NO337412B1 - Enzymatisk hydrolyse av biomasse som har høyt tørrstoffinnhold (DM) - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for smelting og sakkarifisering av

biomasse inneholdende polysakkarider, som har et høyt tørrstoffinnhold og fortrinnsvis besitter fibere og partikler med stor gjennomsnittsstørrelse.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Flere industrielle og jordbruksprosesser f.eks. kommunale operasjoner, mat og

forprosessering og skogbruk genererer biomasser, avfall og biprodukter inneholdende polymere sukker f.eks. i form av stivelse, cellulose og hemicellulose. Jordbruksindustri og kjemiske industrier så vel som offentlige organisasjoner har betydelig interesse i å utvikle prosesser for å omdanne slik biomasse til materialer av høyere verdi. Således, som eksempel kan slik biomasse potensielt bli omdannet til bioetanol, biogass eller kjemikalier ved hjelp av mikroorganismer og/eller hydrolytiske enzymer. Imidlertid har flertallet av prosessene kjent i dag ikke ennå nådd storskala kommersiell praksis på grunn av dens høye produksjonskostnader og høye energikrav og således er knyttet til uviss økonomisk mulighet.

Ved siden av å være viktig som mat og for, kan karbohydrater fra biomasse bli brukt

som råmateriale for en rekke industrielle prosesser. I form av polymere er et velkjent produkt papir hvor cellulose er hovedkomponenten. Imidlertid, når de blir prosessert til oligomere og monomere karbohydrater er de et viktig råmateriale for en rekke industrielle prosesser. Som det vil bli beskrevet i detalj er de nødvendige

for en rekke av mikrobielle prosesser, men i tillegg kan de bli brukt som

råmaterialer for f.eks. enzymatisk presisering til spesielle karbohydrater til mat og for f.eks. trehalose. I tillegg kan karbohydratoligomere og monomere erstatte petrokjemikalier for prosessering til plast og organiske kjemikalier. Videre kan karbohydrater bli brukt som hydrogenbærere i katalytisk hydrogenering.

Det er derfor åpenbart at dersom en lavkost og vanlig ressurs av prosesserte

karbohydrater kan bli tilgjengelig for industriell prosessering kan den ha et stort økonomisk potensiale.

Stivelse er det mest utbredte lagringskarbohydratet i planter og finnes i form av granuler, som er markert forskjellige i størrelse og fysisk karakteristikk fra art til

art. Stivelsesgranuler er generelt ganske resistente til penetrering av både vann og hydrolytiske enzymer på grunn av dannelsen av hydrogenbindinger inn i det samme molekylet og med andre nabomolekyler. Imidlertid kan disse inter- og intrahydrogenbindingene bli svakere når temperatures av suspensjonen blir økt. Når en vandig suspensjon av stivelse blir varmet opp svekkes hydrogenbindingene, vann blir absorbert og stivelsesgranulene sveller. Denne prosessen blir vanligvis kalt gelatinisering fordi løsningen danner en gelatinaktig, høyt viskøs konsistens.

Kjemisk er stivelse en naturlig polymer av glukose, som vanligvis er uløselig men dispergerbar i vann ved romtemperatur og dannet av en repetert enhet lignende de av cellulose og bundet sammen med a-1,4- og a-l,6-glukosidbindinger, i motsetning til p-l,4-glukosidbindinger for cellulosen. Enhetene danner enten en lineær kjedeforbindelse, kalt amylose eller en forgrenet kjedeforbindelse, kalt amylopektin. De fleste plantefrø, korn og knoller inneholder omkring 20-25 % amylose. Med noen, slik som ertestivelse har 60 % amylose og visse arter av mais har 80 % amylose. Voksaktige varianter av korn, slik som ris, har lavt amyloseinnhold.

Bortsett fra stivelse er de tre hovedbestanddelene i plantebiomassen cellulose, hemicellulose og lignin, som vanligvis refereres til ved den generiske betegnelsen lignocellulose. Polysakkaridinneholdende biomasser som en generisk betegnelse inkluderer både stivelse og lignocellulosiske biomasser.

Cellulose, hemicellulose og lignin er tilstede i ulike mengder i ulike planter og ulike deler av planten og de er nært assosiert til dannelsen av det strukturelle rammeverket av planten.

Cellulose er et homopolysakkarid bestående fullstendig av D-glukose bundet sammen med p-1,4-glukosidiske bindinger og med en grad av polymerisering opptil

10000. Den lineære strukturen av cellulose muliggjør dannelsen av både intra- og intermolekylære hydrogenbindinger, noe som resulterer i aggregeringen av cellulosekjeder til mikrofibriller. Regioner inne i mikrofibrillene med høy orden blir betegnet krystallinsk og mindre ordnede regioner blir betegnet amorfe. Mikrofibrillene settes sammen til fibriller, som så danner cellulosefiberene. Den delvise krystallinske strukturen av cellulose sammen med den mikrofibrillære ordningen gir cellulose høy strekkstyrke, den gjør cellulose uløselig i de fleste løsningsmidler, og er delvis ansvarlig for cellulosens resistens mot mikrobiell degradering, dvs. enzymatisk hydrolyse.

Hemicellulose er et komplekst heterogent polysakkarid sammensatt av en rekke

monomere rester: D-glukose, D-galaktose, D-mannose, D-xylose, L-arabinose, D-

glukuronsyre og 4-O-metyl-D-glukuronsyre. Hemicellulose haren grad av polymerisering under 200, har sidekjeder og kan bli acetylert. I myke treslag slik som gran, furu og rødgran, er galaktoglukomannan og arabino-4-O-metyl-glukuronxylan hovedhemicellulosefraksjonen. I harde treslag slik som bjørk, poppel, osp eller eik, er 4-0-acetyl-4-metyl-glukuronxylan og glukomannan hovedbestanddelene av hemicellulose. Gress slik som ris, hvete, havre og staudehirse har hemicellulose bestående hovedsakelig av glukuronarabinoksylan.

Lignin er et komplekst nettverk dannet ved polymerisering av fenylpropanenheter og det utgjør den vanligste ikke-polysakkaridfraksjonen i lignocellulose. De tre monomerene i lignin er p-coumarylakohol, koniferylalkohol og sinapylalkohol, og de er oftest bundet gjennom arylglyseryl--aryleterbindinger. Lignin er bundet til hemicellulose og innkapsler karbohydratene og tilbyr derved beskyttelse mot mikrobiell og kjemisk degradering.

Som angitt over kunne den prosesserte biomassen potensielt bli omdannet til

bioetanol eller kjemikalier ved hjelp av mikroorganismer og/eller hydrolytiske enzymer, eller

karbohydratene fra den prosesserte biomassen kunne bli brukt som råmateriale for en rekke industrielle prosesser, f.eks. enzymatisk prosessering til spesielle karbohydrater for mat og for eller som substituenter for petrokjemikalier i produksjonen av plast og organiske kjemikalier. I tillegg kan prosesseringen av karbohydrater i biomassen ifølge foreliggende oppfinnelse bli kombinert med separasjon og fraksjonering av ikke-karbohydratkomponentene. En særlig foretrukket bruk av en prosess ifølge den foreliggende oppfinnelsen er en integrert del av en prosess for bioetanolproduksjon.

Bioetanolproduksjon fra polysakkaridinneholdende biomasser kan bli inndelt i tre

trinn: 1) forbehandling, 2) hydrolyse av polysakkaridene til fermenterbare

karbohydrater, 3) og fermentering av karbohydratene.

Forbehandling er nødvendig dersom etterfølgende hydrolyse (f.eks. enzymatisk hydrolyse) av polysakkaridene krever nedbrytning av en ellers beskyttet struktur (f.eks. lignin) av plantematerialene. Mange forbehandlingsteknikker er kjent. For

cerealer og korn kan denne forbehandlingen være i form av en enkel tørrmaling for å gjøre overflatene tilgjengelige, men for lignocellulosiske biomasser er termiske og/eller kjemiske prosesser nødvendig i tillegg. En polysakkaridinneholdende biomasse bestående av f.eks. raffinert stivelse krever ikke nevnte forbehandlingsmetoder for enzymatisk prosessering. Forbehandlingsprosesser kan være basert på syre hyd ro lyse, dampeksplosjon, oksidasjon, ekstraksjon med alkali eller etanol, osv. Et vanlig trekk ved forbehandlingsteknikkene er at de kombinert med virkningen av mulige tilsatte reaktanter kan to fordelen av mykningen og løsningen av plantematerialer som oppstår ved temperaturer over 100°C.

Etter den følgende forbehandlingen, er neste trinn i utnyttelsen av

polysakkaridinneholdende biomasser for produksjon av bioetanol eller andre

biokjemikalier hydrolyse av den frigjorte stivelsen, cellulosen og hemicellulosen til fermenterbare sukker. Dersom dette gjøres enzymatisk kreves det et stort antall av ulike enzymer med ulike virkningsmekanismer. Enzymene kan bli tilsatt eksternt eller mikroorganismer som vokser på biomassen kan tilveiebringe dem.

Cellulose blir hydrolysert til glukose ved de karbohydrolytiske cellulasene. Den

fremherskende forståelsen av det cellulolyttiske systemet deler cellulasene inn i tre klasser: ekso-l,4-p-D-glukanaser eller cellobiohydrolaser (CBH) (EC 3.2.1.91), som kløyver av cellobioseenheter fra endene av cellulosekjeder: endo-l,4-p-glukanaser (EG) (EC 3.2.1.4), som hydrolyserer interne p-l,4-glukosidiske bindinger tilfeldig i cellulosekjeden: 1,4-p-glukosidase (EC 3.2.1.21), som hydrolyserer cellobiose til glukose og også kløyver av glukoseenheter fra cellooligosakkarider.

De ulike sukker i hemicellulose blir frigjort ved hemicellulasene. Det hemicellulytiske system er mer komplekst enn det cellulolytiske systemet på grunn

av den heterologe naturen av hemicellulose. Systemet involverer blant andre endo-

1,4-p -D-xylanaser (EC 3.2.1.8), som hydrolyserer interne bindigner i xylankjeden: 1,4-p -D-

xylosidaser (EC 3.2.1.37), som angriper xylooligosakkarider fra den ikke-reduserende enden og frigjør xylose: endo-l,4-p-D-mannanaser (EC 3.2.1.78), som kløyver interne bindinger: 1,4-p -D-mannosidaser (EC 3.2.1.25), som kløyver mannooligosakkarider til mannose. Sidegruppene blir fjernet ved en rekke av enzymer: a-D-glukuronidaser (EC 3.2.1.139), cinnamoylesteraser (EC 3.1.1.-), acetylxylanesteraser (EC 3.1.1.6) og feruloylesteraser (EC 3.1.1.73).

De viktigste enzymene for bruk i stivelseshydrolyse er alfa-amylaser (1,4-a-D-glukanglukanohydrolaser (EC 3.2.1.1). Disse er endovirkende hydrolaser som

kløyver 1,4-a-D-glukosidiske bindinger og kan omgå men ikke hydrolysere 1,6-

alfa-D-glukosidiske forgreningspunkter. Imidlertid, kan også eksovirkende glykoamylaser slik som beta-amylase (EC 3.2.1.2) og pullulanase (EC 3.2.1.41) bli brukt til stivelseshydrolyse. Resultatet av stivelseshydrolyse er primært glukose, maltose, maltotriose, a-dekstrin og ulike mengder av oligosakkarider. Når det stivelsesbaserte hydrolysatet blir brukt for fermentering kan det være fordelaktig å tilsette proteolytiske enzymer. Slike enzymer kan forhindre flokkulering av mikroorganismen og kan generere aminosyre tilgjengelig for mikroorganismen.

I kombinasjon med forbehandling og enzymatisk hydrolyse av lignocellulosiske biomasser, har

det blitt funnet at anvendelsen av oksidative enzymer kan ha en positiv effekt på totalhydrolysen så vel som overlevelsen av mikroorganismene som anvendes for den etterfølgende fermenteringen. Årsaken til denne effekten er den oksidative kryssbindingen av ligniner og andre fenoliske inhibitorer som forårsaket av de oksidative enzymene. Vanligvis blir lakkase (EC

1.10.3.2) eller peroksidase (EC 1.11.1.7) anvendt enten eksternt eller ved inkorporering av et lakkasegen i den anvendte mikroorganismen.

Enzymatisk hydrolyse av biomasse har tidligere blitt beskrevet. Imidlertid, har i tilfelle av lignocellulosiske biomasser bare materialet bestående av fibere og partikler med en gjennomsnittlig størrelse mindre enn 1 tomme (25,4 mm) og videre som har et relativt lavt tørrstoffinnhold, dvs. under 20 % (vekt/vekt), med fremgang blitt hydrolysert ved en slik metode.

US 4 409 329 beskriver hydrolyse av fast cellulosemateriale til sukker, der cellulose blir hydrolysert til enkle sukker ved å behandle en granulær slurry av 3-20 % (vekt/vekt) fastfase inneholdende 30-80 % (vekt/vekt) cellulose, med et cellulaseenzymkompleks. Den faste celluloseinneholdende råladningen hadde en middel partikkelstørrelse fra 0,01 til 1 tomme (0,0254-25,4 mm) i diameter. Perforerte rotorblader ble anvendt for blanding. Tørrstoffinnholdet i prosessen er således mindre enn 20% og det anvendes ikke en gravitasjonsbasert type av blanding.

US 2002117167A beskriver enzymatisk hydrolyse av hemicellulose i biomassemateriale, omfattende oppløsning av minst en del av hemicellulosen og

hydrolyse av den oppløste hemicellulosen til å produsere minst ett monosakkarid.

Den benyttede biomassen er fortrinnsvis vannholdig slurry av råmateriale eller forbehandlet materiale. Biomassematerialet kan være ethvert cellulosisk materiale som inkluderer hemicellulose. Prosessen blir beskrevet å være særlig effektiv ved kornfibere slik som mais, hvete, ris, havre eller bygg.

US 2004005674A beskriver en prosess for enzymatisk hydrolyse av lignocellulose.

Degradering av lignocellulose til sukker omfatter å kontakte lignocellulosen med minst ett valgfritt enzym og minst en cellulase. Det lignocellulosiske materialet ble malt (den gjennomsnittelige fiberstørrelsen av materialet ble ikke videre spesifisert) og hadde et lavt tørrstoffinnhold (0,2 g av malt råmateriale i 10 ml av enzymløsningen).

WO 97/28306A beskriver en prosess til fremstilling av cellulose-papirmasse (pulp) og anvender en roterende trommel og en skråstilt transport skrue i en enzymatisk prosess hvor polymerere av vegetabilsk materiale degraderes. Tromlen anvendes dog til å sortere andre materialer fra. Det er således ikke et formål med prosessen å nedbryte massen ved sakkarifisering.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen angår en prosess for smelting og sakkarifisering av polysakkaridinneholdende biomasser som har et tørrstoffinnhold på over 20 %,karakterisertveda utsette nevnte biomasse for samtidig:

a) enzymatisk hydrolyse, og

b) blande med en gravitasjonsbasert type av blanding basert på tønneblandere,

trommelblandere, en blander med en roterende aksel som løfter biomassen eller

lignende blandingsanordninger som utnytter fritt fall prinsipp tilveiebringende mekanisk prosessering og/eller degradering av biomassen.

Den nevnte polysakkaridinneholdende biomasse kan være en lignocellulosisk biomasse avledet fra jordbruksavlinger bestående av f.eks. maisstrå, bagasse, halm f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps og durra, knoller f.eks. roe, potet, cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra, tre bestående av mykved fieks. Pinus syfvestris, Pinus radiata, hardved f.eks. Salix spp., Eucalyptus spp. eller kommunalt fast avfall, avfallspapir, fiberfraksjoner fra prosessering av biogass, gjødsel og lignende biomasser.

I en utførelsesform er den nevnte polysakkaridinneholdende biomasse stivelse f.eks. stivelsesinneholdende korn eller raffinert stivelse.

I en anden utførelsesform er den nevnte polysakkaridinneholdende biomasse en blanding av stivelse, f.eks. stivelsesinneholdende korn eller raffinert stivelse, og lignocellulosiske biomasser oppnådd fra jordbruksavlinger bestående av f.eks. maisstrå, halm f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps og durra, knoller f.eks. roe, potet, cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra, tre bestående av mykved f.eks. Pinus sylvestris, Pinus radiata, hardved f.eks. Salix spp., Eucalyptus spp. eller kommunalt fast avfall, avfallspapir og lignende biomasser.

I en videre utførelsesform er tørrstoffinnholdet av den polysakkaridinneholdende biomassen er fortrinsvis mellom 25-80 %.

Prosessen ifølge oppfinnelsen kan ytterligere værekarakterisert vedat minst 20 %

(vekt/vekt) av den lignocellulosiske biomassen har en fiberstørrelse over 26 mm.

I en utførelsesform har den lignocellulosiske biomassen blitt utsatt for varmeforbehandling mellom 110-250°C.

I en annen utførelsesform er prosessenkarakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen blir utført med en kombinasjon av hydrolytiske enzymer inkludert et karbohydrolytisk enzym og et oksidativt enzym.

I en ytterligere utførelsesform er prosessenkarakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen av stivelsesinneholdende korn blir utført med en kombinasjon av hydrolytiske enzymer og proteolytiske enzymer.

Prosessen ifølge oppfinnelsen kan likevel værekarakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen blir utført ved 0-105°C.

I en utførelsesform er prosessenkarakterisert vedat blandingen av den polysakkaridinneholdende biomassen er basert på fritt fall blandere slik som tønneblandere, trommelblandere eller lignende blanderanordninger.

I en anden utførelsesform er prosessenkarakterisert vedat tiden for behandling for den enzymatiske hydrolysen er 0-72 timer.

I en ytterligere utførelsesform er prosessenkarakterisert vedat den blir utført som en sats, fodesats, kontinuerlig eller lignende prosess.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Produksjon av konsentrerte sukkerløsninger er fordelaktige i forhold til etterfølgende fermentering eller andre mikrobielle prosesser på grunn av forbedret volumetrisk produktivitet og reduserte kostnader av nedstrøms prosessering. I tilfelle av bioetanolproduksjon, blir energien påkrevd for destillasjon signifikant redusert dersom fermenteringssatsen inneholder over 4 % etanol (Galbe og Zacchi, 2002). Dette krever en sukkerkonsentrasjon over 8 %, som for de fleste typer av lignocellulosiske biomasser korresponderer til et initielt tørrmasseinnhold over 20 %. Det er med andre ord ønskelig å anvende polysakkaridinneholdende biomasser med høyt tørrstoffinnhold, fortrinnsvis over 20 %, for enzymatisk hydrolyse for å være i stand til etterfølgende å produsere bioetanol inneholdende fermenteringssatser egnet for destillasjon av etanol.

Prosessene ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en grad av enzymatisk hydrolyse på typisk 30-50 %. Imidlertid, kan under optimaliserte forhold en enda høyere grad av enzymatisk hydrolyse bli oppnådd. Den smeltede og sakkarifiserte biomassen vil deretter inneholde relativt store mengder av glukose, xylose, cellobiose, lignin, ikke-degradert cellulose og hemicellulose og enda aktive enzymer egnet for videre prosessering, dvs. fermenteringsprosesser (etanol, melkesyre, etc). Den smeltede biomassen vil også være egnet for gassifisering, hydrogenering, organisk syntese eller produksjon av biogass og for.

Dersom den polysakkaridinneholdende biomassen er lignoselulosisk må forbehandlingen sikre at strukturen av det lignocellulosiske innholdet blir gjort mer tilgjengelig for enzymer, og samtidig forblir konsentrasjonene av farlige inhibitoriske biprodukter slik som eddiksyre, furfural og hydroksyfurfural substansielt lav. Det er flere strategier for å oppnå dette, som impliserer og utsetter lignocellulosiske materialer til temperaturer mellom 110-250°C i 1-60 min. f.eks.:

• Varmtvannsekstraksjon

• Multitrinns fortynnet sy re hyd ro lyse, som fjerner oppløst materiale for inhibitoriske substanser blir dannet

• Fortynne sy re hyd ro lys er ved relativt lavt intense betingelser

• Alkalisk våtoksidasjon

• Dampeksplosjon

• Nesten enhver forbehandling med etterfølgende avgiftning

Polysakkaridinneholdende biomasser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer ethvert materiale inneholdende polymere sukre f.eks. i form av stivelse så vel som raffinert stivelse, cellulose og hemicellulose. Biomasser som har et tørrstoffinnhold over 20 % er foretrukket.

Relevante typer av biomasser for enzymatisk hydrolyse og blanding ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan inkludere biomasser avledet fra jordbruksavlinger slik som f.eks.:

• Stivelse f.eks. stivelsesinneholdende korn og raffinert stivelse

• Maisstrå

• Bagasse

• Skall f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, raps, durra

• Myke treslag fieks. Pinus sylvestris, Pinus radiata

• Harde treslag fieks. Salix spp. Eucalyptus spp.

• Knoller f.eks. bete, potet

• Cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra og mais

• Avfallspapir, fiberfraksjoner fra biogassprosessering, gjødsel, rester fra oljepalmeprosessering, kommunalt fast avfall eller lignende med et lignende tørrstoffinnhold.

Dersom de polysakkaridinneholdende biomassene er lignocellulosisk, kan materialet bli kuttet i biter hvor 20 % (vekt/vekt) av biomassen fortrinnsvis er innenfor området 26-70 mm, før forbehandling. Det forbehandlede materialet har fortrinnsvis et tørrmasseinnhold over 20 % for det går inn i blandingsanordningen. Foruten å frigjøre karbohydratene fra biomassen, steriliserer og delvis oppløser forbehandlingsprosessen biomassen og samtidig vaskes ka Num klorid ut fra ligninfraksjonen.

Blandingen utført i en prosess ifølge foreliggende oppfinnelse tjener minst en firefoldig

hensikt.

For det første sikrer den tett kontakt mellom enzymene som anvendes og den polysakkaridinneholdende biomassen (substrat), siden dette i de fleste tilfeller vil være uløselig eller bare svært lite løselig.

For det andre hjelper det mekaniske arbeidet utført på materialet under blandingen å drive større biomassefibere og partikler fra hverandre og vil derfor medvirke i å øke overflatearealet av materialet. Dette vil øke tilgjengeligheten av f.eks. cellulose og hemicellulose for de enzymene som anvendes. For videre å øke det mekaniske arbeidet på materialet, kan stålballer eller lignende midler som vil kollidere med materialet bli tilsatt til trommelen.

For det tredje, forhindrer blandingen av materialet lokal akkumulering av høy cellobiosekonsentrasjon som - som er velkjent for fagpersonen på området- kan inhibere f.eks. cellulaseenzymer, særlig cellobiohydrolasene.

For det fjerde, er en viktig karakteristikk ved cellulaseenzymene innvirkningen av cellulosebindende domener (CBD) på enzymytelsen. CBD'er er funksjonelle deler av cellulosedegraderingsenzymer. CBD'en muliggjør adhesjon av det vannløselige enzymet på en uløselig substratoverflate (cellulose). Den tette forbindelsen mellom enzymet og cellulose tilveiebrakt av CBD'en forsterker den katalytiske hastigheten og stabiliteten av enzymet. For å hydrolysere cellulose må enzymet forandre posisjon av CBD'en og på cellulosekjeden. Det er antatt at mekanisk virkning, dvs. blanding, er viktig for bevegelsen av CBD og følgelig for enzymvirkningen av enzymer langs cellulosekjeden.

I tillegg til det ovenfor skal det bemerkes at enzymatisk hydrolyse av biomasse har tradisjonelt vært utført i omrørte tankreaktorer utstyrt med skovlhjul (f.eks. Rushton turbin eller Intemig impeller) montert på et sentralt plassert skovlhjulskaft lignende de som er anvendt i fermenteringsindustrien. På grunn av dette utstyret, kan ikke løsninger av høy viskositet, svært klebende eller svært tørt materiale bli omrørt effektivt, men vil resultere i soner med svært dårlig eller ingen blanding. Videre, krever omrøring av slike løsninger svært stor energiinnsats, noe som er ødeleggende for prosessøkonomien. Å operere med polysakkaridinneholdende biomasser har

dette tidligere begrenset den øvrige mulige grensen til omtrent 20 %. Det

tyngdekraftbaserte blandingsprinsippet ifølge den foreliggende oppfinnelsen overkommer dette problemet og kan bli anvendt for polysakkaridinneholdende biomasser med et tørrstoffinnhold på opptil 80 %, fortrinnsvis 20-50 %. Prinsippet ved tyngdekraftblanding ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan lett bli bortskalert og anvendes for alle tyder av biomasser, foruten raffinert stivelse, inneholdende opptil mer enn 80 % cellulose.

Ulik konvensjonelle omrøringstankreaktorer tradisjonelt brukt for enzymatisk hydrolyse, utnytter et tyngdekraftbasert blandingsprinsipp, dvs. en tønneblander, en blander med en roterende aksel som løfter biomassen eller lignende

blandingsanordninger et fritt fall prinsipp, samtidig som den muliggjør en effektiv blanding selv med liten krafttilsats og høy tørrstoffinnhold og videre utfører en mekanisk prosessering/degradering gjennom kreftene av tyngde inkludert skjærkrefter og rivekrefter mellom materiale og tønne så vel som kreftene som resulterer fra sammenstøtet mellom fallende materiale og bunnen av tønnen og

samtidig positivt påvirke innvirkningen av cellulosebindende domener (CBD) på

enzymyteevne.

Selv om prosessering av ikke-blandbare plantematerialer, slik som f.eks. polysakkaridinneholdende biomasse med relativt høyt innhold av tørrstoff og store gjennomsnittsfibere og partikkelstørrelser, er kjent fra fastfasefermentering eller

bioreaktorer, hvor trommeltypeblandere er brukt for blanding (Giovanozzi et al.

2002), har ikke dette prinsippet tidligere blitt implementert i en prosess dedikert til smelting/sakkarifisering eller en bioetanolfermenteringsprosess.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en prosess for prosessering av biomasse med relativt høyt tørrstoffinnhold, f.eks. tørrstoffinnhold mellom 20-80

%, fortrinnsvis mellom 20-50 %. Videre, sikrer prosessen ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektiv smelting og sakkarifisering som gjør det mulig a direkte bruke endeproduktet i f.eks. fermentorer.

Enzymer som er i stand til å avstedkomme en konvertering av stivelse, cellulose og hemicellulose eller deler derav til glukose, xylose og cellobiose blir tilsatt til biomassen enten i naturlig form eller i form av mikrobielle organismer som gir opphav til akkumuleringen av slike enzymer. pH'en og temperaturen av biomassen blir justert med referanse til pH-optimum og temperaturoptimum for de anvendte enzymene.

Avhengig av enzymladningen vil biomassen bli smeltet og sakkarifisert til en væske uten noen eller bare med få gjenværende store fibere og partikler innen 3-24 timer.

Å tilsette en glukosemetaboliserende mikroorganisme ved ethvert gitt tidspunkt under hydrolysen og smeltingen kan forsterke graden av enzymatisk hydrolyse siden hemmende enzymprodukter blir fjernet derved.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

En prosess ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli utført ved hjelp av følgende

foretrukne tekniske parametere.

• Tørrstoffinnhold: 20-80 %, fortrinnsvis 25-70 %, mer foretrukket 25-60 %, enda mer foretrukket 25-50 % eller 25-40 % og mest foretrukket 25-35 %.

• Distribusjon av fibere og partikkelstørrelser av lignocellulosisk biomasse:

0-150 mm, fortrinnsvis 5-125 mm, mer foretrukket, 10-100 mm, enda mer foretrukket 15-90 mm eller 20-80 mm og mest foretrukket 26-70 mm Den foretrukne distribusjon av fiber og partikkelstørrelser er definert som minst 20 % (vekt/vekt) av den lignocellulosiske biomassen ligger innenfor det foretrukne intervallet.

Dersom den polysakkaridinneholdende biomassen er lignocellulosisk, må den forbehandles f. eks. ved en varmtvannsekstraksjon. Dersom en hydrotermal forbehandling blir valgt er de følgende tekniske data foretrukket: Forbehandlingstemperatur: 110-250°C, fortrinnsvis 120-240°C, mer foretrukket 130- 230°C, mer foretrukket 140-220°C, mer foretrukket 150-210°C, mer

foretrukket 160-200°C, enda mer foretrukket 170-200°C eller mest foretrukket 180-200°C.

• Forbehandlingstid: 1-60 min., fortrinnsvis 2-55 min., mer foretrukket 3-50 min.,

mer foretrukket 4-45 min., mer foretrukket 5-40 min., mer foretrukket 5-35 min.,

mer foretrukket 5-30 min., mer foretrukket 5-25 min., mer foretrukket 5-20

min. og mest foretrukket 5-15 min.

• Tørrstoffinnhold etter forbehandling på minst 20 vekt/vekt%.

Enzymatisk behandling av polysakkaridinneholdende biomasse i en

gravitasjonsblander:

Dersom en beholder basert på fritt fallblandingskonseptet i form av en reaktor med

et horisontalt plassert omrøringsskaft som lofter biomassen eller lignende blandingsanordninger blir brukt, de følgende tekniske data er foretrukket: • Rotasjonshastighet: 0-30 rpm, fortrinnsvis 0-20 rpm, mer foretrukket 0-15 rpm, enda mer foretrukket 0-10 rpm og mest foretrukket 0-5 rpm.

• Rotasjon med periodisk endret roteringsretning.

• Rotasjon i predefinerte intervaller.

Den optimale rotasjonshastigheten vil avhenge av volumet av beholderen, den foretrukne rotasjonshastigheten kan således være relativt høy når prosessen blir utført i en relativt liten beholder, mens den kan være relativt lav når prosessen blir utført i en relativt stor beholder.

• Enzymer for lignocellulosebiomasse:

- Cellobiase (f.eks. Novozym 188)

- Cellulase (f.eks. Celluclast 1.5 FG L)

• Enzymladning i filterpapirenheter (FPU)/g DM. 1 FPU tilsvarer mengden

av enzym nødvendig for å hydrolysere 1 .umol/min. av glykosidiskebindinger for Whatman # 1 filterpapir, under spesifiserte betingelser velkjent for en fagperson på området. Imidlertid kan enzymatisk aktivitet i prinsippet bli tilført på enhver tenkelig måte inkludert gjennom tilsetning av mikroorganismer som gir opphav til den ønskede enzymatiske aktiviteten.: Korresponderende til 0,001-15 FPU/g tørrstoff, fortrinnsvis 0,01-10 FPU/g tørrstoff, mer foretrukket 0,1-8 FPU/g tørrstoff, mer foretrukket 1-7 FPU/g tørrstoff og mest foretrukket mindre enn 6 FPU/g.

• Enzymer for stivelsesinneholdende biomasse:

- Enzymer i prosesseringen av stivelse: alfaamylaser og glukoamylaser.

• Behandlingstid for enzymatisk hydrolyse: 0-72 timer, fortrinnsvis 1-60 timer, mer foretrukket 2-48 timer og mer foretrukket 3-24 timer slik som 4-24 timer, slik som 6-24 timer, slik som 8-24 timer, slik som 10-24 timer, slik som 12-24 timer, slik som 18-24

timer eller 22 timer.

Temperatur for enzymatisk hydrolyse. Justert med referanse til optimum

temperatur for de anvendte enzymatiske aktiviteter: 0-105°C, fortrinnsvis 10-100°C, mer foretrukket 15-90°C, mer foretrukket 20-80°C, mer foretrukket 25-70°C og mest foretrukket 30-70°C slik som 40-45°C eller romtemperatur.

• pH av biomasse. Justert med referanse til optimal pH for de anvendte

enzymatiske aktiviteter: 3-12, slik som 5-10, slik som 6-9, slik som 7-8 og

fortrinnsvis 4-11.

Enzymatisk behandling kan bli utført som en sats, fødesats eller en kontinuerlig

prosess.

Eksempel 1: Enzymatisk hydrolyse i laboratorieskala

Presset forbehandlet hvetehalm med en gjennomsnittsstørrelse på omtrent 40 mm

(motstrøms vannekstraksjon ved 180-200°C i 5-10 min., vann og tørrstoff strømforhold ved 5:1)

tilsvarende til 25 g tørrvekt (= 67,0 g forbehandlet halm) ble lagt i en plastpose. 0,75 ml av Novozym 188, 3,75 ml av Celluclast 1,5 FG Log 11,9 ml av 50 mM natriumsitratbuffer, pH 5,0, ble blandet og sprayet på halmen. Dette resulterte i et sluttørrstoffinnhold på 30 %. Enzymladningen

korresponderte til 10 filterpapirenheter (FPU)/g DM.

Blanderen bestod av en trommel (1,0 m lang og 0,78 m i diameter) med 5 indre ribber langs

den lange aksen for å sikre passende blanding av materialet. Trommelen roterte langs den horisontale aksen med en fart på 26 rpm.

Blandingen/hydrolysen av materialet ble utført i 18-24 timer ved romtemperatur. Dette resulterte i en tykk pasta uten noe gjenværende store fibere. En kontrollpose med den samme enzymladningen men uten blanding viste ingen tegn til degradering av halmen.

Deler av det resulterende materialet etter den enzymatiske hydrolysen i 24 timer (en

mengde korresponderende til 29 g tørrstoff) ble fortynnet til 15 % tørrstoff i en flaske med sikkerhetskork (blue cap bottle) og gjær (bakegjær, De Danske Spritfabrikker) ble tilsatt. Flasken ble lukket ved et lufttett lokk og plassert i 72 timer ved 30°C med omrøring ved 500 rpm. Den resulterende væsken inneholdt 33 g/l av etanol, 10 g/l av xylose. Ingen glukose ble påvist og indikerte at gjæren var i stand til å utnytte all glukosen produsert under hydrolysen. Forutsatt et etanolutbytte på glukose av 0,5 g etanol/g glukose korresponderer dette til konvertering av 70 % av den opprinnelige cellulosen.

Eksempel 2: Enzymatisk hydrolyse i pilots ka la

Presset forbehandlet hvetehalm med en gjennomsnittelig størrelse på omtrent 40

mm (forbehandlet ved motstrøms vannekstraksjon ved 180-200°C i 5-10 min., med et vann- og tørrstoffstrømningsforhold av 5:1) tilsvarende til 7 kg DW (= 20 kg forbehandlet halm) ble lagt i en konvensjonell roterende sementblander med en horisontalakse hellende omkring 10°. Blanderen hadde 2 indre ribber langs den langsgående aksen for å sikre blandingen av materiale. Et deksel ble montert på åpningen for å hindre fordampning fra blanderen. Blandetrommelen roterte langs den horisontale aksen med en fart på 29 rpm. 200-1150 ml av Celluclast 1,5 FG L og 40-225 ml av Novozym 188 ble tilsatt til halmen. Dette resulterte i et sluttråstoffinnhold på 30 %. Enzymladningen korresponderte til 3-15 FPU/g DM. pHen ble justert til 4,8-5,0 ved tilsetning av natriumkarbonat.

Sementblanderen ble varmet til 40-45°C ved hjelp av en vifteovn. Blandingen/hydrolysen av materialet ble utført i 22 timer. Avhengig av enzymladningen resulterte dette i mer eller mindre viskøs væske uten noen gjenværende store fibere. Den forbehandlede halmen ble degradert til en pasta i løpet av omtrent 3-5 timer. Etter 5-24 timer av blanding var pastaen endret til en viskøs væske. Kontrollforsøk med bare forbehandlet hvetehalm eller hvetehalm forbehandlet ved bare 160°C men ved bruk av den samme enzymladningen viste ingen tegn på smelting av halmen.

Samtidig sakkarifisering og fermentering ble utført ved å tilsette gjær til sementblanderen

etter 24 timer av hydrolyse ved 40-45°C ved bruk av en enzymladning pa 10-15 FPU/g DM. Temperaturen ble tillatt å kjølne til under 35°C og komprimert gjær (bakegjær, De

Danske Spritfabrikker) ble tilsatt til en konsentrasjon på omkring 1 % (vekt/vekt) basert

på initielt tørrstoff av halm. Sakkarifiseringen og fermenteringen ble fortsatt i 48 timer ved 25°C.

Det resulterende materialet ble sentrifugert i 15 min. ved 2500 rpm. Supernatanten

ble filtrert gjennom et 0,45 pm filter og analysert for sukker på HPLC. Ved en enzymladning på 15 FPU/g DM, inneholdt supernatanten 70 g/l av glukose, 30 g/l av xylose etter 24 timers hydrolyse. Dette korresponderte til 50 % hydrolyse av cellulosen og hemicellulosen opprinnelig tilstede i halmen. Den samtidige sakkarifiseringen og fermenteringen ved hjelp av en enzymladning på 10 FPU/g DM resulterte i 42 g/l av etanol og 30 g/l av xylose.

Eksempel 3: Smelting, hydrolyse og fermentering

Hydrolysereaktoren ble utformet for å utføre forsøk med smelting og hydrolyse med faste konsentrasjoner over 20 % DM (fig. 1). Reaktoren bestod av en horisontalt

plassert trommel delt inn i fem separate kammer hver 20 cm brede og 50 cm i diameter. En horisontalt roterende aksel montert med tre padlere i hvert kammer ble brukt for blanding/omrøring. En 1,1 kW motor ble brukt som driver og rotasjonshastigheten ble justert innen området av 2,5 og 16,5 rpm. Rotasjonsretningen ble programmert å skifte to ganger i minuttet mellom med urviseren og mot urviseren. En vannfylt varmekappe på utsiden muliggjorde kontrollen av temperaturen opptil 80°C.

Kamrene ble fylt med presset forbehandlet hvetehalm med en gjennomsnittelig størrelse på omtrent 40 mm (forbehandlet ved motstrøms vannekstraksjon ved 180-200°C i 5-10 min. med et vann- og tørrstoffstrømforhold pa 5:1) og vann for a gi et initielt DM-innhold på 20-40 %. Celluclast 1,5 FG L og Novozym 188 i 5:1 forhold ble tilsatt fora gi en enzymladning pa 7 FPU/g DM. Smeltingen og hydrolysen ble utført ved 50°C og pH 4,8-5,0. Blandingshastigheten var 6,6 rpm. Samtidige sakkarifiserings- og fermenterings (SSF) forsøk ble utført ved å senke temperaturen til 32°C etter 8 timer av smelting og hydrolyse og etterfølgende tilsetning av 15 g av komprimert bakegjær (De Danske Spritfabrikker) pr. kg av opprinnelig DM.

Smelting og hydrolyse var mulig med opprinnelig DM-innhold på opptil 40 % DM (fig. 2 og 3). Med opprinnelig 40 % DM var det mulig å nå glukosekonsentrasjoner på 80 g/kg1 etter 96 timer. Det var også. mulig å operere prosessen som SSF (fig. 3), derved å redusere produkthemmingen av cellulasene på grunn av glukoseakkumuleringen. Det var mulig å fermentere hydrolysatet med opptil 40 % opprinnelig DM-innhold ved hjelp av normal bakergjær. Under ikke fullt anaerobe betingelser var etanolutbyttet 80, 79, 76, 73 og 68 % av hva som var teoretisk oppnåelig ved 20, 25, 30, 35 og

40 % DM henholdsvis.

Eksempel 4: Helavlings smelting, sakkarifisering og fermentering

Lignocellulosisk og stivelsesinneholdende biomasse kan bli prosessert samtidig ved

hjelp av gravitasjonsblanding og en blanding av cellulaser, hemicellulaser og amylaser. De lignocellulosiske biomassene kan være oppnådd fra jordbruksavlinger bestående av f.eks. maisstrå, halm f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra, tre bestående av mykved f.eks. Pinus

sylvestris, Pinus radiata, hardved f.eks.

Salix spp., Eucalyptus spp., kommunalt fast avfall, avfallspapir og lignende biomasser.

Hydrolysereaktoren beskrevet i eksempel 3 ble brukt for forsøkene. Hvetehalm (primært en lignocellulosekilde) ble forbehandlet ved hjelp av

motstrømsvannekstraksjon ved 180-200°C i 5-10 min. med et vann- og

tørrstoffstrømforhold av 5:1. Hvetekorn (primært en stivelseskilde) ble tørrmalt ved hjelp av en Kongskilde valsemølle. Hvetekornene og forbehandlet halm med en gjennomsnittlig størrelse på omtrent 40 mm ble blandet i et 1:1 forhold på en tørr basis. DM ble justert til mellom 30 og 40 % ved tilsetning av vann. Celluclast 1,5 FG L og Novozym 188 i et 5:1 forhold ble tilsatt for å gi en enzymladning på 7 FPU/g DM av halm. Hydrolyse av stivelse ble utført ved bruk av kald mosenzym NS50033 (Novozymes A/S, Bagsværd, Danmark) ved en ladning på 3,5 g/kg av hvetekorn. Smeltingen og hydrolysen ble utført ved 50°C og pH 4,8-5,0. Etter 8 timer ble temperatures senket til 34°C og 15 g av komprimert bakegjær (De Danske Spritfabrikker) ble tilsatt pr. kg av opprinnelig DM. Et forsøk med halm bare ved 30 % DM ble kjørt i parallell.

Blanding av halm med korn resulterte i en rask initiell akkumulering av glukose i smelte og hydrolysetrinnet sammenlignet med anvendelsen av bare halm (fig. 4). Etter 96 timer med smelting og SSF var etanolkonsentrasjonen 41 g/kg når bare hvetehalm ble brukt som det eneste substratet (fig. 4). I forsøket med halm og korn nådde etanolkonsentrasjonen 68 g/kg<1>.

Eksempel 5: Lavtemperatursmelting av stivelse eller stivelsesinneholdende materialer

En prosess ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også bli brukt for lavtemperaturprosessering av raffinert stivelse eller stivelsesinneholdende

materialer (f.eks. roer, potet, cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, durra). Ifølge eksempel 4 er varmeforbehandling av kornet ikke nødvendig for smelting og hydrolyse av stivelse. Tørrmaling er på den andre siden vanligvis brukt for forbehandling av stivelsesinneholdende korn. Tørrmalte korn med et tørrstoffinnhold på 20-60 % ble ladet i gravitasjonsblanderen. Cold mash enzyme NS50033 (Novozymes A/S, Bagsværd, Danmark) eller alfa-amylase og glukoamylaser blir tilsatt samtidig. En full smelting og sakkarifisering av stivelsen blir så mulig i en satsprosess (one-pot process). Temperatur og pH-områder under den enzymatiske hydrolyse prosessen er definert ved enzymene og vil bli i området av 25-60°C, fortrinnsvis 40-55°C, og pH 3-12, fortrinnsvis pH 3-8 henholdsvis.

Prosessen kan bli kombinert med SSF.

Sitert litteratur

Galbe, M., Zacchi, G. (2002). A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbial biotechnol. 59:618-698.

Glovannozzi-Sermanni, G.. D'Annibale„A, Perani, C, Porri A., Falesiedi, G. (2002). Solid-state bioreac.tors for the sustainability.

htps://www.unitus.it/dipatmenti/dabac/progetti/ssbioreactors/solidstatebioreactor. htm Gregg, D., Saddler, J.N. (1995). Bioconversion of lignocellulosic residues to ethanol: Process flow-sheet development. Biomass Bioenerg. 9:287-302.

Mais, U., Esteghalalian, A.R., Saddler, J.N. (2002). Influence of mixing regime on enzymatic saccharification of steam-exploded softwood chips. App!. Biochem.

Biotechnol. 98-100:463-472.

US4409399

US2002117167A

US2004005674A

WO 97/28306

Claims (13)

1. En prosess for smelting og sakkarifisering av polysakkaridinneholdende biomasser som har et tørrstoffinnhold på over 20 %,karakterisert vedå utsette nevnte biomasse for samtidig: a) enzymatisk hydrolyse, og b) blande med en gravitasjonsbasert type av blanding basert på tønneblandere, trommelblandere, en blander med en roterende aksel som løfter biomassen eller lignende blandingsanordninger som utnytter fritt fall prinsipp tilveiebringende mekanisk prosessering og/eller degradering av biomassen.

2. Prosessen ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte polysakkaridinneholdende biomasse er en lignocellulosisk biomasse avledet fra jordbruksavlinger bestående av f.eks. maisstrå, bagasse, halm f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps og durra, knoller f.eks. roe, potet, cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra, tre bestående av mykved fieks. Pinus sylvestris, Pinus radiata, hardved f.eks. Salix spp., Eucalyptus spp. eller kommunalt fast avfall, avfallspapir, fiberfraksjoner fra prosessering av biogass, gjødsel og lignende biomasser.

3. Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte polysakkaridinneholdende biomasse er stivelse f.eks. stivelsesinneholdende korn eller raffinert stivelse.

4. Prosess ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte polysakkaridinneholdende biomasse er en blanding av stivelse, f.eks. stivelsesinneholdende korn eller raffinert stivelse, og lignocellulosiske biomasser oppnådd fra jordbruksavlinger bestående av f.eks. maisstrå, halm f.eks. fra ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps og durra, knoller f.eks. roe, potet, cerealer fra f.eks. ris, hvete, rug, havre, bygg, rug, raps, durra, tre bestående av mykved f.eks. Pinus sylvestris, Pinus radiata, hardved f.eks. Salix spp., Eucalyptus spp. eller kommunalt fast avfall, avfallspapir og lignende biomasser.

5. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-4,karakterisert vedat tørrstoffinnholdet av den polysakkaridinneholdende biomassen er mellom 25-80 %.

6. Prosess ifølge ethvert av kravene 1, 2 eller 4,karakterisert vedat minst 20 % (vekt/vekt) av den lignocellulosiske biomassen har en fiberstørrelse over 26 mm.

7. Prosess ifølge ethvert av kravene 1, 2 eller 4,karakterisert vedat den lignocellulosiske biomassen har blitt utsatt for varmeforbehandling mellom 110-250°C.

8. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-7,karakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen blir utført med en kombinasjon av hydrolytiske enzymer inkludert et karbohydrolytisk enzym og et oksidativt enzym.

9. Prosess ifølge ethvert av kravene 1, 3 eller 4,karakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen av stivelsesinneholdende korn blir utført med en kombinasjon av hydrolytiske enzymer og proteolytiske enzymer.

10. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-9,karakterisert vedat den enzymatiske hydrolysen blir utført ved 0-105°C.

11. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-10,karakterisert vedat blandingen av den polysakkaridinneholdende biomassen er basert på fritt fall blandere slik som tønneblandere, trommelblandere eller lignende blanderanordninger.

12. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-11,karakterisert vedat tiden for behandling for den enzymatiske hydrolysen er 0-72 timer.

13. Prosess ifølge ethvert av kravene 1-12,karakterisert vedat den blir utført som en sats, fodesats, kontinuerlig eller lignende prosess.