JP5638783B2

JP5638783B2 - アルコール発酵用酵母およびそれを用いたエタノールの製造方法

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Publication number: JP5638783B2
Application number: JP2009208387A
Authority: JP
Inventors: 八代　洵; 洵八代; 雄二中原; 廣田　真; 真廣田
Original assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2029-09-09
Also published as: JP2011055756A

Description

本発明は、アルコール発酵用酵母、およびアルコール酵母を用いたエタノールの製造方法に関するものである。

近年、石油価格の高騰及び地球温暖化等の問題から、再生可能な資源であるバイオマスより発酵生産するエタノールが世界的に脚光を浴び、その生産技術の開発・改良が精力的に進められている。特にそのうち食糧と競合しない草本・木本類の多糖類を利用しようとする動きが活発化しており、これら非可食性バイオマスの多糖を酸や酵素で加水分解し、得られた単糖をエタノール発酵させる方法が主流となりつつある。

これら加水分解した糖液の発酵方法としては、回分法、繰り返し回分発酵法、菌体リサイクル連続発酵法、固定化菌体法などがある。回分法とは、単純に発酵槽に糖液あるいはこの糖液に各種栄養剤を加えた培地（以下、まとめて糖液ということがある）に酵母等を植菌し発酵させる方法である。繰り返し回分発酵法とは、酵母等で発酵後一部の培養液を残して培養液を分離し、これに再度フレッシュな糖液を注入し再発酵を行う方法である。菌体リサイクル連続発酵法（通称ｒｅ−ｕｓｅ法）とは、発酵槽に連続的に糖液を供給し、オーバーフローした培養液の菌体を沈降法や遠心分離法で回収してフレッシュ糖液供給側に戻す方法である。固定化菌体法とは、担体に菌体を固定化して発酵を行う方法であり、最近になって普及しつつある。

しかし、これらの発酵方法を行う場合にはいずれも、何らかの雑菌汚染対策を講じる必要があった。

ところで、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液を糖源として、アルコール（エタノール）発酵がなされている。木本類および／または草本類中には、セルロース以外にヘミセルロース（例えば、針葉樹ではマンナン類、広葉樹ではキシラン類など）が含まれている。かかるヘミセルロースが分解されることにより生成された単糖が、エタノール発酵に利用されている。

亜硫酸パルプ排液に含まれるヘミセルロース由来の糖類（単糖など）のエタノール発酵の際には、上記の発酵方法のうちｒｅ−ｕｓｅ法が採用されることが多く、その場合通常、設備をクローズド化し難い。そのため、雑菌汚染対策としては一般に、糖液の固形分の濃度アップ、糖液の弱酸性（ｐＨ５程度）への調整がなされることが多い。しかし、弱酸性の雰囲気では発酵安定性や菌の生存率低下等の問題があった。

特開２００４−３４４０８４号公報（特許文献１）には雑菌を抑制できるより低ｐＨ領域で培養・発酵が可能な耐酸性のアルコール発酵用酵母（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ種酵母）に関する提案がされている。また、国際公開第２００８−０６２５５８号公報（特許文献２）には、耐熱性の高いアルコール発酵酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ種酵母）に関する提案がされている。さらに、特開２００６−３２５５７７号公報（特許文献３）には、生ゴミのアルコール発酵技術において、乳酸発酵を行い酸性化した糖化液に耐酸性の酵母を加え発酵を行う技術が提案されている。

特開２００４−３４４０８４号公報国際公開第２００８−０６２５５８号公報特開２００６−３２５５７７号公報

しかしながら、より一層の雑菌汚染を防止するために、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液のｐＨを５前後に調整した場合、特許文献１〜３に開示されている酵母では、十分に発酵することができない場合がある。その理由は明確ではないが、例えば、木本類および／または草本類を、硫酸や亜硫酸により酸加水分解して得られる糖液であって、固形分濃度が２０重量％以上に調整された糖液の場合は、糖液が酢酸や各種のフルフラール類等発酵阻害物質を大量に含んでいるために充分な発酵が困難となるものと推測される。また、特許文献３に開示されている酵母は乳酸発酵させる酵母であり、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液をアルコール発酵させる能力は低い。

そこで、本発明は、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液のｐＨや固形分濃度などの発酵条件に左右されず安定したアルコール発酵能力を発揮でき、中でも、ｐＨが５前後の弱酸性に調整された糖液であって木本類および／または草本類を酸加水分解して得られる糖液、あるいは、係る糖液であってさらに固形分が２０重量％以上に調整された糖液に添加されても、アルコール発酵能力が阻害されない、耐酸性および発酵安定性に優れるアルコール発酵用酵母と、該酵母を用いるエタノールの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、様々なアルコール発酵酵母の分離を行った結果、優れた耐酸性を示すアルコール発酵用酵母を見出した。そして、かかるアルコール発酵用酵母をエタノール製造に用いることにより、安定的なエタノールの製造が可能であると共に、糖液のｐＨや固形分濃度といった発酵条件に左右されずにエタノールを安定的に製造できることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔８〕を提供する。
〔１〕木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液中で、アルコール発酵能を有する、アルコール発酵用サッカロミセス属酵母。
〔２〕サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株（ＦＥＲＭＰ−２１７９３）である請求項１に記載のサッカロミセス属酵母。
〔３〕木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液をエタノール発酵するにあたり、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上の条件で生育可能であるアルコール発酵用サッカロミセス属酵母を用いる、エタノールの製造方法。
〔４〕前記糖液は、ｐＨ４．２〜５．５の糖液である、〔３〕に記載のエタノールの製造方法。
〔５〕前記加水分解が、硫酸および／または亜硫酸による加水分解である、〔３〕または〔４〕に記載のエタノールの製造方法。
〔６〕前記糖液は、固形分濃度が２０重量％以上である、〔３〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のエタノールの製造方法。
〔７〕前記エタノール発酵は、前記糖液に前記酵母を接種して発酵を行う工程、および前記酵母を回収して新しい前記糖液に供給して再び発酵を行う工程を含む、菌体リサイクル連続発酵である、〔３〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のエタノールの製造方法。
〔８〕サッカロミセス属酵母を、木本および／または草本類を加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液に添加し発酵させることにより、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液中でアルコール発酵能を有するサッカロミセス属酵母を分離する方法。

本発明によれば、糖液のｐＨや固形分濃度などの発酵条件に左右されず安定したアルコール発酵能力を発揮できるアルコール発酵用酵母を提供することができる。かかるアルコール発酵用酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、複雑かつ精緻な雑菌汚染対策を講じることがなく安定的なエタノールの供給が可能である。

図１は、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６およびサッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６の各ＰＣＲ産物の電気泳動図である。図２は、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６およびサッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６の生成エタノール濃度に対する、糖液のｐＨ条件の変化の影響を示すグラフである。

図１中、レーン１、レーン２、Ｍは、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６の結果、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６の結果、分子量マーカーを、それぞれ示す。

本発明においては、アルコール発酵用サッカロミセス属酵母を用いる。ここでアルコールとは、炭化水素に含まれる１又は２以上の水素原子を水酸基に置換した化合物を意味し、代表的なものとしてはエタノールが挙げられる。

サッカロミセス属酵母としては、サッカロミセス属に属するものであれば特に限定されないが、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）が好ましく、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株が好ましい。サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株は、糖液のｐＨや固形分濃度に関わらず安定的な発酵能力を有し、特に、耐酸性および発酵阻害物質に対する耐性を有する。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液中で、アルコール発酵能を有する。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、ｐＨ４．２〜５．５、好ましくはｐＨ４．４〜４．８の木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液中でアルコール発酵能を有する。これにより、弱酸性〜酸性条件下での発酵が可能となるので、雑菌汚染対策を取りながらも効率的なエタノール製造が実現できる。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは２３％（ｗ／ｖ）以上の、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液中でアルコール発酵能を有する。これにより、弱酸性〜酸性条件下での発酵が可能となるので、ｐＨの調製など簡単な雑菌に対する対策をするだけで効率的なエタノール製造が実現できる。

なお、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液の定義、すなわち、木本類、草本類、加水分解、糖液、ｐＨの調整、固形分濃度などのそれぞれの定義については、後述する。

アルコール発酵能を有するとは、エタノールをはじめとするアルコールを発酵する能力を備えることを意味する。具体的には、エタノールの生産量が０．５５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、好ましくは０．６％（ｗ／ｖ）以上であることがより好ましい。また、既存種であるサッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６（通称ＴＡＩＫＥＮ３９６）のエタノール生産量に対する比率で、２倍以上であることが好ましい。エタノールの生産量は、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上に調整された、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液中で継代培養を行い、３代継代後の培養液中のエタノール濃度として測定可能である。

また、アルコール発酵能を発揮するために、上記ｐＨの範囲の糖液中で生育可能であることが好ましい。生育可能とは、具体的には酵母の生存率が好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。ここで酵母の生存率とは、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上に調整された培地に対し継代培養を行い、１代目の植菌時の発生コロニー数に対する次世代以後の発生コロニー数の割合の百分率を意味する。発生コロニー数は、ＭＹ培地での発生コロニー数から特定され得る。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、発酵阻害物質に対し耐性を示す酵母であることが好ましい。発酵阻害物質とは、サッカロミセス属酵母のアルコール発酵を阻害する物質を意味し、その代表的なものとしては酢酸、フルフラール類、亜硫酸類が例示される。フルフラール類とは、フルフラールを骨格とする化合物群を意味し、例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、メチルフルフラールが挙げられる。アルコール発酵用サッカロミセス属酵母が発酵阻害物質に対し耐性を示すことの確認は、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液から抽出されているかどうかで、或いは、酢酸およびフルフラール類から選ばれる発酵阻害物質を添加した培地中での生存率を調べることにより確認可能である。

サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株は下記の性質を有する。
（１）コロニー観察（ＹＭ平板培地上２８℃５日間後に観察）
周縁の形状：全縁
隆起状態：円錐形
表面形状：平滑
光沢及び性状：輝光、バター様、湿性
色調：白色からクリーム色

（２）形態性状観察（ＹＭ平板培地上で２８℃１０日培養後、光学顕微鏡観察）
栄養細胞：球形−広楕円形
栄養増殖：多極出芽
子嚢：１−４個の球形子嚢胞子形成

（３）２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析
アポロンＤＢ−ＦＵＢＬＡＳＴ検索でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｅａｅＮＲＲＬＹ−１２６３２と１００％相同
ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ等の国際塩基配列データーベースでは、３０種のサッカロミセスセレビシエと１００％相同

以上の性質から、本酵母は、サッカロミセスセレビシエＭｅｙｅｎｅｘＥ．Ｃ．Ｈａｎｓｅｎと推定された。

また、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株は下記の生理学的性状を有する。

（１）糖類発酵性試験（＋：ｐｏｓｉｔｉｖｅ −：ｎｅｇａｔｉｖｅＷ：ｗｅａｋＳ：ＳｌｏｗＬ：ｌａｔｅｎｔＳＷ：Ｓｌｏｗａｎｄｗｅａｋ）
Ｇｌｕｃｏｓｅ「＋」
α−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ「−」
Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ「−」
Ｇａｌａｃｔｏｓｅ「＋」
Ｓｕｃｒｏｓｅ「＋」
Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ「−」
Ｍａｌｔｏｓｅ「＋」
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ「−」

（２）炭素源資化性試験
Ｇｌｕｃｏｓｅ「＋」
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ「Ｌ」
Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ「−」Ｇａｌａｃｔｏｓｅ「＋」
α−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ「−」
Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ「−」
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ「−」
Ｓａｌｉｃｉｎ「−」
Ｉｎｏｓｉｔｏｌ「−」
Ｄ−Ｒｉｂｏｓｅ「−」
Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ「−」
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ「−」
Ｄ−Ｘｙｌｏｓｅ「−」
Ｌａｃｔｏｓｅ「−」
ＤＬ−Ｌｓｃｔａｔｅ「Ｌ」
Ｓｕｃｒｏｓｅ「＋」
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ「−」
Ｅｔｈａｎｏｌ「ＳＷ」
Ｍａｌｔｏｓｅ「＋」
Ｒｉｂｉｔｏｌ「−」

（３）窒素源資化性試験
Ｎｉｔｒａｔｅ「−」
Ｌ−Ｌｙｓｉｎ「−」
Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ「−」
Ｅｔｈｙａｍｉｎ「−」

（４）耐性試験
Ｇｒｏｗｔｈａｔ３０℃「＋」
Ｇｒｏｗｔｈａｔ３７℃「＋」
Ｇｒｏｗｔｈａｔ４０℃「＋」
Ｇｒｏｗｔｈａｔ４５℃「−」
０．１％ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ「−」
５０％Ｇｌｕｃｏｓｅ「＋」
１０％ＮａＣｌ／５％Ｇｌｕｃｏｓｅ「Ｓ」

（５）ビタミン要求性試験
Ｖｉｔａｍｉｎ−ｆｒｅｅ「Ｓ」

サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株の上記の生理学的性状を、Ｙｅａｓｔ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ第３版（Ｂａｒｅｎｅｔｔｅｔａｌ．，２０００）に記載されているサッカロミセスセレビシエ標準株と比較すると、ＮＰＣ３３８４６株は耐熱性及び耐糖性に優れていた。ここで耐熱性とは、高温下で長期間生存しうる能力を意味する。高温とは好ましくは３５℃以上、より好ましくは４０℃以上を意味する。長期間とは好ましくは１週間以上、より好ましくは１ヶ月以上を意味する。耐糖性とは、糖が多く含まれる条件下で長期間生存しうる能力を意味する。糖としては、グルコースが例示される。これらの具体例のうちの１種であってもよく２種類以上の合計量であってもよい。糖の濃度は好ましくは４０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上を意味する。長期間とは好ましくは１週間以上、より好ましくは１ヶ月以上を意味する。

本発明におけるアルコール発酵用のサッカロミセス属酵母は、そのゲノムＤＮＡ中の一部（遺伝子マーカー）に、既存のエタノール発酵能を有する菌株と比較して異なる部分（多型）を有することが好ましい。既存のエタノール発酵能を有する菌株としては、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６が例示される。遺伝子マーカーとしては、プライマーＭ１３、Ｎ２１、（ＧＴＧ）₅、（ＧＡＣ）₅、（ＧＡＣＡ）₅（それぞれ配列番号１〜配列番号５に記載される塩基配列参照）で増幅される塩基部分が例示され、これらのいずれかのプライマーで増幅される遺伝子マーカーに多型を有することが好ましく、すべての遺伝子マーカーに多型を有する異なることがより好ましい。遺伝子マーカーにおける多型の有無の確認を一例を挙げて説明すると次のとおりである。まず検体及び既存の菌株のそれぞれからゲノムＤＮＡを常法により抽出する。このＤＮＡを鋳型として、所定のプライマーでＰＣＲ（例えばＲＡＰＤ、ＭＳＰ−ＰＣＲ等）を行い、遺伝子マーカーを増幅する。得られる増幅産物を電気泳動等で視覚化する。電気泳動パターンにおいて、バンドの部位に相違があるかどうかで、本発明によるアルコール発酵用サッカロミセス属酵母かどうかを判断し得る。

サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、２００９年（平成２１年）３月２６日付で寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭＰ−２１７９３である。

本発明においては、アルコール発酵用のサッカロミセス属酵母を使用してエタノールを製造することにより、糖液の条件に左右されずにエタノールを効率よく得ることができる。特に、発酵における雑菌汚染対策として糖液のｐＨの酸性〜弱酸性への調整、発酵温度や固形分濃度の調整などを行なっても、安定的にエタノールが供給される。よって、本発明は、これらの雑菌汚染対策が採られることの多い、いわゆる菌体リサイクル連続発酵法（ｒｅ−ｕｓｅ法）によるエタノール製造に好適に用いられ得る。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母の取得は、サッカロミセス属酵母を、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．２〜５．５でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液に添加し発酵させ、アルコール発酵能を有する菌体を選抜することにより可能である。また、アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、そのゲノムＤＮＡ中の一部（遺伝子マーカー）に、既存のサッカロミセス属酵母のそれと比較して異なる部分（多型）を有するものとしても、選抜されうる。既存のエタノール発酵能を有する菌株、遺伝子マーカーについては、先に説明したとおりである。

サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株の取得は次のようにして行われた。広葉樹を亜硫酸で加水分解（最高温度１６０℃）して糖液を得た。この糖液の濃縮液（固形分２５〜３０％、ｐＨ１．５〜２）から、アルコール発酵能を指標にして分離した。なお、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株は糖液の濃縮液中に胞子として存在していたと推測され、分離時点でほぼ一種の酵母に純化していた。このような起源を持つため耐熱・耐酸性に優れた酵母が得られたものと推測される。

本発明で用いる、アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は、微酸性下、例えばｐＨ４．２〜５．５の条件でエタノール発酵を行っても、菌体の生存率が非常に高い。また木本や草本類の酸加水分解によって得られた糖液に含有される発酵阻害物質に対して、強い耐性を示す。よって、長期間、かつ連続的にアルコール生産が可能であり、雑菌汚染対策として、酸性の糖液を用いる場合でも、発酵安定性に優れ、菌の生存率も保たれるので、菌体を繰り返し使用するいわゆるＲｅ−ｕｓｅ法による発酵にも有用である。

アルコール高発酵能サッカロミセス属酵母は、エタノールの製造に好適に用いられ得る。すなわち、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液をエタノール発酵するにあたり、上記アルコール高発酵能サッカロミセス属酵母が使われ得る。

木本類としては、各種の針葉樹（まつ、すぎ、つが、ひのき、ヘムロック、ダグラスファー、ラジアーパイン等）、広葉樹（ユーカリ、ハンノキ、ぶな、かば、なら、しい等）が挙げられる。これらの中から１種を選択して用いてもよいし、２種以上を選択し組み合わせて用いてもよい。

草本類としては、わら、稲、麦等が挙げられる。これらの中から１種を選択して用いてもよいし、２種以上を選択し組み合わせて用いてもよい。

本発明においては、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液が用いられる。すなわち、木本類を加水分解して得られる糖液、草本類を加水分解して得られる糖液、或いは、木本類および草本類を加水分解して得られる糖液が用いられる。中でも、木本類を加水分解して得られる糖液が好ましい。木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液は、パルプ製造の際の排液（パルプ排液）として得ることができる。

加水分解の条件は特に限定されない。例えば、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素による加水分解などが挙げられる。このうち酸加水分解が好ましく、硫酸および亜硫酸のいずれか、あるいは両方による加水分解がより好ましく、亜硫酸による加水分解がさらに好ましい。なお、本発明において硫酸としては、硫酸およびその塩を用いることができ、また、亜硫酸としては、亜硫酸およびその塩を用いることができる。

硫酸および／または亜硫酸による、木本類および／または草本類の加水分解の条件は特に限定されない。硫酸、亜硫酸、または、硫酸と亜硫酸の両方を、原料である木本類および／または草本類に添加して行うことができるが、硫酸と亜硫酸、亜硫酸と亜硫酸の塩、濃硫酸と希硫酸のいずれを用いるかによって、好ましい添加量、酸加水分解時の温度、酸加水分解時間が異なるため、適宜これらの条件を調整することが必要である。

木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液は、アルコール発酵用酵母を作用させる前に、ｐＨ４．２〜５．５、好ましくはｐＨ４．４〜４．８に調整（中和）することが好ましい。これにより、アルコール高発酵能のサッカロミセス属酵母の特性を充分に生かすことができる。また、エタノール製造における雑菌対策汚染対策を取りつつも高効率なエタノールの製造が可能である。糖液のｐＨの下限を上記数値とすることにより、アルコール高発酵能のサッカロミセス属酵母の活性を低下させずに発酵を進めることができる、などの利点がある。尚、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液が、ｐＨの調整（中和）を行わなくとも上記ｐＨの範囲内である場合には、ｐＨの調整（中和）工程は省略することができる。

糖液のｐＨ調整は、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化ナトリウムなどの試薬の添加などによればよく、特に限定されない。

なお、加水分解に亜硫酸を用いる場合、加水分解終了段階で亜硫酸がブドウ酒等の保存剤として添加される量の１０倍以上含まれている。亜硫酸は経験的にＨ⁺＋ＨＳＯ₃態が最も抗菌性が高いが、ｐＨ５前後（弱酸性）でこの形が増加する。よって、糖液のｐＨを５前後とすることにより、雑菌汚染を有効に防ぐことができる。糖液のｐＨ５．５を超えると、上記した酵母は安定した発酵が可能であるが雑菌汚染が起こり易くなる上、加水分解によって得られた糖液にスラッジが生成し酵母分離の妨げや酵母劣化の原因となる。

木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液は、その固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、２２％（ｗ／ｖ）以上であることがより好ましい。これにより、エタノール製造における雑菌対策汚染対策を取りつつも高効率なエタノールの製造が可能である。固形分濃度の上限は特に制限されないが、液比重が上がり酵母分離が困難になるおそれがあるので、３０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。ここで、固形分濃度とは、培養開始時の糖液に含まれる固形分であって、発酵中に別途外添される糖分等は含まない。固形分の調整方法は特に問わないが、エバポレーター等の機器を用いる濃縮が例示される。

木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液中の組成は、その原料である木本類、草本類の種類、加水分解の条件などによって異なり、一様に規定することはできないが、ヘキソースではグルコース、マンノース、ガラクトース、ペントースではキシロース、アラビノースなどの糖を含んでいる。

本発明において、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液をエタノール発酵する条件は、ｐＨ５前後の条件で生育可能であるアルコール発酵用サッカロミセス属酵母を用いるのであれば特に制限はない。具体的には、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液に対しアルコール発酵用サッカロミセス属酵母を添加して、必要に応じて撹拌しつつ、発酵させればよい。発酵の際の温度は、通常は４０℃以下であり、エタノール収率および酵母の生存率の点からは３７℃以下であることが好ましい。また、下限は２５℃以上であることが、発酵速度の低下のおそれを防ぐ点で好ましい。最も好ましくは、３０℃〜３５℃である。

アルコール発酵用サッカロミセス属酵母は糖液に添加する前に前培養を行ってもよく、その場合の培地としては糖蜜培地、ＭＹ培地、ＹＥＰＧ培地などが例示される。発酵方式としては、通常糖液の発酵の際用いられる方式ならいずれも採用可能である。かかる発酵法式としては回分法、繰り返し回分発酵法、菌体リサイクル連続発酵法、固定化菌体法などが例示される。中でも菌体リサイクル連続発酵法（ｒｅ−ｕｓｅ法）は、本発明におけるアルコール発酵用サッカロミセス属酵母の特色を生かして、雑菌汚染対策を採りつつ安定的なエタノール製造が可能となるので好ましい。

ｒｅ−ｕｓｅ法は連続発酵において、菌体を繰り返し用いる方式である。すなわち、木本類および／または草本類を加水分解して得られる糖液にアルコール発酵用酵母を接種して発酵を行う工程（Ｉ）、および、前記酵母を回収して新しい前記糖液に供給して再び発酵を行う工程（ＩＩ）を含む方式である。工程（ＩＩ）については１度でもよいし、２度以上繰り返して行ってもよい。

以下に実施例をもって本発明を説明する。

（実施例１）
サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株とサッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６との間で、ゲノムＤＮＡの多型の比較を行った。

まず両菌株を培養した。培地として、Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ−ｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔｂｒｏｔｈ（ＹＭｂｒｏｔｈ）（ＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＦｅｌｌ，１９９８）を用い、２５℃、好気条件で１日間、往復振とう培養した。

培養後の各菌株の菌体からゲノムＤＮＡを抽出し、ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）法およびＭＳＰ−ＰＣＲ（ｍｉｃｒｏ／ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｐｒｉｍｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法に基づき、多型の比較を行った。ＤＮＡの抽出は、キット（Ｇｅｎとるくん（登録商標）（酵母用）、ＴａＫａＲａＢｉｏｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いた。ＰＣＲは、永塚らの方法（Ｎａｇａｔｓｕｋａｅｔａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１，２３５−２４３）に従い、キット（ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａＢｉｏｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。プライマーとしては、Ｍ１３（配列番号１、Ａｎｄｒｉｇｈｅｔｔｏｅｔａｌ．，２０００，ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０，５−９参照）、Ｎ２１（配列番号２、Ｎａｕｍｏｖａｅｔａｌ．，２００３，ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ３，１７７−１８４参照）、（ＧＴＧ）₅（配列番号３、Ｎ２１と同じ文献およびＢａｌｅｉｒａｓｅｔａｌ，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．１，４１−４６参照）、（ＧＡＣ）₅（配列番号４、Ｎ２１および（ＧＴＧ）₅と同じ文献参照）、（ＧＡＣＡ）₅（配列番号５、（ＧＴＧ）₅と同じ文献参照）を用いた。ＰＣＲの産物を分析するため電気泳動を行った。電気泳動は、１．２％ＡｇａｒｏｓｅＳ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とＴＢＥｂｕｆｆｅｒを用いて行った。

各プライマーを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、図１に示す。図１中、レーン１及びレーン２はそれぞれ、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６の結果及びサッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株の結果を示す。Ｍは分子量マーカーを示す。

図１から明らかなとおり、両菌株のバンドパターンには相違が見られた。このことから、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株は、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６とは、遺伝子的にも別の菌株であることが明らかとなった。

（実施例２）
国内産広葉樹雑木を主体とした材構成チップを亜硫酸蒸解（１５０℃、９時間）した時に発生した蒸解抽出液（固形分１５％ｗ／ｖ）のロータリーエバポレーター濃縮液（固形分２５％ｗ／ｖ）を水酸化マグネシウムでｐＨ４．５に中和した。これを糖液培地（ヘキソース濃度１．９％、ペントース濃度４．３％）とした。

別にサッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６（ＮＰＣ３３８４６株）及びサッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６（通称ＴＡＩＫＥＮ３９６）をＹＥＰＧ培地（グルコース４％、ポリペプトン２％、酵母エキス１％）１００ｍｌで３０℃フルグロースまで生育させた。それぞれ分離・水洗浄して純水１０ｍｌに懸濁し、１０ｍｌの濃縮菌体水懸濁液とした。次いでそれぞれの濃縮菌体水懸濁液を、上記糖液培地９０ｍｌ／２００ｍｌ三角フラスコに添加し、３０℃で、５０ｒｐｍで撹拌しつつ、１晩発酵を行った。その後発酵液を遠心分離し、菌体を分離・洗浄して再び純水１０ｍｌに懸濁し、１回目と同じ培地９０ｍｌに添加し発酵を行った。

これを計３回（代）繰り返した時の、培養液中のエタノール濃度およびＮＰＣ３３８４６株とＴＡＩＫＥＮ３９６株の生存率を、それぞれ表１および表２に示した。なお、生存率はＹＥＰＧ（５％グルコース、１％ペプトン、０．５％酵母エキス、１．５％寒天）培地の平板培養（３０℃、４８時間）での発生コロニー数から測定し、各一代目植菌時濃縮菌体水懸濁液の発生数を１００％として計算した。

表１および表２から明らかなように、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株では継代発酵をしても殆ど発酵率の低下はなく酵母の生存率も変わらなかったのに対し、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６では、発酵率が低く、かつ継代発酵が進むにつれ急速に酵母が死滅した。

（実施例３）
国内産針葉樹雑木を主体とした材構成チップを実施例２と同様の条件で亜硫酸蒸解した時に発生した蒸解抽出液（固形分１５％ｗ／ｖ）のロータリーエバポレーター濃縮液（固形分２５％ｗ／ｖ）を水酸化マグネシウムでｐＨ４．５に中和した。これを糖液培地（ヘキソース濃度３．７％、ペントース濃度１．８％）とした。この糖液に関し実施例２と同じ方法で継代エタノール発酵を行いＮＰＣ３３８４６株とＴＡＩＫＥＮ３９６株を比較した。培養液中のエタノール濃度およびＮＰＣ３３８４６株とＴＡＩＫＥＮ３９６株の生存率を、それぞれ表３および表４に示した。

針葉樹由来の糖液の場合、サッカロミセスセレビシエの野生株が発酵可能なヘキソースが多いため、生成エタノール濃度が広葉樹と比較し高くなる。また発酵阻害物質も少ない事が知られている。

しかし、表３および表４から明らかなように、糖液のｐＨが４．５の場合、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６は継代培養で安定して発酵が行われるのに対し、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６（通称ＴＡＩＫＥＮ３９６）では継代が進むにつれ、菌体の劣化によると推測される発酵性低下が顕著であり、急速な菌体の死滅が見られた。

以上の実施例２および実施例３から、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６は、ｐＨが、従来の糖液と比較して弱酸性に調整され、かつ、固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上に調整された糖液に添加されても、アルコール発酵能力が阻害されないことが分かる。また、ＮＰＣ３３８４６株を用いれば、ｒｅ−ｕｓｅ法などのエタノール生産システムにおいて、雑菌汚染対策を講じつつも安定的なエタノールの供給が可能である。

（実施例４）アルコール発酵時の耐酸性評価
実施例２と同じ広葉樹亜硫酸加水分解液濃縮液において、中和ｐＨを３．９から５．６の間で変化させたものを用意した。別途培養した酵母（サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６、サッカロミセスセレビシエＮＢＲＣ０２１６（通称ＴＡＩＫＥＮ３９６））を、それぞれの濃縮液に１％濃度で添加し、３０℃で１日発酵を行った。この時のエタノールの生成濃度を測定した。結果を図２に示す。

図２から、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６はＴＡＩＫＥＮ３９６株と比較しｐＨ５前後、特にｐＨ５前後での耐久性、すなわち発酵段階でのｐＨ耐久性に優れていることがわかる。

ＦＥＲＭＰ−２１７９３

Claims

木本類および／または草本類を亜硫酸により加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．４〜４．８でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液中で、アルコール発酵能を有する、サッカロミセスセレビシエＮＰＣ３３８４６株（ＦＥＲＭＰ−２１７９３）。
木本類および／または草本類を亜硫酸により加水分解して得られる糖液であって、ｐＨ４．４〜４．８でかつ固形分濃度が２０％（ｗ／ｖ）以上である糖液をエタノール発酵するにあたり、請求項１に記載の酵母を用いる、エタノールの製造方法。
前記エタノール発酵は、前記糖液に前記酵母を接種して発酵を行う工程、および前記酵母を回収して新しい前記糖液に供給して再び発酵を行う工程を含む、菌体リサイクル連続発酵である、請求項２に記載のエタノールの製造方法。