas. Típicamente, se emplean laccasa (EC 1.10.3.2) o peroxidasa (EC. 1.11.1.7) ya sea externamente o por incorporación de un gen de laccasa en el microorganismo aplicado. La hidrólisis enzimática de biomasa ha sido descrita previamente. Sin embargo, en el caso de las biomasas lignocelulósicas, únicamente el material que consiste en fibras y partículas con un tamaño promedio por debajo de 25,4 mm (1 pulgada) y que tiene además un contenido de materia seca relativamente bajo, es decir por debajo de 20% (p/p), han sido hidrolizados exitosamente mediante dicho método. La US4409329 describe la hidrólisis del material de celulosa sólido a azúcar, donde la celulosa es hidrolizada a azúcares simples mediante el tratamiento de una suspensión granular de 3-20% (p/p) de nutrientes sólidos que contienen 30-80% (p/p) de celulosa, con un complejo enzimático de celulasa. El material de carga que contiene celulosa sólida tenía un tamaño de partícula promedio de desde 0,0254 mm - 25,4 mm (0,01 a 1 pulgada) de diámetro. Para la mezcla, se usaron cuchillas de rotor perforadas. La US 2002117167A describe la hidrólisis enzimática de hemicelulosa a material de biomasa, que comprende solubilizar por lo menos una porción de hemicelulosa e hidrolizar la hemicelulosa solubilizada para producir por lo menos un monosacárido. La biomasa utilizada es preferiblemente una suspensión acuosa de material crudo o pre-tratado. El material de biomasa puede ser cualquier material celulósico que incluya hemicelulosa. El procedimiento se describe como un procedimiento especialmente eficaz con fibras de granos tales como maíz, trigo arroz, avena o cebada. La US 2004005674A describe un procedimiento para la hidrólisis enzimática de lignocelulosa. La degradación de lignocelulosa a azúcares, comprende poner en contacto la lignocelulosa con por lo menos una enzima auxiliar y con por lo menos una celulasa. El material lignocelulósico fue triturado (el tamaño promedio de la fibra del material no se especificó) y tenía un contenido de materia seca bajo (0,2 g de material de forraje triturado en 10 ml de solución enzimática). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la Licuefacción y sacarificación de biomasa que contiene polisacáridos, que tiene un contenido de materia seca relativamente elevado, preferiblemente por arriba de 20%, y que preferiblemente consiste en fibras y partículas relativamente grandes donde por lo menos el 20% (p/p) de la biomasa está comprendida dentro de los 26-27 mm. Además, el procedimiento es particularmente apropiado para la licuefacción y sacarificación de biomasas que contienen polísacárido que consisten principalmente en almidón, almidón refinado, celulosa, hemicelulosa y lignina, por ejemplo granos o paja de trigo. En el caso de biomasas lígnocelulósicas, éstas son pre- tratadas preferiblemente, sometiéndolas a temperaturas comprendidas entre 110- 250°C durante 1-60 minutos en manera que asegure la accesibilidad de la celulosa a las enzimas y que al mismo tiempo asegure un contenido limitado de inhibidores de fermentación en la biomasa pre-tratada. La presente invención combina la hidrólisis enzimática basada en la combinación de enzimas hidrolíticas que incluyen una enzima carbohidrolítica y una enzima oxidativa con un tipo de mezcla que se basa en el principio de gravedad que asegura la aplicación de fuerzas mecánicas, principalmente fuerzas de corte y de desgarramiento, para las bíomasas. Los tipos preferidos de mezcladores son por ejemplo los mezcladores de caída libre, tales como mezcladores de tambor, mezcladores giratorios, o dispositivos de mezcla similares.

BREVE DOSCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una vista longitudinal del reactor de hidrólisis de 5 cámaras (lado izquierdo) y una vista transversal del reactor de hidrólisis de 5 cámaras (lado derecho); La Figura 2 ilustra la concentración de glucosa durante la licuefacción e hidrólisis de paja de trigo pre-tratado con un contenido de materia seca de 20%, 25%, 30%, 35%, y 40% utilizando una carga de enzima de 7 FPU (g DM)"1; La Figura 3 ilustra la concentración de glucosa (símbolos abiertos) y etanol (símbolos cerrados) durante la licuefacción, hidrólisis y fermentación de paja de trigo pre-tratada con un contenido de materia seca de 20%, 25%, 30%, 35% y 40% utilizando una carga de enzima de 7 FPU (g DM)"1. Se agregó levadura después de 8 horas (línea punteada). La Figura 4 ilustra la concentración de glucosa xílosa y etanol durante la licuefacción y fermentación de paja de trigo pre-tratada (símbolos cerrados) en una mezcla de paja de trigo pre-tratada y grano de trigo (símbolos abiertos). Se agregó levadura después de 8 horas de licuefacción e hidrólisis. DOSCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La producción de soluciones concentradas de azúcar es beneficiosa en relación a la fermentación subsiguiente u otros procesos microbianos debido a la productividad volumétrica mejorada y al costo reducido del procesamiento de corriente descendente. En el caso de la producción de bio-etanol, los requisitos de energía para la destilación se reducen significativamente si el caldo de fermentación contiene por arriba de 4% de etanol) Galbe Y Zacchi, 2002). Esto requiere una concentración de azúcar por arriba del 8%, que con la mayor parte de tipos de biomasas lignocelulósicas corresponde a un contenido inicial de materia seca del %. En otras palabras, es deseable someter las biomasas que contienen polisacáridos con alto contenido de masa seca, preferiblemente por arriba del 20%, para la hidrólisis enzimática con el fin de poder producir subsiguientemente caldos de fermentación que contienen bio-etanol, apropiados para la destilación de etanol. Los procedimientos de la presente invención proveen un grado de hidrólisis enzimática de típicamente 30-50%. Sin embargo, bajo condiciones óptimas, puede obtenerse incluso un grado más alto de hidrólisis enzimática. La biomasa licuada y sacarificada, contendrá consecuentemente cantidades relativamente grandes de glucosa, xilosa, celobiosa, lignina celulosa no degradada y hemicelulosa y aún enzimas activas apropiadas para procesamiento adicional, es decir procesos de fermentación (etanol, ácido láctico, etc.). La biomasa licuada será también apropiada para la gasificación, hidrogenación, síntesis orgánica, o producción de biogás y nutrientes. Si las biomasas que contienen polisacárido son lignocelulósicas, el pre-tratamiento debe asegurar que la estructura del contenido lignocelulósico será más accesible para las enzimas, y al mismo tiempo las concentraciones de subproductos inhibidores dañinos tales como ácido acético, furfural e hidroximetil furfural permanecerán sustancialmente bajas. Existen varias estrategias par lograr esto, que implican, todas someter el material lignocelulósico a temperaturas comprendidas entre 110-250 °C durante 1-60 minutos por ejemplo: • Extracción de agua caliente • Hidrólisis de ácido diluido, en etapas múltiples, que remueve el material disuelto antes de que se formen las sustancias inhibidoras • Hidrólisis de ácido diluido bajo condiciones de intensidad relativamente baja • Oxidación alcalina húmeda • Explosión de vapor • Casi cualquier pre-tratamiento con desintoxicación subsiguiente Las biomasas que contienen polisacáridos de acuerdo con la presente invención, incluyen cualquier material que contiene azúcares poliméricos, por ejemplo, en forma de almidón, así como también en forma de almidón refinado, celulosa y hemicelulosa. Se prefieren las biomasas que tienen un contenido de materia seca por arriba del 20%. Los tipos relevantes de biomasas para hidrólisis enzimática y mezcla, de acuerdo con la presente invención, pueden incluir biomasas derivadas de cultivos agrícolas tales como por ejemplo: • Almidón, por ejemplo granos que contienen almidón y almidón refinado • forraje de maíz • Bagazo • Paja, por ejemplo de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza sorgo • Maderas blandas por ejemplo Pinus sylvestris, Pinus radiata • Maderas duras, Salix spp. Eucalyptus spp. • Tubérculos, por ejemplo remolacha y patata • Cereales de, por ejemplo, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza, sorgo y maíz. • Desechos de papel, fracciones de fibras de procesamiento de biogás, abono, residuos de procesamiento de aceite de palma, desechos sólidos municipales o similares con un contenido de materia seca similar. Si las biomasas que contienen polisacáridos son lignocelulósicas, el material puede cortarse en trozos, donde el 20% (p/p) de la biomasa, está preferiblemente comprendida dentro de un rango de 26-70 mm, antes del pre-tratamíento. El material pre-tratado tiene preferiblemente un contenido de materia seca por arriba del 20% antes de entrar al dispositivo de mezcla. Además de liberar los carbohidratos de la biomasa, el procedimiento de pre-tratamiento esteriliza y disuelve parcialmente la biomasa y al mismo tiempo limpia de cloruro de potasio la fracción de lignina. La mezcla obtenida en un procedimiento de acuerdo con la presente invención cumple por lo menos cuatro objetivos. En primer lugar, asegura un contacto estrecho entre las enzimas usadas y la biomasa (sustrato) que contiene polisacárido, ya que éste, será insoluble o solo muy ligeramente soluble en la mayoría de los casos. En segundo lugar, el trabajo mecánico efectuado sobre el material durante la mezcla ayuda a desgarrar fibras y partículas de la biomasa, más grandes, y por lo tanto ayudará a aumentar el área superficial del material. Esto incrementará la accesibilidad de por ejemplo la celulosa y la hemicelulosa a las enzimas usadas. Para aumentar más el trabajo mecánico sobre el material, podrían agregarse al tambor, bolas de acero o medios similares que colisionaran con el material. En tercer lugar, la mezcla del material evita la acumulación local de una concentración elevada de celobiosa, que — tal como es bien conocido por los expertos en la materia — podría inhibir por ejemplo las enzimas celulasas, especialmente las celobiohídrolasas. En cuarto lugar, una importante característica de las enzimas de celulasa es la influencia de los dominios de unión de celulosa (CBD) sobre el rendimiento de la enzima. Los CBD son partes funcionales de las enzimas degradadoras de celulosa. Los CBD permiten la adhesión de la enzima soluble en agua sobre una superficie de sustrato insoluble (celulosa). La estrecha relación entre la enzima y la celulosa provista por el CBD mejora la velocidad catalítica y la estabilidad de la enzima. Para hidrolizar la celulosa, la enzima debe cambiar la posición del CBD sobre la cadena de celulosa. Se cree que la acción mecánica, es decir la mezcla, es importante para el movimiento del CBD y por consiguiente para la acción enzimática de las enzimas a lo largo de la cadena de celulosa. Además, de lo anterior, debería observarse que la hidrólisis enzimática de biomasa se ha llevado a cabo tradicionalmente en reactores de tanque agitado equipados con impulsores (por ejemplo turbina Rushton o impulsor Intemig) montados sobre un eje impulsor colocado centralmente, similar a los que se usan en la industria de la fermentación. Debido a este equipo, las soluciones de viscosidad elevada, de material seco muy pegajoso o muy seco, no pueden ser agitadas eficientemente, dado que dan como resultado zonas muy pobres o sin ninguna mezcla. Además, la agitación de dichas soluciones requiere un ingrese de energía muy grande, lo cual es perjudicial para la economía del procedimiento. Al operar con biomasas que contienen polisacáridos, se ha restringido previamente el límite superior posible hasta aproximadamente 20%. El principio de mezcla en base a la gravedad de acuerdo con la presente invención, supera este problema y puede usarse para biomasas que contienen polisacárido con un contenido de materia seca de hasta 80%, preferiblemente de 20-50%. El principio de mezcla por gravedad de acuerdo con la presente invención puede efectuarse fácilmente en escala ascendente y puede aplicarse para todas las clases de biomasas, además de almidón refinado, que contiene hasta más del 80% de celulosa. A diferencia de los reactores de tanque agitado convencionales, usados tradicionalmente para la hidrólisis enzimática, un principio de mezcla a base de gravedad, es decir un mezclador de tambor, un mezclador con un eje giratorio que levanta la biomasa o un dispositivo de mezcla similar, que utiliza un principio de caída libre, permiten obtener al mismo tiempo, una mezcla eficiente, incluso con pequeños ingresos de energía y contenidos de materia seca elevados y además efectúan un procesamiento/ degradación mecánica a través de las fuerzas de gravedad, incluyendo fuerzas de corte y de desgarramiento entre el material y el tambor, así como también las fuerzas resultantes del impacto entre el material que cae y el fondo del tambor y al mismo tiempo afectan positivamente la influencia de los dominios de adhesión de celulosa (CBD) sobre el rendimiento de la enzima. Aunque el procesamiento de materiales no miscibles, de plantas, tales como por ejemplo biomasas que contienen polisacáridos con un contenido de materia seca relativamente alto y un tamaño promedio elevado de fibra y de partícula, es conocido a partir de la fermentación o de biorreactores de estado sólido, donde para la mezcla se emplean mezcladores de tipo giratorio (Giovanozzi et al. 2002), este principio no ha sido previamente implementado en un proceso de Licuefacción/sacarificación o en un procedimiento de fermentación de bio-etanol. La presente invención provee un procedimiento para procesar biomasas con un contenido de materia seca relativamente elevado, por ejemplo un contenido de materia seca de entre 20-80%, preferiblemente de entre 20-50%. Además, el procedimiento de acuerdo con la presente invención asegura una eficiente licuefacción y sacarificación que permite el uso directo del producto en, por ejemplo, fermentadores. Las enzimas capaces de efectuar una conversión de almidón, celulosa y hemícelulosa o partes de éstas en glucosa, xilosa y celobiosa, se agregan a la biomasa en forma natural o bien en forma de organismos microbianos que dan lugar a la acumulación de dichas enzimas. El pH y la temperatura de la biomasa se ajustan con referencia al pH óptimo y a la temperatura óptima de las enzimas aplicadas. Dependiendo de la carga de enzima, la biomasa será licuada y sacarificada hasta un líquido sin ninguna o con solamente pocas fibras y partículas grandes remanentes dentro de las 3-24 horas. El agregado de un microorganismo metabolizador de glucosa en cualquier momento durante la hidrólisis y licuefacción puede mejorar el grado de hidrólisis enzimática a medida que los productos inhibidores de enzima son removidos de esta manera. DOSCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede ser llevado a cabo usando los parámetros técnicos preferidos siguientes. • Contenido de materia seca: 20-80%, preferiblemente 25-70%, más preferiblemente 25-60%, incluso más preferiblemente 25-50% ó 25-40%, y más preferiblemente 25-35%. • Distribución de los tamaños de fibra y partícula de la biomasa lignocelulósíca: 0-150 mm, preferiblemente 5-125 mm, más preferiblemente 10-100 mm, aún más preferiblemente 15-90 mm ó 20-80 mm y más preferiblemente 26-70 mm. La distribución preferida de tamaños de fibra y partícula, se define como por lo menos de 20% (p/p) de la biomasa lignocelulósica que está dentro del intervalo preferido. Si la biomasa que contiene polisacárido es lignocelulósica, debe ser pretratada, por ejemplo con extracción de agua caliente. Si se elige un pre-tratamiento hidro térmico, se prefieren los datos técnicos siguientes: • Temperatura de pretratamiento: 110-250°C, preferiblemente 120-240°C, más preferiblemente 130-230°C, más preferiblemente 140-220°C, más preferiblemente 150-210°C, más preferiblemente 160-200°C, aún más preferiblemente 170-200°C ó más preferiblemente 180-200°C. • Tiempo de pre-tratamiento: 1-60 min, preferiblemente 2-55 min, más preferiblemente 3-50 min, más preferiblemente 4-45 min, más preferiblemente 5-40 min más preferiblemente 5-35 min, más preferiblemente 5-30 min, más preferiblemente 5-25 min, más preferiblemente 5-20 min y más preferiblemente 5-15 min. • Contenido de materia seca después del pre-tratamiento de por lo menos 20 p/p%.

El tratamiento enzimático de las bíomasas que contienen polisacárido en una mezcladora por gravedad: Si se usa un recipiente basado en el concepto de mezcla de caída libre, en forma de un reactor con un eje agitador colocado horizontalmente, que eleva la biomasa, u otro dispositivo de mezcla similar, se prefieren los siguientes datos técnicos: • Velocidad de rotación: 0-30 rpm, preferiblemente 0-20 rpm, más preferiblemente 0-25 rpm incluso más preferiblemente 0-10 rpm y más preferiblemente 0-5 rpm. • Rotación con dirección de rotación periódicamente alternada. • Rotación en intervalos pre-definidos. La velocidad de rotación Óptima dependerá del volumen del recipiente, la velocidad de rotación preferida puede ser por lo tanto relativamente elevada cuando se lleva a cabo un procedimiento en un recipiente relativamente pequeño, mientras que puede ser relativamente baja cuando el procedimiento se lleva a cabo en un recipiente relativamente grande. • Enzimas para biomasa lignocelulósíca: - Cellobiasa (por ejemplo Novozym 188) - Celulasa (por ejemplo Celluclast 1.5 FG L) • Carga de enzimas en Unidades de Papel Filtro (FPU)/g DM. 1 FPU es igual a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 µmol/min de enlaces glicosídícos en papel filtro Whatmann # 1 , bajo condiciones especificadas bien conocidas por un experto en la materia. Sin embargo, la actividad enzimática podría en principio ser provista en cualquier forma concebible, incluyendo a través de la adición de microorganismos que dan lugar a la actividad enzimática deseada: que corresponde a 0,001-15 FPU/g de materia seca, preferiblemente 0,01 — 10 FPU/g de materia seca, más preferiblemente 0,1-8 FPU/g de materia seca, más preferiblemente 1-7 FPU/g de materia seca y más preferiblemente menos de 6 FPU/g • Enzimas para biomasa que contiene almidón: - Enzimas en el procesamiento de almidón: alfa-amilasas y glucoamilasas • Tiempo de tratamiento para hidrólisis enzimática: 0-72 horas, preferiblemente 1-60 horas, más preferiblemente 2-48 horas, y más preferiblemente 3-24 horas, tal como 4-24 horas, tal como 6-24 horas, tal como 8-24 horas, tal como 10-24 horas, tal como 12-24 horas, tal como 18- 24 horas ó 22 horas. • Temperatura para hidrólisis enzimática. Ajustado con referencia a las temperaturas óptimas de las actividades enzimáticas aplicadas: 0-105°C, preferiblemente 10-100°C, más preferiblemente 15-90°C, más preferiblemente 20-80°C, más preferiblemente 25-70°C y más preferiblemente 30-70°C tal como 40-45°C o temperatura ambiente. • pH de la biomasa. Ajustado con referencia al pH óptimo de las actividades enzimáticas aplicadas: 3-12, tal como 5-10, tal como 6-9, tal como 7-8 y preferiblemente4-11 • El tratamiento enzímático puede llevarse a cabo como tanda, tanda de alimentación o procedimiento continuo.

Ejemplo 1: Hidrólisis enzimática a escala de laboratorio Paja de trigo pre-tratada, prensada con un tamaño promedio de aproximadamente 40 mm (extracción de agua a contracorriente a 180-200°C durante 5-10 min., relación de fluidez de agua y materia seca de 5:1 ) que corresponde a 25 g de peso seco ( 67,0 g de paja pre-tratada) se colocó dentro de una bolsa de plástico, 0,75 ml de Novozym, 188,375 mL de Celluclast 1 ,5 FG L y 11 ,9 mL de buffer de citrato de sodio 50 mM, pH 5,9, se mezcló y roció sobre la paja. Esto dio como resultado un contenido final de materia seca del 30%. La carga de enzima correspondió a 10 Unidades de Papel Filtro (FPU)/g DM. La mezcladora consistía en un tambor (1 ,0 m de longitud y 0,78 m de diámetro) con 5 nervaduras internas a lo largo del eje largo para asegurar una mezcla apropiada del material. El tambor rotó a lo largo del eje horizontal con una velocidad de 26 rpm. La mezcla/hidrólisis del material se llevó a cabo durante 8- 24 horas a temperatura ambiente. Esto dio como resultado una pasta espesa sin ninguna fibra grande remanente. Una bolsa de control, con la misma carga enzimática pero sin mezcla, no mostró ningún signo de degradación de la paja. Parte del material resultante después de la hidrólisis enzimática durante 24 horas (una cantidad que corresponde a 29 g de materia seca) se diluyó hasta 15% de materia seca en una botella de tapa azul y se agregó levadura (levadura de panadería, De Danske Spritfabrikker) la botella fue cerrada con bloqueo neumático y colocada durante 72 horas a 30°C con agitación a 500 rpm. El líquido resultante contenía 33 g/L de etanol, 10 g/L de xilosa. No se detectó glucosa lo cual indica que la levadura es capaz de utilizar toda la glucosa producida durante la hidrólisis. Asumiendo un rendimiento de etanol en glucosa de 0,5 g de etanol por g de glucosa, esto correspondió a una conversión del 70% de la celulosa original.

Ejemplo 2. Hidrólisis enzimática a escala piloto Paja de trigo pre-tratada, prensada con un tamaño promedio de aproximadamente 40 mm (pre-tratada por extracción de agua a contracorriente a 180-200°C durante 5-10 min., con una relación de fluidez de agua y materia seca de 5:1 ) que corresponde a 7 kg DW (=20 kg de paja pre-tratada) se depositó en una mezcladora giratoria convencional para cemento, con un eje horizontal inclinado a aproximadamente 10 grados. La mezcladora tenía 2 nervaduras internas a lo largo del eje largo para asegurar la mezcla del material. Se monto una tapa sobre la abertura para evitar la evaporación desde la mezcladora. El tambor de la mezcladora giró a lo largo del eje horizontal con una velocidad de 29 rpm. Se agregaron a la paja, 200-1150 mL de Celluclast 1.5 FG L y 40-225 mL de Novozym 188. Esto dio como resultado un contenido final de materia seca del 30%. La carga de enzima correspondió a 3-15 FPU/g DM. El pH se ajustó a 4,8 hasta 5,0 por adición de carbonato de sodio. La mezcladora de cemento se calentó a 40-45 °C mediante el uso de un calefactor de ventilador. La mezcla/ hidrólisis del material se llevó a cabo durante 22 horas. Dependiendo de la carga de enzima, esto dio como resultado un líquido más o menos viscoso sin ningún resto de fibras grandes. La paja pre-tratada se degradó hasta una pasta en aproximadamente 3-5 horas. Después de 5-24 horas de mezcla, la pasta se convirtió en un líquido viscoso. Los experimentos de control con paja de trigo pre-tratada solamente o con paja de trigo pre-tratada a solamente 160° C, pero usando la misma carga de enzima, no mostraron ningún signo de licuefacción de la paja. La sacarificación y fermentación simultanea se efectuó mediante el agregado de levadura a la mezcladora de cemento, después de 24 horas de hidrólisis a 40- 45°C usando una carga de enzima de 10-15 FPU/g DM. La temperatura se dejó enfriar por debajo de 35° C y se agrego levadura comprimida (levadura de panadería, De Danske Spritfabrikker) hasta una concentración de aproximadamente 1 % (p/p) basado en materia seca de paja. La sacarificación y fermentación se continuó durante 48 horas a 25°C. El material resultante se centrifugo durante 15 mín. a 2500 rpm. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 µm y se analizó para determinar los azúcares medíante HPLC. Con una carga de enzima de 15 FPU/g DM; el sobrenadante contenía 70 g/L de glucosa, 30 g/L de xilosa después de 24 horas de hidrólisis. Esto correspondió a una hidrólisis de 50% de la celulosa y hemicelulosa originalmente presente en la paja. La sacarificación y fermentación simultanea, usando una carga de enzima de 10 FPU/g DM dio como resultado 42 g/L de etanol y 30 g/L de xilosa. Ejemplo 3: Licuefacción, hidrólisis y fermentación El reactor de hidrólisis fue diseñado para llevar a cabo experimentos con licuefacción y concentraciones sólidas de hidrólisis por arriba de 20 % de DM (Fig. 1 ). El reactor consistía en un tambor colocado horizontalmente dividido en 5 cámaras separadas, cada una de 20 cm de ancho y 60 cm de diámetro. Se usó un eje giratorio horizontal montado con tres paletas en cada cámara, para mezcla/agitación. Se usó un motor de 1 ,1 kW para la propulsión y la velocidad rotacional se ajustó dentro del rango de 2,5 y 16,5 rpm. La dirección de rotación fue programada para cambiar dentro de un rango de 2,5 y 16,5 rpm. La dirección de rotación fue programada para cambiar dos veces por minuto entre la dirección de las agujas del reloj y dirección contraria. Una camisa calefactora llena de agua, en la parte externa permitió el control de la temperatura hasta 80°C.

Las cámaras se llenaron con paja de trigo pretratada prensada con un tamaño promedio de aproximadamente 40 mm (pre-tratada por extracción de agua a contra-corriente a 180-200°C durante 5-10 min. con una relación de fluidez de agua y materia seca de 5:1 ) y agua para proporcionar un contenido inicial de DM de 20 a 40%. Se agregaron Celluclast 1.5 FG L y Novozym 188 en una relación de 5:1 para proporcionar una carga de enzima de 7 FPU por g de DM. La licuefacción e hidrólisis se efectuaron a 50°C y a un pH de 4,8 a 5,0. La velocidad de mezcla fue de 6,6 rpm. Se efectuaron experimentos de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) disminuyendo la temperatura hasta 32°C después de 8 h de licuefacción e hidrólisis y a continuación se agregaron 15 g de levadura de panadería comprimida (De Danske Spritfabrikker) por kg de DM inicial. La licuefacción e hidrólisis fue posible con un contenido inicial de DM de hasta 40% de DM (Fig. 2 y 3). Con 40% inicial de DM fue posible alcanzar concentraciones de glucosa de 80 g kg1 después de 96 h. También fue posible operar el procedimiento como SSF (Fig. 3), reduciendo de esta manera la inhibición de producto, de las celulasas, causada por la acumulación de glucosa. Fue posible fermentar los hidrolizados con hasta 40% del contenido inicial de DM usando levadura de panadería normal. Bajo condiciones no completamente anaeróbicas, el rendimiento de etanol fue del 80, 79, 76, 73 y 68% de lo que es teóricamente obtenible a 20, 25, 30, 35 y 40% de DM, respectivamente. Ejemplo 4: Licuefacción, sacarificación y fermentación del producto agrícola completo La biomasa que contiene lignocelulósico y almidón puede procesarse simultáneamente usando mezcla por gravedad y una mezcla de celulasas, hemicelulasas y amilasas. Las biomasas lignocelulósicas pueden derivar de cultivos agrícolas que consisten en por ejemplo trigo, forraje, paja, por ejemplo de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza y sorgo, tubérculos por ejemplo, remolacha, patata, cereales de por ejemplo arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza, sorgo, madera que consiste en madera blanda, por ejemplo de Pinus sylvestris, Pinus radiata, maderas duras, por ejemplo Salix spp., Eucalyptus spp. desechos sólidos municipales, residuos de papel y biomasas similares. Para los experimentos, se usó el reactor de hidrólisis descrito en el ejemplo 3. Se pretrató paja de trigo (principalmente una fuente de lignocelulosa) usando extracción de agua a contracorriente a 180-200°C durante 5-10 min., con una relación de fluidez de agua y materia seca de 5:1. Se trituraron en seco granos de trigo (principalmente una fuente de almidón) usando un molino de rodillos Kongskilde. El grano de trigo y la paja pretratada con un tamaño promedio de aproximadamente 4o mm, se mezcló en una relación de 1 :1 en base seca. Se ajustó el DM a entre 30 y 40 % por adición de agua. Se agregaron Celluclast 1.5 FG L y Novozym 188 en una relación de 5:1 para proporcionar una carga de enzima de 7 FPU por g de DM de paja. La hidrólisis de almidón se llevó a cabo usando enzima NS59933 machacada en frío (Novozymes AIS, Bagsvaerd, Dinamarca) en una carga de 3,5 g por kg de grano de trigo. La licuefacción e hidrólisis se llevó a cabo a 50°C y a un pH de 4,8 a 5,0. Después de 8 h. La temperatura disminuyó a 34 °C y se agregaron 15 g de levadura de panadería comprimida (De Danske Spritfabrikker) por kg de DM inicial. Se llevó a cabo en paralelo un experimento con paja únicamente con 30 % de DM. La mezcla de paja con granos dio como resultado una rápida acumulación inicial de glucosa en la etapa de licuefacción e hidrólisis en comparación con la aplicación de paja solamente (figura 4). Después de 96 h de licuefacción y SSE, la concentración de etanol fue de 41 g kg"1 usando solamente paja de trigo como Único sustrato (fig 4). En el experimento con paja y grano la concentración de etanol alcanzó los 68 g kg"1. Ejemplo 5: Licuefacción a baja temperatura de almidón o de materiales que contienen almidón. Un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede aplicarse también para procesar, a baja temperatura, almidón refinado o materiales que contienen almidón, (por ejemplo, remolacha, patata, cereales de, por ejemplo, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, avena, sorgo). De acuerdo con el ejemplo 4, el pre-tratamiento del grano con calor no es necesario para la licuefacción e hidrólisis del almidón. La molienda en seco se usa, por otra parte, generalmente para el pretratamiento de granos que contienen almidón. Los granos molidos en seco con un Contenido de materia seca de 20-60% son cargados a la mezcladora por gravedad. Se agregan simultáneamente, la enzima NS50033 machacada en frío (Novozymes AIS, Bagsvaerd, Dinamarca) o alfa-amilasas y glucoamilasas. Luego es posible una licuefacción y sacarificación completa del almidón en un procedimiento de una sola etapa. Los rangos de temperatura y pH durante el procedimiento de hidrólisis enzimática son definidos por las enzimas y estarán en el rango de 25-60%, preferiblemente 49-55% y un pH de 3-12, preferiblemente un pH de 3-8, respectivamente. El procedimiento puede combinarse con SSF.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para la licuefacción y sacarificación de biomasas que contienen polisacáridos que tienen un contenido de materia seca por arriba de 20%, caracterizado porque se somete dicha biomasa a: a) hidrólisis enzimática, y b) mezclado del tipo basado en la gravedad, que provee procesamiento mecánico y/o degradación de la biomasa.
2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , en el cual dicha masa que contiene polisacáridos es una biomasa lignocelulósica derivada de productos agrícolas que consisten en por ejemplo, forraje de maíz, bagazo, paja, por ejemplo de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza y sorgo, tubérculos, por ejemplo remolacha, patata, cereales de por ejemplo arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza, sorgo, madera que consiste en madera blanda por ejemplo de Pinus sylvestris, Pinus radiata, maderas duras, por ejemplo Salix spp., Eucalyptus spp., desechos sólidos municipales, papel residual, fracciones de fibras del procesamiento de biogás, abono y biomasas similares.
3. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , donde dicha biomasa que contiene polisacáridos es almidón, por ejemplo granos que contienen almidón o almidón refinado
4. 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 , donde dicha biomasa que contiene polisacáridos es una mezcla de almidón, por ejemplo granos que contienen almidón, o almidón refinado, y biomasas lignocelulósícas derivadas de productos agrícolas que consisten en por ejemplo forraje de maíz, paja, por ejemplo de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza y sorgo.tubérculos, por ejemplo remolacha, patata, cereales de por ejemplo arroz, trigo, centeno, avena, cebada, centeno, colza, sorgo, madera que consiste en madera blanda por ejemplo de Pinus sylvestris, Pinus radiata, maderas duras, por ejemplo Salix spp., Eucalyptus spp., desechos sólidos municipales, papel residual, y biomasas similares.
5. 5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el Contenido de materia seca de la biomasa que contiene polisacáridos está comprendido entre 25-80%.
6. 6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4 donde por lo menos el 20% (p/p) de la biomasa lignocelulósica tiene un tamaño de fibra por arriba de los 26 mm.
7. 7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4, donde la biomasa lignocelulósica ha sido sometida a un pretratamiento con calor comprendido entre 110-250°C.
8. 8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el cual la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con una combinación de enzimas hidrolíticas que incluyen una enzima carbohidrolítica y una enzima oxidatíva.
9. 9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3 ó 4, en el cual la hidrólisis enzimática de almidón se lleva a cabo con una combinación de enzimas hidrolíticas y enzimas proteolíticas.
10. 10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 9. en el cual la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a 0-105°C.
11. 11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 10. donde la mezcla de la biomasa que contiene polisacáridos, se basa en mezcladoras de caída libre, tales como mezcladoras de tambor, mezcladoras giratorias o dispositivos de mezcla similares.
12. 12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , donde el tiempo de tratamiento para la hidrólisis enzimática es de 0-72 horas.
13. 13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el cual se lleva a cabo en tanda, por alimentación de tandas, continuo o un procedimiento similar.
14. 14. Uso de un material producido por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en un procedimiento para la producción de etanol.
15. 15. Uso de un material producido por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en un procedimiento para la producción de ácido láctico.
16. 16. Uso de un material producido por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en un procedimiento para la producción de bio-gas.
17. 17. Uso de un material producido por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en un procedimiento para la producción de nutrientes.