CN113403344A - 生物甲烷生产的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了处理城市固体废物(MSW)的方法，其中同时酶促水解和微生物发酵废物导致可降解组分的液化以及微生物代谢产物的积聚。然后将液化的可降解组分与不可降解的固体分离以产生包含大百分比的溶解固体的生物液体，所述溶解固体的大部分包含乙酸盐、乙醇、丁酸盐、乳酸盐、甲酸盐或丙酸盐的一些组合。该生物液体本身是新型生物甲烷底物组合物，其允许非常快速地转化为生物甲烷。进一步提供使用该生物液体以及采用其他通过同时酶促水解和微生物发酵有机材料而产生的生物甲烷底物组合物来生产生物甲烷的方法。

Description

生物甲烷生产的方法和组合物

发明人：Jacob Wagner Jensen,Georg

和Sebastian BuchAntonsen

本申请是申请日为2013年6月12日、申请号为201380030920.1、 发明名称为“生物甲烷生产的方法和组合物”的发明专利申请的分案 申请。

城市固体废物(MSW)，尤其包括家庭日常废物、来自饭店和 食品加工厂的废物和来自办公楼的废物，含有大量可被进一步加工 成能源、燃料和其他有用产品的有机材料组分。目前，只有小部分 的可用MSW被回收，而绝大部分被扔到垃圾填埋场。

发展高效而环境友好的处理固体废物的方法来最大限度地回收 其固有能量潜力，以及回收可回收材料已经引起了非常大的兴趣。 “废物到能源”加工中一个重大的挑战是MSW的异质性。固体废物 通常包含大量混入了塑料、玻璃、金属和其他不可降解材料的有机 可降解材料的组分。未分类废物可直接焚烧，就像在依赖于区域供 热系统的国家如丹麦和瑞典广泛应用(Strehlik 2009)。然而，焚烧方 法与负面环境后果相关，也不能完成原材料的有效回收。清洁和高 效地利用MSW的可降解组分与回收组合通常需要一些分类法将可 降解的材料和不可降解的材料分开。

MSW中的可降解组分可采用热化学和生物方法用于“废物到能 源”加工中利用。MSW可以经历高温分解或其他方式的热化学气化。 有机废物在极高温下的热分解会产生挥发性组分，例如焦油和甲烷 以及与直接焚烧相比，燃烧产生较低毒性后果的固体残留或“焦炭”。 或者，有机废物可以热转化为包含一氧化碳、二氧化碳和氢气的“合 成气”，其可以进一步被转化为合成燃料。参见例如Malkow 2004 综述。

用于转化MSW中可降解组分的生物方法包括发酵，以生产特定 有用的终产物例如乙醇。参见例如WO2009/150455；WO2009/095693； WO2007/036795；Ballestero s等，2010；Li等，2007。

或者，生物转化也可以通过厌氧消化生成生物甲烷或“沼气” 实现。参见例如Hartmann and Ahring 2006综述。预分类的MSW有 机成分可以直接转化为生物甲烷，参见例如US2004/0191755，或涉 及在添加水的存在下的切碎的相对简单的“制浆”过程之后，参见 例如US2008/0020456。

然而，预分类MSW而获得的有机组分通常是昂贵、低效或无用 的。源分类需要庞大的基础设施和运营费用以及废物收集所在社区 的积极参与和支持，这在现代都市社会已被证明难以实现。机械分 类是典型的资金密集型，且与有机材料的大量损失有关，大约至少 30％且通常更高。参见例如Connsonni 2005。

有关分拣系统的这些问题中的一些已经通过将未分拣废物中有 机可降解组分进行液化而成功避免。液化后的有机材料可轻易与不 可降解材料分离。一旦被液化为可泵浆料，有机组分可以容易地用 于热化学或生物转化过程。通过高压高温的“压热器”法液化可降 解组分已经被广泛报道。参见例如US2013/0029394；US2012/006089； US20110008865；WO2009/150455；WO2009/108761；WO2008/081028； US2005/0166812；US2004/0041301；US5427650；US 5190226。

一种完全不同的液化可降解有机组分的方法是其可采用生物过 程，尤其是通过酶促水解来实现。参见Jensen等，2010；Jensen等， 2011；Tonini and Astrup 2012；WO2007/036795；WO2010/032557。

与“压热器”法相比，酶促水解在液化可降解有机组分方面提 供独特的优势。采用酶促液化，MSW加工可以以连续的方式进行， 使用相对廉价的设备可以在相对较低的温度下运行非加压反应。相 比之下，“压热器”过程则必须以批处理模式进行，而且通常涉及 更高的资本成本。

“灭菌”以减少MSW引起的可能的健康风险—伯恩病原微生物 的认知性需求已经成为支持“压热器”液化法占优势的流行观点。 参见例如WO2009/150455；WO2000/072987；Li等，2012；Ballesteros 等，2010；Li等，2007。类似地，之前据信酶促液化需要热预处理到相对较高的至少90-95℃的温度。这样的高温被认为是必需的，一部 分是为了实现未分拣MSW的“灭菌”，也能使可降解有机组分软化 和纸张产品的“浆化”。参见Jensen等，2010；Jensen等，2011；Tonini 和Astrup 2012。

我们发现，未分拣MSW的安全的酶促液化可以不通过高温预处 理而实现。事实上，与期望相反，高温预处理不仅不是必需的，而 且是非常有害的，因为这会杀死在废物中生长旺盛的环境微生物。 促进微生物发酵的同时，在>45℃的嗜热条件下，酶促水解采用“环境”微生物或采用选择性“接种”的生物来促进“有机捕获”。也 就是说，同时进行的嗜热微生物发酵安全地增加“生物液体”(通 过酶促水解获得的液化的可降解组分)的有机产量。在这些情况下， 通常在MSW中存在的病原微生物无法生长。参见例如Hartmann和 Ahring2006；Deportes等，1998；Carrington等，1998；Bendixen等， 1994；Kubler等，1994；Six和DeBaerre等，1992。在这些情况下， 典型的MSW-伯恩病原体很容易被普遍存在的乳酸菌和其他安全的 生物战胜。

除了从酶促水解促进“有机捕获”，用乳酸菌或能产生醋酸盐、 乙醇、甲酸盐、丁酸盐、乳酸盐、戊酸盐或己酸盐的微生物的任意 组合进行的同时存在的微生物发酵，能“预处理”生物液体使其更 有效的成为生物甲烷生产的底物。与单独的酶促液化产生的生物液体相比，微生物发酵产生的生物液体中溶解物的比例相对于悬浮固 体通常增加。由于微生物的“预处理”，高链多糖通常降解得更充 分。微生物发酵和酶促水解的同时进行将生物聚合物降解为随时可 用的底物，而且，使初始底物通过代谢转化为短链羧酸和/或乙醇。 由此产生的包含高比例的微生物代谢产物的生物液体提供了一种有 效避免限速“水解”步骤的生物甲烷底物，参见例如Delgenes等2000；Angelidaki等，2006；Cysneiros等，2011，而且为甲烷生产提供进一 步的优势，尤其是采用非常快速“固定过滤”厌氧消化系统。

概述

附图说明

图1.干物质转化率，以上清液中回收的干物质占通过接种来自 实施例5的EC12B生物液体刺激的同时进行的酶促水解和微生物发 酵中总干物质的百分比来表示。

图2.从随后通过加入来自实施例5的生物液体诱导的同时进行 的酶促水解和发酵上清液中回收的细菌代谢产物。

图3.REnescience测试反应器的示意图。

图4.显示工厂装置的示意图。

图5.在不同时间段期间生物液体的有机捕获，以kg VS/kg处 理的MSW表示。

图6.细菌代谢物，以实验期间不同时间点的生物液体中溶解的 VS百分比和需氧细菌计数表示。

图7.来自实施例3的生物液体中鉴定的细菌种类分布。

图8.从实施例5所述的测试取样的EC12B中13种优势菌的分 布。

图9.采用来自实施例5的生物液体的生物甲烷生产的增加和减 少。

图10.来自实施例2的“高乳酸盐”生物液体的生物甲烷生产 的“增加”和“减少”表征。

图11.来自实施例2中的“低乳酸盐”生物液体的生物甲烷生 产的“增加”和“减少”表征。

图12显示水解的小麦秸秆生物液体的生物甲烷生产的“增加” 表征。

实施方式的详细说明

在一些实施方案中，本发明提供了一种处理城市固体废物 (MSW)的方法，包括以下步骤：

(i)在45-75℃的温度下提供非水含量为5-40％的MSW，

(ii)在45-75℃的温度下酶促水解同时微生物发酵MSW中的 可生物降解部分，导致废物的可生物降解部分液化和微生物代谢产 物聚集，然后

(iii)从不可生物降解的固体中分拣液化的废物的可生物降解部 分以产生特征在于包含溶解的挥发性固体的生物液体，其中至少25 重量％的挥发性固体包含任意组合的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、 乳酸盐和/或丙酸盐，然后

(iv)厌氧消化该生物液体以产生生物甲烷。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过酶促水解和微生物 发酵城市固体废物(MSW)产生的有机液体生物气体底物，其特征 在于

-至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，该溶解的 挥发性固体包含至少25重量％的任意组合的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、 甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐。

在一些实施方案中，本发明提供了一种生产生物气体的方法， 包括以下步骤：

(i)提供一种通过微生物发酵预处理的有机液体生物气体底物， 其中至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，该溶解的 挥发性固体包含至少25重量％的任意组合的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、 甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐，

(ii)将该液体底物转移至厌氧消化系统中，然后

(iii)进行该液体底物的厌氧消化以生产生物甲烷。

厌氧消化中涉及的微生物群落的代谢动力学非常复杂。参见 Supaphol等，2010；Morita和Sasaki 2012；Chandra等，2012。在典型 的生产甲烷生物气体的厌氧消化(AD)中，由微生物介导的生物过 程完成四个主要的步骤-将生物大分子水解为构成单体或其他代谢 物；酸化，其中产生短链烃酸和醇；乙酸化，其中将可用的营养物 异化为乙酸、氢和二氧化碳；和甲烷化，其中乙酸和氢通过专用的 古细菌异化为甲烷和二氧化碳。水解步骤统筹是限速的。参见 Delgenes等，2000；Angelidaki等，2006；Cysneiros等2011。

因此，有利的是通过某种形式的预处理提前水解制备生物甲烷 生产的底物。在一些实施方案中，本发明方法结合了MSW的微生物 发酵和酶促水解，这不仅作为最终生物甲烷生产的快速生物预处理， 也作为从未分拣MSW中分拣可降解有机组分的方法。

用含有MSW中源分类的有机组分的固体生物甲烷底物进行的 生物预处理已有报导。参见Fdez-Guelfo等，2012；Fdez-Guelfo等， 2011A；Fdez-Guelfo等，2011B；Ge等，2010；Lv等，2010；Borghi 等，1999。厌氧消化中最终甲烷产量的提高被报道为复杂生物聚合 物的降解增加和挥发性固体的溶解增加的结果。然而，通过这些之 前报导的方法实现的挥发性固体的溶解水平和其转化成挥发性脂肪 酸的水平甚至不接近本发明方法所实现的水平。例如，Fdez-Guelfo 等，2011A报道了通过对MSW中预分拣的有机部分的各种生物预 处理实现挥发性固体溶解度的10-15％的相对提高，这对应于挥发性 固体的7-10％的最终绝对溶解水平。相比之下，本发明的方法生产 的液体生物甲烷底物包含至少40％溶解的挥发性固体。

也报道过两阶段厌氧消化系统，其中第一阶段过程水解包括 MSW中源分拣的有机组分和其他特定生物底物的生物甲烷底物。在 通常是嗜热的第一厌氧阶段，高链聚合物降解产生挥发性脂肪酸。 随后是在物理上分离的反应器中进行第二阶段厌氧阶段，其中甲烷化和乙酸化占主导地位。所报道的两阶段厌氧消化系统通常使用源 分拣的、特定的、具有小于7％总固体的生物来源底物。参见Supaphol 等，2011；Kim等，2011；Lv等，2010；Riau等，2010；Kim等，2004； Schmit和Ellis 2000；Lafitte-Trouque和Forster 2000；Dugba和Zhang 1999；Kaiser等，1995；Harris和Dague 1993。最近，报道了一些两 阶段AD系统，其使用源分拣的、特定的、含有高达10％总固体的 生物来源底物。参见Yu等，2012；Lee等，2010；Zhang等，2007。 当然，没有任何报道过的两阶段厌氧消化系统预期使用未分拣MSW 作为底物，更不用说用来生产高固体的液体生物甲烷底物。两阶段 厌氧消化是为了转化固体底物，向第一阶段反应器中持续送入额外 的固体，并从一阶段反应器中持续去除挥发性脂肪酸。

可以使用任何合适的固体废物以实施本发明方法。本领域技术 人员将理解，术语“城市固体废物”(MSW)是指城市中通常可见 的废物部分，其本身并不需要来自于城市。MSW可以是任意组合的 纤维素、植物、动物、塑料、金属或玻璃废物，包括但不限于以下 的一种或多种：正常城市收集系统收集的垃圾，任选在一些中心分 拣、粉碎或打浆装置如

或

中处理；家庭分拣 出来的固体废物，包括有机部分和富含纸张部分；来源于工业的废 物部分，比如饭店业、食品加工业、普通工业；来自造纸工业的废 物部分；来自回收设施的废物部分；来自食品或饲料工业的废物部 分；来自医药工业的废物部分；来自农业或农场相关部门的废物部 分；来自富含糖或淀粉的产品加工的废物部分；污染的或以其他方 式变质的农产品，例如不能用来生产食品或饲料的谷物、马铃薯和甜菜；花园垃圾。

MSW本质上通常是异质性的。关于废物材料的组成，能为国家 之间的比较提供坚实基础的统计数据并不广为人知。正确的采样和 表征的标准以及操作流程仍未标准化。事实上，仅报道过很少的标 准化采样方法。参见Riber等，2007。至少在家庭废物方面，其组成表现出季节和地理变化。参见Dahlen等，2007；Eurostat,2008；Hansen 等，2007b；Muhle等，2010；Riber等，2009；Simmons等，2006；The Danish Environmental Protection agency,2010。还报道了家庭废物组 成的地理变化，即使是在短距离的200-300km的不同城市之间(Hansen等，2007b)。

在一些实施方案中，MSW以“未分拣的”废物处理。如本文所 用的术语“未分拣的”是指其中MSW没有被充分分成单独部分，这 样生物来源材料就没有充分和塑料和/或其他无机材料分离的过程。 据此定义，尽管去除了一些大型物体或金属物体，且尽管塑料和/或无机材料有一些分离，如本文所用，废物可以是“未分拣的”。如 本文所用的“未分拣的”废物是指没有被充分分离以提供其中低于 15％干重是非生物来源材料的生物来源部分的废物。包含生物来源和 非生物来源材料的混合物、其中大于15％干重是非生物来源材料的废物是如本文所用的“未分拣的”。通常，未分拣的MSW包含生物 来源废物，即可降解为生物可转化物质的废物，包括食品和厨房废 物、含有纸张和/或纸板的材料、食物废物等；可回收材料，包括玻 璃、瓶、罐、金属、和某些塑料；其他可燃烧物质，虽然其本身几 乎不是可回收的，但可能以废物衍生燃料的形式提供热能；和惰性 物质，包括陶瓷、岩石、和各种形式的碎片。

在一些实施方案中，MSW可以“分拣的”废物处理。如本文所 用的术语“分拣的”是指MSW被充分分成但独部分，这样生物来源 材料就充分和塑料和/或其他无机材料分离的过程。包含生物来源和 非生物来源材料的混合物、其中低于15％干重是非生物来源材料的废物是如本文所用的“分拣的”。

在一些实施方案中，MSW可以是主要包含水果、蔬菜和/或动物 废物的源分离的有机废物。可以在一些实施方案中使用各种不同的 分拣系统，包括源分拣，其中住户分开处理不同的废物材料。目前 在奥地利、德国、卢森堡、瑞典、比利时、荷兰、西班牙和丹麦的 某些城市里适当使用源分拣系统。或者，可以使用工业分拣系统。 机械分拣和分离的手段包括任何现有技术已知的方法，包括但不限 于在US2012/0305688；WO2004/101183；WO2004/101098； WO2001/052993；WO2000/0024531；WO1997/020643； WO1995/0003139；CA2563845；US5465847中描述的系统。在一些实 施方案中，可略微分拣废物，但仍产生了如本文所用的“未分拣的” 废物部分。在一些实施方案中，使用未分拣MSW，其中大于15％的 干重是非生物来源物质，或大于18％、或大于20％、或大于21％、 或大于22％、或大于23％、或大于24％、或大于25％。

在本发明的实施方法中，MSW应以10-45％的非水含量，或在 某些实施方案中12-40％、或13-35％、或14-30％、或15-25％的非水 含量提供。MSW通常包含相当大的水含量。MSW中的所有其他固 体均称为如本文所用的“非水含量”。本发明实施方法中使用的含 水量水平与若干个相互关联的变量有关。本发明的方法产生了一种 液体生物来源的浆料。本领域技术人员将理解，使固体组分转化为 液体浆料的能力会随着含水量的增加而增加。有效的含有大量典型 MSW的纸张和纸板的制浆通常随着含水量的增加而改进。此外，众 所周知，当水解在低含水量的条件下进行时，酶活性会表现出降低 的活性。例如，纤维素酶在水解非含水量高于10％的混合物时，通 常表现出降低的活性。在降解纸张和纸板的纤维素酶情况下，已报 道了来自每克底物的酶促反应的底物浓度和产量的有效线性反向关 系。参见Kristensen等，2009。利用可商购的为木质纤维素生物物质 转化而优化的分离的酶制剂，我们在中试规模研究中观察到非水含 量可以高达15％而没有观察到明确的有害影响。

在一些实施方案中，应在废物中正常加入一些水量以使其达到 适当的非水含量。例如，考虑一部分未分拣的丹麦家庭废物。表1 描述了Riber等(2009),“Chemicalcomposition of material fractions in Danish household waste,”Waste Management29:1251中报道的未分拣 MSW的特有组成。Riber等表征了2001年一天内在丹麦从2220户家庭获得的家庭废物的组分部分。本领域技术人员很容易理解，该 报道的组成仅是一个用于解释本发明方法的代表性实例。在表1的 实例中，在温和加热前不加入任何的水量，含有蔬菜、纸张和动物 废物的有机可降解部分预期平均具有大约47％的非水含量。[(绝对的非水％)/(％湿重)＝(7.15+18.76+4.23)/(31.08+23.18+9.88)＝47％ 非水含量。]加入相当于被处理废物部分1个重量的体积的水会使废 物本身的非水含量降低到29.1％(58.2％/2)，同时使可降解组分的 非水含量降低到约23.5％(47％/2)。加入相当于被处理废物部分2个 重量的体积的水会使废物本身的非水含量降低到19.4％(58.2％/3)， 同时使可降解组分的非水含量降低到约15.7％(47％/3)。

表1.丹麦2001年总结的废物部分的质量分布

(a)纯的部分。

(b)报纸、杂志、广告、书籍、干净/脏的办公室用纸、纸张和 纸箱容器、纸板、带有塑料的纸箱、带有铝箔的纸箱、脏纸板和厨 房用的纸巾的总和。

(c)软塑料、塑料瓶、其他硬塑料和不可回收塑料的总和。

(d)土壤、岩石等、灰、陶瓷、猫砂和其他非可燃物的总和。

(e)铝容器、铝箔、金属箔、金属容器和其他金属的总和。

(f)透明玻璃、绿色玻璃、褐色玻璃和其他玻璃的总和。

(g)剩余13种材料部分的总和。

在本发明的实施方法中，如果需要的话，本领域技术人员能很 容易地确定要加入废物的适当的水量。通常作为一个实际问题，尽 管被处理的MSW的组成存在一些可变性，方便的是加入相对恒定的 质量比的水，在一些实施方案中，为0.8-1.8kg水/kg MSW，或者0.5-2.5水/kg MSW，或者1.0-3.0水/kg MSW。因此，在处理过程中， MSW中实际的非水含量可以在一个合适范围内变化。非水含量的合 适水平可以根据实现酶促水解所使用的方式而变化。

酶促水解可以通过各种不同方式实现。在一些实施方案中，酶 促水解可以通过分离的酶制剂实现。如本文所用，术语“分离的酶 制剂”是指包含酶活性的制剂，该制剂是提取的、分泌的、或者是 通过生物来源获得的，任选经部分或广泛纯化。

各种不同的酶活性可以有利地用于实践本发明的方法。例如， 就表1所示的MSW组成而言，显而易见的是，含纸张废物包含最大 干重的生物材料单一组分。因此，对于本领域技术人员显而易见的 是，对于典型的家庭废物，纤维素降解活性将是特别有利的。在含 纸张废物中，纤维素被预先加工，并作为混合有木质素和半纤维素 的木质纤维素生物质组分与其天然组分分离。因此，含纸张废物可 以用相对“简单的”纤维素酶制剂有利地降解。

“纤维素酶活性”是指纤维素中1,4-B-D-糖苷键的酶促水解。 在从细菌、真菌或其他来源获得的分离的纤维素酶制剂中，纤维素 酶活性通常包含不同酶活性的混合物，包括分别催化1,4-B-D-糖苷 键的内切和外切水解的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶(也叫纤维二 糖水解酶)，以及将外切葡聚糖酶水解的低聚糖产物水解为单糖的 B-葡萄糖苷酶。不溶性纤维素的完全水解通常需要不同酶之间的协 同作用。

作为一个实际问题，有利的是在一些实施方案中简单地使用市 售的为木质纤维素生物质转化而优化的分离的纤维素酶制剂，因为 这些酶制剂可以以相当低的成本买到。这些制剂当然适用于实施本 发明的方法。术语“为木质纤维素生物质转化而优化”是指为了提 高水解产量和/或降低将预处理的木质纤维素生物质水解为可发酵糖 的酶消耗量的特定目的而选择和修饰酶混合物的产品开发过程。

然而，市售的为水解木质纤维素生物质而优化的纤维素酶混合 物通常包含高水平的其他专用的酶活性。例如，我们测定了市售的 由NOVOZYMES^TM以商标CELLIC CTEC2^TM和CELLIC CTEC3^TM提供的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂，和由 GENENCOR^TM以商标ACCELLERASE 1500^TM提供的相似制剂中存在 的酶活性，发现这些制剂中的每一种包含超过200U/g的木聚糖内切 酶活性，超过85U/g水平的木糖苷酶活性，超过9U/g水平的B-L- 阿拉伯呋喃糖酶活性，超过15U/g水平的淀粉葡萄糖苷酶活性，和 超过2U/g水平的a-淀粉酶活性。

更简单的分离的纤维素酶制剂也可以有效用于实践本发明的 方法。合适的纤维素酶制剂可以通过本领域熟知的方法从各种微生 物中获得，包括好氧和厌氧细菌、白腐真菌、软腐真菌和厌氧真菌。 如其整体通过引用明确结合于此的参考文献13，R.Singhania等, "Advancement and comparative profiles in the production technologiesusing solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases,"Enzyme and Microbial Technology(2010)46:541-549所述，产生纤维素 酶的生物通常产生合适比例的不同酶的混合物以适于木质纤维素底 物的水解。优选的可用于木质纤维素生物质转化的纤维素酶制剂的 来源包括真菌，比如木霉(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、 镰刀菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、黑曲霉(Aspergillus)和 黄孢原毛(Phanerochaete)的种。

除了纤维素酶活性，一些其他的在实践本发明方法中证实是有 利的酶活性包括作用于食品废物的酶，如蛋白酶、葡糖淀粉酶、内 切淀粉酶、蛋白酶、果胶酯酶、果胶裂解酶和脂肪酶，以及作用于 花园废物的酶，如木聚糖酶和木糖苷酶。在一些实施方案中，有利地包括其他酶活性如海带多糖酶(laminarase)、角蛋白酶或漆酶。

在一些实施方案中，可以直接接种表现出胞外纤维素酶活性的 所选择微生物以同时进行酶促水解和微生物发酵，包括但不限于以 下一种或多种嗜热的分解纤维素的生物可以单独或与其他生物一起 接种：类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)，参见Asha等，2012； 热纤梭菌(Clostridium thermocellum),参见Blume等，2013和Lv和 Yu，2013；所选择的链霉菌属(Streptomyces)、小双孢菌属 (Microbispora)和芽孢杆菌属(Paenibacillus)的种,参见Eida等， 2012；Clostridium straminisolvens,参见Kato等，2004；厚壁菌属 (Firmicutes)、放线菌属(Actinobacteria)、变形菌属(Proteobacteria)和拟杆菌属(Bacteroidetes)的种,参见Maki等，2012；Clostridium clariflavum,参见Sasaki等，2012；与热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和Clostridiumstraminisolvens在系统发育和生理学上相 关的新的梭菌属的种，参见Shiratori等，2006；Clostridium clariflavum sp.nov.和Clostridium Caenicola,参见Shiratori等，2009；嗜热地芽孢 杆菌(Geobacillus Thermoleovorans),参见Tai等，2004；Clostridiumstercorarium,参见Zverlov等，2010；或一种或多种嗜热真菌嗜热侧 孢霉(Sporotrichumthermophile)、Scytalidium thermophillum、Clostridium straminisolvens和弯曲高温单胞菌(Thermonospora curvata),参见 Kumar等，2008综述。在一些实施方案中，可以接种表现出其他有 用的胞外酶活性的微生物以同时进行酶促水解和微生物发酵，例如， 蛋白和角蛋白降解真菌，参见Kowalska等，2010,或表现出胞外脂肪 酶活性的乳酸菌，参见Meyers等，1996。

酶促水解可通过本领域公知的方法，采用一种或多种包括之前 提及的那些的任一种的多种酶制剂的任何一种或多种的分离的酶制 剂，或者通过用一种或多种所选择的能影响所需酶促水解的生物接 种处理MSW来进行。在一些方案中，酶促水解采用有效量的一种或 多种包含纤维素酶、β-葡萄糖苷酶酶、淀粉酶和木聚糖酶活性的分 离的酶制剂来进行。量是其中所使用的酶制剂在18小时的水解反应 时间内在所使用的条件下共同实现了MSW中存在的可降解的生物 来源材料的至少40％干重的溶解的“有效量”。在一些实施方案中， 使用一种或多种分离的酶制剂，其中各种酶活性的相对比例总体如 下：使用酶活性混合物，以使其1FPU的纤维素酶活性与至少31 CMC U的内切葡聚糖酶活性相关，以及1FPU的纤维素酶活性与至 少7pNPG U的β-葡萄糖苷酶活性相关。本领域技术人员将容易地 理解，CMC U是指羧甲基纤维素单位。一个CMC U活性在50℃和 pH4.8的特定分析条件下，1分钟内释放1umol还原糖(以葡萄糖当 量表示)。本领域技术人员将容易地理解pNPG U是指pNPG的单 位。一个pNPG U活性在50℃和pH4.8下，每分钟从对硝基苯基-B-D- 葡萄糖苷中释放1umol硝基苯酚。本领域技术人员还将容易地理解 “滤纸单位”FPU提供了纤维素酶活性的度量。如文本所用，FPU 是指采用全文通过引用明确并入本文的Adney,B.and Baker,J., Laboratory Analytical Procedure#006,"Measurement of cellulase activity",August 12,1996,the USA National Renewable Energy Laboratory(NREL)中的方法测定的滤纸单位。

在实践本发明的实施方案时，在开始酶促水解前调节MSW的 温度可以是有利的。本领域众所周知，纤维素酶和其他酶通常表现 出最佳温度范围。虽然从极端嗜热生物中分离的酶的实例当然是已 知的，其最佳温度大约为60或甚至70℃，酶最佳温度范围通常落入35-55℃范围内。在一些实施方案中，酶促水解在30-35℃、或35-40℃、 或40-45℃、或45-50℃、或50-55℃、或55-60℃、或60-65℃、或 65-70℃、或70-75℃的温度范围内进行。在一些实施方案中，有利 的是在至少45℃的温度下同时进行酶促水解和微生物发酵，因为这 有利于阻碍MSW-伯恩病原菌的生长。例如参见Hartmann and Ahring 2006；Deportes等，1998；Carrington等，1998；Bendixen等，1994； Kubler等，1994；Six和De Baerre等，1992。

利用纤维素酶活性的酶促水解通常将纤维素材料糖化。因此， 在酶促水解过程中，固体废物被糖化且液化，即，从固体形式转化 为液体浆料。

之前，利用酶促水解实现生物来源组分液化的加工MSW的方 法已经预期将MSW加热到比酶促水解需要的温度高很多的温度的 需要，尤其为了实现废物的“灭菌”，然后是必须的冷却步骤，以 使经加热的废物回到适于酶促水解的温度。在实践本发明的方法时， 将MSW简单地置于适于酶促水解的温度已经足够。在一些实施方案 中，有利的是用热水简单地将MSW调节到合适的非水含量，以将 MSW置于适合酶促水解的温度的方式实施。在一些实施方案中，通 过在反应容器里加入热水量、或蒸汽，或通过其他加热方式加热 MSW。在一些实施方案中，将MSW在反应容器里加热到高于30℃ 但低于85℃的温度、或到84℃或更低的温度、或到80℃或更低 的温度、或到75℃或更低的温度、或到70℃或更低的温度、或到 65℃或更低的温度、或到60℃或更低的温度、或到59℃或更低的 温度、或到58℃或更低的温度、或到57℃或更低的温度、或到56 ℃或更低的温度、或到55℃或更低的温度、或到54℃或更低的温 度、或到53℃或更低的温度、或到52℃或更低的温度、或到51℃ 或更低的温度、或到50℃或更低的温度、或到49℃或更低的温度、 或到48℃或更低的温度、或到47℃或更低的温度、或到46℃或 更低的温度、或到45℃或更低的温度。在一些实施方案中，将MSW 加热到不高于进行酶促水解的最高温度以上10℃的温度。

如在此所述，将MSW“加热到一个温度”是指在反应器中将 MSW的平均温度升高到该温度。如本文所用，将MSW加热到的温 度是在反应器中达到的MSW的最高平均温度。在一些实施方案中， 最高平均温度可能不会在整个过程中维持。在一些实施方案中，加 热反应器可包含不同的区域以使加热在不同温度的阶段发生。在一 些实施方案中，加热可在进行酶促水解的同一反应器中实现。加热 的目的是简单地使纤维素废物的大部分和工厂废物的很大一部分处 于适合酶促水解的最佳环境。为了处于适合酶促水解的最佳条件， 理想地，废物应具有适合酶促水解中采用的酶活性的温度和水含量。

在一些实施方案中，有利的是在加热过程中搅拌以实现均匀加 热的废物。在一些实施方案中，搅拌可包括自由落体混合，例如在 具有基本上沿水平轴旋转的腔室的反应器中或具有旋转轴升降MSW的混合器中或具有水平轴或桨升降MSW的混合器中混合。在 一些实施方案中，搅拌可包括振摇、搅拌或通过运送螺旋输送机输 送。在一些实施方案中，在将MSW加热到所需温度后进行搅拌。在 一些实施方案中，搅拌进行1-5分钟、或5-10分钟、或10-15分钟、 或15-20分钟、或20-25分钟、或25-30分钟、或30-35分钟、或35-40 分钟、或40-45分钟、或45-50分钟、或50-55分钟、或55-60分钟、 或60-120分钟。

酶促水解在加入分离的酶制剂时开始。或者，在不加分离的酶 制剂而是采用表现出所需胞外酶活性的微生物的情况下，酶促水解 在加入所需微生物时开始。

在实践本发明方法时，酶促水解与微生物发酵同时进行。同时 发生的微生物发酵可采用各种不同方法实现。在一些实施方案中， 简单地使MSW中天然存在的微生物在反应条件下生长，其中处理的 MSW没有被预加热到足以产生“灭菌”效果的温度。典型地，MSW 中存在的微生物包括适应局部环境的生物。同时进行微生物发酵的 总体有益效果是比较强大的，意味着非常广泛种类的不同生物能够 单独或共同地通过酶促水解MSW而有利于有机物捕获。不希望受理 论束缚，我们认为共发酵微生物单独地对于没有被纤维素酶水解的食物废物的降解具有一些直接作用。同时，纤维素酶水解所释放的 碳水化合物单体和低聚体特别易于被几乎任何微生物种消耗。这为 纤维素酶提供有益的协同作用，可能通过酶活性产物抑制的释放， 也可能因为不能立即显现的其他原因。微生物代谢的终产物在任何情况下通常都适于作为生物甲烷底物。因此，微生物代谢产物中酶 促水解MSW的富集其本身已经导致生物甲烷底物质量的提高。乳酸 菌尤其在自然中普遍存在，且通常在非水含量为10-45％的MSW在 45-50温度范围内酶促水解时观察到乳酸产生。在更高的温度下，可 能其他天然存在的微生物种占优势，除乳酸之外的微生物代谢产物 变得更加普遍。

在一些实施方案中，可通过采用一种或多种微生物种直接接种 来实现微生物发酵。本领域技术人员将容易理解，可以有利地选择 用于接种以提供MSW的同时酶促水解和发酵的一种或多种细菌种， 其中该细菌种能在所使用的酶活性的最适温度或其附近生长。

接种水解混合物来诱导微生物发酵可以通过各种不同方法实 现。

在一些实施方案中，有利的是在加入酶活性或加入表现出胞外 纤维素酶活性的微生物之前、之后或同时接种MSW。在一些实施方 案中，有利的是采用一种或多种包括但不限于以下一种或多种、或 其遗传修饰变体的LAB种：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、 乳链球菌(Streptococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、 清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约古特乳杆菌(Lactobacillus jugurti)、发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)、肉乳杆菌(Lactobacillus carnis)、栖鱼乳杆 菌(Lactobacillus piscicola)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus maltaromicus)、假胚芽乳酸杆菌(Lactobacilluspseudoplantarum)、敏 捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、巴伐利亚乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillus uamanashiensis、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、分歧 乳杆菌(Lactobacillus divergens)、干酪乳杆菌阿拉伯糖亚种 (Lactobacillus alactosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、同 型腐酒乳杆菌(Lactobacillushomohiochii)、旧金山乳杆菌 (Lactobacillus sanfrancisco)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillusponti、 罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、融合乳杆菌 (Lactobacillusconfuses)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、坎氏乳杆 菌(Lactobacilluskandleri)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、 希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardi)、克菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)、丘状乳杆菌(Lactobacilluscollinoides)、Lactobacillus vaccinostericus、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、保加利亚乳 杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、赖氏乳杆菌(Lactobacillus leichmanni)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、Lactobacillus salicinus、加氏乳杆菌 (Lactobacillusgasseri)、Lactobacillus suebicus,口乳杆菌 (Lactobacillus oris)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、阴道乳杆菌 (Lactobacillus vaginalis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、面包 乳杆菌(Lactobacillus panis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、葡 聚糖乳球菌(Lactococcus dextranicum)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、霍氏乳球菌(Lactococcus hordniae)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、双乙酰乳酸链球菌(Streptococcus diacetylactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、葡聚糖明 串珠菌(Leuconostocdextranicum)、乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)、酒明串珠菌(Leuconostocoenos)、副肠膜明串珠菌 (Leuconostoc paramesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudoesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、冷明串 珠菌(Leuconostoc gelidum)、檬酸明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、 有害片球菌(Pediococcus damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(Pediococcus cervisiae)、小片球菌 (Pediococcus parvulus)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、戊糖片 球菌(Pediococcus pentosaceus)、中间型片球菌(Pediococcus intermedius)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、短双歧 杆菌(Bifidobacterium breve)、和费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)，或接种随后发现的LAB种或接种来自肠球菌属 (Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、 明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)或肉杆菌(Carnobacterium)的对产生乳酸的代谢过程表现出有用能力的其他 种。

本领域技术人员将容易地理解用于接种的细菌制剂可包含不 同生物的集合。在一些实施方案中，可以采用在任何给定地理区域 存在且适于在来自该区域MSW中生长的天然存在的细菌。如本领域 众所周知，LAB普遍存在且通常包含MSW中任意天然存在的细菌群体的主要成分。

在一些实施方案中，可以通过持续回收用于从不可降解固体中 回收残余有机材料的洗涤水或加工液而用天然存在的细菌接种 MSW。随着洗涤水或加工液的回收，其逐渐获得更高的微生物水平。 在一些实施方案中，微生物发酵具有降低pH效应，尤其是当代谢物 包含短链羧酸/脂肪酸例如甲酸盐、乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐或乳酸 盐时。因此在一些实施方案中，有利地监控并调节同时进行的酶促 水解和微生物发酵混合物的pH。当洗涤水或加工液用于在酶促水解 之前提高进入废物的水含量，在以分离的酶制剂或表现出胞外纤维 素酶活性的微生物方式加入酶活性之前进行接种是有利的。在一些 实施方案中，适于在来自特定区域的MSW上生长的天然存在的细菌 可以在MSW上或通过酶促水解MSW获得的液化有机组分上培养。 在一些实施方案中，然后可以将培养的天然存在细菌作为接种体单独或补充加入到采用回收的洗涤水或加工液的接种中。在一些实施 方案中，可以在加入分离的酶制剂之前或同时，或在预水解开始一 段时间后加入细菌制剂。

在一些实施方案中，可以为接种培养特定的菌株，包括经过特 殊修饰或“训练”以使其在酶促水解反应条件下生长和/或强化或去 强化特定代谢过程的菌株。在一些实施方案中，有利地用被鉴定为 能够以邻苯二甲酸盐为唯一碳源生存的细菌菌株接种MSW。这些菌 株包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰变体： Chryseomicrobiumintechense MW10T、Lysinibaccillus fusiformis NBRC 157175、Tropicibacterphthalicus、戈登氏菌属JDC-2(Gordonia JDC-2)、 Arthrbobacter JDC-32、枯草芽孢杆菌3C3(Bacillus subtilis3C3)、睾丸酮 丛毛单胞菌(Comamonas testosteronii)、丛毛单胞菌E6(Comamonas sp E6)、戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)、Rhodoccoccus jostii、洋葱伯 克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、分支杆菌(Mycobacteriumvanbaalenii)、Arthobacter keyseri、芽孢杆菌007(Bacillus sb 007)、节 杆菌PNPX-4-2(Arthobacter sp.PNPX-4-2)、Gordonia namibiensis、 Rhodococcus phenolicus、假单胞菌PGB2(Pseudomonas sp.PGB2)、假单 胞菌Q3(Pseudomonas sp.Q3)、假单胞菌1131(Pseudomonas sp.1131)、 假单胞菌CAT1-8(Pseudomonas sp.CAT1-8)、假单胞菌(Pseudomonas sp. Nitroreducens)、节杆菌AD38(Arthobacter sp AD38)、戈登氏菌属CNJ863(Gordonia sp CNJ863)、Gordonia rubripertinctus、氧化节杆菌 (Arthobacteroxydans)、Acinetobacter genomosp和醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)。参见例如Fukuhura等，2012；Iwaki等， 2012A；Iwaki等，2012B；Latorre等，2012；Liang等，2010；Liang等， 2008；Navacharoen等，2011；Park等，2009；Wu等，2010；Wu等，2011。 在很多商业聚氯乙烯制品中被用作增塑剂的邻苯二甲酸盐是可滤去 的，而且根据我们的经验，其经常以不合需要的水平存在于液化的 有机组分中。在一些实施方案中，可以有利地采用通过本领域熟知 的方法遗传修饰过的菌株以强化代谢过程和/或去强化其他代谢过 程，包括但不限于消耗葡萄糖、木糖或阿拉伯糖的过程。

在一些实施方案中，用鉴定为能够降解木质素的细菌菌株接种 MSW是有利的。这种菌株包括但不限于以下的任意一种或多种，或 其遗传修饰的变体：丛毛单胞菌B-9(Comamonas sp B-9)、弗氏柠檬酸 菌(Citrobacter freundii)、柠檬酸菌FJ581023(Citrobacter sp FJ581023)、 纽伦堡潘多拉菌(Pandorea norimbergensis)、无枝酸菌ATCC39116(Amycolatopsis sp ATCC 39116)、Streptomyces viridosporous、 红球菌(Rhodococcus jostii)和鞘氨醇单胞菌SYK-6(Sphingobium sp. SYK-6)。参见例如Bandounas等，2011；Bugg等，2011；Chandra等，2011；Chen等，2012；Davis等，2012。根据我们的经验，MSW通常包 含相当大量的一般在AD后作为未消化残留物被回收的木质素。

在一些实施方案中，用能够产生醋酸盐的细菌菌株接种MSW 是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的 变体：瘤胃聚乙酸菌(Acetitomaculumruminis)、Anaerostipes caccae、 潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)、伍氏醋酸杆菌 (Acetobacterium woodii)、凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、解脂厌氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)、Bacteroides coprosuis、Bacteroides propionicifaciens、溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanolyticus)、 链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、 角双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、没食子双歧杆菌(Bifidobacteriumgallicum)、婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、假长双 歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、尿酸发酵梭菌(Clostridium acidurici)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、少纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、Clostridium formicaceticum、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、 Clostridiumlochheadii、甲基戊烯梭菌(Clostridium methylpentosum)、巴 氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、丙酸盐梭菌(Clostridiumpropionicum)、腐化梭菌 (Clostridium putrefaciens)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、破伤风梭 菌(Clostridium tetani)、破伤风形梭菌(Clostridiumtetanomorphum)、热纤 梭菌(Clostridium thermocellum)、东方脱硫肠状菌(Desulfotomaculum orientis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、反刍真杆菌(Eubacteriumruminantium)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、多对毛螺 菌(Lachnospira multiparus)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、热 醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、Pelobacter acetylenicus、没食子 酸居泥杆菌(Pelobacteracidigallici)、马赛居泥杆菌(Pelobacter massiliensis)、Prevotella ruminocola、费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、嗜淀粉瘤胃 杆菌(Ruminobacter amylophilus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、 布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、Ruminococcuschampanellensis、 反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、Sporomusapaucivorans、 溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succinimonas amylolytica)、溶葡聚糖琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolven)、大伴生单胞菌(Syntrophomonas wolfei)、Syntrophus aciditrophicus、Syntrophus gentianae、伯氏螺旋体(Treponema bryantii)和Treponema primitia。

在一些实施方案中，用能够产生丁酸盐的细菌菌株接种MSW 是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的 变体：发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、穗状丁酸弧菌 (Butyrivibrio crossotus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、亨氏 丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、产纤维二糖 梭菌(Clostridium cellobioparum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、无害梭 菌(Clostridium innocuum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、巴氏梭菌 (Clostridiumpasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、蛋 白溶解梭菌(Clostridiumproteoclasticum)、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、第三梭菌 (Clostridium tertium)、酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、规则粪球 菌(Coprococcus eutactus)、陪伴粪球菌(Coprococcuscomes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、巴氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、两形真杆菌(Eubacterium biforme)、溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)、圆柱 状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、 庞大真杆菌(Eubacterium hadrum)、Eubacterium halii、淤泥真杆菌 (Eubacterium limosum)、念珠状真杆菌(Eubacterium moniliforme)、氧化 还原真杆菌(Eubacterium oxidoreducens)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、砂优杆菌(Eubacterium saburreum)、多曲真杆菌(Eubacterium tortuosum)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、普拉 梭杆菌(Fusobacterium prausnitzii)、Peptostreptoccoccus vaginalis、Peptostreptoccoccus tetradius、瘤胃假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio ruminis)、Pseudobutyrivibrio xylanivorans、盲肠罗斯氏菌(Roseburia cecicola)、肠炎罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)、Roseburia hominis和 布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)。

在一些实施方案中，用能够产生丙酸盐的细菌菌株接种MSW 是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的 变体：解脂厌氧弧菌(Anaerovibriolipolytica)、Bacteroides coprosuis、 Bacteroides propionicifaciens、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丁酸梭菌 (Clostridium butyricium)、甲基戊烯梭菌(Clostridium methylpentosum)、巴 氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、丙酸盐梭菌(Clostridium propionicum)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、埃氏巨球形菌 (Megasphaera elsdenii)、Prevotellaruminocola、费氏丙酸盐杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、 Ruminococcus champanellensis、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)和大伴生单胞菌(Syntrophomonas wolfei)。

在一些实施方案中，用能够产生乙醇的细菌菌株接种MSW是 有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变 体：甲醇醋酸杆菌(Acetobacteriumcarbinolicum)、威氏醋酸杆菌 (Acetobacterium wieringae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、溶纤 维拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanolyticus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、贝氏梭菌 (Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、产纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、Clostridium lochheadii、巴氏梭菌 (Clostridiumpasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、热 纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、多对毛螺菌(Lachnospira multiparus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、浸 麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、Pelobacter acetylenicus、白色瘤 胃球菌(Ruminococcusalbus)、Thermoanaerobacter mathranii、伯氏螺旋 体(Treponema bryantii)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。

在一些实施方案中，不同微生物的组合，任选包括细菌和/或真 菌的不同种，可用于实现同时进行的微生物发酵。在一些实施方案中， 选择合适的微生物以在预期反应条件下提供所需代谢结果，然后用高剂 量水平接种以超过天然存在的菌株。例如，在一些实施方案中，采用同 型发酵乳酸产生菌接种可能是有利的，因为它在所产生的生物甲烷底物中能够提供高于异型发酵乳酸产生菌所能提供的最终产甲烷能力。

在一些实施方案中，如在WO2006/056838和WO2011/032557中 所述，在能通过自由落体混合搅拌的水解反应器中进行同时存在的酶促 水解和微生物发酵。

同时存在的酶促水解和微生物发酵进行一段时间之后，以非含水 量为10-45％提供的MSW被转化，生物来源或“可发酵”组分变成液化 的，且微生物代谢产物在水相中积聚。同时存在的酶促水解和微生物发 酵进行一段时间后，废物中液化的可发酵部分与不可发酵的固体分离。 液化材料一旦与不可发酵的固体分离，就是我们所说的“生物液体”。在 一些实施方案中，这种生物液体中至少40％的非水含量包含溶解的挥发 性固体，或至少35％、或至少30％、或至少25％。在一些实施方案中， 生物液体中至少25重量％的溶解的挥发性固体包含乙酸盐、丁酸盐、 乙醇、甲酸盐、乳酸盐、和/或丙酸盐的任意组合。在一些实施方案中， 至少70重量％的溶解的挥发性固体包含乳酸盐，或至少60％、或至少 50％、或至少40％、或至少30％、或至少25％。

在一些实施方案中，分离MSW中不可发酵的固体和液化的可发 酵部分以产生生物液体，其特征在于包含溶解的挥发性固体，其至少25 重量％含有乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意 组合，所述分离在酶促水解开始之后进行少于16小时，或少于18小时、 或少于20小时、或少于22小时、或少于24小时、或少于30小时、或 少于34小时、或少于36小时。

废物中液化的可发酵部分与不可发酵固体的分离可以通过各种 手段实现。在一些实施方案中，这可采用至少两种不同的分离操作的任 意组合来实现，包括但不限于螺旋压力机操作、弹道分离器操作、振动 筛操作或其它本领域已知的分离操作。在一些实施方案中，与废物中可 发酵部分分离的不可发酵固体包含至少约20％干重的MSW，或至少25％、或至少30％。在一些实施方案中，与废物中可发酵部分分离的不 可发酵固体包含至少20％干重的可回收材料，或至少25％、或至少30％、 或至少35％。在一些实施方案中，通过至少两种分离操作的分离产生的 生物液体含有至少0.15kg挥发性固体/kg处理的MSW或至少010。本 领域技术人员将容易地理解MSW中固有的生物来源组成是可变的。尽 管如此，0.15kg挥发性固体/kg处理的MSW的数据反映了典型的未分 拣MSW中生物来源材料至少80％的总捕获。每kg处理的MSW生物 液体中捕获的挥发性固体kg的计算可以在测定总产量和处理的总 MSW的一段时间内估计。

在一些实施方案中，在分离MSW中不可发酵固体和液化的可发 酵部分以产生生物液体之后，该生物液体可在不同条件包括不同温度或pH下进行后发酵。

如本文所用的术语“溶解的挥发性固体”是指如下计算的简单测 量：将50ml离心管中的生物液体样品在6900g离心10分钟以产生沉淀 和上清液。倒出上清液，沉淀的湿重以占最初液体样品总重量的百分比 表示。上清液样品在60℃干燥48小时以测定干物质含量。从干物质测 量中减去550℃熔炉燃烧后残留的灰来测定上清液样品中挥发性固体 的含量，并作为溶解的挥发性固体以质量百分比％表示。通过基于沉淀 中挥发性固体含量的计算测定溶解的挥发性固体的独立测量。沉淀的湿 重部分作为未溶解固体体积占总初始体积比例的分数应用。60℃干燥 48小时以测定沉淀中干物质含量。从干物质测量中减去550℃熔炉燃 烧后残留的灰来测定沉淀中挥发性固体的含量。沉淀中挥发性固体含量 通过估计的来自上清液的贡献按(1-沉淀的湿分)X(测量的上清液挥 发性固体％)来校正。从原始液体样品中检测到的总挥发性固体％减去 (校正后的沉淀中挥发性固体含量％)X(未溶解固体体积占总初始体积 比例的分数估计)得到溶解的挥发性固体％的独立估计。采用两个估计中 较高的一个以免高估细菌代谢物代表的溶解的挥发性固体的百分比。

在一些实施方案中，本发明提供用于生物甲烷生产的组合物和方 法。关于处理MSW的方法的实施方案的之前详细讨论可任选应用于提 供用于生物甲烷生产的方法和组合物的实施方案。在一些实施方案中， 产生生物甲烷的方法包括以下步骤：

(i)提供通过过微生物发酵预处理的有机液体生物甲烷底物，使得 至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥 发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳 酸盐和/或丙酸盐的任意组合，

(ii)将该液体底物转移到厌氧消化系统中，然后

(iii)进行该液体底物的厌氧消化以产生生物甲烷。

在一些实施方案中，本发明提供通过酶促水解和生物发酵城市固 体废物(MSW)或预处理的木质纤维素生物质产生的有机液体生物甲 烷底物，所述生物甲烷底物包含经酶促水解和微生物发酵的MSW，或 包含经酶促水解和微生物发酵的预处理的木质纤维素生物质，其特征在 于-至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，该溶解的挥发 性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐 和/或丙酸盐的任意组合。

如本文所用，术语“厌氧消化系统”是指包含在控制的通风条件下 操作的一个或多个反应器的发酵系统，其中甲烷气体在构成该系统的每 个反应器中产生。产生甲烷气体的程度是在“厌氧消化系统”中发酵混合 物的水相中代谢产生的溶解甲烷的浓度在所用条件下是饱和的，且甲烷 气体从该系统中释放。

在一些实施方案中，“厌氧消化系统”是固定的过滤系统。“固定的 过滤厌氧消化系统”是指将厌氧消化群体固定在(任选在生物膜内)物 理支持基质上的系统。

在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含至少8％总固体、或 至少9％总固体、或至少10％总固体、或至少11％总固体、或至少12％ 总固体、或至少13％总固体。如本文所用的“总固体”是指可溶的和不可 溶的固体两者，且事实上是指“非水含量”。总固体通过在60℃干燥直 到获得恒定重量来测量。

在一些实施方案中，微生物发酵在抑制产甲烷菌产生甲烷的条件 下进行，例如，pH小于6.0、或pH小于5.8、或pH小于5.6、或pH小 于5.5。在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含小于饱和浓度的溶 解甲烷。在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含小于15mg/L溶解 甲烷，或小于10mg/L、或小于5mg/L。

在一些实施方案中，在厌氧消化产生生物甲烷前，通过蒸馏、过 滤、电渗析、特异性结合、沉淀或本领域已知的其他方法从液体生物甲 烷底物中除去溶解的挥发性固体的一种或多种组分。在一些实施方案 中，在厌氧消化产生生物甲烷前从液体生物甲烷底物中除去乙醇或乳酸 盐。

在一些实施方案中，将固体底物如MSW或来自预处理木质纤维 素生物质的纤维部分同时进行酶促水解和微生物发酵以产生通过过微 生物发酵预处理的液体生物甲烷底物，使得至少40重量％的非水含 量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重 量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意 组合。在一些实施方案中，具有上述性质的液体生物甲烷底物通过 热压器过程同时进行酶促水解和微生物发酵从未分拣MSW获得的 液化的有机材料产生。在一些实施方案中，预处理的木质纤维素生 物质与酶促水解和生物发酵的MSW混合，任选以这样的方式以使 MSW衍生的生物液体的酶活性为木质纤维素底物的水解提供酶活 性以产生来源于MSW和预处理的木质纤维素生物质两者的复合液 体生物甲烷底物。

“软木质纤维素生物质”是指除了含有纤维素、半纤维素和木 质素的木材的植物生物质。可以采用任何合适的软木质纤维素生物 质，包括例如至少小麦秸秆、玉米秸秆、玉米棒、空果串、水稻秸 秆、燕麦秸秆、大麦秸秆、油菜秸秆、黑麦秸秆、高粱、甜高粱、 大豆秸秆、柳枝稷、百慕大群岛草和其它草、甘蔗渣、甜菜浆、玉 米纤维或其任意组合的生物质。木质纤维素生物质包括其他的木质 纤维素材料例如纸张、新闻用纸、纸板、或其他城市或办公废物。 木质纤维素生物质可作为来源于不同原料的材料的混合物使用，可 以是新鲜的、部分干燥的、完全干燥的或其任意组合。在一些实施 方案中，本发明的方法使用至少约10kg生物质原料来实施，或至少 100kg、或至少500kg。

在进行酶促水解和微生物预处理之前，木质纤维素生物质一般 应用本领域已知的方法预处理。在一些实施方案中，生物质通过水 热预处理。“水热预处理”是指利用水，以包含高温液体或蒸汽或 两者的热的液体、蒸汽或高压蒸汽的形式，在120℃或更高的温度下，添加或者不添加酸或其他化学物质的情况下“煮”生物质。在 一些实施方案中，木质纤维素生物质原料通过自发水解预处理。“自 发水解”是指在预处理期间通过半纤维素水解释放的乙酸进一步催 化半纤维素水解的预处理过程，且应用于任何在pH3.5-9.0进行的木质纤维素生物质水热预处理。

在一些实施方案中，经水热预处理的木质纤维素生物质分为液 体部分和固体部分。“固体部分”和“液体部分”是指在固/液分离 中经预处理的生物质的分馏。分离的液体统称为“液体部分”。含 有相当大量的不溶性固体含量的残余部分称为“固体部分”。固体部分或液体部分或两者的组合可用于实施本发明的方法或生产本发 明的组合物。在一些实施方案中，固体部分可被洗涤。

实施例1.同时进行的微生物发酵改进了未分拣MSW的酶促水解的 有机捕获

用来自于实施例5所描述的测试的生物液体样品进行实验室 规模的反应。

用于实验室规模反应的模型MSW底物采用新鲜产生以包含城 市固体废物的有机部分(定义为纤维素、动物和植物部分)来制备 (如基于Riber等，2009的Jensen等，2010所述制备)。

将模型MSW以等分试样储存于-20℃且在4℃解冻过夜。在 50ml离心管中进行反应，总反应体积是20g。将模型MSW添加至 5％干物质(DM)(以在60℃ 2天后剩余的干物质含量测量)。

用于水解的纤维素酶是Cellic CTec3(VDNI0003,Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)(CTec3)。为了调节并将pH维持为5，加入 柠檬酸盐缓冲液(0.05M)使总体积为20g。

在置于烘箱(Binder GmBH,Tuttlingen,Germany)中的Stuart Rotator SB3(转速为4RPM)上培养反应24小时。平行设置阴性对照 以评估培养期间从底物释放的干物质背景。培养后，在4℃以1350g 离心试管10分钟。然后倒出上清液，取1ml用于HPLC分析，剩余上清液和沉淀在60℃干燥2天。记录干物质重量并用于计算干物质 的分布。模型MSW中DM的转化基于这些数字计算。用装备有折 射指数检测器(

RI-101)和250nm UV检测器的UltiMate 3000 HPLC(Thermo Scientific Dionex)测量有机酸和乙醇的浓度。在Rezex RHM单糖柱(Phenomenex)上在80℃用5mM H₂SO₄作为洗脱液以 0.6ml/min的流速进行分离。用Chromeleon软件程序(Dionex)分析结 果。

为评估同时进行的发酵和水解的效果，在反应中加入2ml/20g 来自于实施例5描述的测试的生物液体(取样于十二月15日和16 日)，添加或者不添加CTec3(24mg/g DM)。

MSW中的DM转化

将上清液中发现的固体含量占总干物质的百分比测定为固体 的转化。图1表明了MSW空白、分离的酶制剂、单独接种微生物、 和微生物接种与酶的组合中的转化。结果表明与空白反应(MSW空 白)中释放的干物质背景相比，加入来自实施例5的EC12B导致明 显更高的干物质转化(Students t检验p<0.0001)。与只用CTec3水解 的反应和只加入EC12B的反应相比，加入EC12B样品诱导的同时进 行的微生物发酵和采用CTec3的酶水解导致了明显更高的干物质转 化率。

葡萄糖、乳酸盐、乙酸盐和EtOH的HPLC分析

上清液中测定的葡萄糖和微生物代谢物(乳酸盐、乙酸盐和乙 醇)的浓度如图2所示。如图所示，在模型MSW空白中这些的背景 浓度低，乳酸含量可能来自模型MSW中固有的细菌，因为用于产生 底物的材料不可能被灭菌或加热杀菌。加入CTec3的效果导致了上 清液中葡萄糖和乳酸的增加。在同时加入来自实施例5的EC12B生 物液体和CTec3的反应中发现了葡萄糖和细菌代谢物的最高浓度。 因此同时进行的发酵和水解改进了模型MSW中干物质的转化，且增 加了液体中细菌代谢物的浓度。

参考文献：Jacob Wagner Jensen,Claus Felby,Henning

Georg

Nanna Dreyer

Enzymatic processing of municipalsolid waste.Waste Management.12/2010； 30(12):2497-503。

Riber,C.,Petersen,C.,Christensen,T.H.,2009.Chemical composition ofmaterial fractions in Danish household waste.Waste Management 29,1251–1257。

实施例2.同时进行的微生物发酵改进了未分拣MSW的 的有机捕获

用未分拣MSW在专门设计的如图3所示的批式反应器中进行 测试以证实实验室规模实验中获得的结果。该实验测试为了实现同 时进行微生物发酵和酶促水解而加入包含获自实施例3细菌的生物 液体的接种微生物的效果。测试使用未分拣MSW进行。

用于小规模试验的MSW是REnescience研究开发的重点。为 使试验结果有价值，要求废物是代表性的且可再生的。

在2012年三月从Nomi I/S Holstebro收集废物。废物是来自于 各个地区的未分拣城市固体废物(MSW)。将废物切成30x30mm的 碎片用于小规模试验以及代表样品的收集。通过将切碎废物亚采样 到22升桶中对切碎废物运用抽样理论。在–18℃的冷藏箱中储存该桶直到使用。“真正的废物”由收集的八桶废物组成。再混合这些 桶的内容物并再次取样以确保尽可能低的重复间的可变性。

在相似的水、温度、转速和机械效果条件下处理所有样品。使 用六个箱子：三个没有接种，三个有接种。通过添加水将试验期间 的非水含量指定为15％非水含量。计算接种材料中的干物质，在接 种箱里新加入的水更少。在每个箱子里加入6kg MSW，和84g商购 的纤维素酶制剂CTEC3。在接种箱里加入2升接种物，相应地减少 加入的水。

分别采用添加20％NaOH以提高pH和72％H₂SO₄以降低pH 以保持接种箱的pH为5.0和非接种箱的pH为4.2。非接种箱的较低 pH有助于确保固有的细菌不会繁殖。我们之前表明，在MSW水解 中使用酶制剂CTEC3 Tm，在pH4.2-pH5.0没有区分活性的差异。在 能提供恒定旋转搅拌的实验反应器中50℃下继续反应3天。

在反应结束时，通过筛子和含有通过同时酶促水解和微生物发 酵MSW产生的液化物质的生物液体清空箱子。

测定干物质(TS)和挥发性固定(VS)。

干物质(DM)法：

样品于60℃干燥48小时。干燥前后样品重量用于计算DM百 分比。

样品DM(％)：样品干重/湿重(g)×100

挥发性固体法：

计算挥发性固体，以DM百分比减去灰含量表示。样品的灰含 量通过在燃烧炉中550℃燃烧预干燥样品至少4小时来检测。然后， 如下计算灰：

样品干物质中的灰百分比：样品灰重量(g)/样品干重(g) ×100

挥发性固体百分比：(1-样品灰百分比)×(样品DM百分比)

结果如下所示。如所示，接种箱中获得的生物液体获得了更高 的总固体含量，表明同时进行的微生物发酵和酶促水解优于单独的 酶促水解。

实施例3.同时进行的微生物发酵改进了未分拣MSW的酶促水解的 有机捕获

在丹麦哥本哈根阿玛加尔资源中心(ARC)的REnescience示 范工厂进行实验。图4显示了工厂主要特征的示意图。ARC REnescience废物冶炼厂的概念是将MSW分拣成四种产品。用于生 物气体生产的生物液体、用于回收的惰性物质(玻璃和沙)和适于 RDF生产或回收金属、塑料和树木的无机材料的2D以及3D部分。

用塑料袋收集来自大城市的MSW。将MSW运送到 REnescience废物冶炼厂并储存于筒仓中直至加工。根据MSW的特 征，在REnescience系统前可以安装分拣步骤以去除过大的颗粒(大 于600mm)。

如本实施例测试的REnescience技术包括三个步骤。第一步是 用热水温和加热(预处理，如图4所示)MSW 20-60分钟到40-75℃ 的温度范围。该加热和混合阶段打开塑料袋并提供可降解组分的充 分碎浆，以在添加酶前制备更均匀的有机相。在加热过程中调节温 度和pH使其最适于酶促水解所用的分离酶制剂。如图4所示，加入 的热水可以是干净的自来水或在洗缸中首次使用并在温和加热中再 循环的洗涤水。

第二步是酶促水解和发酵(液化，如图4所示)。在REnescience 处理的第二步骤加入酶以及可选的选定的微生物。在最适于酶性能 的温度和pH下连续进行酶促液化和发酵，驻留时间约为16小时。 通过这种水解和发酵，将MSW的生物来源部分液化为在不可降解材料间有高干物质的生物液体。pH通过加入CaCO₃控制。

如本实施例中实施的REnescience技术的第三步骤是将生物液 体与不可降解部分分开的分离步骤。在弹道分离器、洗缸和液压器 中进行该分离。弹道分离器将酶处理的MSW分离成生物液体、2D 不可降解材料部分和3D不可降解材料部分。3D部分(物理上三维物体如罐头和塑料瓶)不与大量生物液体结合，因此单一的洗涤步 骤足以清洁3D部分。2D部分(例如纺织品和箔)与大量生物液体 结合。因此，使用螺旋压力机加压、洗涤和再次加压2D部分以优化 生物液体的回收并获得“干净”和干燥的2D部分。从生物液体中筛 除沙和玻璃这样的惰性物质。所有在洗缸中使用的水都可以再循环、 加热并作为热水用于第一步骤中的加热。

本实施例中记录的试验分为三个部分，如表1所示。

表1

时间(小时)	Rodalon	温和加热的自来水/洗涤水
			27–68	+	自来水
86–124	-	自来水
			142-187	-	洗涤水

在7天的试验中，将获自丹麦哥本哈根的未分拣MSW以 335kg/h连续装载到REnescience示范工厂。在温和加热中，在进入 温和加热反应器前加入536kg/h水(自来水或洗涤水)，加热到约75℃。调节MSW温度至约50℃，通过加入CaCO₃调节pH至约4.5。

在第一部分中，在添加水中包括3g活性成分/kg MSW的表面 活性抗菌剂Rodalon^TM(苄基烷基氯化铵)。

在液化反应器中加入约14kg Cellic Ctec3(可从Novozymes商 购的纤维素酶制剂)/MSW湿吨。将温度维持在45-50℃的范围，通 过加入CaCO₃调节pH至4.2-4.5的范围。酶反应器的驻留时间是约 16小时。

在弹道分离器、液压器和洗缸的分离系统中，将生物液体(液 化的可降解材料)与不可降解材料分开。

选择性地将洗涤水倒掉、记录有机含量、或再循环并在温和加 热中再次用于湿进料MSW。洗涤水的再循环具有用50℃反应条件 下生长的生物比最初存在的生物完成更高水平的细菌接种的效果。 在所使用的过程方案中，首先将再循环的洗涤水加热到约70℃，在这种情况下，为将进料MSW置于适合酶促水解的温度而加热到约 50℃。特别对于乳酸菌，加热到70℃已经被证实提供选择性和“诱 导性”的耐热表达。

在选定的时间点从以下位置获得样品：

–通过小筛的生物液体，其称为“EC12B”；

–储罐中的生物液体；

–乳清筛之后的洗涤水；

-2D部分；

-3D部分；

–来自于两个洗涤单元的底部惰性部分。

采用储罐上的负载细胞测量生物液体的生产。采用流量计测量 输入流，采用负载细胞测量回收的或抽干的洗涤废物。

如下检查细菌数：用SPO(蛋白胨盐溶液)将选择的生物液体 样品稀释10倍，将1ml稀释液以播种深度涂在牛肉提取物琼脂 (3.0g/L牛肉提取物(Fluka,Cas.:B4888)、10.0g/L胰蛋白胨(Sigma, cas.no.:T9410)、5.0g/L NaCl(Merck,cas.no.7647-14-5)、15.0g/L琼脂(Sigma,cas.no.9002-18-0))。分别在有氧和无氧环境中在50℃培养 板。在合适的容器中进行的无氧培养通过Anoxymat吹气和加入 iltfjernende letter(AnaeroGen fromOxoid,cat.no AN0025A)维持厌氧。 16小时后计数有氧克隆数，并于24小时后再次计数。64-72小时后 量化厌氧生长的细菌。

图5表明了EC12B生物液体样品的总挥发性固体含量，以 kg/kg处理的MSW表示。通过将三个独立的实验阶段中的每一个视 为独立的时间段在实验期间的不同时间点获得点估计。因此，阶段 1(Rodalon)期间的点估计以相对于阶段1期间的质量平衡和物料流表示。如图5所示，在由于工厂困难而长期停止后启动的阶段1期间， 观察到生物液体中捕获的总固体稳步下降，与Rodalon^TM的轻微抗菌 效果一致。在阶段2期间，总捕获固体回到略高水平。在阶段3期 间，再循环为进料MSW提供有效的“接种”，生物液体kg VS/kg 上升到相当高的约12％的水平。

对于如图5所示的10个时间点上的每一个点，取生物液体 (EC12B)样品并用HPLC测定总固体、挥发性固体、溶解的挥发性固 体、和假定的细菌代谢物乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、和丙酸 盐的浓度。包括甘油浓度的这些结果如下表1所示。

表1.生物液体样品的分析

对于在10个时间点的每个点上取样的生物液体样品，图6表 明了有氧条件下的活菌计数和以溶解的挥发性固体表示的“细菌代 谢物”(指乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、和丙酸盐的总和)的 重量百分比。如同所示，细菌代谢物的重量百分比随着细菌活性的 提高而明显提高，而且与生物液体中增加的固体捕获相关。

实施例4.有助于实施例3中的同时进行的发酵的微生物鉴定

分析来自实施例3的生物液体样品的微生物组成。

通过将样品中存在的微生物种的16S rRNA基因序列与已良好 表征的种(参照种)的16S rRNA基因序列比对来鉴定样品中存在的 微生物种。种鉴定的一般截止值与参照种16S rRNA基因序列具有 97％相似性。如果相似性低于97％，它很可能是不同的种。

得到的序列在NCBI数据库中用BlastN进行查询。该数据库包 含长度至少为1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。仅包括 BLAST点击≥95％一致性的序列。

将取样的生物液体直接转移用于分析，在提取DNA前不冷冻。

总共鉴定了7个细菌种(图7)且鉴定了7个古细菌种。在细 菌种的某些情况下，亚种无法确定(嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、食淀 粉乳杆菌(L.amylovorus)、猪肠道乳杆菌(L.sobrius)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)、L.frumenti,发酵乳杆菌(L.fermentum)、L.fabifermentans、 胚芽乳杆菌(L.plantarum)、戊糖乳杆菌(L.pentosus))。

实施例5.采用同时微生物发酵和酶促水解未分拣MSW进行有机捕 获的详细分析

采用实施例1中描述的REnescience示范工厂详细研究采用同 时微生物发酵和酶促水解未分拣MSW进行的总有机捕获。

通过Econet表征来自哥本哈根的废物以确定其含量。

分析废物分析以测定含量和变化。将MSW大样品运送到进行 废物分析的EconetA/S。将初级样品缩小为约50-200kg的子样品。 将该子样品通过受过训练的人员分拣为15个不同的废物部分。记录 每个部分的重量并计算分布。

表X.废物组分占总量的(％)，在300小时测试期间用ECOnet分 析

样品	1.	2.	3.	4.	5.	6.	7.	8.	9.	平均	标准方差
													％	％	％	％	％	％	％	％	％	％
塑料包装	5.1	6.7	8.0	4.9	6.2	2.5	6.2	7.5	6.4	5.9	1.64
												塑料箔	10.8	8.6	10.7	7.9	10.1	7.8	8.8	8.5	9.5	9.2	1.13
其他塑料	0.7	0.8	0.5	0.7	1.0	0.7	1.6	0.4	0.9	0.8	0.33
												金属	2.5	3.6	2.7	2.0	2.5	2.1	3.6	2.1	3.6	2.7	0.68
玻璃	0.2	0.0	0.5	0.6	0.6	0.0	0.6	0.4	0.0	0.3	0.27
												院子废物	0.7	3.5	1.9	1.8	0.9	2.7	0.6	4.5	2.8	2.1	1.33
WEEE(电池等.)	0.7	0.1	0.6	0.4	0.7	0.8	1.1	0.1	0.5	0.6	0.33
												纸张	14.8	8.3	13.3	8.8	10.5	5.6	10.2	12.6	12.4	10.7	2.86
塑料和纸板包装	10.4	21.4	11.9	8.6	11.0	6.7	10.7	11.8	13.9	11.8	4.13
												食物废物	19.8	15.6	25.9	27.6	26.3	24.5	24.5	23.3	18.0	22.8	4.09
尿片	8.0	10.3	6.9	18.8	8.1	25.1	15.2	10.1	14.0	12.9	6.00
												脏纸	8.5	6.7	7.3	7.4	8.5	8.6	7.9	5.7	6.3	7.4	1.03
细屑	9.7	2.5	4.2	2.1	4.5	4.7	2.7	7.0	4.9	4.7	2.40
												其他可燃物	2.0	0.9	0.8	1.2	1.8	0.7	0.7	2.2	0.8	1.2	0.61
其他不可燃物	6.2	11.1	5.0	7.3	7.2	7.6	5.6	3.7	6.2	6.7	2.07
												总和	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100.0

废物的组成经常变化，表2所显示的是在300小时内收集的不 同样品的废物分析结果。在作为影响可捕获有机材料含量的所有部 分的尿片、塑料和纸板包装和食物废物中观察到最大变化。

在“300小时测试”的整个过程中，平均“捕获”生物可降解 材料以kg VS/kg处理的MSW表示，为0.156kg VS/kg送入的MSW。

当工厂处于稳定运行期间，在实验过程中的各个时间点取生物 液体的代表性样品。通过HPLC分析样品以测定如实施例3所述的 挥发性固体、总固体和溶解的固体。结果如下表2所示。

表2.生物液体样品分析

实施例6.有助于实施例5中同时进行的发酵的微生物鉴定

从实施例5所述测试期间于2012年12月15日和16日取出生 物液体“EC12B”样品并储存于-20℃以便于为鉴定样品中的微生物 进行的16S rDNA分析。16S rDNA分析基于核糖体小亚基的16S组 件而广泛应用于原核生物的鉴定和系统发育分析。将干冰上的冷冻 样品运送至进行16S rDNA分析(GATC_Biotech)的GATC Biotech AB,Solna,SE。该分析包括：提取基因组DNA，用跨越高变区域V1 到V3的通用引物对(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R: ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)制备扩增子文库，用GS FLX 适配子PCR标记，在基因组测序仪FLX仪器上测序以获得每个样品 104.000-160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项 目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库 包含长度为至少1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前 的Release(RDPRelease10，2012年9月19日更新)包含9162种细 菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击 (序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。

一共鉴定了226个不同的细菌。

EC12B样品中的优势菌是一种产丙酸盐的细菌Paludibacter propionicigenesWB4(Ueki等，2006)，其占总鉴定细菌的13％。图8 显示了鉴定的13种优势菌(Paludibacterpropionicigenes WB4、 Proteiniphilum acetatigenes、欧洲放线菌(Actinomyceseuropaeus)、 Levilinea saccharolytica、Cryptanaerobacter phenolicus、Sedimentibacter hydroxybenzoicus、植物发酵梭菌ISDg菌株(Clostridiumphytofermentans ISDg)、Petrimonas sulfuriphila、乳酸发酵梭菌(Clostridiumlactatifermentans)、Clostridium caenicola、Garciella itratireducens、局限 脱卤杆菌DSM 9455(Dehalobacter restrictus DSM 9455)、Marinobacter lutaoensis)的分布。

在属水平上比较鉴定的细菌表明，梭菌(Clostridium)、 Paludibacter、Proteiniphilum、放线菌(Actinomyces)和Levilinea(均为厌 氧菌)代表了大约一半鉴定的属。乳杆菌(Lactobacillus)属占鉴定细 菌的2％。优势菌种P.propionicigenes WB4在EC12B样品中属于第 二大优势属(Paludibacter)。

EC12B样品中的优势病原菌是链球菌(Streptococcus spp.)， 其占总鉴定细菌的0.028％。在生物液体中未发现任何孢子形成的病 原菌。

链球菌是实施例5的生物液体中存在的唯一病原菌。链球菌具 有(非孢子形成)的最高的耐温性和D值，表明在给定温度下将活 链球菌细胞数减少十倍所需的时间量高于Déportes等(1998)报道的 MSW中任何其他病原菌。这些结果表明实施例5中所用条件能够将REnescience过程分拣期间的MSW消毒至只有链球菌存在的水平。

生物间对营养物的竞争，和在过程中温度的升高将明显降低病 原生物的数量，且如上所述消除REnescience过程中分拣MSW中病 原体的存在。其他因素如pH、a_w、耐氧量、CO₂、NaCl、和NaNO₂也影响生物液体中病原菌的生长。以上提及因素之间的相互作用可 能减少过程中降低活细胞数量所需的时间和温度。

实施例7.通过同时微生物发酵和酶促水解获自遥远地理位置的未 分拣MSW进行有机捕获的详细分析

采用实施例3中描述的REnescience示范工厂处理从荷兰进口 的MSW。发现该MSW含有以下组成：

表Y：废物组分占总量的(％)，在van Gansewinkel测试中采用ECOnet 分析。

该材料进行如实施例3和实施例5中描述的同时酶促水解和微 生物发酵并在工厂运行中测试3天。在各个时间点获得生物液体样 品并表征。结果如表3所示。

表3.生物液体的分析

根据干燥期间损失的乳酸盐用9％校正溶解的VS。

实施例8.采用获自同时微生物发酵和酶促水解未分拣MSW的生物 液体的生物甲烷生产

将实施例5描述的实验中获得的生物液体冷冻于20升桶内并 储存于-18℃以备后用。采用两个相同的充分准备的固定过滤厌氧消 化系统测试该材料的生物甲烷生产，所述系统包含固定在过滤支持 物上的生物膜内的厌氧消化群体。

初始样品是在反应器内采集的进料和液体。在DR2800分光光 度计上通过HACHLANGE试管测试测定VFA、tCOD、SCOD和氨 浓度，并每天用HPLC测定具体的VFA。还通过重量法测定TSVS 测量。每天采集用于GC分析的气体样品。通过测量进料罐的顶空 体积和反应器的流出物排放量进行进料速度的证实。过程期间的取 样通过用注射器采集液体或流出物进行。

采用两个消化系统观察到10周的稳定的生物气体生产，对应 于0.27-0.32L/gCOD、或R-Z L/g VS。

在两个系统中的一个中断生物液体进料且监测到回到基线，如 图9所示。水平线2表示稳定的气体生产水平。垂直线3表示中断 进料的时间点。如同所示，稳定运行数月后，在垂直线3和4所示 的时间段期间仍有残留的被转化的弹性材料。垂直线4之后的时间 段表示回到基线或“下降”。基线期后，在垂直线1所示的点再次 开始进料。垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产 或“上升”。

从生物液体生产气体的参数(包括如所述测量的“上升”和“下 降”)如下所示。

*上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。

**下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。

***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生 产。

****按背景气体生产的2L/天校正。

实施例9.采用具有和不具有同时存在的微生物发酵的未分拣MSW 的酶促水解获得的生物液体的比较的生物甲烷生产

采用实施例8所述的固定过滤厌氧消化系统比较实施例2的 “高乳酸盐”和“低乳酸盐”生物液体的生物甲烷生产。如实施例8 所述获得测量结果并测定“上升”和“下降”时间。

图10显示了“高乳酸盐”生物液体的“上升”和“下降”。 水平线2表示稳定的气体生产水平。垂直线1表示进料开始的时间 点。垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产或“上 升”。垂直线3表示中断进料的时间点。垂直线3到垂直线4所示 的时间段表示回到基线或“下降”。

图11显示了“低乳酸盐”生物液体的相同特性，其中相关点 如图11所述。

来自“高乳酸盐”和“低乳酸盐”生物液体的气体生产的比较 参数(包括如所述测量的“上升”和“下降”)如下所示。

“上升”/“下降”时间的不同表明生物降解能力的容易度不 同。最快的可生物转化的生物质最终将具有最高的生物气体生产应 用中的总有机转化率。并且，“较快的”生物甲烷底物更适于非常 快速厌氧消化系统例如固定过滤消化器的转化。

如同所示，“高乳酸盐”生物液体在生物甲烷生产中表现出快 得多的“上升”和“下降”时间。

*上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。

**下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。

***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生 产。

****按背景气体生产的2L/天校正。

实施例11.采用通过同时微生物发酵和酶促水解水热预处理的小麦 秸秆获得的生物液体的生物甲烷生产

预处理小麦秸秆，分成纤维部分和液体部分，然后单独洗涤纤 维部分。然后将5kg经洗涤的纤维在含有Cellic CTEC3剂量和从实 施例3获得的细菌组成的发酵微生物的卧式旋转鼓反应器内培养。 将小麦秸秆在50℃下进行同时水解和微生物发酵3天。

然后采用实施例8所述的固定过滤厌氧消化系统测试该生物 液体的生物甲烷生产。如实施例8所述获得测量结果的“上升”时 间。

图12显示了水解的小麦秸秆生物液体的“上升”特征。水平 线2表示稳定的气体生产水平。垂直线1表示进料开始的时间点。 垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产或“上升”。

来自小麦秸秆水解的生物液体的气体生产参数如下所示。

如同所示，预处理的木质纤维素生物质也可容易地用于实践本 发明的生物气体生产方法和产生新型生物甲烷底物。

*上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。

**下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。

***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生 产。

****按背景气体生产的2L/天校正。

实施例12.通过选择的生物同时微生物发酵和酶促水解MSW

用特定单培养细菌对模型MSW(如实施例1所述)在实验室 规模内同时进行微生物发酵和酶促水解反应，操作流程如实施例1 所述。反应条件和酶剂量如表4所示。

用活菌株淀粉乳杆菌(DSMZ No.20533)和丙酸丙酸杆菌 (propionibacteriumacidipropionici)(DSMZ No.20272)(DSMZ,不伦瑞 克,德国)(储存于4℃ 16小时直至使用)作为接种物以测定其对于含 或不含CTec3的模型MSW的干物质转化中的效果。产生的主要代 谢物分别是乳酸和丙酸。采用HPLC过程检测这些代谢物的浓度(如 实施例1所述)。

因为丙酸丙酸杆菌是厌氧菌，用气态氮净化该菌株反应所用的 缓冲液，并将活培养物接种至也用气态氮净化的移动厌氧箱(Atmos Bag,Sigma Chemical CO,St.Louis,MO,US)内的反应管中。含有P. propionici的反应管在转移到培养箱前关闭。用1mlP.propionici或L. amylophilus接种该反应。

表4所示结果明确表明产生了预期的代谢物；用P. acidipropionic接种的反应中检测到丙酸，而包含含或不含CTec3的 模型MSW的对照中没有检测到丙酸。仅加入模型MSW的对照反应 中的乳酸浓度几乎与仅加入L.amylophilus的反应相同。对照反应中的 乳酸生产归因于模型MSW中固有的细菌。由于模型废物的单个组分 是冷冻的但在制备模型MSW前没有经过任何进一步灭菌的新鲜产 品，预期了某些背景细菌。当同时加入L.amylophilus和CTec3时， 乳酸浓度几乎翻倍(表4)。

水解后将DM释放到上清液的积极效果通过与CTec3同时加 入L.amylophilus或P.propionici的反应中较高的DM转化来证实(与 仅加入CTec3的反应相比增加了30-33％)。

表4.实验室规模测试的单独或同时进行酶促水解的细菌培养 物。显示了温度、pH、和CTec3的剂量96mg/g。在含或不含CTec3 的缓冲液中平行进行MSW对照反应以评估反应中细菌代谢物的背 景(除了进行一次的MSW对照外，显示了4个反应的平均值和标准 方差)。

Nd.未检测，低于检测限。

实施例13.有助于实施例7的同时进行的发酵的微生物鉴定

在实施例7所述测试期间取出生物液体“EC12B”样品和再循 环水“EA02”样品(于3月21日和22日取样)。将该液体样品在 10％甘油中冷冻，并储存于-20℃以便于为鉴定样品中的微生物进行 的16S rDNA分析，该16S rDNA分析基于其核糖体小亚基的16S组 件而广泛应用于原核生物的鉴定和系统发育分析。将干冰上的冷冻 样品运送至进行16S rDNA分析(GATC_Biotech)的GATC Biotech AB,Solna,SE。该分析包括：

提取基因组DNA，用跨越高变区域V1到V3的通用引物对 (27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R: ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)制备扩增文库，用GS FLX 适配子PCR标记，在基因组测序仪FLX仪器上测序以获得每个样品 104.000-160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项 目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库 包含长度为至少1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前 的Release(RDP Release 10，2012年9月19日更新)包含9162种 细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点 击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。

在样品EC12B-21/3、EC12B-22/3和EA02B 21/3、EA02-22/3 中一共鉴定了452、310、785、594个不同的细菌。

分析清楚地表明，在种水平上，迄今为止淀粉乳杆菌是最优势 菌，占检测的全部微生物的26％-48％。EC12B样品中的微生物是相 似的，13种优势菌(淀粉乳杆菌DSM11664、德氏乳杆菌属德氏亚 种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、噬淀粉乳杆菌 (Lactobacillus amylovorus)、德氏乳杆菌属紫檀亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp indicus)、Lactobacillus similis JCM 2765、德氏乳杆菌 属乳酸亚种DSM20072(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis DSM 20072)、凝固芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、加氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、类布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)、胚芽乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pontis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri))的分布比较 两个不同取样日事实上相同。

EA02样品与EC12B相似，尽管L.amylolyticus优势较弱。13 种优势菌(淀粉乳杆菌DSM11664、德氏乳杆菌属德氏亚种、噬淀粉 乳杆菌、德氏乳杆菌属乳酸亚种DSM20072、Lactobacillus similis JCM 2765、德氏乳杆菌属紫檀亚种、类胚芽乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、加纳魏斯氏菌(Weissella ghanensis)、寡糖发酵乳杆菌LMG22743(Lactobacillus oligofermentans LMG 22743)、贝宁魏斯氏菌 (Weissellabeninensis)、Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811,Weissella soli、类胚芽乳杆菌)的分布也很相似，除了在13种优势细菌种中有 适冷假单胞菌14-3(Pseudomonasextremaustralis 14-3)的存在。之前从 南极州的临时池塘分离出EA02(21/3)中发现的该假单胞菌，且其应 能够从辛酸盐和葡萄糖产生聚羟基脂肪酸酯(PHA)(Lopez等，2009；Tribelli等，2012)。

在属水平上比较结果表明，乳杆菌(Lactobacillus)占样品中鉴定 细菌的56-94％。再一次，EC12B和EA02的两个取样日之间属的分 布极其相似。有趣的是，在EA 02样品中，魏斯氏菌(Weisella)、明 串珠菌(Leuconostoc)和假单胞菌(Pseudomonas)属大量存在(1.7-22％)， 但在EC12B样品中却只占较小构成部分(>0.1％)。魏斯氏菌(Weisella) 和明串珠菌(Leuconostoc)与乳杆菌一样都属于乳杆菌目。

实施例7所述检测期间取样的EC12B和EA02中优势病原菌 分别占鉴定的总细菌的0.281-0.539％和0.522-0.592％。EC12B样品 中的优势病原菌是气单胞菌(Aeromonasspp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、布鲁氏菌(Brucella sp.)、枸橼酸杆菌(Citrobacter spp.)、产气荚 膜梭菌(Clostridium perfrigens)、Klebsiells sp.、变形杆菌(Proteus sp.)、 普罗威登斯菌(Providencia sp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、志贺菌(Shigellae spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。在实施例7中描述的EC12B和EA02中未检测到孢子形成 的病原菌。EC12B和EA02中检测到的病原菌总量随时间下降， EC12B中的总细菌数在一天内几乎消失。

Déportes等(1998)概述了已知在MSW中存在的病原菌。表5 显示了实施例3、5和7所述的MSW中存在的病原菌(Déportes等 (1998)和16S rDNA分析)。除Déportes等(1998)描述的病原菌外，从 实施例7所述测试期间取样的EC12B和EA02中还发现Proteua sp. 和普罗威登斯菌(Providencia sp.)。然而，这里不存在实施例5的生物 液体中唯一存在的病原菌，链球菌。这表明在实施例7的EC12B和 EA02中存在其他细菌群体，这可能归因于生物间对营养物的竞争以 及将更促进其他细菌群体的生长的在过程期间温度的略微下降。

表5.实施例3、5和7中存在的病原体综述

菌株鉴定和DSMZ保藏

将3月21日和22日从实施例7所述测试期间取出的EA02样 品送到生物持续性诺北欧中心(NN中心)(赫斯霍尔姆，丹麦)涂 板以鉴定并获得分离细菌的单一培养。在到达NN中心后，将样品 于50℃培养过夜，然后在不同板上(GM17,胰蛋白大豆培养基和 牛肉提取物(GM17琼脂:48.25g/L m17琼脂高温灭菌20分钟后加 入葡萄糖至最终浓度为0.5％,胰蛋白大豆琼脂:30g/L胰蛋白大豆 培养基,15g/L琼脂,添加15g/L琼脂的牛肉培养基(国立血清研究 所，哥本哈根，丹麦))涂板，并于50℃有氧生长。一天后，肉眼 检查板，将选定的克隆再次涂到相应板上并送到DSMZ进行鉴定。

从EA02再循环水中分离的以下菌株已在德国伯伦斯威克 DSMZ的DMSZ进行专利保藏：

鉴定的样品

样品ID：13-349沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)源自于(EA02-21/3), DSM27312，于2013年06月11日保藏于DSMZ。

样品ID：13-352短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)源自于(EA02-22/3), DSM27314，于2013年06月11日保藏于DSMZ。

样品ID：13-353枯草芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.subtilis)源自于(EA02-22/3),DSM 27315，于2013年06月11日保藏 于DSMZ。

样品ID：13-355地衣杆菌(Bacillus licheniformis)源自于(EA02-21/3), DSM27316，于2013年06月11日保藏于DSMZ。

样品ID：13-357牛放线菌(Actinomyces bovis)源自于(EA02-22/3), DSM 27317，于2013年06月11日保藏于DSMZ。

未鉴定的样品

样品ID：13-351源自于(EA02-22/3),DSM 27313，于2013年06月11 日保藏于DSMZ。

样品ID：13-362A源自于(EA02-22/3),DSM 27318，于2013年06月 11日保藏于DSMZ。

样品ID：13-365源自于(EA02-22/3),DSM 27319，于2013年06月11 日保藏于DSMZ。

样品ID：13-367源自于(EA02-22/3),DSM 27320，于2013年06月 11日保藏于DSMZ。

参考文献

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GATC_Biotech supporting material.Defining the Microbial Compositionof Environmental Samples Using Next Generation Sequencing.Version 1.Tribelli,P.M.,Iustman,L.J.R.,Catone,M.V.,Di Martino,C.,Reyale,S., Méndez,B.S.,López,N.I.(2012).Genome Sequence of the Polyhydroxybutyrate ProducerPseudomonas extremaustralis,a Highly Stress-Resistant AntarcticBacterium.J.Bacteriol.194(9):2381.

Nancy I.López,N.I.,Pettinari,J.M.,Stackebrandt,E.,Paula M.Tribelli,P.M.,

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实施方式和实施例仅是代表性的，并不意欲限制权利要求的范 围。

Claims (17)

1.处理城市固体废物(MSW)或未分拣MSW的方法，包括以下步骤：

(i)提供MSW，

(ii)在适于酶促水解的温度下采用纤维素酶活性酶促水解同时微生物发酵MSW的可生物降解部分，使得废物的可生物降解部分液化且微生物代谢产物积聚，然后

(iii)分拣废物中液化的可生物降解部分与不可降解固体，以产生生物液体，其中至少25或40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合；任选地，然后

(iv)厌氧消化所述生物液体以产生生物甲烷，

其中，同时进行的微生物发酵通过MSW中天然存在的细菌来实现。

2.根据权利要求1所述的方法，其中同时进行的微生物发酵通过一种或多种选自乳酸菌、产乙酸盐菌、产乙醇菌、产丙酸盐菌或产丁酸盐菌的菌种来实现。

3.根据权利要求1所述的方法，其中分拣所述废物中液化的可生物降解部分与不可降解固体通过采用至少两步足以提供具有至少0.10kg挥发性固体/kg处理的MSW的生物液体的分离操作来实现。

4.生产生物甲烷的方法，包括以下步骤：

(i)提供通过过微生物发酵预处理的有机液体生物甲烷底物，使得至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合，

(ii)将该液体底物转移到厌氧消化系统中，然后

(iii)进行该液体底物的厌氧消化以产生生物甲烷。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物发酵在pH小于5.5的条件下进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述有机液体生物甲烷底物通过同时酶促水解和微生物发酵未分拣MSW而产生。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述有机液体生物甲烷底物通过同时酶促水解和微生物发酵预处理的木质纤维素生物质而产生。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述有机液体生物甲烷底物通过压热器法通过同时酶促水解和微生物发酵获自未分拣MSW的液化有机材料而产生。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述有机液体生物甲烷底物包含至少8％总固体。

10.根据权利要求4所述的方法，其中所述厌氧消化系统是固定过滤厌氧消化器。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述酶促水解和微生物发酵在30-75℃或45-50℃的温度范围内进行。

12.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物甲烷底物中至少40重量％的溶解的挥发性固体包含乳酸盐，和/或其中所述生物甲烷底物在25℃下包含小于15mg/L的溶解的甲烷含量。

13.根据权利要求4所述的方法，其中所述液体生物甲烷底物通过水热预处理木质纤维素生物质产生和/或在pH为3.5-9.0以及温度为120℃或更高预处理所述木质纤维素生物质。

14.通过酶促水解和微生物发酵预处理的木质纤维素生物质而产生的有机液体生物甲烷底物，其特征在于，至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合。

15.根据权利要求14所述的液体生物甲烷底物，包含至少8％的总固体含量。

16.根据权利要求14所述的液体生物甲烷底物，在25℃下包含小于15mg/L的溶解的甲烷含量。

17.根据权利要求14所述的液体生物甲烷底物，包含至少10％的总固体含量。

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