JP6887149B2

JP6887149B2 - 発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母

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Publication number: JP6887149B2
Application number: JP2016239366A
Authority: JP
Inventors: 正朗小西; 知子荒川; 奨石田; 勇太加藤
Original assignee: Kitami Institute of Technology NUC
Current assignee: Kitami Institute of Technology NUC
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: JP2017221182A

Description

本発明は、セルロース系バイオマス由来の糖化液を原料とする有用物質の生産に利用可能な、発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母に関する。

近年、地球温暖化対策や廃棄物の有効利用の観点から、植物資源いわゆるバイオマスの利用が注目されている。加水分解等の糖化処理によってバイオマスを糖類に分解した後、微生物を用いて種々の発酵生産物を製造し、燃料や化学原料として利用する研究が進められている。

バイオマス原料としてはサトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く利用されているが、これらは有用な可食性資源でもあるため、長期的かつ安定的に工業用資源として利用することは、今後の人口増加問題と拮抗するため好ましくない。

以上の観点から、可食性資源ではなく、例えばバガス・稲わら・トウモロコシの非可食部、木材チップその他のセルロース系バイオマスが、次世代の工業用植物資源として注目されている。

セルロース系バイオマスは、種々の物理化学的又は酵素的な前処理法によって、微生物が炭素源として利用し得る糖化液に加工される。前記処理法として、硫酸を使用する方法（特許文献１又は２）、亜臨界水を使用する方法（特許文献３）等が開示されている。

しかし、このような処理で得られる糖化液の多くは、発酵生産物の収率を著しく低下させる発酵阻害という問題を抱えている。一般に、セルロース系バイオマス由来の糖化液に含まれるリグニン、酢酸その他の有機酸等が、発酵阻害の原因物質（発酵阻害物質）と考えられている。

例えば、エタノールの発酵生産にはサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、それらの育種株又は組換え株が利用されることが多いが、Ｓ．セレビシエは発酵阻害物質への耐性が低く、セルロース系バイオマス由来の糖化液に適用することは困難である。

上記問題に対して、発酵阻害物質の除去によって発酵生産物の収率低下を防止する方法が検討されている。例えば、金属水酸化物のエタノール水溶液を用いて糖化液中のリグニン成分を除去する方法（特許文献４）、アンモニア処理と酵素処理を組み合わせることによりリグニン成分を除去する方法（特許文献５）等が報告されている。また、糖化液を精密ろ過して発酵阻害物質を除去する糖化装置も報告されている（特許文献６）。しかしながら、いずれの方法においても処理工程の複雑化は免れず、最終生産物のコスト増加に直結する。

一方、微生物に発酵阻害耐性を付与する方法も検討されている。例えば、酢酸の存在下でも増殖し得る微生物として、転写制御因子ＨＡＡ１を組換え的に過剰発現させた７０ｍＭの酢酸に耐性を示すＳ．セレビシエ（非特許文献１）、Ｙ０Ｌ０４６Ｃ遺伝子を導入した１３０ｍＭの酢酸に耐性を示すＳ．セレビシエ等が報告されている（特許文献７）。しかし、セルロース系バイオマス由来の糖化液には、その原料や製造方法によって上記の濃度を上回る酢酸を含むものもあり、上記組換えＳ．セレビシエの利用には限界がある。

特表平１１−５０６９３４号公報特開２００５−２２９８２１号公報特開２００３−２１２８８８号公報特開２０１３−０４２７２７号公報特開２０１３−１６２７７７号公報特開２０１２−２００１８３号公報特開２０１３−３４４４８号公報

ＴａｎａｋａＫ．，ｅｔａｌ，ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，ｖｏｌ．７８，ｐｐ．８１６１−８１６３

本発明は、セルロース系バイオマス由来の糖化液に含まれる発酵阻害物質の影響を受けにくく、有用物質の発酵生産に利用可能な微生物を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、セルロース系バイオマス由来の糖化液中でも良好に増速する微生物株を見いだし、本発明を完成させた。

（１）セルロース系バイオマス由来の糖化液に含まれる発酵阻害物質に耐性を有するピキア・メンブレニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）。
（２）発酵阻害物質が１００ｍＭ以上の酢酸である、（１）に記載のピキア・メンブレニファシエンス。
（３）２６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域が配列番号１に示される塩基配列と９７％以上の同一性を、及び／又は２６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域が配列番号２に示される塩基配列と９７％以上の同一性を有する、（１）又は（２）に記載のピキア・メンブレニファシエンス。
（４）以下の形態学的特徴及び生理学的性状を有する、（１）から（３）のいずれかに記載のピキア・メンブレニファシエンス。
＜形態学的特徴＞
ＹＭ寒天培地上で２５℃、２日間の培養で直径２〜３ｍｍ程度のコロニー（形：円形、隆起状態：半レンズ状、周縁：スムーズ、表面の形状：スムーズ、透明度：半透明、粘ちょう度：粘ちょう性）を形成する。また、子嚢胞子の形成が確認できる。
＜生理学的性状＞

（５）受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２５７として寄託されているピキアメンブレニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）ＫＳ４７−１株。
（６）発酵阻害物質を含む培養液中で（１）から（５）のいずれかに記載のピキア・メンブレニファシエンスを培養することを含む、有用物質の生産方法。

本発明の微生物は、セルロース系バイオマス由来の糖化液中で増殖するので、該糖化液に含まれる発酵阻害物質の除去処理を不要としたり、糖化液の品質管理の許容度を大幅に増加させたりすることができ、セルロース系バイオマス由来の糖化液を利用した有用物質の発酵生産におけるコストダウンに寄与することができる。また、セルロース系バイオマス由来の糖化液を原料として様々な有用物質を製造する際の遺伝子組換え宿主としても有用である。

Ｐ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株の細胞を光学顕微鏡を用いて撮影した写真である。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２株（パネルＡ）及びＰ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株（パネルＢ）のＹＭ培地及び糖化液それぞれにおける増殖特性を示す図である。Ｐ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株、Ｓ．セレビシエＢＹ４７２７、Ｐ．メンブレニファシエンスの基準株であるＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５株及びその近縁基準株の糖化液中での増殖特性を示す図である。Ｐ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株、Ｓ．セレビシエＢＹ４７２７及びＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５株の酢酸存在下の相対増殖量を示す図である。Ｐ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株、Ｓ．セレビシエＢＹ４７２７及びＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５株の酢酸存在下のエタノール産生を示す図である。（Ａ）はＯＤ_６００、（Ｂ）は酢酸濃度、（Ｃ）はグルコース濃度、（Ｄ）はエタノール濃度の推移を示している。

本発明は、セルロース系バイオマス由来の糖化液に含まれる発酵阻害物質、特に１００ｍＭ以上の酢酸に耐性を有するピキア・メンブレニファシエンスに関する。本発明の微生物は、好ましくは、２６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域が配列番号１に示される塩基配列と９７％以上の同一性を、及び／又は２６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域が配列番号２に示される塩基配列と９７％以上の同一性を有する。

また、本発明の微生物は、次のような形態学的特徴及び上記の表１に示される生理学的性状を有する。

＜形態学的特徴＞
ＹＭ寒天培地上で２５℃、２日間の培養で直径２〜３ｍｍ程度のコロニー（形：円形、隆起状態：半レンズ状、周縁：スムーズ、表面の形状：スムーズ、透明度：半透明、粘ちょう度：粘ちょう性）を形成する。また、子嚢胞子の形成が確認できる。

本発明の微生物の特に好ましい例は、２０１６年５月３１日付で日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２５７（識別の表示：ＫＳ４７−１）として寄託されている、Ｐ．メンブレニファシエンスＫＳ４７−１株（以下、ＫＳ４７−１株と表す）である。ＫＳ４７−１株は、自然界から採集された植物サンプルより分離された微生物であり、上述の形態学的特徴及び生理学的性状を有する。

また、ＫＳ４７−１株の２６ＳリボゾームＲＮＡ（２６ＳｒＲＮＡ）遺伝子のＤ１／Ｄ２領域及びＩＴＳ領域の各塩基配列は、配列番号１及び２にそれぞれ示されるとおりである。両塩基配列は、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）を対象としたＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、Ｐ．メンブレニファシエンスの基準株であるＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各領域に対していずれも９７％以上の同一性を有することが確認された。

本発明の微生物は、セルロース系バイオマス由来の糖化液に含まれる発酵阻害物質に耐性を示し、該糖化液中で増殖する。本発明にいう発酵阻害物質への耐性とは、発酵阻害や増殖阻害を引き起こす発酵阻害物質、例えば有機酸、フルフラール、バニリン、ヒドロキシメチルフルフラール等を含むセルロース系バイオマス由来の糖化液中で生育できる能力のことをいう。これは、例えば、粉砕乾燥させたコーンの芯を希硫酸で加熱処理後、水酸化ナトリウムでｐＨを５付近になるように調整し、次いでセルラーゼ処理して得られる糖化液を培地とした場合でも増殖する、特に発酵阻害物質を含まない糖化液又はこれに類似した組成の培地中で培養したときと同程度以上に増殖する能力を意味する。

発酵阻害物質への耐性はまた、発酵阻害物質を適当量添加した一般的な栄養培地又は合成培地、例えばＹＭ培地等において、発酵阻害物質を含まない条件下で培養したときと同程度以上に増殖する能力と表すこともできる。本発明の微生物は、好ましくは、発酵阻害物質の一種である有機酸、特に酢酸を１００ｍＭ以上含むＹＭ培地中で良好に増殖し、酢酸耐性を示す。本発明にいう酢酸耐性は、酢酸を１００〜１０００ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜３００ｍＭ含む培地中でも増殖する、特に酢酸を含まない条件下で培養したときと同程度に増殖する能力を意味する。本発明の微生物が増殖可能な培地中の酢酸濃度は、培地のｐＨや浸透圧を著しく変化させないかぎり制限はなく、例えば１００ｍＭ以上、好ましくは１５０ｍＭ以上、より好ましくは２００ｍＭ以上、さらにより好ましくは２５０ｍＭ以上、最も好ましくは３００ｍＭ以上であればよく、また１０００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは５００ｍＭ以下であればよい。また、本発明の微生物は、別の発酵阻害物質であるフルフラール２５ｍＭ、バニリン１０ｍＭ、ヒドロキシメチルフルフラール８０ｍＭ、ギ酸１０ｍＭそれぞれの存在下でも増殖することが確認されている。

本発明には、上記のＫＳ４７−１株の他に、これと同等の特性を有するピキア・メンブレニファシエンスも包含される。そのようなピキア・メンブレニファシエンスは、自然界から採集される各種試料から、セルロース系バイオマス由来の糖化液中で増殖する微生物を選択し、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を確認することで、入手することができる。具体的には、土壌、河川・湖沼・海洋の水・樹液・花・葉・果実等の試料を、セルロース系バイオマス由来の糖化液に加え、２０℃〜３７℃で３〜７日間培養し、濁度の上昇が認められたものを適当な栄養成分を含む寒天培地（例えば、ＹＭ寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地等）に播種し、単一コロニーを形成する菌株を分離した後、ＤＮＡを抽出し、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の特定領域のシークエンス解析を行って配列番号１及び又は２との同一性を確認すればよい。

また、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の確認に代えて、分離された単一コロニー形成菌株の形態学的特徴及び生化学的性状を、慣用的な方法（Ｂａｒｎｅｔｔｅｔａｌ，Ｙｅａｓｔｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００；Ｋｕｒｔｚｍａｎｅｔａｌ，ＴｈｅＹｅａｓｔｓ，ａｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１１等）を用いて確認することで、本発明の微生物を入手することができる。

本発明の微生物は、発酵阻害物質を含む培養液、特にセルロース系バイオマス由来の糖化液を用いた有用物質の発酵生産に利用することができ、発酵阻害物質を含む培養液中で該微生物を培養することを含む有用物質の生産方法もまた、本発明の一態様である。例えば、ピキア・メンブレニファシエンスはエタノール生産能を有するので、セルロース系バイオマス由来の糖化液を原料とするエタノール生産に利用することができる。

糖化液には、必要に応じて微生物培養に用いる炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、ビタミン類その他必要な栄養源を添加してもよい。炭素源としては、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等）、アルコール類（エタノール、プロパノール等）、中長鎖脂肪族炭化水素（ヘキサデカン、テトラデカン等）を用いることができる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、尿素、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等の含窒素化合物を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。ビタミン類としては、パントテン酸又はその塩、ニコチン酸、ピリドキサル酸、イノシトール、ビタミンＢ１２等を用いることができる。

発酵生産における培養条件はピキア・メンブレニファシエンスが増殖する範囲であれば、任意の条件を設定することができる。温度条件は１５℃〜３７℃。好ましくは２５℃〜３４℃、さらに好ましくは２８℃〜３０℃である。ｐＨは３．０〜８．０、好ましくは４．０〜５．０である。培養は、好気的条件又は微好気的条件で行うことが好ましい。

本発明の微生物は、糖化液を用いた本培養の前に、適当な栄養培地（例えばＹＭ培地又はＰＤＡ培地）で前培養を行うことが望ましい。前培養の培養条件は、本培養における培養条件に準ずる方法が適用される。雑菌汚染等を防ぐ目的で、任意の濃度の酢酸を培地に添加してもよい。

菌体の接種量は、本培養の培地１Ｌ当たり、上記前培養を行った培地１０〜１００ｍＬ、好ましくは３０〜５０ｍＬ程度を接種すればよい。

また、本発明の微生物は、セルロース系バイオマスを原料とした有用物質の製造を行うときの遺伝子組換え宿主としても利用可能である。ピキア・メンブレニファシエンスの形質転換及び形質転換されたピキア属酵母を用いた外来物質の生産については、例えば杉村ら（生物工学会誌、２０１１年、第８９巻、第１０号、第５７０−５８３ページ）に記載された方法に従って、又は市販のピキア属酵母用発現キット例えばＭｕｌｔｉ−ＣｏｐｙＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いて行うことができる。

以下に、実施例を示すことで本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。

１）菌株の分離
破砕乾燥したコーンコブ２００ｇに３％（ｗ／ｖ）硫酸を１Ｌ添加し、オートクレーブにて１２１℃、６０分間加熱処理した後、１０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨ５に調整した。これに５ｇのメイセラーゼ（株式会社明治）を加え、４０℃で３日間酵素糖化処理を行い、ろ過により残渣を取り除いたろ液を糖化液とした。ボトルトップフィルターを用いた除菌処理又はオートクレーブ処理を行った糖化液を、以下の実験に用いた。

糖化液中の２８０ｎｍにおける紫外吸収、糖組成ならびに発酵阻害物質の組成を下の表２に示す。

糖化液２ｍＬを入れた１５ｍＬ容量のディスポーザブルチューブに自然界から採集したサンプルを入れ、１５０ｒｐｍ、２５℃で１週間の振とう培養を行った。濁度が上昇したサンプルから０．１ｍＬの培養液を採取し、ＹＭ寒天プレートに播種し、コロニー分離法により、分離株を得た。試験管に入れたＹＭ培地に分離株を接種し、１５０ｒｐｍ、２５℃で振とう培養を行った培養液に２５％（ｗ／ｖ）のグリセリンを添加したものを−８０℃で保存し、フリーズストックとした。

２）２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンス
２００ｍＬ容量のバッフル付フラスコに用意した２０ｍＬのＹＭ培地にフリーズストックを播種し、２８℃、２００ｒｐｍで２日間培養した。培養後、遠心分離機を用いて回収した菌体から、ＰＣＲＴｅｍｐｌａｔｅＰｒｅｐａｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ロッシュ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。

抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列からなるプライマーセットを用いて２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域を、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列からなるプライマーセットを用いて２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域を、それぞれＰＣＲ法で増幅した。サイクルシークエンス反応には、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＶ３．１を用いた。サーマルサイクラーはＢｉｏＲａｄ社のＴ−１００を用いて、ＢｉｇＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒのマニュアルに従い、サイクルシークエンス反応を行った。

エタノール沈殿法で生成した反応産物をホルムアミドに再溶解し、９５℃、５分間の熱変性処理を行った後、キャピラリーシークエンサー（ＡＢＩ３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、塩基配列を決定した。

その結果、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列が配列番号１に、ＩＴＳ領域の塩基配列が配列番号２にそれぞれ示されるとおりであることが確認された。両塩基配列についてＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）に対してＢＬＡＳＴ解析を行った結果、各塩基配列はＰ．メンブレニファシエンスの基準株であるＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各領域の塩基配列に対して９７％以上の相同性を示すことが確認された。

３）分離株の生理性状試験
生理性状試験はバーネットら（Ｂａｒｎｅｔｔｅｔａｌ，Ｙｅａｓｔｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）及びクルツマンら（Ｋｕｒｔｚｍａｎｅｔａｌ，ＴｈｅＹｅａｓｔｓ，ａｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１１）に記載の方法に準拠し、温度耐性試験を除き２５℃で７日間培養した。

糖類発酵試験はグルコース及びガラクトースについて検討した。また、炭素源資化試験は、炭素源を含まない酵母最小培地に以下の糖類を添加した寒天培地上で、コロニーを形成する能力の有無を試験した。炭素源資化性試験に用いた炭素源は、グルコース、ガラクトース、Ｌ−ソボース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、スクロース、マルトース、トレハロース、α−メチル−Ｄグルコース、セロビオース、サリシン、メリビオース、ラクトース、ラフィノース、メレジトース、イヌリン、可溶性でんぷん、グリセロール、エリスリトール、リビトール、Ｄ−グルチオール、Ｄ−マンニトール、ガラクチトール、イノシトール、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、５‐ケト‐Ｄ‐グルコン酸、Ｄ−グルコン酸、ＤＬ−乳酸、コハク酸、クエン酸、メタノール、エタノール、サッカリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ヘキサデカンである。

窒素源を含まない最小培地に硝酸を添加した寒天培地上でコロニーを形成する能力（窒素源資化性）を試験した。また、ＹＭ寒天培地に分離株を播種し、３０℃、３７℃、４５℃でそれぞれ培養して増殖するか否かで温度耐性を判断した。さらに、１０％塩化ナトリウム及び５％グルコースを含むＹＭ寒天培地、及びビタミンを含まないＹＭ寒天培地での増殖能力を試験した。

結果として、分離株は、グルコースを発酵し、グルコース、ソボース、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−キシロース、グリセロール、ＤＬ−乳酸、エタノール、Ｎ−アセチル−Ｄ‐グルコサミンを炭素源として利用でき、またビタミンを含まない培地中で増殖できる一方、硝酸を利用できないという、表１に示される生理学的性状を有していた。また、３７℃及び４５℃では生育できないことが確認された。

４）分離株の形態観察
ＤｉｆｃｏＹＭｂｒｏｔｈに寒天を加えたＹＭ寒天培地、ＢＢＬコーンミール寒天培地、及び５％麦芽エキス寒天培地で２７℃、１０日間分離株を培養して、出現したコロニーの目視観察、顕微鏡観察を行なった。

ＹＭ寒天培地上のコロニーは、周縁の形状は全縁から菌糸状、隆起状態はクッション形、表面は平滑、輝光性、湿性、バター様、色調は薄橙色からクリーム色であり、コーンミール寒天培地上のコロニーは、周縁が全縁から菌糸状、隆起状態は周縁部が扁平で、中央はクッション形、表面は平滑で湿性、バター様、色調は白から黄白色であり、５％麦芽エキス培地上のコロニーは、周縁が全縁から菌糸状、隆起状態はクッション形、表面は平滑で輝光性があり、湿性、バター様で、色調は薄橙色からクリーム色であった。

顕微鏡観察では、栄養細胞は亜球形から卵型、楕円形であり、増殖は多極出芽によることが確認できた。培養１０日目に子嚢内に４個の球形から亜球形の子嚢胞子の形成が観察され、偽菌糸の形成が認められた。これらの形態的特長は、Ｐ．メンブレニファシエンスに一致する。

以上の結果から、分離株をＰ．メンブレニファシエンスと判断し、ＫＳ４７−１株と命名した。本分離株を、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、２０１６年５月３１日付で受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２５７（識別の表示：ＫＳ４７−１）として受託された。

５）ＫＳ４７−１株の発酵阻害耐性試験
２００ｍＬ容量のバッフル付フラスコに２０ｍＬのＹＭ培地を入れてオートクレーブ処理したものに、ＫＳ４７−１株及び対照菌株であるＳ．セレビシエＢＹ４７４２株をそれぞれ植菌し、２８℃、２００ｒｐｍ、２日間前培養した。２００ｍＬ容量のバッフル付フラスコに２０ｍＬの糖化液を入れてオートクレーブ処理したものに、前培養したＫＳ４７−１株及びＳ．セレビシエＢＹ４７４２株をそれぞれ植菌し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で２日間培養した。培養中に無菌的に培養液をサンプリングし、分光光度計を用いて６００ｎｍの濁度を測定することで、微生物量を推定した。濁度の経時変化を図２に示す。

ＹＭ培地ではＳ．セレビシエＢＹ４７４２株及びＫＳ４７−１株ともに良好に増殖する一方、糖化液ではＳ．セレビシエＢＹ４７４２株は濁度が増加しないが、ＫＳ４７−１株はＹＭ培地を用いた場合と同様、培養時間に伴い濁度が増加し、良好な増殖が可能であった。以上の実験により、エタノール生産性酵母Ｓ．セレビシエが増殖不可能な糖化液中で、ＫＳ４７−１株は良好に増殖できることが確認された。

６）近縁基準株の発酵阻害耐性試験
前記５）と同様にして、Ｐ．メンブレニファシエンスの基準株であるＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５、近縁種であるＰ．ｍａｎｓｈｕｒｉｃａＮＢＲＣ１０７２６、Ｐ．ｋｌｕｙｖｅｒｉＮＢＲＣ１１６５、Ｐ．ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａＮＢＲＣ１０７１６、及びＫｒｅｇｅｒｖａｎｒｉｊａｆｌｕｘｕｕｍＮＢＲＣ０７７３の糖化液中の増殖試験を行った。各株の濁度の経時変化を図３に示す。

その結果、ＫＳ４７−１株のみが糖化液中で濁度が上昇する一方、その他の株は全て濁度上昇は認められなかった。

７）酢酸耐性能の確認
酢酸を０〜３００ｍＭとなるように加えたＹＭ培地（ｐＨ５．０）を用いて、ＫＳ４７−１株、Ｐ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５株、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４２株を３０℃で４８時間培養した。培養後、分光光度計を用いて波長６００ｎｍの濁度を測定し、酢酸を含まない培地における濁度を基準として、相対増殖量を算出した。その結果を図４に示す。

Ｐ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０１２５株の増殖能は、２００ｍＭの酢酸で著しく低下し、２５０ｍＭの酢酸で失われた。またＳ．セレビシエＢＹ４７４２株の増殖能も、２５０ｍＭで著しく低下した。一方、ＫＳ４７−１株の増殖能は３００ｍＭの酢酸でも実質的な低下は認められず、４８時間後の相対増殖量は１１２％であった。このように、ＫＳ４７−１株は、酢酸耐性を有するとされたＳ．セレビシエＢＹ４７４２株の増殖能が著しく低下する酢酸濃度でも、殆ど変化しない増殖能を持つことが示された。

酢酸以外の発酵阻害物質に対する耐性を同様に評価したところ、２５ｍＭのフルフラール存在下でＰ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０２１５株はほとんど増殖しなかったのに対し、ＫＳ４７−１株は若干の増殖遅延はあるものの増殖能を示した。また、１０ｍＭのギ酸存在下でＳ．セレビシエＢＹ４７４２株は増殖しなかったのに対し、ＫＳ４７−１株は若干の増殖遅延があるものの増殖能を示した。さらに、バニリン１０ｍＭ又はヒドロキシメチルフルフラール８０ｍＭの存在下でも、ＫＳ４７−１株は増殖能を示した。

８）エタノール生産能
２００ｍＬ容量バッフル付三角フラスコに用意したＹＭ改変培地培地４０ｍＬ（１０％グルコース、２５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、酵母エキス３．０ｇ／Ｌ、麦芽エキス３．０ｇ／Ｌ、ペプトン５．０ｇ／Ｌ）に、前培養したＫＳ４７−１株、Ｐ．メンブレニファシエンスＮＢＲＣ１０１２５株及びＳ．セレビシエＢＹ４７４２株を１ｍＬ植菌した。培養温度は３０℃とし、培養開始２４時間目までは２００ｒｐｍで、２４時間目以降は７０ｒｐｍで振盪させた。

菌体増殖は分光光度計により、６００ｎｍの濁度を指標にした。培地中のグルコース、エタノールおよび酢酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。カラムは東ソーＴＳＫｇｅｌＳＣＸ−Ｈ^＋を用い、カラム温度４０℃、移動相は１０ｍＭ過塩素酸とし、グルコースとエタノールは示差屈折計検出器を、酢酸は紫外可視分光検出器を用いて２２０ｎｍで検出した。それぞれの菌株に対して３連の実験を行なった。菌体濁度ならびに培地中の各成分の濃度変化を図５に示す。

ＫＳ４７−１株（●）は培養開始後２４時間で酢酸を１００ｍＭ消費し、ＯＤ６００＝８．７±０．３まで増殖した。その後、グルコースを消費し、徐々にアルコールを生産した。培養開始１２０時間でエタノール濃度は５．８±１．０ｇ／Ｌに達した。エタノール発酵の際、酢酸はほとんど消費しなかった。一方、ＮＢＲＣ１０１２５株（○）は培養開始後６０時間までほとんど増殖せず、６０時間後に徐々に増殖し、ＯＤ６００＝５．２±３．０まで増殖した。１２０時間の培養中、エタノール生産は確認できなかった。ＢＹ４７４２株（▲）は培養期間中増殖せず、エタノールは検出されなかった。

ＫＳ４７−１株は高濃度酢酸存在下で増殖することができ、好気から微好気条件の２段階培養を行うことでエタノール生産が可能であることがわかる。また、好気条件における菌体増殖では、酢酸を優先的に消費しており、グルコースはエタノール発酵に優先的に利用されるため、バイオマス糖化液中の糖の利用効率（歩留まり）の向上が期待できることがわかる。

配列番号１：ＫＳ４７−１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ領域
配列番号２：ＫＳ４７−１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域
配列番号３：２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域増幅用フォワードプライマー
ＮＬ１：５’ｇｃａｔａｔｃａａｔａａｇｃｇｇａｇｇａａａａｇ−３’
配列番号４：２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域増幅用リバースプライマー
ＮＬ４：５’−ｇｇｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇａｃｇｇ−３’
配列番号５：２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ増幅用フォワードプライマー
ＩＴＳ１ＦＳ：５’−ｃｔｔｇｔｔｃａｔｔｔａｇａｇｇａａｔａａ−３’
配列番号６：２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ増幅用リバースプライマー
ＩＴＳ４：５’−ｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔａｔｔｇａｔａｔｇｃ−３’

Claims

受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２５７として寄託されているピキアメンブレニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）ＫＳ４７−１株。
発酵阻害物質を含む培養液中で請求項１に記載のピキア・メンブレニファシエンスを培養することを含む、エタノールの生産方法。