BR112015030765B1

BR112015030765B1 - Método de processamento de resíduo sólido urbano (msw)

Info

Publication number: BR112015030765B1
Application number: BR112015030765-5A
Authority: BR
Inventors: Georg Ørnskov Rønsch; Jacob Wagner Jensen; Sebastian Buch Antonsen
Original assignee: Renescience A/S
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2021-08-03
Also published as: WO2013185777A4; JP2015521533A; KR20150028812A; NZ702906A; TN2014000481A1; CA3095401A1; AU2013275760B2; EP2859106A1; DK3008193T3; IL236158A0; MY180118A; CA2874549C; EA033645B1; EA201590010A1; WO2013185777A1; CN113403344A; MX2014015231A; CA3095401C; PH12014502712A1; UA119635C2

Abstract

método de processamento de resíduo sólido urbano (msw), e pasta fluida de componentes biodegradáveis métodos de processamento de msw não separado são providos utilizando fermentação microbiana com bactéria de ácido láctico isoladamente ou em combinação com atividade de enzima celulase adicionada. componentes biogênicos do msw são hidrolizados suficientemente, de modo que uma pasta fluida biodegradável possa ser separada facilmente de componentes não degradáveis. a pasta fluida biodegradável recuperada provê um substrato de biometano rápido e aprimorado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere, em geral, a métodos de processamento de resíduos sólidos e, em particular, a métodos que contam com fermentação microbiana.

[002] Os resíduos sólidos urbanos (MSW), particularmente incluindo resíduos domésticos familiares, resíduos de restaurantes e instalações de processamento de comida e resíduos de edifícios de escritórios compreendem um componente muito grande de material orgânico que pode ser adicionalmente processado em energia, combustíveis e outros produtos úteis. Atualmente, somente uma pequena fração do MSW disponível é reciclada, sendo que a grande maioria é despejada em aterros.

[003] Um interesse considerável surgiu no desenvolvimento de métodos eficazes e ecológicos para processar resíduos sólidos, para maximizar a recuperação de seu potencial de energia inerente e também a recuperação de materiais recicláveis. Um desafio significativo no processamento de “resíduo em energia” tem sido a natureza heterogênea do MSW. Os resíduos sólidos compreendem tipicamente um componente considerável de material orgânico degradável misturado com plásticos, vidro, metais e outros materiais não degradáveis. Os resíduos não separados podem ser diretamente usados na incineração, conforme é amplamente praticado em países tais como Dinamarca e Suécia, que dependem de sistemas de aquecimento de distrito. (Strehlik 2009). Entretanto, os métodos de incineração são associados a consequências ambientais negativas e não alcançam a reciclagem eficaz de matérias-primas. O uso limpo e eficaz do componente degradável do MSW combinado com a reciclagem exige tipicamente algum método de separação para separar o material degradável do não degradável.

[004] O componente degradável do MSW pode ser usado no processamento de “resíduo em energia” com o uso de ambos os métodos termoquímico e biológico. O MSW pode ser submetido à pirólise e outros modos de gaseificação termoquímica. Os resíduos orgânicos termicamente decompostos a temperatura extremamente altas produzem componentes voláteis tal como alcatrão e metano assim como um resíduo sólido ou “coque” que pode ser queimado com menos consequências tóxicas do que aquelas associadas à incineração direta. Alternativamente, os resíduos orgânicos podem ser termicamente convertidos em “syngas” que compreende monóxido de carbono, dióxido de carbono e hidrogênio que podem ser adicionalmente convertidos em combustíveis sintéticos. Consulte, por exemplo, Malkow 2004 para revisão.

[005] Os métodos biológicos para a conversão de componentes degradáveis de MSW incluem a fermentação para produzir produtos finais úteis, tal como etanol. Consulte, por exemplo, os documentos no WO2009/150455; WO2009/095693; WO2007/036795; Ballesteros et al. 2010; Li et al 2007.

[006] Alternativamente, a conversão biológica pode ser alcançada pela digestão anaeróbica para produzir biometano ou “biogás”. Consulte, por exemplo, Hartmann e Ahring 2006 para revisão. O componente orgânico pré-separado do MSW pode ser convertido em biometano diretamente, consulte, por exemplo, o documento no US2004/0191755 ou após um processo de “polpação” comparativamente simples que envolve a moagem na presença de água adicionada, consulte, por exemplo, o documento no US2008/0020456.

[007] Entretanto, a pré-separação do MSW para obter o componente orgânico é tipicamente custosa, ineficaz ou impraticável. A separação por fonte exige uma infraestrutura e despesas operacionais grandes assim como a participação e suporte ativos da comunidade da qual os resíduos são coletados - uma atividade que se mostrou difícil de alcançar nas sociedades urbanas modernas. A separação mecânica é tipicamente de capital intensivo e adicionalmente associada a uma grande perda de material orgânico, na ordem de pelo menos 30% e frequentemente muito maior. Consulte, por exemplo, Connsonni 2005.

[008] Alguns desses problemas com sistemas de separação foram evitados com sucesso por meio do uso da liquefação de componentes orgânicos degradáveis no resíduo não separado. O material orgânico liquefeito pode ser prontamente separado dos materiais não degradáveis. Uma vez liquefeito em uma pasta fluida bombeável, o componente orgânico pode ser prontamente usado em processos de conversão termoquímica ou biológica. A liquefação de componentes degradáveis foi amplamente relatada com o uso de processos de “autoclave” de alta pressão e alta temperatura, consulte, por exemplo, os documentos no US2013/0029394; US2012/006089; US20110008865; WO2009/150455; WO2009/108761; WO2008/081028; US2005/0166812; US2004/0041301; US 5427650; US 5190226.

[009] Uma abordagem radicalmente diferente para a liquefação de componentes orgânicos degradáveis é que isso pode ser alcançado com o uso do processo biológico, especificamente por meio da hidrólise enzimática, consulte Jensen et al. 2010; Jensen et al. 2011; Tonini e Astrup 2012; WO2007/036795; WO2010/032557.

[010] A hidrólise enzimática oferece vantagens únicas sobre métodos de “autoclave” para a liquefação de componentes orgânicos degradáveis. Com o uso da liquefação enzimática, o processamento de MSW pode ser conduzido de uma maneira contínua, com o uso de equipamento relativamente não custoso e reações não pressurizadas executadas a temperatura comparativamente baixas. Em contraste, os processos de “autoclave” devem ser conduzidos em modo em batelada e envolvem geralmente custos de capital muito maiores.

[011] Uma necessidade percebida de “esterilização” de modo a reduzir possíveis riscos de saúde representados por microrganismos patogênicos gerados em MSW foi um tema predominante no suporte da predominância dos métodos de liquefação de “autoclave”. Consulte, por exemplo, os documentos no WO2009/150455; WO2000/072987; Li et al. 2012; Ballesteros et al. 2010; Li et al. 2007. Similarmente, acreditava-se anteriormente que a liquefação enzimática exigia o pré-tratamento térmico a uma temperatura comparativamente alta de pelo menos 90 a 95 °C. Essa temperatura alta foi considerada essencial, em parte para efetuar uma “esterilização” de MSW não separado e também de modo que os componentes orgânicos degradáveis possam ser amolecidos e os produtos de papel “polpados”. Consulte Jensen et al. 2010; Jensen et al. 2011; Tonini e Astrup 2012.

[012] Foi revelado que a liquefação enzimática segura do MSW não separado utilizando preparações de celulase isolada pode ser alcançada sem o pré-tratamento de alta temperatura. De fato, contrário às expectativas, o pré- tratamento de alta temperatura não é apenas desnecessário, mas pode ser ativamente prejudicial, já que ele mata microrganismos ambientais que estão se desenvolvendo no resíduo. A promoção da fermentação microbiana concomitantemente com a hidrólise de celulase em condições termofílicas tipicamente entre 45 e 55 °C melhora a “captura de biodegradável” ou com o uso de microrganismos “ambientais” ou com o uso de organismos seletivamente “inoculados”. Isto é, a fermentação microbiana termofílica concomitante aumenta de modo seguro o rendimento orgânico de “pasta fluida biodegradável” que é recuperada. Sob essas condições, os microrganismos patogênicos tipicamente encontrados no MSW não se desenvolvem. Consulte, por exemplo, Hartmann e Ahring 2006; Deportes et al. 1998; Carrington et al. 1998; Bendixen et al. 1994; Kubler et al. 1994; Six e De Baerre et al. 1992. Sob essas condições, os patógenos gerados em MSW típicos são facilmente superados pelas bactérias de ácido láctico abundantes e outros organismos seguros.

[013] Adicionalmente à melhora da “captura de biodegradável” a partir da hidrólise enzimática utilizando preparações de celulase isoladas, a fermentação microbiana concomitante que usa qualquer combinação de bactérias de ácido láctico ou microrganismos que produzem acetato, etanol, formato, butirato, lactato, pentanoato ou hexanoato “precondiciona” a pasta fluida biodegradável, de modo a torná-la mais eficaz como um substrato para a produção de biometano. A fermentação microbiana produz pasta fluida biodegradável tendo que tem uma porcentagem geralmente aumentada de sólidos dissolvidos em comparação aos sólidos suspensos, em relação à pasta fluida biodegradável produzida por liquefação enzimátida utilizando preparações de celulase isolada isoladamente. Polissacarídeos de cadeia superior são, de modo geral, mais completamente degradados devido ao “pre- condicionamento” microbiano. A fermentação microbiana e a hidrólise enzimática concomitantes degradam biopolímeros em substratos prontamente utilizáveis e, ademais, alcança a conversão metabólica de substratos primários em ácidos carboxílicos de cadeia curta e/ou etanol. O biodegradável resultante que compreende uma alta porcentagem de metabólitos microbianos provê um substrato de biometano que evita eficazmente a taxa que limita a etapa de “hidrólise”, consulte, por exemplo, Delgenes et al. 2000; Angelidaki et al. 2006; Cysneiros et al. 2011, e que oferece vantagens adicionais para a produção de metano, particularmente, com o uso de sistemas de digestão anaeróbica de “filtro fixo” muito rápidos.

[014] Surpreendentemente, liquefação suficiente de componentes de MSW não separado degradáveis antes da separação de material não degradável pode ser alcançada dentro de um tempo de processamento relativamente curto, tipicamente, 36 horas ou menos, por fermentação microbiana isoladamente, sem qualquer necessidade por preparações de celulase isoladas. Um substrato de biometano “rápido” aprimorado compreendendo um alto grau de sólidos dissolvidos e metabólitos bacterianos pode ser alcançado, mesmo quando a separação inicial de material não degradável for alcançada por fermentação microbiana isoladamente, pelo simples recurso de fermentação continuada da pasta fluida biodegradável recuperada após a separação inicial de sólidos não degradáveis.

REVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015] Figura 1. Ilustração esquemática de aspectos principais da usina de demonstração.

[016] Figura 2: Soma de concentração de lactato, acetato e etanol na pasta fluida biogênica obtida com e sem atividade de celulase suplementar provida por preparações de enzima isoladas.

[017] Figura 3. Captura de biodegradável em kg de TS/kg de resíduo (A). Em pasta fluida biogênica após peneiras de 3 mm. (B) Captura total incluindo material retido pelas peneiras.

[018] Figura 4. Degradação de substratos celulósicos e MSW modelo por inóculo microbiano e CTEC3.

[019] Figura 5. Degradação comparativa de fração celulósica de MSW modelo por inóculo microbiano e CTEC3.

[020] Figura 6. Conversão de matéria seca em hidrólise enzimática concomitante com CTEC3 e fermentação microbiana.

[021] Figura 7. Metabólitos bacterianos recuperados em sobrenadante após a hidrólise enzimática concomitante com CTEC3 e fermentação microbiana.

[022] Figura 8. Apresentação gráfica do reator de teste REnescience.

[023] Figura 9. Captura de biodegradável em pasta fluida biogênica durante diferentes períodos de tempo expressa como kg VS por kg de MSW processado.

[024] Figura 10. Metabólitos bacterianos em pasta fluida biogênica e contagens bacterianas aeróbicas em diferentes pontos no tempo.

[025] Figura 11. Distribuição de espécies bacterianas identificadas na pasta fluida biogênica do exemplo 7.

[026] Figura 12. Distribuição das 13 bactérias predominantes na pasta fluida biogênica do exemplo 9.

[027] Figura 13. Rampa para cima e rampa para baixo de produção de biometano com o uso de pasta fluida biogênica do exemplo 9.

[028] Figura 14. Caracterização de rampa para cima e rampa para baixo de produção de biometano do biolíquido de “alto teor de lactato” do exemplo 6.

[029] Figura 15. Caracterização de rampa para cima e rampa para baixo de produção de biometano do biolíquido de “baixo teor de lactato” do exemplo 6.

[030] Figura 16. Caracterização de rampa para cima de produção de biometano do biolíquido de palha de trigo hidrolisado.

[031] DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES

[032] Em algumas realizações, a invenção provê um método de processamento de MSW compreendendo as etapas de - provisão de um fluxo de MSW não separado a um reator de fermentação microbiana em que o MSW é fermentado com agitação em um teor não aquoso entre 10 e 50% em peso e em uma temperatura entre 35 e 75 graus por um período entre 1 e 72 horas sob condições suficientes para manter uma concentração de bactérias de ácido láctico vivas de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L, e - remoção de um fluxo de MSW não separado fermentado do reator e submeter este a uma etapa de separação pela qual os sólidos não degradáveis são removidos para prover uma pasta fluida de componentes biodegradáveis.

[033] Cepas que ocorrem naturalmente de Bactéria de Ácido láctico (LAB) presentes no resíduo foram apresentadas anteriormente para prover conversão eficaz, em lactato, de resíduos de cozinha modelo compreendendo frutas, vegetais, grãos, carne, peixe e similares. Consulte Sakai et al. 2000; Sakai et al. 2004; Akao et al. 2007a; Akao et al. 2007b. Não foi necessário nenhum procedimento de inoculação particular para produzir uma fermentação de lactato eficaz dos resíduos - eles foram simplesmente moídos em um volume igual de água, então, aquecidos a temperaturas entre 37 e 55 °C. Uma comunidade de cepas que ocorrem naturalmente tipicamente emergia, com uma ou outras espécies emergindo como dominantes claramente. Consulte Sakai et al. 2004. Entretanto, a fim de facilitar processamento em grande escala, é vantajoso manter os tempos de fermentação os mais curtos possíveis durante a etapa inicial antes da remoção de sólidos não degradáveis. Alguma degradação por atividade de enzima derivada microbianamente deve ser geralmente alcançada antes da separação de sólidos não degradáveis. Idealmente, o componente biodegradável do MSW é liquefeito antes da separação, o que significa que uma degradação suficiente ocorreu, de modo que a pasta fluida de sólidos dissolvidos e não dissolvidos seja bombeável.

[034] Quando fermentações de ácido láctico forem conduzidas utilizando substratos que incluem uma grande porcentagem de materiais celulósicos e lignocelulósicos, preparações de enzima de celulase isolada foram tipicamente utilizadas para promover hidrólise de celulase simultaneamente com fermentação utilizando bactéria de ácido láctico. Consulte, por exemplo, Abe e Takagi 1990; Parajo et al. 1997; Chen e Lee 1997; Schmidt e Padukone 1997. Ainda, muitas espécies de LAB, incluindo quase todas as espécies de Lactobaccillus testadas e muitas espécies de Pediococcus foram apresentadas por exibirem atividade de celulase extra- celular. Consulte, por exemplo, Yang et al. 2001; Matthews et al. 2004; Matthews et al. 2006; Gao et al. 2008. Assim, é possível praticar métodos da invenção utilizando uma fermentação microbiana compreendendo principal ou, até, isoladamente LAB e, independentemente, alcançar níveis eficazes de atividade de celulase.

[035] Qualquer resíduo sólido adequado pode ser utilizado para praticar métodos da invenção. Conforme será entendido por um técnico no assunto, o termo “resíduo sólido urbano” (MSW) se refere a frações de resíduo que estão tipicamente disponíveis em uma cidade, mas que não precisam vir de qualquer município per se. MSW pode ser qualquer combinação de resíduo celulósico, de planta, animal, de metal ou de vidro, incluindo, entre outros, qualquer um ou mais dos seguintes: Lixo coletado em sistemas de coleta urbanos normais, opcionalmente, processados em algum dispositivo de separação, fragmentação ou polpação central, como Dewaster® ou reCulture®; resíduo sólido separado de residências, incluindo frações orgânicas e frações ricas em papel; frações de resíduo derivadas da indústria, como indústria de restaurante, indústria de processamento de alimentos, indústria geral; frações de resíduo da indústria do papel; frações de resíduo de instalações de reciclagem; frações de resíduo da indústria de alimentos ou alimentação; fração de resíduo da indústria medicinal; frações de resíduo derivadas da agricultura ou de setores relacionados a lavoura; frações de resíduo de processamento de produtos ricos em açúcar ou amido; produtos da agricultura contaminados ou estragados de outras maneiras, como grãos, batatas e beterrabas não exploráveis para fins alimentícios ou de alimentação; restos de jardinagem.

[036] MSW é, por natureza, tipicamente heterogêneo. Dados estatísticos referentes à composição de materiais de resíduo não são amplamente conhecidos. que provejam uma base firme para comparações entre os países. Padrões e procedimentos operacionais para a amostragem e caracterização corretas permanecem não padronizados. Ao contrário, somente poucos métodos de amostragem padronizados foram relatados. Consulte, por exemplo, Riber et al., 2007. Pelo menos no caso de resíduo de residência, a composição apresenta variação sazonal e geográfica. Consulte, por exemplo, Dahlen et al., 2007; Hansen et al., 2007b; Muhle et al., 2010; Riber et al., 2009. Variação geográfica na composição de resíduo domiciliar foi relatada, mesmo em pequenas distâncias de 200 - 300 km entre os municípios. Vide Hansen et al., 2007b. Como regra geral, o peso seco de resíduos urbanos modernos da Europa Ocidental compreende tipicamente a ordem de 25% em peso de “resíduos vegetais e de alimentos”. Na China, ao contrário, as proporções relativas de “resíduos de alimentos” são tipicamente aumentadas por um fator de pelo menos dois em relação ao MSW da Europa Ocidental. Consulte, por exemplo, Zhang et al. 2010.

[037] Em algumas realizações, MSW é processado como resíduos “não separados”. O termos “não separado”, conforme usado no presente documentos, referem-se a um processo no qual MSW não é substancialmente fracionado em frações separadas, de modo que o material biogênico não seja substancialmente separado de material plástico e/ou outros não biogênicos. Conforme usado no presente documento, o termo “biogênico” se refere a materiais que são biodegradáveis e compreendem materiais derivados de organismos vivos. Os resíduos podem ser “não spearados”, conforme usado no presente documento, apesar da remoção de alguns objetos grandes ou objetos de metal e apesar de alguma separação de material plástico e/ou outro não biogênico. Os termos “resíduo não separado” (ou “MSW não separado”), conforme usado no presente documentos, referem-se a resíduo compreendendo uma mistura de material biogênico e não biogênico em que 15% em peso ou mais do peso seco é material não biogênico.

[038] Tipicamente, MSW não separado compreende resíduos biogênicos, incluindo resíduo de alimento e de cozinha, materiais contendo papel e/ou papelão, resíduos de alimentos e similares; materiais recicláveis, incluindo vidro, garrafas, latas, metais e determinados plásticos; outros materiais combustíveis, que, embora praticamente não recicláveis per se, podem fornecer valor de calor na forma de combustíveis derivados de lixo; assim como materiais inertes, incluindo cerâmica, pedras e diversas formas de detritos.

[039] Em algumas realizações, MSW pode ser processado como resíduo “separado”. O termo “separado”, conforme usado no presente documento, refere-se a um processo no qual MSW é substancialmente fracionado em frações separadas, de modo que material biogênico seja separado substancialmente de plástico e/ou outro material não biogênico. O termo “resíduo separado” (ou “MSW separado”), conforme usado no presente documento, refere-se a resíduo no qual menos de 15% em peso do peso seco é material não biogênico.

[040] Em algumas realizações, MSW pode ser resíduo orgânico separado na fonte compreendendo predominantemente resíduos de fruta, vegetal e/ou animal. Uma variedade de sistemas de separação diferentes pode ser aplicada a MSW não separado em algumas realizações, incluindo separação na fonte, em que residências descartam materiais de resíduo diferentes separadamente. Sistemas de separação na fonte são atualmente disponíveis em alguns municípios na Áustria, Alemanha, Luxemburgo, Suécia, Bélgica, Holanda, Espanha e Dinamarca. Alternativamente, sistemas de separação individuais podem ser utilizados. Meios de separação e classificação mecânicos podem incluir quaisquer métodos conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, sistemas descritos nos documentos US2012/0305688; WO2004/101183; WO2004/101098; WO2001/052993; WO2000/0024531; WO1997/020643; WO1995/0003139; CA2563845; US5465847. Em algumas realizações, resíduos mesmo que sejam levemente separados, ainda produzem uma fração de resíduo que é “não separada”, conforme usado no presente documento. Em algumas realizações, MSW não separado é utilizado, em que mais que 15% em peso do peso seco é material não biogênico, ou mais que 18%, ou mais que 20%, ou mais que 21%, ou mais que 22%, ou mais que 23%, ou mais que 24%, ou mais que 25%.

[041] Na prática dos métodos da invenção, o teor de água do MSW é ajustado, de modo que o MSW compreenda um teor não aquoso entre 10 e 50% em peso, ou em algumas realizações, entre 12 e 40%, ou entre 13 e 35%, ou entre 14 e 30%, ou entre 15 e 25%. Em algumas realizações, o teor de água é considerado por ser “ajustado”, conforme usado no presente documento, em que o MSW compreende o teor não aquoso adequado, com água tendo sido ou não adicionada diretamente. MSW tipicamente compreende teor de água considerável. Todos os outros sólidos compreendendo o MSW são denominados “teor não aquoso”, conforme usado no presente documento. O nível de teor de água utilizado na prática dos métodos da invenção se refere a diversas variáveis interrelacionadas. Os métodos da invenção tipicamente produzem uma pasta fluida biogênica. Conforme será prontamente entendido, a pasta fluida é biogênica que compreende predominantemente material biogênico, mas também pode incluir contaminantes não biogênicos. Uma pasta fluida é “líquida”, conforme usado no presente documento, na medida em que é bombeável, apesar do teor substancial de sólidos não dissolvidos.

[042] Conforme será prontamente entendido por um técnico no assunto, a capacidade de transformar componentes sólidos em uma pasta fluida líquida é aumentada com o teor de água aumentado. A polpação eficaz de papel e papelão, que compreende uma fração substancial de MSW, em alguns países, é tipicamente aprimorada quando o teor de água é aumentado. O teor de água provê um meio no qual a preparação microbiana pode propagar e que dissolve metabólitos. Ainda, conforme é bem conhecido na técnica, as atividades enzimáticas podem apresentar atividade diminuída quando for conduzida hidrólise sob condições com baixo teor de água. Por exemplo, celulases tipicamente apresentam atividade diminuída em misturas de hidrólise que têm teor não aquoso maior que cerca de 10% em peso. No caso de celulases, que degradam papel e papelão, uma relação inversa eficazmente linear foi relatada entre concentração de substrato e produziram do substrato por grama de reação enzimática. Consulte Kristensen et al. 2009.

[043] Em algumas realizações, um pouco de teor de água deve ser adicionado normalmente ao resíduo, a fim de alcançar um teor não aquoso adequado. Por exemplo, considere uma fração de resíduo domiciliar Dinamarquês não separado. A Tabela 1, que descreve a composição característica de MSW não separado, relatada por Riber et al. (2009), “Chemical composition of material fractions in Danish household residue”, Residue Management 29:1251. Riber et al. caracterizou as frações de componente de resíduos domésticos obtidos de 2220 casas da Dinamarca em um único dia em 2001. Será prontamente entendido por um técnico no assunto que essa composição relatada é simplesmente um exemplo representativo, útil na explicação dos métodos da invenção. No exemplo apresentado na Tabela 1, sem qualquer adição de teor de água, a fração biogênica biodegradável compreendendo resíduo vegetal, de papel e animal seria esperado por ter aproximadamente 47% de teor não aquoso em média. [(% absoluta de não aquoso)/(% em peso líquido)=(7,15 + 18,76 + 4,23)/(31,08 + 23,18 + 9,88) = 47% teor não aquoso]. A adição de um volume de água correspondente a um peso equivalente da fração de resíduo sendo processada reduziria o teor não aquoso do resíduo em si para 29,1% (58,2%/2) enquanto a redução do teor não aquoso do componente degradável a cerca de 23,5% (47%/2). A adição de um volume de água correspondente a dois equivalentes em peso da fração de resíduo sendo processada reduziria o teor não aquoso do resíduo em si para 19,4% (58,2%/3, enquanto a redução do teor não aquoso do componente degradável a cerca de 15,7% (47%/3). TABELA 1 DISTRIBUIÇÃO DE MASSA RESUMIDA DE FRAÇÕES DE RESÍDUO DA DINAMARCA 2001 (a) Fração pura. (b) Soma de: jornal, revistas, anúncios, livros, papel de escritório e limpo/sujo, caixas de papel e papelão, papelão, caixa com plástico, caixa com chapa de Al, papelão sujo e tecidos de cozinha. (c) Soma de: Plástico mole, garrafas de plástico, outro plástico duro e plástico não reciclável. (d) Soma de: terra, pedras etc., cinza, cerâmica, detritos de gato e outros não combustíveis. (e) Soma de: recipientes Al, chapa de al, chapa semelhante a metal, recipientes de metal e outros metais. (f) Soma de: Vidro transparente, verde, marrom e outro. (g) Soma de: As 13 frações de material restantes.

Resíduo vegetal (a) 31,08 7,15 Resíduo de papel (b) 23,18 18,76 Resíduo de animal(a) 9,88 4,23 Resíduo plástico (c) 9,17 8,43

[044] Um técnico no assunto será prontamente capaz de determinar uma quantidade adequada de teor de água, se houver, para adicionar aos resíduos no ajuste do teor de água. Tipicamente, como uma matéria prática, apesar de alguma variabilidade na composição de MSW sendo processado, é conveniente adicionar uma proporção de massa relativamente constante de água (que inclui solução aquosa), em algumas realizações, entre 0,8 e 1,8 kg de água por kg de MSW, ou entre 0,5 e 2,5 kg de água por kg de MSW, ou entre 1,0 e 3,0 kg de água por kg de MSW. Como resultado, o teor não aquoso real do MSW durante o processamento pode variar dentro da variação adequada.

[045] Uma variedade de diferentes reatores de fermentação microbiana pode ser utilizada. Em algumas realizações, um reator similar ao descrito no documento WO2011/032557 pode ser utilizado, incluindo uma câmara que gira em uma eixo geométrico substancialmente horizontal, equipado com acessórios em sua superfície interna que forma um arranjo de espiral, que movimenta o MSW continuamente da extremidade de entrada para a de saída. Dependendo do grau no qual o reator está preenchido, e dependendo do tamanho do reator, o “tempo de residência” médio do MSW dentro do reator pode ser controlado. O reator pode ser equipado com elementos de aquecimento, de modo que uma temperatura adequada possa ser mantida. Enquanto se introduz continuamente MSW no reator e remove parcialmente, de maneira contínua, o MSW degradado do reator, um determinado tempo de residência médio é obtido. Em outras realizações, grandes vasos, possivelmente constituídos de concreto ou outros materiais de construção simples, podem ser utilizados, que são equipados com meios para agitação, como um eixo geométrico montado de maneira horizontal tendo pás que elevam e misturam o MSW de entrada. O reator pode ser equipado com meios para aeração passiva, com o que a exposição ao ar é provida e a agitação facilita a exposição ao ar. De maneira alternativa, o reator pode ser configurado de modo a manter eficazmente condições anaeróbicas ao limitar a exposição ao ar.

[046] A agitação pode ser alcançada por uma variedade de diferentes meios. A agitação é vantajosa, pois promove não somente a fermentação microbiana per se, mas também, a hidrólise catalisada por enzimas secretadas por ou de outra forma providas por micro-organismos vivos. De fato, nesse contexto, fermentação microbiana é efetivamente hidrólise e fermentação. Em algumas realizações, agitação é provida por um tipo de mistura de queda livre, como um vaso giratório ou um eixo geométrico montado horizontalmente provendo elevação e mistura de MSW no meio de fermentação microbiana. Em outras realizações, a agitação pode ser provida por meios mais simples, como brocas.

[047] Uma variedade de diferentes meios pode ser utilizada para alcançar e manter uma concentração de bactérias de ácido láctico de pelo menos 1,0 x 1010 UFC (unidade de formação de colônia)/L durante o ciclo de fermentação. Conforme usado no presente documento, a concentração de bactérias de ácido láctico é mantida em uma concentração durante a etapa de fermentação, antes da separação de sólidos não degradáveis, na medida em que a concentração de células de bactérias vivas na fermentação é, em média, de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L pelo ciclo da fermentação. Uma média de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L durante a fermentação é tipicamente demonstrada por uma série de medições em amostras obtidas antes ou após ou durante a fermentação. A medição de UFC/L é determinada por uma medição expressa como UFC por g de sólidos totais presentes em uma amostra representativa da mistura e, então, expressa como uma medição por L por uma medição de teor de sólidos totais de porcentagem em peso da mistura. A porcentagem de sólidos totais de uma amostra representativa de 5 ml é determinada pela secagem em temperatura ambiente, a fim de prover uma base para cálculos. UFC é determinada utilizando PCR quantitativa (qPCR). Alíquotas de 5 ml de material amostrado suspenso em 50% em peso de glicerol são suspensas em 5 ml de H2O filtrado estéril. Uma alíquota é filtrada em um filtro e DNA é extraído da massa celular filtrada. O número de números de cópia de gene 16S rRNA no DNA extraído são quantificados por análise de qPCR com iniciadores de gene de 16S rRNA universais. Número de célula bacteriana é calculado com base nesses dados, presumindo uma média de 3,0 números de cópia do gene de 16s rRNA por célula viva e expresso em termos de teor de sólidos totais da amostra analisada. Contagens de archaeal não são incluídas na contagem de UFC/L. A porcentagem de contagens de célula viva medidas que correspondem à bactéria de ácido láctico é determinada com base em uma estimativa provida pela análise de 16S rDNA, conforme é bem conhecido na técnica. Uma amostra líquida de mistura de fermentação é congelada em 20% em peso de glicerol e armazenada em -20 °C para o objetivo de realização de análise de 16S rDNA para identificar os micro-organismos. Essa análise é bem conhecida na técnica e é amplamente utilizada para identificação e análise filogênica de procariontes com base no componente 16S da subunidade ribossômica pequena. A análise compreende a extração de DNA genômico, preparação de biblioteca de amplificação com o uso do par de iniciadores de iniciadores universais que abrangem as regiões hipervariáveis V1 a V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp de comprimento), etiquetamento PCR com adaptadores GS FLX, e sequenciamento para obter 104.000- 160.000 de leituras por amostra testada. As sequências resultantes podem ser consultadas em um BlastN contra o banco de dados de rDNA do Projeto de Banco de Dados Ribossômicos (Cole et al., 2009). O banco de dados contém sequências de boa qualidade com pelo menos 12.00bp de comprimento e uma associação taxonômica de NCBI. A liberação atual (RDP Release 10, Atualizada em 19 de setembro de 2012) contém 9.162 bactérias e 375 sequências de archaeal. Os resultados de BLAST podem ser filtrados para remover correspondências curtas e de baixa qualidade (identidade de sequência > 90%, cobertura de alinhamento > 90%). A porcentagem numérica de bactérias detectadas por essa análise que são bactérias de ácido láctico, incluindo, entre outros, espécies de Lactobacillus, é, então, aplicada à UFC/L medida tial como uma medida fracional de LAB UFC/L. Por exemplo, quando 2,0 x 1012 de UFC/L de contagens de bactéria viva totais forem determinados em amostras representativas de uma mistura de fermentação, e quando análise de 16s RNA de amostras representativas da mistura de fermentação indicarem que 50% dos micro-organismos detectados é de espécie Lactobacillus, a concentração de bactéria de ácido láctico é estabelecido no momento da medição para ser pelo menos 1,0 x 1012 UFC/L.

[048] Geralmente, é bastante simples alcançar concentrações de bactéria de ácido láctico de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L. Se as condições de aeração forem aeróbicas ou anaeróbicas, LAB compreenderá geralmente uma proporção maior da população médica que se desenvolve quando MSW for simplesmente incubado em temperaturas entre 37 e 50 °C. Consulte, por exemplo, Akao et al. 2007a; Akao et al. 2007b; Sakai et al. 2000; Sakai et al. 2004. Da mesma forma, as condições de fermentação microbiana podem ser aeróbicas ou anaeróbicas. As contagens de bactéria LAB viva na ordem de 1,0 x 1010 UFC/L podem ser obtidas rotineiramente dentro de cerca de 12 horas em fermentação de ácido láctico de resíduo de modelo doméstico, sem atividade de enzima adicionada. Consulte Sakai et al. 2000 e Sakai et al. 2004. Tempos de dobragem de geração de bactéria de ácido láctico identificada nos exemplos apresentados subsequentemente são relatadamente na ordem de 4 a 5 horas. Consulte Liong e Shaw 2005.

[049] Em algumas realizações, o fluxo de MSW de entrada é simplesmente inoculado com um inóculo de microorganismos que ocorrem naturalmente no resíduo e, opcionalmente, “elevado” em resíduo local ou componentes de resíduo local como uma fonte de alimento em condições de fermentação de temperatura dentro da variação 37 a 55 °C, ou 40 a 55 °C, ou 45 a 50 °C, e em um pH dentro da variação 4,2 e 6,0.

[050] Devido a LAB gerar metabólitos acídicos, seu cresimento continuado tipicamente envolve um requisito para ajuste de pH para manter condições de crescimento adequadas. Tipicamente, LAB prefere condições de pH dentro da variação de 4,2 a 6,0. Em algumas realizações, o ajuste de pH durante a fermentação microbiana pode ser provido por meios microbianos, por exemplo, ao inclui na mistura de fermentação microbiana levedura ou bactéria ou outros micro-organismos que convertem produtos acídicos em um não acídico, como os métodos descritos por Nakaski et al. 1996 e Nakasaki et al. 2013.

[051] Geralmente, é vantajoso alcançar separação biológica no mais curto parzo praticável, isto é, para manter a duração da fermentação microbiana antes da separação de sólidos não degradáveis o mais rápido praticável. Isso pode ser alcançado com velocidade particular ao prover uma inoculação inicial do fluxo de MSW não separado de entrada. Em algumas realizações, o inóculo pode ser simplesmente águas de processo recirculadas, que podem ser aquecidas vantajosamente a temperaturas entre 37 e 55 °C. Em algumas realizações, o inóculo em si transmite concentrações de LAB viva de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L ao fluxo de MSW de entrada. Em algumas realizações, células secas por refrigeração podem ser diretamente adicionadas como inóculo. Em algumas realizações, componentes de MSW biodegradáveis de uma determinada localização podem ser utilizados como substrato, no qual um inóculo bacteriano de ácido láctico é originado no fermentador e introduzido no fluxo de MSW não separado de entrada. Em algumas realizações, o fluxo de MSW de entrada pode ser submetido à esterilização por calor, a fim de que uma cepa específica de bactéria de ácido láctico possa ser inoculada, que tenha propriedades vantajosas especializadas.

[052] Em algumas realizações, a concentração de LAB viva é mentida em níveis de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L ou de pelo menos 2,0 x 1010 UFC/L ou de pelo menos 3,0 x 1010 UFC/L no reator de fermentação microbiana durante operação contínua, com um fluxo de MSW de entrada sendo introduzido continuamente e um fluxo de MSW fermentado sendo continuamente removido antes da separação de sólidos não degradáveis, por um período de pelo menos 20 horas, ou pelo menos 50 horas, ou pelo menos 70 horas. Em algumas realizações, a fermentação microbiana pode ser conduzida concomitantemente com hidrólise enzimática utilizando preparações de enzima isoladas. Nessas realizações, níveis de LAB viva durante a fermentação microbiana antes da separação de sólidos não degradáveis podem ser muito menores, na ordem de 5,0 x 107 UFC/L, ou entre 5,0 c 107 UFC/L e 1,0 x 1010 UFC/L.

[053] Em algumas realizações, a atividade de celulase derivada microbianamente de pelo menos 30 FPU/L é provida pelo agrupamento microbiano provendo fermentação microbiana. Conforme usado no presente documento, o termo atividade de celulase derivada microbianamente se refere a uma atividade que nãoé diretamente provida por uma preparação de enzima isolada que foi adicionada a uma mistura de fermentação, mas, ao contrário, a uma atividade provida por organismos vivos. Em alguns casos, organismos vivos podem prover atividade de celulase por secreção de volume de enzimas celulíticas. Em outros casos, organismos vivos podem prover atividade de celulase em contato comparavelmente local com substratos celulósicos. A atividade de celulase derivada microbianamente é determinada como segue: Uma amostra contendo micróbios vivos é incubada com adição de um substrato de celulose limpo, puro, seja papel de seda ou papel de filtro, por um período de 24 horas sob condições de temperatura, pH e aeração para a qual a medição de atividade é desejada. A massa sólida transferida do substrato celulósico adicionado à fase líquida, corrigida para transferência de “base” de massa sólida para a fase líquida pela amostra contendo micróbio em si, e corrigida para transferência de “base” de massa sólida do substrato celulósico adicionado à fase líquida pela água isoladamente, sob as condições de reação testadas, provê uma medida de atividade de celulase derivada microbianamente. Essa medida é, então, comparada com a atividade sob condições equivalentes por uma preparação de enzima celulase isolada tendo atividade de celulase conhecida em Unidades de Papel de Filtro (FPU), conforme determinado pelo método de Ghose, T.K. (1987), Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem., 59(2): p. 257-268. A [(transferência de porcentagem de amostra-base e água-base de massa sólida de substrato celulósico para a fase líquida alcançada pela amostra contendo micróbio) dividida por (transferência de porcentagem de água-base de massa sólida de substrato celulósico para a fase líquida alcançada pela preparação de enzima isolada)] vezes a atividade de FPU conhecida da preparação de enzima isolada provê uma medida de atividade de celulase derivada microbianamente. Essa medição de atividade é, então, dividida pelo volume de reação no qual a medição é feita para prover uma medição expressa como FPU/L. Será prontamente entendido por um técnico no assunto que a amostra contendo micróbio pode ter sido diluída antes da medição, e que uma estimativa final de FPU/L na fonte da amostra pode envolver uma correção para diluição. Em casos nos quais algum componente de atividade FPU provida por uma preparação de enzima isolada for combinado à atividade de celulase derivada microbianamente, a atividade de celulase derivada microbianamente medida é simplesmente corrigida por uma subtração linear da atividade provida por enzimas isoladas em isolamento do contexto microbiano. Um cálculo de exemplo é dado como segue: Uma amostra de inóculo microbiano de 20 ml é incubada por 24 horas na presença de 1 g de substrato celulósico adicionado. Após a correção para a liberação de sólidos de base pela amostra de inóculo em si, um total líquido de 12% de massa celulósica é observado para transferir do substrato celulósico para a fase líquida. Uma amostra de tampão de 20 ml à qual é adicionado 1 g de substrato celulósico adicionado e uma preparação de celulase isolada previamente medida para ter atividade de FPU conhecida em uma quantidade correspondente a 5,7 FPU/g de celulose é incubada por 24 horas sob condições equivalentes. Um total líquido de 62% de massa celulósica é observado para transferir do substrato celulósico para a fase líquida. Uma amostra de 20 ml de água à qual é adicionado 1 g de substrato celulósico adicionado é incubada por 24 horas sob condições equivalentes. Um total líquido de 3% de massa celulósica é observado por transferir do substrato celulósico para a fase líquida. Um pouco de pequena quantidade de preparação de enzima isolada tendo atividade de FPU conhecida é adicionada ao fermentador do qual o inóculo microbiano foi retirado em uma quantidade que, expressa em termos de volume total de conteúdo do fermentador, pode ser expressa como 8 FPU/L. A atividade de celulase derivada microbianamente medida é dada por: [(12% de transferência corrigida de auto-base - 3% de transferência de base de água)/(62% de transferência - 3% de transferência de água)] * (5,7 FPU/0,020 L) = 43,5 FPU/L microbiano inicial - 8 FPU/L de contribuição de enzima isolada = 35,47 FPU/L de atividade de celulase derivada microbianamente.

[054] Em algumas realizações, a atividade de celulase derivada microbianamente pode ser provida pelos organismos de secreção de celulase especializados, o que foi incluído em um inóculo aplicado ao fluxo de MSW de entrada. Em algumas realizações, atividade de celulase derivada microbianamente pode atingir níveis de pelo menos 50 FPU/L ou pelo menos 75 FPU/L ou pelo menos 100 FPU/L ou pelo menos 300 FPU/L ou pelo menos 500 FPU/L ou pelo menos 700 FPU/L, ou pelo menos 1000 FPU/L. Em algumas realizações, pode ser vantajoso adicionar preparações de enzima isolada para a mistura de fermentação microbiana, incluindo preparações amilase ou outras preparações de enzima.

[055] A duração de fermentação microbiana antes da separação de sólidos não degradáveis é determinada pelo tempo de residência médio dentro do reator de fermentação microbiana. Em algumas realizações, tempo de residência médio do fluxo de MSW na fermentação microbiana antes da separação de materiais degradáveis é de 18 horas ou menos, ou 24 horas ou menos, ou 36 horas ou menos, ou entre 36 horas e 48 horas, ou entre 48 horas e 60 horas, ou entre 60 horas e 72 horas, ou 72 horas ou menos. Em algumas realizações, a invenção provê uma pasta fluida biodegradável obtida pelo método de processamento de MSW.

[056] Um fluxo de MSW fermentado é removido do reator de fermentação microbiana, tipicamente, de maneira contínua. Isto é, um fluxo de MSW não separado é introduzido continuamente ao reator e um fluxo de parcialmente hidrolisado, MSW fermentado é removido continuamente do reator. Em algumas realizações; entretanto, o fluxo de MSW pode ser introduzido de maneira pulsátil, com uma injeção de MSW, seguida por uma pause, seguida por uma injeção subsequente de MSW. Semelhantemente, em algumas realizações, o fluxo de parcialmente hidrolisado, MSW fermentado pode ser removido do reator de maneira pulsátil, com uma ejeção de MSW, seguida por uma pausa, seguida por uma ejeção subsequente de MSW e assim por diante.

[057] Após a remoção do reator de fermentação microbiana, o MSW fermentado, parcialmente hidrolisado é submetido a uma etapa de separação, pela com os sólidos não degradáveis são removidos para prover uma pasta fluida de componentes biodegradáveis. Essa etapa de separação, e processamento subsequente, pode ser alcançada em uma variedade de diferentes maneiras.

[058] Em algumas realizações, a etapa de separação é alcançadas em duas etapas. Primeiro, um separador balístico remove dois fluxos de materiais não degradáveis, produzindo uma fração “bidimensional” (2D) compreendendo sacos plásticos e outro material geralmente sem forma, uma fração “tridimensional” (3D) compreendendo garrafas e recipientes tendo uma forma definida, e um volume de uma pasta fluida líquida biogênica de componentes biodegradáveis. Em uma segunda etapa, a fração 2D é ainda sujieta à pressionamento com uma prensa helicoidal ou dispositivo semelhante para aumentar mais a produção da pasta fluida biogênica.

[059] Em algumas realizações, a fração 2D é, ainda, submetida à lavagem, a fim de recuperar mais o material biodegradável. As águas de lavagem obtidas nessa etapa podem ser, então, mantidas na temperatura de fermentação e utilizadas para umedecer e, também, inocular o MSW não separado de entrada.

[060] Em algumas realizações, o esquema de processamento descrito na Figura 1 pode ser utilizado. A Figura 1 apresenta uma ilustração esquemática de aspectos principais da usina de demonstração REnescience Versão 1. MSW não separado é submetido a um processo de separação biológica que produz quatro produtos - uma pasta fluida biogênica adequada para produção de biometano ou outros processos, inertes (vidro e areia) para reciclagem, e tanto uma fração “bidimensional” (2D) quanto uma “tridimensional” (3D) de materiais inorgânicos adequados para produção de RDF, assim como para a reciclagem de metais, plástico e madeira. MSW de áreas urbanas é coletado como é em sacos plásticos. O MSW é transportado para a Refinaria de Resíduo REnescience, onde é armazenado em um silo até o processamento. Dependendo do caráter do MSW, uma etapa de separação pode ser instalada na frente do sistema REnescience para extrair partículas sobredimensionadas (acima de 500 mm). Um fluxo de MSW não separado é aquecido e seu teor não aquoso ajustado pela adição de solução aquosa aquecida. Em algumas realizações, a atividade de celulase provida pelas preparações de enzima isoladas pode ser adicionada para facilitar a degradação rápida do component biodegradável do MSW. Em algumas realizações, preparações de enzima isolada são adicionadas ao MSW aquecido em um teor não aquoso adequado. Em algumas realizações, não são adicionadas preparações de enzima isolada e hidrólise microbiana e fermentação são providas para manter bactéria de ácido láctico durante o ciclo de fermentação em níveis de células de bactérias vivas de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L. O MSW, com ou sem enzimas adicionadas, pode ser incubado em um reator de fermentação microbiana semelhante ao descrito no documento WO2011/032557. Enquanto introduz continuamente MSW no reator e remove continuamente de maneira parcial o MSW degradado do reator, um determinado tempo de residência médio é obtido. MSW parcialmente degradado removido reator pode ser, então, submetido a duas etapas de separação distintas. Primeiro, um separador balístico, geralmente utilizado na separação, pode ser utilizado, por exemplo, tendo peneiras entre 20-50 mm para produzir um fluxo de pasta fluida biogênica, assim como uma fração 3D não degradável e uma fração 2D não degradáveç.

[061] Em algumas realizações, conforme apresentado na Figura 1, a fração 2D não degradável pode ser ainda submetido a desumidificação utilizando prensa helicoidal, com a recuperação de pasta fluida biogênica adicional que é, por sua vez, misturada com a pasta fluida obtida da etapa de separador balístico.

[062] Em algumas realizações, conforme apresentado na Figur 1, a pasta fluida biogênica obtida pode ser submetida à separação “fina” adicional utilizando uma série de peneiras de vibração, por exemplo, uma peneira grossa de 6-10 mm, por exemplo, 8 mm, seguida por uma ou mais peneiras mais finas de 2-6 mm, por exemplo, 3 mm. Essas peneiras mais grossas tipicamente separam principalmente contaminantes não degradáveis. As peneiras mais finas, por exemplo, peneiras de 3 mm, tipicamente, separa fibras maiores, que compreendem uma quantidade considerável de material biodegradável. Após a passagem através das peneiras mais finas, em algumas realizações, a pasta fluida biogênica obtida, que é tipicamente bombeável (isto é, líquida) pode ser armazenada em um tanque grande.

[063] Em algumas realizações, materiais biodegradáveis retidospor um ou mais sistemas de peneira podem ser reintroduzidos na pasta fluida biogênica armazenada e submetidos a pós-fermentação, de modo a alcançar degradação mais completa do material, em uma temperatura entre 35 e 75 graus por um período entre 1 e 72 horas.

[064] Em algumas realizações, conforme apresentado na Figura 1, a fração 2D não degradável sólida desumidificada pode ser submetida a um mecanismo de lavagem contra-corrente tanto para limpar a fração 2D e, também, para recuperar material biodegradável adicional que, de outra forma, seria perdido. Por exemplo, os fluxos de água, em algumas realizações, podem ser conforme apresentado na Figura 1. Água fresca pode ser aplicada à lavagem de material 3D não degradável, recuperado do separador balístico em um tambor simples. Essa água de lavagem pode ser, então, utilizada como água “limpa” que é alimentada na segunda de duas unidades de lavagem idênticas, de modo a prover lavagem contra-corrente, - a nova água “limpa” encontra o lixo “mais limpo”, enquanto, de maneira consecutiva, água mais suja é aplicada ao lixo “mais sujo” de entrada. Em algumas realizações, o mecanismo de lavagem funciona como segue: a fração 2D suja entra em um tambor na primeira unidade de lavagem, onde o resíduo é misturado com a água de lavagem contra-corrente e misturado mecanicamente. Adicionalmente, a água de lavagem suja pode ser submetida à filtração de peneira tendo peneiras de 0,04 a 0,08 mm, para remover fibras, que compreendem, de maneira típica, principalmente material biodegradável. Areia e material pesado também podem ser removidos por sedimentação e por um condutor helicoidal no fundo de cada unidade de lavagem. A fração removida é tipicamente, na maioria, areia/vidro/plástico duro/e outros inorgânicos. Após a primeira lavagem, o resíduo pode ser movimentado por broca helicoidal ou outros meios em uma segunda unidade de lavagem, que pode ser idêntica à primeira. A água de lavagem da primeira unidade de lavagem, nessas realizações, tipicamente tem entre 1 - 4 % em peso de TS (sólidos totais), enquanto a água de lavagem da segunda unidade de lavagem tipicamente tem 0,5 -3,0% em peso.

[065] As águas de lavagem, compreendendo algum material biodegradável recuperado do MSW, assim como os micro-organismos associados, em algumas realizações, podem ser armazenados em um tanque de “tampão”. A solução aquosa desse tanque de “tampão” pode ser, então, utilizada para ajustar o teor não aquoso do MSW de entrada. Em algumas realizações, a solução do tanque de “tampão” pode ser aquecida ao aplicar vapor, então, misturar a solução aquecida com o MSW de entrada, de modo a aquecer simultaneamente em uma temperatura adequada e, também, ajustar o teor não aquoso. Em algumas realizações, a solução do tanque de “tampão” é aquecida sozinha no tanque de tampão a uma temperatura dentro da variação de 35 a 55 °C. A mera ação de aquecimento do tanque de tampão que armazena águas de lavagem é suficiente para induzir fermentação e promover crescimento bacteriano, enriquecendo a capacidade da solução para servir como um “inóculo” ao MSW de entrada, ara facilitar a fermentação microbiana. Em algumas realizações, o tanque de “tampão” aquecido que armazena águas de lavagem pode ser, então, agitado, ter o pH ajustado, e “alimentado” com material biodegradável retido por um ou mais sistema de peneira ou pela pasta fluida biogênica obtida ou ambos, de modo a promover mais a fermentação bacteriana e de modo a aprimorar mais a “potência” da solução como um inóculo para o MSW de entrada.

[066] A separação de sólidos não degradáveis e o esquema para promover a fermentação microbiana podem ser alcançados por uma variedade de meios. Em algumas realizações, o fluxo de MSW de entrada pode ser alimentado ao reator de fermentação microbiana, então, após um período de fermentação microbiana, diretamente submetido à pressionamento com uma prensa helicoidal, com separação de pasta fluida biogênica, seguida pela adição de água fresca, seguida por um segundo tratamento de prensa helicoidal, produzindo uma pasta fluida biogênica diluída, recuperada do segundo tratamento de prensa helicoidal que pode ser utilizado para ajustar o teor não aquoso e prover inoculação do fluxo de MSW de entrada. Ou, em algumas realizações, um esquema semelhante é aplicado diretamente e um pouco ou toda a pasta fluida biogênica é utilizada para ajustar o teor não aquoso do fluxo de MSW de entrada.

[067] Em algumas realizações, o fluxo de MSW de entrada pode ser alimentado no reator de fermentação microbiana, então, após um período de fermentação microbiana, submetido a uma etapa de separação, como separador balístico ou separador de tambor ou peneira de vibração, com alguma recuperação da pasta fluida biogênica, seguida pro pressionamento com uma prensa helicoidal para recuperar a pasta fluida biogênica adicional, um pouco dessa pasta fluida pode ser utilizada diretamente para ajustar o teor não aquoso do fluxo de MSW de entrada.

[068] Em algumas realizações, a fermentação microbiana é realizada concomitantemente com hidrólise enzimática. Hidrólise enzimática pode ser alcançada utilizando uma variedade de diferentes meios. Em algumas realizações, hidrólise enzimática pode ser alcançada utilizando preparações de enzima isolada. Conforme usado no presente documento, o termo “preparação de enzima isolada” se refere a uma preparação compreendendo atividades de enzima que foram extraídas, secretadas ou, de outra forma, obtidas de uma fonte biológica e, opcionalmente, purificada de maneira parcial ou extensa.

[069] Uma variedade de diferentes atividades enzimáticas pode ser utilizada vantajosamente para praticar os métodos da invenção. Considerando, por exemplo, a composição de MSW apresentada na Tabela 1, será prontamente aparente que, pelo menos na Dinamarca, resíduos contendo papel compreendem o maior componente isolado, em peso seco, do material biogênico. Da mesma forma, conforme será prontamente aparente a um técnico no assunto, para resíduo doméstico típico, atividade de degradação de celulose será particularmente vantajosa. Em resíduos contendo papel, celulose foi prviamente processada e separada de sua ocorrência natural como um componente de biomassa lignocelulósica, misturada com lignina e hemicelulose. Da mesma forma, resíduos contendo papel podem ser vantajosamente degradados utilizando uma preparação de celulase comparativamente “simples”.

[070] “Atividade de celulase” se refere à hidrólise enzimática de 1,4-B-D-glicosídicas na celulose. Em preparações de enzima de celulase isolada obtidas a partir de fontes bacterianas, fúngicas ou outras fontes, a atividade de celulase compreende tipicamente uma mistura de atividades de enzima diferentes, incluindo endoglucanases e exoglucanases (também denominadas celobiohidrolases), que catalisam respectivamente a endo e exo-hidrólise das 1ligações 1,4-B-D- glicosídicas, com B-glucosidases, que hidrolisam os produtos de oligossacarídeo da hidrólise de exoglucanase em monossacarídeos. A hidrólise completa da celulose insolúvel exige tipicamente uma ação sinérgica entre as diferentes atividades.

[071] Como uma matéria prática, pode ser vantajoso em algumas realizações simplesmente usar uma preparação de celulase isolada comercialmente disponível otimizada para a conversão de biomassa lignocelulósica, já que as mesmas são prontamente disponíveis a um custo comparativamente baixo. Essas preparações são certamente adequadas para a prática dos métodos da invenção. O termo “otimizado para a conversão de biomassa lignocelulósica” refere-se a um processo de desenvolvimento de produto no qual as misturas de enzima foram selecionadas e modificadas para o propósito específico de melhorar os rendimentos de hidrólise e/ou reduzir o consumo de enzima na hidrólise da biomassa lignocelulósica pré-tratada em açúcares fermentáveis.

[072] Entretanto, as misturas de celulase comerciais otimizadas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica contêm tipicamente altos níveis de atividades de enzima adicionais e especializadas. Por exemplo, determinados as atividades de enzima presentes em preparações de celulase comercialmente disponíveis otimizado para a conversão de biomassa lignocelulósica e fornecidas junto à NOVOZYMES ™ sob os nomes comerciais CELLIC CTEC2 ™ e CELLIC CTEC3™ assim como preparações similares fornecidas junto à GENENCOR ™ sob o nome comercial ACCELLERASE 1500 ™ e revelado que cada uma dessas preparações continha atividade de endoxilanase acima de 200 U/g, atividade de xilosidase a níveis acima de 85 U/g, atividade de B-L-arabinofuranosidase a níveis acima de 9 U/g, atividade de amiloglucosidase a níveis acima de 15 U/g e atividade de a-amilase a níveis acima de 2 U/g.

[073] As preparações de celulase isolada mais simples podem também ser usadas eficazmente para praticar os métodos da invenção. As preparações de celulase adequadas podem ser obtidas por métodos bem conhecidos na técnica a partir de uma variedade de microrganismos, incluindo bactérias aeróbicas e anaeróbicas, fungos da podridão branca, fungos da podridão mole e fungos anaeróbicos. Conforme descrito na referência 13, R. Singhania et al., “Advancement areia comparative profiles in the production technologies using solid-state areia submerged fermentation for microbial cellulases,” Enzyme areia Microbial Technology (2010) 46:541 a 549, que é por meio deste expressamente incorporado a título de referência em sua totalidade, os organismos que produzem celulases produzem tipicamente uma mistura de enzimas diferentes em proporções apropriadas de modo a serem adequados para a hidrólise de substratos lignocelulósicos. As fontes preferenciais de preparações de celulase úteis para a conversão da biomassa lignocelulósica incluem fungos tais como as espécies de Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola, Aspergillus e Phanerochaete.

[074] Adicionalmente à atividade de celulase, algumas atividades de enzima adicionais que podem se mostrar vantajosas na prática dos métodos da invenção incluem enzimas que atuam sobre resíduos de comida, tais como proteases, glucoamilases, endoamilases, proteases, pectina esterases, pectina liases e lipases e enzimas que atuam sobre resíduos de jardim, tais como xilanases e xilosidases. Em algumas realizações, pode ser vantajoso incluir outras atividades de enzima tais como laminarases, queratinases ou laccases.

[075] Em algumas realizações, um microrganismo selecionado que exibe atividade de celulase extracelular pode ser diretamente inoculado na realização da hidrólise enzimática e fermentação microbiana concomitantes, incluindo, porém sem limitação, quaisquer um ou mais dos seguintes organismos termofílicos e celulíticos podem ser inoculados sozinhos ou em combinação com outros organismos Paenibacillus barcinonensis , consulte Asha et al 2012, Clostridium thermocellum, consulte Blume et al 2013 e Lv e Yu 2013, espécies selecionadas de Streptomyces, Microbispora e Paenibacillus, consulte Eida et al 2012, Clostridium straminisolvens, consulte Kato et al 2004, espécies de Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria e Bacteroidetes, consulte Maki et al 2012, Clostridium clariflavum, consulte Sasaki et al 2012, novas espécies de Clostridiales filogenética e fisiologicamente relacionadas a Clostridium thermocellum e Clostridium straminisolvens, consulte Shiratori et al 2006, Clostridium clariflavum sp. nov. e Clostridium Caenicola, consulte Shiratori et al 2009, Geobacillus Thermoleovorans, consulte Tai et al 2004, Clostridium stercorarium, consulte Zverlov et al 2010 ou quaisquer um ou mais dos fungos termofílicos Sporotrichum thermophile, Scytalidium thermophillum, Clostridium straminisolvens e Thermonospora curvata, Kumar et al. 2008 para revisão. Em algumas realizações, os organismos que exibem outras atividades enzimáticas extracelulares podem ser inoculados para contribuir com a hidrólise enzimática e a fermentação microbiana concomitantes, por exemplo, fungos proteolíticos e queratinolíticos, consulte Kowalska et al. 2010 ou bactérias de ácido láctico que exibem atividade de lipase extracelular, consulte Meyers et al. 1996.

[076] A hidrólise enzimática pode ser conduzida por métodos bem conhecidos na técnica, com o uso de uma ou mais preparações de enzima isolada que compreendem quaisquer uma ou mais dentre uma variedade de preparações de enzima incluindo qualquer uma daquelas mencionadas anteriormente ou, alternativamente, inoculando-se o MSW de processo com um ou mais organismos selecionados que podem afetar a hidrólise enzimática desejada. Em algumas realizações, a hidrólise enzimática pode ser conduzida com o uso de uma quantidade eficaz de uma ou mais preparações de enzima isolada que compreendem atividades de celulase, B-glucosidase, amilase e xilanase. Uma quantidade é uma “quantidade eficaz” em que, coletivamente, a preparação de enzima usada alcança a solubilização de pelo menos 40% do peso seco do material biogênico degradável presente no MSW dentro de um tempo de reação de hidrólise de 18 horas sob as condições usadas. Em algumas realizações, uma ou mais preparações de enzima isolada são usadas nas quais, coletivamente, as proporções relativas das várias atividades de enzima são conforme segue: Uma mistura de atividades de enzima é usada de modo que 1 FPU de atividade de celulase seja associado a pelo menos 31 CMC U de atividade de endoglucanase e de modo que 1 FPU de atividade de celulase seja associada a pelo menos pelo menos 7 pNPG U de atividade de beta glucosidase. Será prontamente entendido por um versado na técnica que CMC U refere-se a unidades de carboximetilcelulose. Uma CMC U de atividade libera 1 μmol de açúcares de redução (expressos como equivalentes de glicose) em um minuto sob condições de ensaio específicas de 50 °C e pH 4,8. Será prontamente entendido por um versado na técnica que pNPG U refere-se a unidades de pNPG. Uma pNPG U de atividade libera 1 μmol de nitrofenol por minuto de para-nitrofenil-B-D-glucopiranosídeo a 50 °C e pH 4,8. Será prontamente entendido por um versado na técnica que FPU de “unidades de papel de filtro” fornece uma medida de atividade de celulase. Conforme usado no presente documento, FPU refere-se a unidades de papel de filtro conforme determinado pelo método de Adney, B. e Baker, J., Procedimento Analítico de Laboratório no 006, “Measurement of cellulase activity”, 12 de agosto de 1996, o Laboratório de Energia Renovável Nacional dos EUA (NREL), que é expressamente incorporado a título de referência presente documento em totalidade.

[077] Na prática das realizações da invenção, pode ser vantajoso ajustar a temperatura do MSW antes da iniciação da hidrólise enzimática. Conforme é bem conhecido na técnica, as celulases e outras enzimas exibem tipicamente uma faixa de temperatura ideal. Embora exemplos das enzimas isoladas dos organismos termofílicos extremos sejam certamente conhecidos, tendo temperaturas ideais na ordem de 60 ou mesmo 70 °C, as faixas de temperatura ideal de enzima estão tipicamente na faixa de 35 a 55 graus. Em algumas realizações, a hidrólise enzimática é conduzida dentro da faixa de temperatura de 30 a 35 °C ou 35 a 40 °C ou 40 a 45 °C ou 45 a 50 °C ou 50 a 55 °C ou 55 a 60 °C ou 60 a 65 °C ou 65 a 70 °C ou 70 a 75 °C. Em algumas realizações, é vantajoso conduzir a hidrólise enzimática e a fermentação microbiana concomitante a uma temperatura de pelo menos 45 °C, porque isso é vantajoso no desencorajamento da proliferação de patógenos gerados em MSW. Consulte, por exemplo, Hartmann e Ahring 2006; Deportes et al. 1998; Carrington et al. 1998; Bendixen et al. 1994; Kubler et al. 1994; Six e De Baerre et al. 1992.

[078] A hidrólise enzimática que usa atividade de celulase tipicamente hidrolisará o material celulósico. Consequentemente, durante a hidrólise enzimática, os resíduos sólidos são tanto hidrolisados quanto liquefeitos, isto é, convertidos de uma forma sólida para uma pasta fluida líquida.

[079] Anteriormente, os métodos para processar MSW com o uso da hidrólise enzimática para alcançar a liquefação de componentes biogênicos previram uma necessidade de aquecer o MSW a uma temperatura consideravelmente maior do que esta exigida para a hidrólise enzimática, especificamente para alcançar a “esterilização” do resíduo, seguida por uma etapa de resfriamento necessária, para colocar o resíduo aquecido de volta para uma temperatura apropriada para a hidrólise enzimática. Na prática dos métodos da invenção, é suficiente que o MSW seja simplesmente colocado a uma temperatura apropriada para a hidrólise enzimática. Em algumas realizações, pode ser vantajoso simplesmente ajustar o MSW a um teor não aquoso apropriado com o uso de água aquecida, administrada de tal maneira a colocar o MSW a uma temperatura apropriada para a hidrólise enzimática. Em algumas realizações, o MSW é aquecido, ou adicionando teor aquoso aquecida ou vapor ou por meio do aquecimento dentro de um vaso de reator. Em algumas realizações, o MSW é aquecido dentro de um vaso de reator a uma temperatura maior do que 30 °C, mais menor do que 85 °C ou a uma temperatura de 84 °C ou menos ou a uma temperatura de 80 °C ou menos ou a uma temperatura de 75 °C ou menos ou a uma temperatura de 70 °C ou menos ou a uma temperatura de 65 °C ou menos ou a uma temperatura de 60 °C ou menos ou a uma temperatura de 59 °C ou menos ou a uma temperatura de 58 °C ou menos ou a uma temperatura de 57 °C ou menos ou a uma temperatura de 56 °C ou menos ou a uma temperatura de 55 °C ou menos ou a uma temperatura de 54 °C ou menos ou a uma temperatura de 53 °C ou menos ou a uma temperatura de 52 °C ou menos ou a uma temperatura de 51 °C ou menos ou a uma temperatura de 50 °C ou menos ou a uma temperatura de 49 °C ou menos ou a uma temperatura de 48 °C ou menos ou a uma temperatura de 47 °C ou menos ou a uma temperatura de 46 °C ou menos ou a uma temperatura de 45 °C ou menos. Em algumas realizações, o MSW é aquecido a uma temperatura não maior do que 10 °C acima da maior temperatura na qual a hidrólise enzimática é conduzida.

[080] Conforme usado no presente documento, o MSW é “aquecido a uma temperatura” em que a temperatura média do MSW é aumentada dentro de um reator para a temperatura. Conforme usado no presente documento, a temperatura a qual o MSW é aquecido é a maior temperatura média do MSW alcançada dentro do reator. Em algumas realizações, a maior temperatura média pode não ser mantida pelo período inteiro. Em algumas realizações, o reator de aquecimento pode compreender diferentes zonas de modo que o aquecimento ocorra em estágios em diferentes temperaturas. Em algumas realizações, o aquecimento pode ser alcançado com o uso do mesmo reator no qual a hidrólise enzimática é conduzida. O objetivo do aquecimento é simplesmente fornecer a maioria dos resíduos celulósicos e uma fração substancial dos resíduos de planta em uma condição ideal para a hidrólise enzimática. Para estar em uma condição ideal para a hidrólise enzimática, os resíduos devem ter idealmente uma temperatura e um teor aquoso apropriados para as atividades de enzima usadas para a hidrólise enzimática.

[081] Em algumas realizações, pode ser vantajoso agitar durante o aquecimento de modo a alcançar um resíduo igualmente aquecido. Em algumas realizações, a agitação pode compreender mistura de queda livre, tal como a mistura em um reator que tem uma câmara que gira ao longo de um eixo geométrico substancialmente horizontal ou em um misturador que tem um eixo geométrico rotativo que ergue o MSW ou em um misturador que tem pás ou hastes horizontais que erguem o MSW. Em algumas realizações, a agitação pode compreender vibração, mistura ou condução através de um condutor helicoidal de transporte. Em algumas realizações, a agitação continua após o MSW ter sido aquecido à temperatura desejada. Em algumas realizações, a agitação é conduzida por entre 1 e 5 minutos ou entre 5 e 10 minutos ou entre 10 e 15 minutos ou entre 15 e 20 minutos ou entre 20 e 25 minutos ou entre 25 e 30 minutos ou entre 30 e 35 minutos ou entre 35 e 40 minutos ou entre 40 e 45 minutos ou entre 45 e 50 minutos ou entre 50 e 55 minutos ou entre 55 e 60 minutos ou entre 60 e 120 minutos.

[082] A hidrólise enzimática é iniciada nesse ponto em que as preparações de enzima isolada são adicionadas. Alternativamente, no caso em que as preparações de enzima isolada não são adicionadas, mas, em vez disso, microrganismos que exibem atividades de enzima extracelulares desejadas são usados, a hidrólise enzimática é iniciada nesse ponto em que o microrganismo desejado é adicionado.

[083] Na prática de algumas realizações, a hidrólise enzimática é conduzida concomitantemente com a fermentação microbiana. A fermentação microbiana concomitante pode ser alcançada com o uso de uma variedade de diferentes métodos. Em algumas realizações, os microrganismos naturalmente presentes no MSW são simplesmente permitidos a se desenvolver nas condições de reação, em que o MSW processado não foi anteriormente aquecido a uma temperatura que é suficiente para efetuar uma “esterilização.” Tipicamente, os microrganismos presentes no MSW incluirão organismos que são adaptados ao ambiente local. O efeito benéfico geral da fermentação microbiana concomitante é comparativamente robusto, significando que uma variedade muito ampla de diferentes organismos pode, individual ou coletivamente, contribuir para a captura orgânica através da hidrólise enzimática do MSW. Sem se ater à teoria, considera- se que os micróbios de cofermentação têm individualmente algum efeito direto na degradação de resíduos de comida que não são necessariamente hidrolisados por enzimas celulase. Ao mesmo tempo, os monômeros e oligômeros de carboidrato liberados pela hidrólise de celulase, particularmente, são prontamente consumidos por virtualmente qualquer espécie microbiana. Isso gera uma sinergia benéfica com enzimas celulase, possivelmente através da liberação da inibição de produto das atividades de enzima e também possivelmente por outras razões que não são imediatamente aparentes. Os produtos finais do metabolismo microbiano em qualquer caso são tipicamente apropriados para substratos de biometano. O enriquecimento do MSW enzimaticamente hidrolisado em metabólitos microbianos é, assim, já, por si só, uma melhora na qualidade do substrato de biometano resultante. As bactérias de ácido láctico, particularmente, são abundantes na natureza e a produção de ácido láctico é tipicamente observada quando o MSW é enzimaticamente hidrolisado a um teor não aquoso entre 10 e 45% dentro da faixa de temperatura de 45 a 50. Em temperaturas maiores, possivelmente outras espécies de microrganismos de ocorrência natural podem predominar e outros metabólitos microbianos diferentes do ácido láctico podem se tornar mais prevalentes.

[084] Em algumas realizações, a fermentação microbiana pode ser realizada por uma inoculação direta com o uso de uma ou mais espécies microbianas. Será prontamente entendido por um versado na técnica que uma ou mais espécies bacterianas usadas para a inoculação de modo a fornecer a hidrólise enzimática e a fermentação simultâneas do MSW podem ser vantajosamente selecionadas em que as espécies bacterianas podem se desenvolver uma temperatura no ou próximo ao ideal para as atividades enzimáticas usadas.

[085] A inoculação da mistura de hidrólise de modo a induzir a fermentação microbiana pode ser realizada por uma variedade de meios diferentes.

[086] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular os MSW seja antes, após ou concomitantemente à adição de atividades enzimáticas ou à adição de microrganismos que exibem atividade de celulase extracelular. Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular com o uso de uma ou mais espécies de LAB incluindo mas sem limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Lactobacillus plantarum, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus carnis, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus pseudoplantarum, Lactobacillus agilis, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus uamanashiensis, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus divergens, Lactobacillus alactosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus sanfrancisco, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus ponti, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus confusus, Lactobacillus minor, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hilgardi, Lactobacillus kefir, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus vaccinostericus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus leichmanni, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salicinus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus suebicus, actobacillus oris, Lactobacillus brevis, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus panis, Lactococcus cremoris, Lactococcus dextranicum, Lactococcus garvieae, Lactococcus hordniae, Lactococcus raffinolactis, Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc oenos, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc pseudoesenteroides, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc carnosum, Pediococcus damnosus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus cervisiae, Pediococcus parvulus, Pediococcus halophilus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus intermedius, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus, Oenococcus oeni, Bifidobacterium breve, e Propionibacterium freudenreichii, ou com algumas espécies subsequentemente descobertas de LAB ou com outras espécies dos gêneros Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, ou Carnobacterium que exibem capacidade útil de processos metabólicos que produzem ácido láctico.

[087] Será prontamente entendido por um versado na técnica que uma preparação bacteriana usada para a inoculação pode compreender uma comunidade de diferentes organismos. Em algumas realizações, bactérias de ocorrência natural que existem em qualquer região geográfica dada e que são adaptadas para viver nos MSW daquela região podem ser usadas. Conforme é bem conhecido na técnica, LAB são ubíquas e tipicamente compreenderão um componente principal de qualquer comunidade bacteriana de ocorrência natural dentro dos MSW.

[088] Em algumas realizações, MSW podem ser inoculados com bactérias de ocorrência natural, por reciclagem continuada de águas de lavagem ou soluções de processo usadas para recuperar material orgânico residual de sólidos não degradáveis. À medida que as águas de lavagem ou soluções de processo são recicladas, as mesmas gradualmente adquirem níveis microbianos mais altos. Em algumas realizações, a fermentação microbiana tem um efeito de diminuição de pH, especialmente quando metabólitos compreendem ácidos graxos/ácidos carboxílicos de cadeia curta tais como formiato, acetato, butirato, proprionato ou lactato. Em conformidade, em algumas realizações, pode ser vantajoso monitorar e ajustar pH da mistura de fermentação microbiana e a hidrólise enzimática concomitante. Quando as águas de lavagem ou soluções de processo são usadas para aumentar o teor de água de MSW de entrada antes da hidrólise enzimática, a inoculação é vantajosamente realizada antes da adição de atividades enzimáticas, seja como preparações de enzimas isoladas ou como microrganismos que exibem atividade de celulase extracelular. Em algumas realizações, as bactérias de ocorrência natural adaptadas para viver em MSW de uma região particular podem ser cultivadas em MSW ou em componente orgânico liquefeito obtido por hidrólise enzimática de MSW. Em algumas realizações, bactérias de ocorrência natural cultivadas podem, então, ser adicionadas como um inóculo, seja separadamente ou suplementar à inoculação com o uso de soluções de processo ou águas de lavagem recicladas. Em algumas realizações, preparações bacterianas podem ser adicionadas antes ou concomitantemente à adição de preparações de enzimas isoladas, ou após algum período inicial de pré-hidrólise.

[089] Em algumas realizações, cepas específicas podem ser cultivadas para a inoculação, incluindo cepas que foram especialmente modificadas ou “treinadas” para viver sob condições de reação de hidrólise enzimática e/ou para enfatizar ou desenfatizar processos metabólicos particulares. Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de cepas bacterianas que foram identificadas como tendo capacidade para sobreviver em ftalatos como única fonte de carbono. Tais cepas incluem mas não têm limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Chryseomicrobium intechense MW10T, Lysinibaccillus fusiformis NBRC 157175, Tropicibacter phthalicus, Gordonia JDC-2, Arthrbobacter JDC-32, Bacillus subtilis 3C3, Comamonas testosteronii, Comamonas sp E6, Delftia tsuruhatensis, Rhodoccoccus jostii, Burkholderia cepacia, Mycobacterium vanbaalenii, Arthobacter keyseri, Bacillus sb 007, Arthobacter sp. PNPX-4-2, Gordonia namibiensis, Rhodococcus phenolicus, Pseudomonas sp. PGB2, Pseudomonas sp. Q3, Pseudomonas sp. 1131, Pseudomonas sp. CAT1-8, Pseudomonas sp. Nitroreducens, Arthobacter sp AD38, Gordonia sp CNJ863, Gordonia rubripertinctus, Arthobacter oxydans, Acinetobacter genomosp, e Acinetobacter calcoaceticus. Consulte, por exemplo, Fukuhura et al 2012; Iwaki et al. 2012A; Iwaki et al. 2012B; Latorre et al. 2012; Liang et al. 2010; Liang et al. 2008; Navacharoen et al. 2011; Park et al. 2009; Wu et al. 2010; Wu et al. 2011. Ftalatos, que são usados como plastificantes em muitas preparações de cloreto de poli vinila comerciais, são lixiviáveis e, na experiência dos presentes inventores, estão frequentemente presentes em componente orgânico liquefeito em níveis que são indesejáveis. Em algumas realizações, podem ser vantajosamente usadas cepas que foram geneticamente modificadas por métodos bem conhecidos na técnica, com a finalidade de enfatizar processos metabólicos e/ou desenfatizar outros processos metabólicos incluindo mas sem limitação a processos que consomem glicose, xilose ou arabinose.

[090] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de cepas bacterianas que foram identificadas como tendo capacidade para degradar lignina. Tais cepas incluem mas não têm limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Comamonas sp B-9, Citrobacter freundii, Citrobacter sp FJ581023, Pandorea norimbergensis, Amycolatopsis sp ATCC 39116, Streptomyces viridosporous, Rhodococcus jostii, e Sphingobium sp. SYK-6. Consulte por exemplo, Bandounas et al. 2011; Bugg et al. 2011; Chandra et al. 2011; Chen et al. 2012; Davis et al. 2012. Na experiência dos presentes inventores, MSW tipicamente compreendem um teor considerável de lignina, que é tipicamente recuperado como resíduo não digerido após AD.

[091] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de uma cepa bacteriana que produz acetato, incluindo mas sem limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Acetitomaculum ruminis, Anaerostipes caccae, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium carbinolicum, Acetobacterium wieringae, Acetobacterium woodii, Acetogenium kivui, Acidaminococcus fermentans, Anaerovibrio lipolytica, Bacteroides coprosuis, Bacteroides propionicifaciens, Bacteroides celulosolvens, Bacteroides xylanolyticus, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Butirivibrio fibrisolvens, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutilicum, Clostridium acidurici, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium butiricium, Clostridium cellobioparum, Clostridium formicaceticum, Clostridium histolyticum, Clostridium lochheadii, Clostridium methylpentosum, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium propionicum, Clostridium putrefaciens, Clostridium sporogenes, Clostridium tetani, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermocelum, Desulfotomaculum orientis, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Eubacterium limosum, Eubacterium ruminantium, Fibrobacter succinogenes, Lachnospira multiparus, Megasphaera elsdenii, Moorella thermoacetica, Pelobacter acetylenicus, Pelobacter acidigallici, Pelobacter massiliensis, Prevotella ruminocola, Propionibacterium freudenreichii, Ruminococcus flavefaciens, Ruminobacter amylophilus, Ruminococcus albus, Ruminococcus bromii, Ruminococcus champanellensis, Selenomonas ruminantium, Sporomusa paucivorans, Succinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinosolven, Syntrophomonas wolfei, Syntrophus aciditrophicus, Syntrophus gentianae, Treponema bryantii e Treponema primitia.

[092] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de uma cepa bacteriana que produz butirato, incluindo mas sem limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Acidaminococcus fermentans, Anaerostipes caccae, Bifidobacterium adolescentis, Butirivibrio crossotus, Butirivibrio fibrisolvens, Butirivibrio hungatei, Clostridium acetobutilicum, Clostridium aurantibutiricum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butiricium, Clostridium cellobioparum, Clostridium difficile, Clostridium innocuum, Clostridium kluyveri, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium proteoclasticum, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Clostridium tyrobutiricum, Coprococcus eutactus, Coprococcus comes, Escherichia coli, Eubacterium barkeri, Eubacterium biforme, Eubacterium celulosolvens, Eubacterium cylindroides, Eubacterium dolichum, Eubacterium hadrum, Eubacterium halii, Eubacterium limosum, Eubacterium moniliforme, Eubacterium oxidoreducens, Eubacterium ramulus, Eubacterium rectale, Eubacterium saburreum, Eubacterium tortuosum, Eubacterium ventriosum, Faecalibacterium prausnitzii, Fusobacterium prausnitzii, Peptostreptoccoccus vaginalis, Peptostreptoccoccus tetradius, Pseudobutirivibrio ruminis, Pseudobutirivibrio xylanivorans, Roseburia cecicola, Roseburia intestinalis, Roseburia hominis e Ruminococcus bromii.

[093] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de uma cepa bacteriana que produz propionato, incluindo mas sem limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Anaerovibrio lipolytica, Bacteroides coprosuis, Bacteroides propionicifaciens, Bifidobacterium adolescentis, Clostridium acetobutilicum, Clostridium butiricium, Clostridium methylpentosum, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium propionicum, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminocola, Propionibacterium freudenreichii, Ruminococcus bromii, Ruminococcus champanellensis, Selenomonas ruminantium e Syntrophomonas wolfei.

[094] Em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular MSW com o uso de uma cepa bacteriana que produz etanol, incluindo mas sem limitação a qualquer um ou mais dentre os seguintes, ou variantes geneticamente modificadas dos mesmos: Acetobacterium carbinolicum, Acetobacterium wieringae, Acetobacterium woodii, Bacteroides celulosolvens, Bacteroides xylanolyticus, Clostridium acetobutilicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butiricium, Clostridium cellobioparum, Clostridium lochheadii, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium thermocelum, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermosaccharolyticum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Lachnospira multiparus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Paenibacillus macerans, Pelobacter acetylenicus, Ruminococcus albus, Thermoanaerobacter mathranii, Treponema bryantii e Zymomonas mobilis.

[095] Em algumas realizações, um consórcio de diferentes micróbios, opcionalmente incluindo diferentes espécies de bactérias e/ou fungos, pode ser usado para alcançar fermentação microbiana concomitante. Em algumas realizações, microrganismos adequados podem ser selecionados com a finalidade de fornecer um resultado metabólico desejado nas condições de reação pretendidas e, então, inoculados em um nível de dose alto com a finalidade de sobrepujar cepas de ocorrência natural. Por exemplo, em algumas realizações, pode ser vantajoso inocular com o uso de um produtor de lactato homofermentativo, visto que isso fornece um potencial de metano eventual mais alto em um substrato de biometano resultante do que pode ser fornecido por um produtor de lactato heterofermentativo...

[096] Em algumas realizações, a invenção provê um método de processamento de resíduo sólido urbano (MSW) compreendendo as etapas de (i) . provisão de MSW em um teor não aquoso entre 5 e 40% e em uma temperatura dentro da variação 35 e 75 °C, (ii) . submeter as partes biodegradáveis do MSW a fermentação microbiana e hidrólise enzimática em uma temperatura dentro da variação 35 e 75 °C resultando em liquefação parcial de partes biodegradáveis do resíduo e acúmulo de metabólitos microbianos, seguido por (iii) . separação das partes liquefeitas, biodegradáveis do resíduo de sólidos não biodegradáveis para produzir uma pasta fluida biodegradável caracterizada por compreender sólidos voláteis dissolvidos dos quais pelo menos 25% em peso compreendem qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formato, lactato e/ou propionato, opcionalmente, seguido por (iv) . digestão anaeróbica do biolíquido para produzir biometano.

[097] Após algum período de hidrólise enzimática e fermentação microbiana concomitante, MSW provido em um teor não aquoso entre 10 e 45% é transformado, de modo que componentes biogênicos ou “fermentáveis” se tornem liquefeitos e metabólitos microbianos se acumulem na fase aquosa. Após algum período de hidrólise enzimática e fermentação microbiana concomitante, as partes liquefeitas, fermentáveis do resíduo são separadas de sólidos não fermentáveis. O material liquefeito, uma vez separado dos sólidos não fermentáveis, é o que denomina “pasta fluida biodegradável”. Em algumas realizações, pelo menos 40% do teor não aquoso dessa pasta fluida biodegradável compreende sólidos voláteis dissolvidos, ou pelo menos 35%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 25%. Em algumas realizações, pelo menos 25% em peso dos sólidos voláteis dissolvidos na pasta fluida biodegradável compreendem qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formato, lactato, e/ou propionato, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 35% ou pelo menos 40%. Em algumas realizações, pelo menos 70% em peso dos sólidos voláteis dissolvidos compreende lactato, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 25%.

[098] Em algumas realizações, a separação de sólidos não fermentáveis de partes liquefeitas, degradáveis do MSW, de modo a produzir uma pasta fluida biodegradável caracterizada por compreender sólidos voláteis dissolvidos dos quais pelo menos 25% em peso compreende qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formato, lactato e/ou propionato é conduzida em menos que 16 horas após o início da hidrólise enzimática, ou em menos que 18 horas, ou menos que 20 horas, ou em menos que 22 horas, ou em menos que 24 horas, ou em menos que 30 horas, ou em menos que 34 horas, ou em menos que 36 horas, ou entre 36 e 48 horas, ou entre 48 e 60 horas, ou entre 60 e 72 horas.

[099] A separação de partes liquefeitas, degradáveis do resíduo de sólidos não degradáveis pode ser alcançada por uma variedade de meios. Em algumas realizações, isso pode ser alcançado utilizando qualquer combinação de pelo menos duas operações de separação diferentes, incluindo, entre outros, operações de prensa helicoidal, operações de separador balístico, operações de peneira de vibração, ou outras oprações de separação conhecidas na técnica. Em algumas realizações, os sólidos não degradáveis separados de partes biodegradáveis do resíduo compreendem em média pelo menos cerca de 20% do peso seco do MSW processado, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 30%. Em algumas realizações, os sólidos não degradáveis separados de partes degradáveis do resíduo processado compreendem em média pelo menos 20% em peso seco de materiais recicláveis, ou pelo menos 25%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 35%. Em algumas realizações, a separação utilizando pelo menos duas operações de separação produz uma pasta fluida biodegradável que compreende pelo menos 0,15 kg de sólidos voláteis por kg de MSW processado, ou pelo menos 0,10. Será prontamente entendido por um técnico no assunto que a composição biogênica inerente de MSW é variável. Não obstante, a figura de 0,15 kg de sólidos voláteis por kg de MSW processado reflete uma captura total de material biogênico em MSW não separado típico de pelo menos 80% em peso seco. O cálculo de kg de sólidos voláties capturados na pasta fluida biodegradável por kg de MSW processado pode ser estimado por um período de tempo no qual os rendimentos totais e MSW processado total são determinados. Por um determinado período, a produção média de pasta fluida biogênica obtida pode ser calculada =kg de pasta fluida/H; a produção média de MSW é calculada =kg de MSW/H; o teor de VS médio da pasta fluida é analisado e o resultado expresso como VS% de massa total; o kg de VS é calculado como kg de pasta fluida/H * VS% = kg de VS/H

[0100] Então, kg de VS/H/kg de MSW/H = kg de VS/kg de MSW.

[0101] Em algumas realizações, após a separação de sólidos não degradáveis de partes liquefeitas, fermentáveis do MSW ser alcançada para produzir uma pasta fluida biodegradável, a pasta fluida pode ser submetida a pós-fermentação sob diferentes condições, incluindo temperatura ou pH diferente.

[0102] O termo “sólidos voláteis dissolvidos”, conforme usado no presente documento se refere a uma medição simples calculada como segue: A amostra de pasta fluida biodegradável é centrifugada a 6900 g por 10 minutos em um tubo Falcon de 50 ml para produzir um pélete e um sobrenadante. O sobrenadante é decantado e o peso líquido do pélete expresso como uma fração de porcentagem do peso inicial total da amostra líquida. A amostra de sobrenadante é seca em 60 graus por 48 horas para determinar o teor de matéria seca. O teor de sólidos voláteis da amostra de sobrenadante amostra é determinado ao subtrair da medição de matéria seca a cinza restante após a queima em fornalha a 550 °C e expresso como uma porcentagem em massa como sólidos voláteis dissolvidos em %. O teor de matéria seca do pélete é determinado por secagem a 60 °C por 48 horas. A parte líquida do pélete sendo (1-matéria seca do pélete) é expressa como uma porcentagem de massa do pélete. A composição da parte líquida do pélete é estimada por ser semelhante ao sobrenadante. Assim, os sólidos voláteis dissolvidos totais da amostra é a soma dos sólidos voláteis dissolvidos do sobrenadante e a (porcentagem de massa da parte líquida do pélete)x(o sólido volátil dissolvido do sobrenadante).

[0103] Em algumas realizações, a invenção provê composições e métodos para produção de biometano. A discussão detalhada anterior referente às realizações dos métodos de processamento de MSW, incluindo detalhes referentes aos aspectos de composição da pasta fluida biodegradável obtida, podem ser aplicados opcionalmente às realizações que provêem métodos e composições ara produção de biometano. Em algumas realizações, quaisquer dos detalhes referentes aos aspectos de composição da pasta fluida biodegradável podem ser obtidos por um processo no qual MSW não separado submetido à fermentação microbiana é submetido à separação de sólidos não degradáveis para produzir uma pasta fluida biodegradável, essa pasta fluida é, então, submetida à fermentação continuada em uma temperatura dentro da variação de 35 a 75 °C, ou entre 40 e 55 °C, ou entre 45 e 50 °C, em um pH dentro da variação 4,2 a 6,0 por um tempo entre 1 e 72 horas. Em algumas realizações, essa fermentação continuada é suplementada em que material biodegradável recuperado por peneiras ou outros sistemas, como o material não foi parte tecnicamente da pasta fluida biodegradável recuperada inicialmente, pode ser adicionada à pasta fluida.

[0104] As dinâmicas metabólicas das comunidades microbianas engajadas na digestão anaeróbica são complexas. Consulte Supaphol et al. 2010; Morita e Sasaki 2012; Chandra et al. 2012. Na digestão anaeróbica (AD) típica para a produção do biogás de metano, os processos biológicos mediados por microrganismos alcançam quatro etapas primárias - hidrólise de macromoléculas biológicas em monômeros constituintes ou outros metabólitos; acidogênese, através da qual álcoois e ácidos de hidrocarboneto de cadeia curta são produzidos; acetogênese, através da qual os nutrientes disponíveis são catabolizados em ácido acético, hidrogénio e dióxido de carbono; e metanogênese, através da qual o ácido acético e hidrogênio são catabolizados por arquebactérias especializadas em metano e dióxido de carbono. A etapa de hidrólise é tipicamente limitante de taxa. Consulte, por exemplo, Delgenes et al. 2000; Angelidaki et al. 2006; Cysneiros et al. 2011.

[0105] Consequentemente, é vantajoso na preparação de substratos para a produção de biometano que esses sejam hidrolisados anteriormente através de alguma forma de pré-tratamento. Em algumas realizações, os métodos da invenção combinam a fermentação microbiana com a hidrólise enzimática de MSW tanto como um pré-tratamento biológico rápido para a produção de biometano eventual assim como um método para separar os componentes orgânicos degradáveis do MSW não separado.

[0106] Os pré-tratamento biológico foram relatados com o uso de substratos de biometano sólidos incluindo o componente orgânico separado por fonte do MSW. Consulte, por exemplo, Fdez-Guelfo et al. 2012; Fdez-Guelfo et al. 2011 A; Fdez-Guelfo et al. 2011 B; Ge et al. 2010; Lv et al. 2010; Borghi et al. 1999. Melhoras nos rendimentos de metano eventuais da digestão anaeróbica foram relatadas como uma consequência da degradação aumentada de biopolímeros complexos e solubilização aumentada de sólidos voláteis. Entretanto, o nível de solubilização de sólidos voláteis e o nível de conversão de ácidos graxos voláteis alcançados por esses métodos relatados anteriormente nem mesmo se aproximam dos níveis alcançados pelos métodos da invenção. Por exemplo, Fdez-Guelfo et al. 2011 A relata uma melhora relativa de 10 a 50% na solubilização de sólidos voláteis alcançada através de vários pré-tratamentos biológicos da fração orgânico pré- separada do MSW - isso corresponde aos níveis absolutos finais da solubilização entre cerca de 7 a 10% de sólidos voláteis. Em contraste, os métodos da invenção produzem substratos de biometano líquidos que compreendem pelo menos 40% de sólidos voláteis dissolvidos.

[0107] Os sistemas de digestão anaeróbica de dois estágios foram também relatados nos quais o processo de primeiro estágio hidrolisa substratos de biometano incluindo o componente orgânico separado por fonte do MSW e outros substratos biogênicos especializados. Durante o primeiro estágio anaeróbico, que é tipicamente termofílico, polímeros de cadeia superior são degradados e ácidos graxos voláteis produzidos. Isso é seguido por um segundo estágio anaeróbico conduzido em um reator fisicamente separado no qual a metanogênese e a acetogênese dominam. Os sistemas de digestão anaeróbica de dois estágios relatados utilizaram tipicamente substratos biogênicos especializados separados por fonte que têm menos do que 7% de sólidos totais. Consulte, por exemplo, Supaphol et al. 2011; Kim et al. 2011; Lv et al. 2010; Riau et al. 2010; Kim et al. 2004; Schmit e Ellis 2000; Lafitte- Trouque e Forster 2000; Dugba e Zhang 1999; Kaiser et al. 1995; Harris e Dague 1993. Mais recentemente, alguns sistemas AD de dois estágios foram relatados que utilizam substratos biogênicos especializados separados por fonte a níveis tão altos quanto 10% de sólidos totais. Consulte, por exemplo, Yu et al. 2012; Lee et al. 2010; Zhang et al.2007. Certamente, nenhum dos sistemas de digestão anaeróbica de dois estágios relatados jamais contemplou o uso de MSW não separado como um substrato, muito menos a fim de produzir um substrato de biometano líquido de alto teor de sólidos. A digestão anaeróbica de dois estágios procura converter substratos sólidos, alimentando continuamente sólidos adicionais ao e removendo continuamente ácidos graxos voláteis do reator de primeiro estágio.

[0108] Em algumas realizações, o método de produção de biometano compreende as etapas de (i). provisão de um substrato de biometano líquido precondicionado por fermentação microbiana de modo que pelo menos 40% em peso do teor não aquoso exista como sólidos voláteis dissolvidos, tais sólidos voláteis dissolvidos compreendem pelo menos 25% em peso de qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formiato, lactato e/ou propionato, (ii). transferência do substrato líquido para um sistema de digestão anaeróbica, seguido por (iii). condução de digestão anaeróbica do substrato líquido para produzir biometano.

[0109] Em algumas realizações, a invenção fornece um substrato de biometano líquido produzido por hidrólise enzimática e fermentação microbiana de resíduos sólidos urbanos (MSW), ou de biomassa lignocelulósica pré- tratada, alternativamente, compreende MSW microbianamente fermentados e enzimaticamente hidrolisados, ou compreende biomassa lignocelulósica pré-tratada microbianamente fermentada e enzimaticamente hidrolisada caracterizada em que - pelo menos 40% em peso do teor não aquoso existe como sólidos voláteis dissolvidos, tais sólidos voláteis dissolvidos compreendem pelo menos 25% em peso de qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formiato, lactato e/ou propionato.

[0110] Em algumas realizações, a invenção provê um substrato de biogás líquido orgânico produzido pela hidrólise enzimática e fermentação microbiana do resíduo sólido urbano (MSW), caracterizado em que - pelo menos 40% em peso do teor não aquoso existe como sólidos voláteis dissolvidos, tais sólidos voláteis dissolvidos compreendem pelo menos 25% em peso de qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formiato, lactato e/ou propionato.

[0111] Em algumas realizações, a invenção provê um método para produzir biogás compreendendo as etapas de (i) . provisão de um biogás de líquido orgânico precondicionado pela fermentação microbiana de modo que pelo menos 40% em peso do teor não aquoso exista como sólidos voláteis dissolvidos, tais sólidos voláteis dissolvidos compreendem pelo menos 25% em peso de qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formiato, lactato e/ou propionato, (ii) . transferência do substrato líquido em um sistema de digestão anaeróbica, seguido por (iii) . condução de digestão anaeróbica do substrato líquido para produzir biometano.

[0112] Conforme usado no presente documento, o termo “sistema de digestão anaeróbica” se refere a um sistema de fermentação que compreende um ou mais reatores operados sob condições de aeração controlada em que o gás metano é produzido em cada um dos reatores que compreende o sistema. O gás metano é produzido até o ponto em que a concentração de metano dissolvido metabolicamente gerado na fase aquosa da mistura de fermentação dentro do “sistema de digestão anaeróbica” seja saturado nas condições usadas e o gás metano seja emitido do sistema.

[0113] Em algumas realizações, o “sistema de digestão anaeróbica” é um sistema de filtro fixo. Um “sistema de filtro fixo de digestão anaeróbica” se refere a um sistema em que um consórcio de digestão anaeróbica é imobilizado, opcionalmente em um biofilme, em uma matriz de suporte físico.

[0114] Em algumas realizações, o substrato de biometano líquido compreende pelo menos 8% de sólidos totais, ou pelo menos 9% de sólidos totais, ou pelo menos 10% de sólidos totais, ou pelo menos 11% de sólidos totais, ou pelo menos 12% de sólidos totais, ou pelo menos 13% de sólidos totais. “Sólidos totais”, conforme usado no presente documento, se refere tanto a sólidos solúveis quanto insolúveis e efetivamente significa “teor não aquoso.” Sólidos totais são medidos por secagem a 60 oC até que um peso constante seja alcançado.

[0115] Em algumas realizações, a fermentação microbiana é conduzida sob condições que desestimulam a produção de metano por metanogênios, por exemplo, em pH inferior a 6,0, ou em pH inferior a 5,8, ou em pH inferior a 5,6, ou em pH inferior a 5,5. Em algumas realizações, o substrato de biometano líquido compreende menos do que condições de saturação de metano dissolvido. Em algumas realizações, o substrato de biometano líquido compreende menos de 15 mg/l metano dissolvido, ou menos de 10 mg/l, ou menos de 5 mg/l.

[0116] Em algumas realizações, antes da digestão anaeróbica para produzir biometano, um ou mais componentes dos sólidos voláteis dissolvidos podem ser removidos do substrato de biometano líquido por destilação, filtração, eletrodiálise, ligação específica, precipitação ou outros meios bem conhecidos na técnica. Em algumas realizações, o etanol ou lactato pode ser removido do substrato de biometano líquido antes da digestão anaeróbica para produzir biometano.

[0117] Em algumas realizações, um substrato sólido tal como MSW ou fração de fibra da biomassa lignocelulósica pré-tratada é submetido à hidrólise enzimática concomitantemente à fermentação microbiana com a finalidade de produzir um substrato de biometano líquido precondicionado por fermentação microbiana de modo que pelo menos 40% em peso do teor não aquoso exista como sólidos voláteis dissolvidos, tais sólidos voláteis dissolvidos compreendem pelo menos 25% em peso de qualquer combinação de acetato, butirato, etanol, formiato, lactato e/ou propionato. Em algumas realizações, um substrato de biometano líquido que tem as propriedades mencionadas acima é produzido por fermentação microbiana e hidrólise enzimática concomitante de material orgânico liquefeito obtido dos MSW não separados por um processo de autoclave. Em algumas realizações, a biomassa lignocelulósica pré-tratada pode ser misturada com MSW microbianamente fermentados e enzimaticamente hidrolisados, opcionalmente de tal maneira que a atividade enzimática do biolíquido derivado de MSW forneça a atividade enzimática para a hidrólise do substrato lignocelulósico para produzir um substrato de biometano líquido compósito derivado tanto dos MSW quanto da biomassa lignocelulósica pré-tratada.

[0118] “Biomassa lignocelulósica macia” se refere a biomassa vegetal diferente de madeira que compreende celulose, hemicelulose e lignina. Qualquer biomassa lignocelulósica macia adequada pode ser usada, incluindo biomassas tais como pelo menos palha de trigo, palha de milho, espigas de milho, cachos de frutas vazios, palha de arroz, palha de aveia, palha de cevada, palha de canola, palha de centeio, sorgo, sorgo doce, palha de soja, painço amarelo, grama de Bermuda e outras gramas, bagaço, polpa de beterraba, fibra de milho, ou quaisquer combinações dos mesmos. A biomassa lignocelulósica pode compreender outros materiais lignocelulósicos tais como papel, papel de jornal, papelão, ou outros resíduos urbanos ou de escritório. A biomassa lignocelulósica pode ser usada como uma mistura de materiais provenientes de diferentes matérias-primas, pode ser fresca, parcialmente seca, totalmente seca ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas realizações, os métodos da invenção são praticados com o uso de pelo menos cerca de 10 kg de matéria-prima de biomassa, ou pelo menos 100 kg, ou pelo menos 500 kg.

[0119] A biomassa lignocelulósica geralmente deve ser pré-tratada por métodos conhecidos na técnica antes de se conduzir a hidrólise enzimática e precondicionamento microbiano. Em algumas realizações, a biomassa é pré-tratada por pré-tratamento hidrotérmico. “Pré-tratamento hidrotérmico” se refere ao uso de água, seja como líquido quente, vapor d’água ou vapor pressurizado que compreende vapor ou líquido de alta temperatura ou ambos, para “cozinhar” a biomassa, a temperaturas de 120 °C ou mais, seja com ou sem a adição de ácidos ou outros produtos químicos. Em algumas realizações, as matérias-primas de biomassa lignocelulósica são pré-tratadas por auto-hidrólise. “Auto- hidrólise” se refere a um processo de pré-tratamento em que o ácido acético liberado por hidrólise de hemicelulose durante o pré-tratamento adicionalmente catalisa a hidrólise de hemicelulose e aplica a qualquer pré-tratamento hidrotérmico de biomassa lignocelulósica conduzido em pH entre 3,5 e 9,0.

[0120] Em algumas realizações, biomassa lignocelulósica hidrotermicamente pré-tratada pode ser separada em uma fração líquida e uma fração sólida. “Fração sólida” e “fração líquida” se referem ao fracionamento de biomassa pré-tratada em separação sólido/líquido. O líquido separado é coletivamente denominado “fração líquida.” A fração residual que compreende um teor considerável de sólido insolúvel é denominado “fração sólida”. Seja a fração sólida ou a fração líquida ou ambas combinadas podem ser usadas para praticar os métodos da invenção ou para produzir composições da invenção. Em algumas realizações, a fração sólida pode ser lavada.

EXEMPLO1.CAPTURADEBIODEGRADÁVELEMUMAPASTA FLUIDABIOGÊNICAOBTIDAPORHIDRÓLISEMICROBIANAE FERMENTAÇÃODEMSWSEMATIVIDADEDECELULASESUPLEMENTARDE PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0121] Experimentos foram conduzidos na usina de demonstração REnescience situada em Amager ressource center (ARC), Copenhagen, Dinamarca. Um desenho esquemático que mostra os recursos principais da usina é mostrado na Figura 4. O conceito da Refinaria de Resíduos ARC REnescience é separar MSW em quatro produtos. Um biolíquido para a produção de biogás, materiais inertes (vidro e areia) para reciclar e frações de 2D e 3D de materiais inorgânicos adequados para a produção de RDF ou reciclagem de metais, plásticos e árvore.

[0122] MSW de áreas urbanas é coletado como é em sacos plásticos. O MSW é transportado à Refinaria de Resíduo REnescience onde é armazenado em um silo até o processamento. Dependendo do caráter do MSW, uma etapa de separação pode ser instalada na frente do sistema REnescience para retirar partículas sobredimensionadas (acima de 500 mm).

[0123] Conforme apresentado na Figura 1, um fluxo de MSW não separado é aquecido e seu teor não aquoso ajustado pela adição de solução aquosa aquecida. Em incorporações anteriores do processo de REnescience, contamos com a atividade de celulase provida pelas preparações de enzima isolada para facilitar a degradação rápida do componente biodegradável. Préviamente, foram adicionadas preparações de enzima isolada ao resíduo aquecido em um teor não aquoso adequado. O resíduo, com enzimas adicionadas, foi, então, previamente incubado em um reator denominado um “reator de enzima” semelhante ao descrito no documento WO2011/032557, incluindo uma câmara que gira em um eixo geométrico substancialmente horizontal, equipado com acessórios em sua superfície interna que forma um arranjo em espiral, que movimenta o MSW continuamente da extremidade de entrada para a de saída.Dependendo do grau ao qual o reator está preenchido, e dependendo do tamanho do reator, o “tempo de residência” médio de MSW dentro do reator pode ser controlado. O reator foi equipado com elementos de aquecimento, de modo que uma tempertaura adequada possa ser mantida.

[0124] Enquanto introduz continuamente MSW no reator e remove parcialmente, de maneira contínua, MSW degradado do reator, um determinado tempo de residência médio é obtido. MSW parcialmente degradado removido do reator é. então, submetido a duas etapas de separação diferentes. Primeiro, um separador balístico tendo peneiras de 40 mm é aplicado para produzir um fluxo de pasta fluida biogênica, assim como uma fração não degradável 3D e uma fração não degradável 2D. Em segundo lugar, a fração não degradável 2D é, ainda, submetida a desumidificação utilizando uma prensa helicoidal, com a recuperação de pasta fluida biogênica adicional que é, por sua vez, misturada com a pasta fluida obtida da etapa de separador balístico.

[0125] A pasta fluida biogênica obtida é, então, submetida à separação “fina” adicional utilizando duas peneiras de vibração, a primeira tendo peneiras de 8 mm, que separa principalmente contaminantes não degradáveis. A segunda peneira de vibração, tendo peneiras de 3 mm, tipicamente separa fibras maiores, que compreendem uma quantidade considerável de material biodegradável. Após passara através da peneira de 3 mm, a pasta fluida biogênica obtida é armazenada em um grande tanque que é equipado com células de carga, permitindo um registro preciso da massa de pasta fluida biogênica obtida dentro de um determinado período de tempo.

[0126] A fração 2D sólida desumidificada é, então, submetida a um mecanismo de lavagem contra-corrente para limpar a fração 2D e, também, recuperar material biodegradável adicional que, de outra forma, seria perdido - A fração 2D sólida desumidificada é, então, submetida a um mecanismo de lavagem contra-corrente de dois estágios em tambores para limpar a fração 2D e, também, recuperar material biodegradável adicional que, de outra forma, seria perdido. Os detalhes são providos na Figura 1, que apresenta os fluxos de água no sistema. Água fresca é aplicada à lavgem de material não degradável 3D recuperado do separador balístico em um tambor simples. Essa água de lavagem, então, é usada como água “limpa” que é alimentada à segunda das duas unidades de lavagem idênticas, de modo a prover lavagem contra-corrente - a nova água “limpa” encontra o lixo “mais limpo”, enquanto, consecutivamente, mais água suja é aplicada ao lixo “mais sujo” de entrada. O mecanismo de lavagem funciona como segue: a sujeira 2D entra em um tambor na primeira unidade de lavagem, onde o resíduo é misturado à água de lavagem contra-corrente. Adicionalmente, a água de lavagem suja é submetida à filtração de peneira tendo peneiras de 0,04 a 0,08 mm, para remover fibras, que compreendem tipicamente material biodegradável principalmente. Areia e material pesado também é removido por sedimentação e um condutor helicoidal no fundo de cada unidade de lavagem. A fração removida é principalmemte areia/vidro/plástico duro/e outros inorgânicos. Após a primeira lavagem, o resíduo pe movimentado por uma broca helicoidal a uma segunda unidade de lavagem, que é idêntica à primeira. A água de lavagem da primeira unidade de lavagem tem tipicamente entre 1 - 4 % em peso de TS, enquanto a água de lavagem da segunda unidade de lavagem tem tipicamente 0,5 -3,0% em peso.

[0127] As águas de lavagem, que compreendem um pouco de material biodegradável recuperado do MSW, assim como os micro-organismos associados, foram, então, armazenadas em um tanque de “tampão”. A solução aquosa desse tanque de “tampão” foi, então, previamente utilizada para ajustar o teor não aquoso do MSW de entrada. Previamente, tipicamente, primeiro, aquecemos a solução do tanque de “tampão” ao aplicar vapor, então, a mistura da solução aquecida com MSW de entrada, de modo a aquecer simultaneamente a uma temperatura adequada e, também, ajustar o teor não aquoso.

[0128] Conforme é explicado nos exemplos apresentados subsequentemente a esse exemplo 1, determinamos previamente que a inoculação do MSW de entrada provido pelas águas de lavagem recirculadas melhorou o que denominados de captura de biodegradável que é alcançada com a assistência de hidrólise enzimática utilizando preparações de celulase isolada. Por “captura de biodegradável”, significa que a massa de sólidos voláteis que é capturada na pasta fluida biogênica, que é tipicamente expressa como kg de VS (sólidos voláteis)/kg de MSW processado.

[0129] Nesse experimento, buscamos testar quão eficaz a captura de biodegradável seria se não aplicássemos qualquer preparação de enzima isolada, mas, ao contrário, simplesmente aplicou-se um inóculo de micro-organismos naturalmente presentes no MSW, para alcançar uma degradação rápida por hidrólise microbiana e fermentação.

[0130] Para este fim, ajustamos o tanque de “tampão”, do qual solução de pagua de lavagem recirculada pe coletada para ajustar o teor não aquoso do MSW de entrada, com um sistema trocador de calor, a fim de ser utilizado como um fermentador que mantém uma temperatura de 45 °C, para promover crescimento bacteriano. O tanque de “tampão” é equipado com um sistema de agitação eficaz compreendendo um eixo geométrico vertical montado no centro equipeado com dois conjuntos de ventoinhas incluídas ao eixo geométrico. Os dois conjuntos de ventoinhas atingem dois terços do diâmetro do tanque e são incluídos em uma altura no eixo correspondente a um quarto da distância do fundo do tanque e três quartos da distância do fundo do tanque. A fim de evitar aquecimento do “inóculo” coletado do tanque de tampão/fermentador, de modo que possa aquecer os micro-organismos, utilizamos diferentes procedimentos para aquecer o MSW de entrada comparado aos procedimentos normais utilizados ao aplicar preparações de enzima isolada.

[0131] O ensaio de dezessete (17) dias documentado nesse exemplo foi dividido em cinco seções, conforme apresentado na Tabela 2. TABELA2.EVOLUÇÃOTEMPORALDOENSAIODEHIDRÓLISE MICROBIANA E FERMENTAÇÃO Tempo (horas) % de enzima Comentário adicionada

[0132] MSW não separado obtido de Copenhague, Dinamarca foi carregado continuamente na usina demonstrativa REnescience. A preparação de enzima isolada utilizada foi uma preparação de celulase disponível comercialmente otimizada para conversão de biomassa lignocelulósica e provida por NOVOZYMES ™ sob o nome comercial CELLIC CTEC 3 ™. Por períodos nos quais a preparação de celulase isolada foi utilizada, uma quantidade corresondente a 9 g de preparação de enzima foi adicionada para cada kg de MSW de entrada (0,9% em peso).

[0133] As configurações para a operação foram como segue para ambos os períodos nos quais a preparação de enzima comercial isolada foi adicionada: - Introduzido um fluxo de MSW de entrada ao reator de enzima na taxa de 280 kg de MSW/h - Ajustado o teor não aquoso do fluxo de MSW de entrada ao adicionar uma solução de água de lavagem recirculada, que foi armazenada no tanque de tampão em temperatura ambiente, então, aquecida a aproximadamente 75 °C no aquecedor de água na taxa de 560 L de água/h - Introduzido CTEC 3 ™ ao fluxo de MSW de entrada em 0,9% em peso correspondente à atividade de celulase de aproximadamente 670 FPU por L teor de água do MSW molhado - Executou-se o reator de enzima de modo a alcançar um tempo de retenção médio de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 50 °C, com pH ajustado utilizando CaCO3 para dentro da variação de pH 4,5 - 5.

[0134] Durante o período de “manutenção”, o reator foi interrompido. No fim desse período, aproximadamente 2000 kg de conteúdo foram removidos do reator de enzima bantes de proceder com a operação contínua no período “sem enzimas”.

[0135] O período mencionado como “tempo de elevação” sem enzimas se refere ao período durante o qual CTEC3 residual foi removido do sistema.

[0136] As configurações para a operação durante o período sem enzimas (isto é, para “tempo de elevação” e “fermentação microbiana somente”) como segue: - Introduzido um fluxo de MSW de entrada ao reator de enzima/fermentador microbiano na taxa de 130 kg de MSW/h - Ajustado o teor não aquoso do fluxo de MSW de entrada pela adição de um inóculo, compreendendo uma solução de água de lavagem recirculada coletada do tanque de tampão/fermentador, que foi mantido a 45 °C e agitado continuamente utilizando o agitator descrito acima, executando a cerca de 30 rpm, e em que os substratos foram adicionados para promover o crescimento bacteriano e expressão de enzima de celulase, incluindo aproximadamente 1% em peso de extrato de levedura, aproximadamente 1% em peso de glicose/sucrose misturadas, e aproximadamente 1% em peso de celulose microcristalina (nome comercial AVICEL ™). Esse “inóculo” foi coletado por meio do aquecedor de água mantido em aproximadamente 45 °C na taxa de 260 L de água/h - Executouo-se o reator de enzima/fermentador microbiano (OBSERVAÇÃO explica o tempo de retenção), de modo a alcançar um tempo de retenção médio de aproximadamente 36 horas em aproximadamente 45 °C, com pH ajustado utilizando CaCO3 para dentro da variação 4,5 - 5.

[0137] As amostras foram obtidas em pontos no tempo selecionado no seguintes lugares: - A pasta fluida biogênica obtida após a passagem da peneira peneira de 3 mm, que é denominado “EC12B” - Material retido pela peneira de 8 mm - Material retido pela peneira de 3 mm - Material retido pela peneira de Fibra 1 aplicada a águas de lavagem - Material retido pela peneira de Fibra 2 aplicada a águas de lavagem - Água de lavagem amostrada após limpeza das peneiras de Fibra - Fração 2D não degradável - Fração 3D não degradável - Fração de fundo inerte de ambas as unidades de lavagem

[0138] A produção de pasta fluida biogênica foi medida com células de carga no tanque de armazenamento. O fluxo de entrada de águas frescas foi medido com medidores de fluxo. As outras frações foram pesadas separadamente em uma escala, de modo que os fluxos de massa total para qualquer determinado período de tempo possam ser contados.

[0139] Para o objetivo de análise de teor, amostras também foram obtidas em pontos no tempo selecionados de EC12B, do tanque de tampão/fermentador, e do reator de enzima/reator de fermentação microbiana. Essas amostras foram fervidas, de modo a interromper a atividade microbiana e enzimática.

[0140] A Figura 2 apreseta a soma dos metabólitos microbianos lactato, acetato e etanol, expressos como uma concentração em gramas por litro, em amostras de pasta fluida biogênica obtidas em diversos pontos no tempo. Conforme apresentado, durante o primeiro período com atividade de celulase adicionada, entre as horas 1 e 153, o nível de metabólitos microbianos eleva gradualmente até se tornar relativamente estável a cerca de 35 g/L. Durante o período com fermentação microbiana somente, entre as horas 250 e 319, o nível de metabólitos foi um tanto menor, mas estável em cerca de 27-30 g/L. Durante o segundo período com atividade de celulase adicionada, entre as horas 319 e 390, o nível de metabólitos parece ser aumentado em relação ao primeiro período com atividade de celulase adicionada para entre 35-40 g/L.

[0141] Esses resultados indicam, por um lado, que poderia ser vantajoso incluir alguma atividade de celulase suplementar com fermentação microbiana. Por outro lado, esses resultados também indicam que o inóculo utilizado foi suficiente para promover degradação rápida do MSW utilizando somente fermentação microbiana.

[0142] A Figura 3 apresenta a captura de biodegradável em kg de TS (Sólidos totais)/kg de MSW para diversos períodos de tempo. Normalmente, a captura orgânica é determinada em termos de sólidos voláteis (VS). Essas amostras foram obtidas e os resultados podem ser providos pós-depósito. Aqui, os resultados são apresentados em termos de TS, que inclui teor de cinza.

[0143] A Figura 3(A) apresenta a captura de biodegradável em kg de TS/kg de MSW em amostras de pasta fluida biogênica obtidas após a passagem através da peneira de 3 mm denominada “EC12B”. Por um determinado período, a produção média de pasta fluida biogênica obtida após a passagem através da peneira de 3 mm denominada “EC12B” pe calculada =kg de pasta fluida/H; a produção média de MSW é calculadas =kg de MSW/H; o teor de VS médio da pasta fluida é analisado e o resultado expresso como % de VS da massa total; o kg de VS é calculado como kg de pasta fluida/H * % de VS = kg VS/H

[0144] Então, kg de VS/H/kg de MSW/H = kg de VS/kg de MSW. Durante o período com fermentação microbiana somente, entre horas 250 e 319, as figuras foram corrigidas, de modo a não contar a massa de substratos especiais adicionados ao tanque de tampão/fermentador. Conforme apresentado, durante o primeiro período com atividade de celulase adicionada, entre horas 1 e 153, o nível de captura de biodegradável na pasta fluida biogênica obtida após a peneira de 3 mm foi de cerca de 0,21-0,25 kg de TS/kg de MSW. Durante o período com fermentação microbiana somente, entre as horas 250 e 319, o nível de “captura orgânica” na pasta fluida biogênica obtida após a peneira de 3 mm foi claramente diminuído para cerca de 0,10 a 0,15 kg de TS/kg de MSW. Durante o segundo período com atividade de celulase adicionada, entre as horas 319 e 390, o nível de captura de biodegradável na pasta fluida biogênica obtida após a peneira de 3 mm foi semelhante ao observado durante o primeiro período com atividade de celulase adicionada, em cerca de 0,21 - 0,25 kg de TS/kg de MSW.

[0145] A Figura 3(B) apresenta a “captura de biodegradável total” em kg de TS/kg de MSW, combinando o TS obtido nas amostras de pasta fluida biogênica obtida após a passagem através de peneira de 3 mm denominada “EC12B” assim como o TS obtido nas frações de fibra retidas pela peneira de 3 mm e pelas peneiras de Fibra 1 e 2 aplicadas às águas de lavagem. Durante o período com fermentação microbiana somente, entre as horas 250 e 319, as figuras foram corrigidas de modo a não contar a massa de substratos especiais adicionados ao tanque de tampão/fermentador. Conforme apresentado, durante o primeiro período com atividade de celulase adicionada, entre as horas 1 e 153, o níel de “captura de biodegradável total” foi somente discretamente maior que o nível de captura de biodegradável no líquido. Durante o período com fermentação microbiana somente, entre as horas 250 e 319, o nível de “captura de biodegradável total” foi muito maior comparado à captura no líquido somente, aos níveis aproximadamente os mesmos que os alcançados com atividade de celulase adicionada. Durante o segundo período com atividade de celulase adicionada, entre as horas 319 e 390, o nível de “captura de biodegradável total” foi semelhante ao observado durante o primeiro período com atividade de celulase adicionada.

[0146] Esses resultados indicam que, enquanto a atividade de celulase adicionada facilita claramente uma degradação mais completa do MSW durante o curto tempo de retenção antes da separação de sólidos não degradáveis, não obstante, a fermentação microbiana isoladamente pode prover degradação suficiente do MSW durante um tempo de retenção semelhantemente curto, de modo a permitir “captura de biodegradável” essencialmente equivalente na separação biológica de MSW.

[0147] Isso é particularmente significativo em que a pasta fluida biogênica obtida utilizando atividade de celulase comercial adicionada não retém muita atividade após a separação de sólidos não degradáveis. Esse efeito surge possivelmente de um modo substancialmente diferentede catálise de celulase no caso de atividade secretada por organismos vivos na vida real, comparado às atividades dos produtos secretados, geneticamente concebidos que foram “cultivados” e providos como CTEC3™. Nos estudos anteriores, na usina de demonstração, examinamos as diversas frações descritas acima, visando identificar o fato da atividade de celulase comercial adicionada. Os níveis de atividade de celulase (FPU) observados na pasta fluida biogênica obtida após a peneira de 3 mm denominada “EC12B” foram tipicamente menores que 0,5% dos observados no reator de enzima antes da separação de materiais não degradáveis.

[0148] Ao contrário, a pasta fluida biogênica obtida utilizando somente fermentação microbiana pode ser esperada por reter um nível bastante alto de atividade de celulase derivada microbianamente, na medida em que retém um alto nível de células vivas.

[0149] Da mesma forma, ao contrário da degradação dependente de CTEC3 ™, fermentação microbiana permite o simples recurso de pós-fermentação da pasta fluida biogênica, antes da produção de biometano ou outros usos. Na pós-fermentação, “captura de biodegradável” retida pelas diversas peneiras é misturada com pasta fluida biogênica e peritida a continuar para fermentar em uma temperatura adequada.

[0150] Amostras de pasta fluida biogênica obtida em pontos no tempo selecionados durante o período de fermentação microbiana foram analisadas para sólidos dissolvidos. O teor de sólidos voláteis da amostra de sobrenadante foi determinada ao subtrair da medição de matéria seca a cinza remanescente após fornalha queimando a 550 °C e expressa como uma porcentagem de massa como sólidos voláteis dissolvidos em %. O teor de matéria seca do pélete é determinado por secagem a 60 °C por 48 horas. A parte líquida do pélete sendo (1-matéria seca do pélete) expressa como uma porcentagem de massa do pélete. A composição da parte líquida do pélete é estimada por ser semelhante ao sobrenadante. Assim, os sólidos voláteis dissolvidos totais da amostra é a soma dos sólidos voláteis dissolvidos do sobrenadante e a (porcentagem de massa da parte líquida do pélete)x(o sólido volátil dissolvido do sobrenadante).

[0151] Resultados da análise são apresentados na Tabela 3. Concentrações de lactato, acetato e etanol são apresentadas como % em peso geral. TABELA 3. ANÁLISE DE PASTA FLUIDA BIOGÊNICA

[0152] Conforme apresentado, como uma porcentagem de sólidos voláteis totais, o teor de sólidos dissolvidos da pasta fluida biogênica obtida utilizando fermentação microbiana isoladamente foi consistentemente entre 40-50%. Isso indica que a fermentação microbiana isoladamente é suficiente para degradar substancialmente MSW, de modo a tornar o teor biodegradável suscetível de recuperação dem uma operação de separação biológica, conforme é descrito aqui. A pasta fluida obtida, conforme descrita, foi bombeável em todos os períodos de tempo durante a fermentação microbiana.

EXEMPLO 2. CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DE CELULASE DERIVADA MICROBIANAMENTE E OUTRAS ATIVIDADES DE DEGRADAÇÃO DE MSW EXPRESSAS POR INÓCULO MICROBIANO

[0153] Durante o ensaio descrito no Exemplo 1, uma amostra líquida do tanque de tampão/tanque fermentador (inóculo microbiano) foi retirado na hora 245. Enquanto essa amostra foi obtida levemente antes da lavagem completa da atividade de CTEC3 residual, a atividade de CTEC residual no tanque de tampão/fermentador nesse ponto pode não ter sido maior que 8 FPU/L em uma estimativa de pior caso. Do momento em que a amostra foi retirada até o experimento der iniciado, 5,5 horas passaram. 20ml do inóculo microbiano foi adicionado a 1g de substrato seco. Os substrates foram; papel de seda de 100% de polpa de novo papel (LOMELETTER™), a fração celulósica do resíduo modelo e resíduo modelo completo. O resíduo de modelo foi preparado utilizando produção fresca para compreender a fração “orgânica” (definida como as frações celulósicas, animais e vegetais) de resíduo sólido urbano (preparado como em Jensen et al., 2010 com base em Riber et al. 2009). Composição do resíduo modelo completo foi como segue:

[0154] A fração celulósica consiste em papelão (revestido e não revestido), papel limpo, anúncios, embalagens de presente e mais. A fração animal consiste em proteína e gorduras de aves, suínos e carne. As frações vegetais contêm frutas, vegetais, e partes não comestíveis, como cascas de vagem de ervilha verde.

[0155] O resíduo modelo foi armazenado em alíquotas a -20 °C e derretido durante a noite a 4 °C. O resíduo modelo tem um teor de matéria seca de 28,4% (3,52g de resíduo modelo foi adicionado para produzir 1g de matéria seca (DM)). Além disso, para cada tipo de substrato, CELLIC CTEC3 ™ (VDNI0009, NOVOZYMES A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) (CTec3) foi aplicado em uma dosagem de 32mg/g de matéria seca nos substratos, para comparar com a medida de hidrólise alcançada pelo inóculo microbiano.

[0156] A atividade de celulase do CTEC3 foi medida previamente pelo método relatado em Ghose, T.K., Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem., 1987. 59(2): p. 257-268, e encontrado por ser 179 FPU/g de preparação de enzima. Da mesma forma, a dose utilizada nesses experimentos corresponde a aproximadamente 5,7 FPU/g de DM ou, expressos em termos do volume de reação, aproximadamente, 286 FPU/L.

[0157] Para ajustar e manter o pH em 5 durante a reação com CTEC3 adicionado, um tampão de acetato de sódio (0,05M) foi aplicado para constitir o volume total para 20g. Cada reação foi feita em triplicata, e uma reação de cada substrato foi incubada em paralelo com somente um tampão adicionado (substrato branco).

[0158] As reações foram incubadas por 24 horas em um Stuart Rotator SB3 (girando a 4RPM) colocado em um gabinete de aquecimento (Binder, GmBH, Tuttlingen, Germany) ajustado a 45 °C. os tubos foram, então, removidos da incubadora e fotografados. Uma vez que a estrutura física das amostras pareceu parcialmente dissolvida, os tubos foram agitados vigorosamente com a mão por aprox. 2 segundos e fotografados mais uma vez.

[0159] Os tubos foram, então, centrifugados a 1350g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi, então, decantado, o sobrenadante e pélete foram secos por 2 dias a 60 °C no gabinete de aquecimento. O peso do material seco foi registrado e utilizando para calcular a distribuição de matéria seca. A conversão de matéria seca nas amostras foi calculada com base nesses números. Como um controle, uma amostra de inóculo microbiano (teor de sólidos de 4,54 % ±0,06) foi incubada sem substrato para avaliar a liberação de base de sólidos (33,9% ±0,8). A conversão de sólidos dos substratos adicionada por inóculo microbiano foi corrigida ao subtrair a contribuição de sólidos à fração líquida do inóculo microbiano em si.

[0160] A base relativamente alta nessas amostras possivelmente sobre-estima a base observada nas amostras contendo asubstraato adicionado. Essa base alta poderia incluir contribuição considerável de massa celular que, na ausência de fonte de alimento adicional, retornou a uma forma solúvel durante a evolução do experimento, ao contrário com a forma de um organismo vivo, que precipita prontamente nessas condições experimentais. Para todos os substratos, a adição do inóculo microbiano resultou em uma liberação maior de sólidos do que essa liberação de base de sólido, indicando hidrólise parcial dos substratos pelo inóculo microbiano.

[0161] A Figura 4 apresenta a degradação comparativa de substratos celulósicos e MSW modelo pelo inóculo microbiano e conforme auxiliado por CTEC3. Conforme apresentado, com um substrato celulósico limpo, como papel de seda, CTEC3 claramente provê uma degradação mais extensa no determinado nível de dose. Utilizando a degradação comparativa de papel de seda como uma estimativa da atividade de celulase, o inóculo microbiano é apresentado por exibir aproximadamente 1/6 de atividade exibida por CTEC3. A atividade de celulase derivada microbiana expressa pelo inóculo microbiano pode ser, assim, estimada como (1/6)*(286 FPU/L) ou aproximadamente 48 FPU/L dentro do período de tempo de incubação de 24 horas.

[0162] Deve ser observado que os mecanismos precisos pelos quais a atividade de celulase derivada microbiana é provida não são conhecidos. Sem desejar ser vinvulado à teoria, parece-nos que o contato com substrato induz a expressão de atividade de celulase de maneira que seja eficazmente “local” ao organismo doador e surge eficazmente durante o ciclo de incubação. Na medida em que isso é correto, a atividade de celulase derivada microbianamente principalmente “seguirá” as células vivas.

[0163] As amostras de CTEC3 também são apresentadas por proverem uma degradação mais extensa do MSW modelo. Aqui, entretanto, a degradação de substrato branco é alta, sugerindo que alguma atividade microbiana também pode ter contribuído para a degradação CTEC3.

[0164] Ironicamente, não obstante, níveis muito menores de atividade de celulase per se em FPU/L, o inóculo microbiano é apresentad por alcançar níveis de degradação da fração celulósica do MSW modelo que são comparáveis aos níveis alcançados utilizando CTEC3.

[0165] A Figura 5 apresenta uma fotografia tirada appós agitação de três tubos aos quais a fração celulósica de MSW modelo foi adicionada como substrato, apresentando a aparência comparativa no final da incubação. Conforme apresentado, a fração celulósica é, de fato, degradada de maneira aproximadamente equivalente em comparação as amostras CTEC3 e inóculo. Foi previamente relatado em fermentações de ácido láctico com hidrólise simultânea utilizando preparações de celulase isolada, consulte Schmidt e Padukone 1997, que atividades de celulase típicas em níveis tão altos quanto 25 FPU/g de DM papel de revista brilhante de sinopse e outro papel revestido, assim como jornal, com menos que a metade da eficiência que podem com papel limpo de sinopse. Os resultados aqui apresentados sugerem que algumas atividades de enzima, além da atividade de celulase, podem ser expressas pelo inóculo microbiano ou sua progênie que contribui para degradação da fração celulósica do MSW modelo.

EXEMPLO3.CARACTERIZAÇÃODECONTAGENSBACTERIANAS DE LAB

[0166] Durante o ensaio descrito no Exemplo 1, as amostras do tanque de tampão/fermentador (inóculo microbiano) assim como as amostras da pasta fluida biogênica obtida após a peneira de 3 mm denominadas “EC12B” foram removidas em diversos pontos no tempo durante o período da hora 235 a 319.

[0167] Alíquotas das amostras foram removidas e teor de matéria seca determinado por secagem em temperatura ambiente (de modo a evitar dano ao teor de DNA). As amostras descongeladas obtidas em tubos de 50 ml, então, congeldas com 50 % em peso de glicerol adicionado.

[0168] As contagens celulares foram determinadas por PCR quantitativo (qPCR). 5 ml dos células suspensas em glicerol foram suspensos em 5 ml de H2O filtrado estéril. Uma alíquota foi filtrada em um filtro e a concentração de sólidos foi determinada. DNA foi extraído da massa celular filtrada utilizando um kit FastDNA ™ (MP BIOMEDICALS ™). O número dos números de cópia de gene 16S rRNA no DNA extraido foi quantificado por análise qPCR com iniciadores de gene de 16S rRNA universal. O método quantifica somente Bactéria e não Archaeal. O número de célula bacteriana foi calculado com base nesses dados, presumindo uma média de 3,0 npumeros de cópia do gene 16s rRNA por célula viva. Os números de célula bacteriana calculados foram, então, relacionados à concentração de matéria seca (sólidos totais) nas amostras. O UFC/g DM calculado foi utilizado para estimar UFC/L, quando o inóculo microbiano foi, em média, 3,95% em peso de DM durante o período de tempo e quando a pasta fluida biogênica era, em média, 11,98% em peso de DM.

[0169] As contagens bacterianas por g de matéria seca para as amostras são apresentadas na Tabela 4, junto a uma estimativa de UFC/L. TABELA4.CONTAGENSDEBACTÉRIASVIVASEMINÓCULO MICROBIANO E PASTA FLUIDA BIOGÊNICA

[0170] Esses resultados demonstram claramente que as células de bactérias vivas seguem a pasta fluida biogênica. Da mesma forma, pode ser esperado que a pasta fluida biogênica em si possa prover um inóculo eficaz e proverá atividade de celulase derivada microbianamente para pós-fermentação de fibras biodegradáveis coletadas por diversas peneiras, assim como para sólidos não dissolvidos retidos na pasta fluida no momento da separação inicial de sólidos não degradáveis.

[0171] Esses resultados indicam que a hidrólise e fermentação microbianas induzidas por inóculo microbiano resultaram em crescimento relativamente fixo durante o ciclo de hidrólise e fermentação e que a pasta fluida biogênica obtida pode ser esperada por porver um inóculo adequado para pós-fermentação com fibras recuperadas nas diversas peneiras.

[0172] Geralmente, se espera que LAB compreenda uma proporção maior da população microbiana que evolui quando MSW estiver simplesmente incubado em temperaturas entre 37 e 50 °C. Consulte, por exemplo, Akao et al. 2007a; Akao et al. 2007b; Sakai et al. 2000; Sakai et al. 2004. Contagens de batérias LAB vivas na ordem de 1010 UFC/L podem ser obtidas rotineiramente dentro de cerca de 12 horas na fermentação de ácido láctico de resíduo de modelo doméstico, sem atividade de enzima adicionada. Consulte Sakai et al. 2000 e Sakai et al. 2004. A geração de tempos de dobragem de bactéria de ácido láctico identificada nos examplos apresentados subsequentemente a esse exemplo 3 são na ordem de 4 a 5 horas. Consulte Liong e Shaw 2005.

[0173] A proporção da bactéria viva nas amostras que representam a bactéria de ácido láctico pode ser determinada de maneira decisiva das medições de 16s RNA descritas no Exemplo 4. Entretanto, esses resultados não estarão disponíveis até pós-depósito. Em todos os estudos experimentais anteriores na usina de demonstração REnescience envolvendo inoculação de MSW de entrada com águas de lavagem recirculadas, quando as amostras forem adequadamente congeladas com glicerol para proteger os organismos, espécies Lactobacillus pareceram como predominantes, invariavelmente compreendendo mais que 90% de organismos detectados totais em amostras do reator de enzima/reator de fermentação microbiana e da pasta fluida biogênica. Da mesma forma, quando estimamos que as espécies Lactobacillus (que provavelmente não estão somente presentes em LAB) compreendem pelo menos 90% das células vivas, níveis de LAB na fase aquosa dentro do reator de enzima/reator de fermentação microbiana no Exemplo 1 foram matidos durante o ciclo de hidrólise e fermentação a pelo menos 2,1 x 1010 UFC/L.

EXEMPLO4.IDENTIFICAÇÃODEMICRO-ORGANISMOS PROVENDO HIDRÓLISE E FERMENTAÇÃO NO EXEMPLO 1

[0174] As amostras da pasta fluida biogênica obtidas após a pssagem através de peneira de 8 mm denominada “EC12B”, e do líquido (inóculo microbiano) do tanque de tampão/fermentador denominado “EA02”, assim como amostras do aquecedor de água “LB01” foram obtidas durante o teste nas horas 101 e 125, durante o primeiro período com CTEC3 adicionado, na hora 245, no fim do “tempo de elevação sem CTEC3” na hora 269, durante o período com fermentação microbiana somente, e nas horas 341 e 365, durante o segundo período com CTEC3 adicionado.

[0175] As amostras líquidas foram congeladas em 20% de glicerol e armazenadas a -20 °C para o objetivo de realização de análise de 16S rDNA ppara identificar os micro-organismos. Essa análise é bem conhecida na técnica e é amplamente identificada para a identificação e análise filogênica de procariontes com base no componente 16S da pequena subunidade ribossômica. As amostras congeladas foram enviadas em gelo seco para GATC Biotech AB, Solna, SE onde a análise de 16S rDNA foi realizada (GATC_Biotech).

[0176] A análise compreendeu: extração de DNA genômico, preparação de biblioteca amplicon utilizando o par iniciador de iniciadores universais abrangendo as regiões hipervariáveis V1 a V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp de comprimento), Etiquetação por PCR com adaptadores de GS FLX, sequenciamento em um instrumento FLX Sequenciador de Genoma para obter uma quantidade de 104,000- 160,000 de leituras por amostra. As sequências resultantes foram, então, consultadas em um BlastN contra o banco de dados de rDNA do Projeto de Banco de Dados Ribossômicos (Cole et al., 2009). O banco de dados contém sequências de boa qualidade com pelo menos 12.00 bp de comprimento e uma associação taxonômica de NCBI. A liberação atual (RDP Release 10, Atualizada em 19 de setembro de 2012) contém 9.162 bactérias e 375 sequências de archaeal. Os resultados de BLAST foram filtrados para remover correspondências curtas e de baixa qualidade (identidade de sequência > 90%, cobertura de alinhamento > 90%).

[0177] O número de projeto para as amostras registradas em GATC foi NG-7116. Os resultados estarão disponíveis pós-depósito.

EXEMPLO 5. FERMENTAÇÃO MICROBIANA CONCOMITANTE MELHORA A CAPTURA ORGÂNICA POR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MSW NÃO SEPARADO UTILIZANDO PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0178] Reações de escala de banco de Laboratório foram conduzidas com a amostra de pasta fluida biodegradável do teste descrito no exemplo 9.

[0179] O substrato de MSW-modelo para reações de escala de laboratório foi preparado com o uso de produto fresco para compreender a fração orgânica (definida como as frações celulósica, animal e vegetal) de resíduos sólidos urbanos (preparados, conforme descrito em Jensen et al., 2010 com base em Riber et al. 2009)...

[0180] Os MSW-modelo foram armazenados em alíquotas a -20 °C e descongelados de um dia para o outro a 4 °C. As reações foram realizadas em tubos de centrífuga de 50 ml, e o volume de reação total foi de 20 g. Os MSW-modelo foram adicionados a 5% de matéria seca (DM) (medida como o teor de matéria seca remanescente após 2 dias a 60 °C).

[0181] A celulase aplicada para hidrólise foi Cellic CTec3 (VDNI0003, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) (CTec3). Para ajustar e manter o pH a pH5, um tampão de citrato (0,05 M) foi aplicado para constituir o volume total em 20 g.

[0182] As reações foram incubadas por 24 horas em um Stuart Rotator SB3 (girando a 4 RPM) colocado em um forno de aquecimento (Binder GmBH, Tuttlingen, Alemanha). Controles negativos foram realizados paralelamente para avaliar a liberação de fundo de matéria seca do substrato durante a incubação. Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 1.350 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi, então, removido por decantação, 1 ml foi removido para análise de HPLC e o pélete e o sobrenadante remanescente foram secos por 2 dias a 60 °C. O peso de material seco foi registrado e usado para calcular a distribuição de matéria seca. A conversão de DM nos MSW-modelo foi calculada com base nesses números.

[0183] As concentrações de ácidos orgânicos e etanol foram medidas com o uso de uma HPLC UltiMate 3000 (Thermo Scientific Dionex) equipada com um detector de índice de refração (Shodex® RI-101) e um detector de UV a 250 nm. A separação foi realizada em uma coluna de monossacarídeo Rezex RHM (Phenomenex) a 80 °C com H2SO4 5 mM como eluente em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. Os resultados foram analisados com o uso do programa de software Chromeleon (Dionex).

[0184] Para avaliar o efeito de hidrólise e fermentação concomitante, 2 ml/20 g do biolíquido a partir do teste descrito no exemplo 5 (amostrado em 15 e 16 de dezembro) foram adicionados às reações com ou sem CTec3 (24 mg/g de DM).

CONVERSÃO DE DM EM MSW

[0185] A conversão de sólidos foi medida como o teor de sólidos encontrado no sobrenadante como uma porcentagem da matéria seca total. A Figura 1 mostra a conversão para material bruto de material bruto de MSW, preparação de enzima isolada, inóculo microbiano por si só e a combinação de inóculo microbiano e enzima. Os resultados mostram que a adição de EC12B do exemplo 5 resultou em conversão significativamente mais alta de matéria seca em comparação com a liberação de fundo de matéria seca no material bruto de reação (material bruto de MSW) (Teste t de Student p<0,0001). A fermentação microbiana concomitante induzida pela adição da amostra de EC12B e hidrólise enzimática com o uso de CTec3 resultou em conversão significativamente mais alta de matéria seca em comparação com a reação hidrolisada apenas com CTec3 e as reações com adição de EC12B por si só (p<0,003).

ANÁLISE DE HPLC DE GLICOSE, LACTATO, ACETATO E ETOH

[0186] A concentração de glicose e os metabólitos microbianos (lactato, acetato e etanol) medidos no sobrenadante são mostrados na Figura 2. Conforme mostrado, houve uma concentração de fundo baixa dos mesmos no material bruto de MSW-modelo, e o teor de ácido láctico presumivelmente vem de bactérias nativas para os MSW-modelo visto que o material usado para criar o substrato não foi de modo algum esterilizado ou aquecido para matar bactérias. O efeito da adição de CTec3 resultou em um aumento na glicose e ácido láctico no sobrenadante. As concentrações mais altas de glicose e metabólitos bacterianos foi encontrada nas reações em que o biolíquido de EC12B do exemplo 5 foi adicionado concomitantemente a CTec3. Hidrólise e fermentação concomitante, desse modo, aprimoram a conversão de matéria seca nos MSW-modelo e aumentam a concentração de metabólitos bacterianos nos líquidos.

[0187] Referências: Jacob Wagner Jensen, Claus Felby, Henning J0rgensen, Georg 0rnskov R0nsch, Nanna Dreyer N0rholm. Enzymatic processing of municipal solid waste. Waste Management. 12/2010; 30(12):2.497 a 2.503.

[0188] Riber, C., Petersen, C., Christensen, T.H., 2009. Chemical composition of material fractions in Danish household waste. Waste Management 29, 1.251 a 1.257.

EXEMPLO 6 . FERMENTAÇÃO MICROBIANA CONCOMITANTE APRIMORA A CAPTURA ORGÂNICA POR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MSW NÃO SEPARADO UTILIZANDO PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0189] Testes foram realizados em um reator de batelada especialmente projetado mostrado na Figura 8, com o uso de MSW não separados com o objetivo de validar os resultados obtidos em experimentos de escala de laboratório. Os experimentos testaram o efeito da adição de um inóculo de microrganismos que compreende o biolíquido obtido de bactérias do exemplo 7 com a finalidade de alcançar a fermentação microbiana concomitante e hidrólise enzimática. Testes foram realizados com o uso de MSW não separados.

[0190] MSW usados para ensaios de pequena escala foram um ponto focal da pesquisa e desenvolvimento em REnescience. Para que os resultados de ensaios fossem de valor, foi necessário que o resíduo fosse representativo reproduzível.

[0191] O resíduo foi coletado de Nomi I/S Holstebro em março de 2012. O resíduo foi resíduos sólidos urbanos não separados (MSW) da respectiva área. O resíduo foi triturado em 30 x 30 mm para o uso em ensaios de pequena escala e para a coleta de amostras representativas para os ensaios. A teoria de amostragem foi aplicada ao resíduo triturado por subamostragem de resíduo triturado em tinas de 22 litros. As tinas foram armazenadas em um recipiente de congelador a -18 °C até o uso. O “resíduo real” foi composto por oito tinas de resíduo da coleta. O teor dessas tinas foi novamente misturado e novamente amostrado a fim de garantir que a variabilidade entre repetições fosse tão baixa quanto possível.

[0192] Todas as amostras foram executadas sob condições semelhantes em relação à água, temperatura, rotação e efeito mecânico. Seis câmaras foram usadas: três sem inoculação e três com inoculação. O teor não aquoso durante o ensaio foi estabelecido para 15% do teor não aquoso por adição de água. A matéria seca no material de inoculação foi considerada, então a adição de água nas câmaras inoculadas foi menor. 6 kg de MSW foram adicionados a cada câmara, assim como foram 84 g de CTEC3, uma preparação de celulase comercial. 2 litros de inóculo foram adicionados às câmaras inoculadas, com uma redução correspondente na água adicionada.

[0193] O pH foi mantido em 5,0 nas câmaras inoculadas e em pH 4,2 nas câmaras não inoculadas com o uso respectivamente de adição de 20% de NaOH para aumentar o pH e 72% de H2SO4 para diminuir a pH. O pH mais baixo na câmara não inoculada auxiliou a garantir que bactérias intrínsecas não se desenvolvessem. Foi previamente mostrado que, com o uso da preparação de enzima usada, CTEC3 Tm, no contexto de hidrólise de MSW, nenhuma diferença na atividade pode ser discernida entre pH 4,2 e pH 5,0 A reação foi continuada a 50 °C por 3 dias, com o reator piloto fornecendo agitação de rotação constante.

[0194] No final da reação, as câmaras foram esvaziadas através de uma peneira e biolíquido que compreende material liquefeito produzido por fermentação microbiana e hidrólise enzimática concomitante de MSW.

[0195] A matéria seca (TS) e sólidos voláteis (VS) foram determinados pelo método de Matéria Seca (DM):

[0196] Amostras foram secas a 60 °C por 48 horas. O peso da amostra antes e após a secagem foi usado para calcular a porcentagem de DM.

[0197] Método de sólidos voláteis:

[0198] Os sólidos voláteis são calculados e apresentados como a porcentagem de DM subtraído o teor de cinza. O teor de cinza de uma amostra foi encontrado por queima da amostra pré-seca a 550 °C em uma fornalha por um mínimo de 4 horas. Em seguida, a cinza foi calculada como:

[0199] Porcentagem de Cinza de Amostra de matéria seca:

[0200] Porcentagem de sólidos voláteis: (1 - porcentagem de cinza de amostra) x Porcentagem de DM de Amostra

[0201] Os resultados foram conforme mostrado abaixo. Conforme mostrado, um teor de sólidos totais mais alto foi obtido no biolíquido obtido nas câmaras inoculadas, indicando que a fermentação microbiana concomitante e hidrólise enzimática foram superiores à hidrólise enzimática por si só.

EXEMPLO7.FERMENTAÇÃOMICROBIANACONCOMITANTE APRIMORA A CAPTURA ORGÂNICA POR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MSW NÃO SEPARADOS COM O USO DE PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0202] Experimentos foram conduzidos na usina de demonstração REnescience situada em Amager ressource center (ARC), Copenhagen, Dinamarca. Um desenho esquemático que mostra os recursos principais da usina é mostrado na Figura 1. O conceito da Refinaria de Resíduos ARC REnescience é conforme descrito de modo geral no exemplo 1.

[0203] Tecnologia REnescience, conforme testada nesse exemplo, compreende três etapas.

[0204] A primeira etapa é um aquecimento brando (pré-tratamento, conforme mostrado na Figura 4) dos MSW por água quente a temperaturas na faixa de 40 a 75 oC por um período de 20 a 60 minutos. Esse período de mistura e aquecimento abre bolsas plásticas e fornece polpação adequada de componentes degradáveis preparando uma fase orgânica mais homogênea antes da adição de enzimas. A temperatura e pH são ajustados no período de aquecimento para ideal das preparações de enzimas isoladas que são usadas para a hidrólise enzimática. A água quente pode ser adicionada como água de torneira limpa ou como água de lavagem primeiramente usada nos tambores de lavagem e depois recirculada para o aquecimento brando conforme indicado na Figura 1.

[0205] A segunda etapa é a fermentação e hidrólise enzimática e (liquefação, conforme mostrado na Figura 4). Na segunda etapa do processo de REnescience, as enzimas são adicionadas e opcionalmente selecionados os microrganismos. A fermentação e liquefação enzimática é realizada continuamente em um tempo de residência de aproximadamente 16 horas, à temperatura e pH ideais para o desempenho de enzima. Por essa fermentação e hidrólise, a parte biogênica dos MSW é liquefeita em um biolíquido com alto teor de em matéria seca entre materiais não degradáveis. O pH é controlado pela adição de CaCO3.

[0206] A terceira etapa de tecnologia de REnescience conforme praticado nesse exemplo é uma etapa de separação em que o biolíquido é separado das frações não degradáveis. A separação é realizada em um separador balístico, tambores de lavagem e prensas hidráulicas. O separador balístico separa os MSW tratados enzimáticos no biolíquido, uma fração de materiais não degradáveis 2D e uma fração de materiais não degradáveis 3D. A fração 3D (objetos tridimensionais físicos como latas e garrafas plásticas) não aglutina grandes quantidades de biolíquido, então uma única etapa de lavagem é suficiente para limpar a fração 3D. A fração 2D (produtos têxteis e folhas metálicas como exemplos) aglutina uma quantidade significativa de biolíquido. Portanto a fração 2D é prensada com o uso de uma prensa de parafuso, lavada e prensada novamente para otimizar a recuperação de biolíquido e para se obter uma fração 2D seca e “limpa”. O material inerte que é areia e vidro é peneirado do biolíquido. A água usada em todos os tambores de lavagem pode ser recirculada, aquecida e depois usada como água quente na primeira etapa para aquecimento.

[0207] O ensaio documentado neste exemplo foi dividido em três seções conforme mostrado na tabela 5 TABELA 5 Tempo (horas) Rodalon Água de torneira / Água de lavagem ao aquecimento brando

[0208] Em um ensaio de 7 dias, os MSW não separados obtidos de Copenhagen, Dinamarca foram carregados continuamente em 335 kg/h para o interior da usina de demonstração da REnescience. No aquecimento brando foram adicionados 536 kg/h de água (água de torneira ou água de lavagem) aquecida a, aproximadamente, 75 °C antes de entrar no reator de aquecimento brando. A temperatura é, através deste, ajustada a, aproximadamente, 50 °C nos MSW e o pH é ajustado a, aproximadamente, 4,5 por adição de CaCO3.

[0209] Na primeira seção, o agente antimicrobiano ativo em superfície Rodalon ™ (cloreto alquil benzil de amônio) foi incluído na água adicionada em 3 g de ingrediente ativo por kg de MSW.

[0210] No reator de liquefação são adicionados aproximadamente 14 kg de Cellic Ctec3 (preparação de celulase comercialmente disponível junto à Novozymes) por tonelada úmida de MSW. A temperatura foi mantida na faixa de 45 a 50 °C e o pH foi ajustado na faixa de 4,2 a 4,5 através da adição de CaCO3. O tempo de retenção do reator de enzima é de, aproximadamente, 16 horas.

[0211] No sistema de separação de separador balístico, prensas e tambores de lavagem, o biolíquido (material degradável liquefeito) é separado de materiais não degradáveis.

[0212] As águas de lavagem foram, seletivamente, tanto vertidas para fora, gravando o teor orgânico, quanto recirculadas e reusadas para molhar os MSW de entrada no aquecimento brando. A recirculação de água de lavagem tem o efeito de realizar a inoculação bacteriana com o uso de organismos que vivem em condições de reação a 50 °C a níveis superiores àqueles presentes inicialmente. No esquema de processo usado, a água de lavagem recirculada foi primeiramente aquecida a, aproximadamente, 70 °C, para colocar os MSW de entrada em uma temperatura adequada para a hidrólise enzimática, e tal caso, cerca de 50 °C. Especificamente no caso de bactérias de ácido láctico, foi constatado que o aquecimento a 70 °C fornece uma seleção e “indução” de expressão de tolerância térmica.

[0213] As amostras foram obtidas em pontos de tempo selecionados nos seguintes lugares: - O biolíquido que deixa a pequena peneira, que é chamado de “EC12B” - O biolíquido no tanque de armazenamento - A água de lavagem após a peneira de trigo - A fração 2D - A fração 3D - A fração de fundo inerte de ambas as unidades de lavagem

[0214] A produção de pasta fluida biodegradável foi medida com células de carga no tanque de armazenamento. O fluxo de entrada de águas frescas foi medido com fluxômetros, o resíduo de lavagem reciclado ou drenado foi medido com células de carga.

[0215] As contagens bacterianas foram examinadas da seguinte forma: As amostras selecionadas de biolíquido foram diluídas 10 vezes no SPO (solução de água peptona) e 1 ml das diluições foi emplacado em profundidade de semeadura em Agar de Extrato de carne bovina (3,0 g/L de extrato de Bife (Fluka, Cas.: B4888), 10,0 g/L Tryptone (Sigma, número cas: T9410), 5,0 g/L de NaCl (Merck, número cas 7647-14-5), 15,0 g/L de ágar (Sigma, número cas 9002-18-0)). As placas foram incubadas a 50 graus, respectivamente. Atmosfera aeróbica e anaeróbica. O cultivo anaeróbico ocorreu em recipientes adequados que foram mantidos anaeróbicos através de gaseificação com Anoxymat e adição de cartas de iltfjernende (AnaeroGen da Oxoid, número cat AN0025A). As colônias aeróbicas foram contadas após 16 horas e, novamente, após 24 horas. As bactérias em crescimento anaeróbico foram quantificadas após 64 a 72 horas.

[0216] A Figura 9 mostra o teor de sólidos voláteis total em amostras de biolíquido em EC12B como kg por kg de MSW processados. Estimativas de ponto foram obtidas em diferentes pontos de tempo durante o experimento considerando-se cada um dos três períodos experimentais separados como um período de tempo separado. Dessa forma, uma estimativa de ponto durante o período 1 (Rodalon) é expressa em relação aos saldos de massa e fluxos de material durante o período 1. Uma mostrada na Figura 5, durante o período 1, que foi iniciada após uma interrupção prolongada devido às complicações na usina, percebe-se que os sólidos totais capturados no biolíquido gotejam de modo estável, consistente com um efeito antibacteriano leve de Rodalon ™. Durante o período 2, os sólidos capturados totais retornam aos níveis ligeiramente superiores. Durante o período 3, em que a recirculação fornece uma “inoculação” eficaz de MSW de entrada, a razão de kg de VS/kg de affald de biolíquido é elevada a níveis consideravelmente superiores em cerca de 12%.

[0217] Para cada um dos 10 pontos de tempo mostrados na Figura 9, as amostras do biolíquido (EC12B) foram tomadas e os sólidos totais, sólidos voláteis, sólidos voláteis dissolvidos e concentrações dos metabólitos bacterianos presumidos acetato, butirato, etanol, formato e proprionato foram determinados através de HPLC. Tais resultados que incluem concentrações de glicerol são mostrados na Tabela 1 abaixo. TABELA 6. ANÁLISE DE AMOSTRAS DE PASTA FLUIDA BIODEGRADÁVEL

[0218] Para as amostras de pasta fluida biodegradável tomadas em cada um dos dez pontos de tempo, a Figura 10 tanto as contagens de bactérias vivas determinadas sob condições aeróbicas e, também, a porcentagem de peso “metabólitos bacterianos” (que significa a soma de acetato, butirato, etanol, formato e proprionato) expressa como uma porcentagem de sólidos voláteis dissolvidos. Conforme mostrado, a porcentagem de peso de metabólitos bacterianos aumenta claramente com a atividade bacteriana aumentada e é associada à captura aumentada de sólidos no biolíquido.

EXEMPLO8.IDENTIFICAÇÃODEMICRO-ORGANISMOSQUE CONTRIBUEMPARAAFERMENTAÇÃOCONCOMITANTENOEXEMPLO7

[0219] As amostras de biolíquido obtidos a partir do exemplo 7 foram analisadas em relação à composição microbiana.

[0220] As espécies microbianas presentes na amostra foram identificadas através da comparação de suas sequências de gene de rRNA de 16S com as sequências de gene de rRNA de espécies bem caracterizadas (espécie de referência). O valor de corte normal para a identificação de espécies é de 97% de similaridade da sequência de gene de rRNA de 16S com uma espécie de referência. Se a similaridade fora abaixo de 97%, será, provavelmente, uma espécie diferente.

[0221] As sequências resultantes foram consultadas em um BlastN contra o banco de dados de NCBI. O banco de dados contém sequências de boa qualidade com pelo menos 1.200 bp de comprimento e uma associação taxonômica de NCBI. Apenas os resultados de correspondências de BLAST > 95% de identidade foram incluídos.

[0222] A pasta fluida biodegradávela amostrada foi diretamente transferida para a análise sem ser congelada antes da extração de DNA.

[0223] Um total de 7 espécies bacterianas foram identificadas (Figura 11) e 7 espécies de Archea foram identificadas. Em alguns casos, as espécies bacterianas, as subespécies, não puderam ser atribuídas (L. acidophilus, L. amylovorus, L. sobrius, L. reuteri, L. frumenti, L. fermentum, L. fabifermentans, L. plantarum, L. pentosus).

EXEMPLO 9 . ANÁLISE DETALHADA DE CAPTURA ORGÂNICA COM O USO DE FERMENTAÇÃO MICROBIANA E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA CONCOMITANTES DE MSW NÃO SEPARADO UTILIZANDO PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0224] A usina de demonstração de REnescience descrita no exemplo 1 e no exemplo 7 foi usada para produzir um estudo detalhado da captura orgânica total com o uso de fermentação bacteriana e hidrólise enzimática concomitantes de MSW não separado.

[0225] O lixo de Copenhagen foi caracterizado pela Econet por determinar seu teor.

[0226] A análise de resíduos foi analisada por determinar o teor e a variação. Uma grande amostra de MSW foi entregue à Econet A/S, que realizou as análises de resíduo. A amostra primária foi reduzida a uma subamostra com cerca de 50 a 200 kg. Tal subamostra foi, então, separada por um pessoal treinado em 15 diferentes frações de resíduo. O peso de cada fração foi gravado e uma distribuição foi calculada. TABELA 7 COMPOSIÇÃO DE RESÍDUO COMO (%) DO TOTAL, ANALISADA PELA ECONET DURANTE O TESTE DE 300 HORAS

[0227] A composição de resíduo varia de tempo em tempo, está apresentado na tabela 7 o resultado de análise de resíduo de diferentes amostras coletadas ao longo de 300 horas. A maior variação é percebida nas frações fraldas, embalagens de plástico e papelão e resíduo de comida, todas as quais são frações que afetam o teor de material orgânico que pode ser capturado.

[0228] Ao longo de todo o curso do “Teste de 300 Horas,” a média de material biodegradável “capturado” expressa como kg de VS por kg de MSW processados foi de 0,156 kg de VS/kg de MSW inseridos.

[0229] As amostras representativas de biolíquido foram tomadas em vários pontos de tempo durante o curso do experimento, quando a usina esteve em um período de operação estável. As amostras foram analisadas através de HPLC e determinaram os sólidos voláteis, sólidos totais e sólidos dissolvidos conforme descrito no exemplo 7. Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo. TABELA8.ANÁLISEDEAMOSTRASDEBIOLÍQUIDO

EXEMPLO 10. IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS QUE CONTRIBUEM PARA A FERMENTAÇÃO CONCORRENTE NO EXEMPLO 9

[0230] Observação: Nesse exemplo, as amostras de material analisadas para a identificação de micro-organismos foram congeladas sem glicerol. Os resultados obtidos são inconsistentes com os níveis de alto teor de lactato observado e com todos os outros resultados obtidos em todos os outros testes quando as amostras forem congeladas com glicerol adicionado e não se acredita que sejam precisos.

[0231] Uma amostra da pasta fluida biodegradável “EC12B” foi retirada durante o teste descrito no exemplo 9 em 15 e 16 de dezembro de 2012 e armazenada a -20 °C para o propósito de realizar análise de rDNA de 16S para identificar os microrganismos na amostra. A análise de rDNA de 16S é amplamente usada para a identificação e análise filogênica de procariontes baseada no componente 16S da pequena subunidade ribossômica. As amostras congeladas foram enviadas em gelo seco para GATC Biotech AB, Solna, SE onde a análise de rDNA de 16S foi realizada (GATC_Biotech). extração de DNA genômico, preparação de biblioteca de amplificação com o uso do par de iniciadores de iniciadores universais que abrangem as regiões hipervariáveis V1 a V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp de comprimento), etiquetação por PCR com adaptadores de GS FLX, sequenciamento em um instrumento FLX Sequenciador de Genoma (Genome Sequencer FLX) para obter uma quantidade de 104.000 a 160.000 de leituras por amostra. As sequências resultantes foram, então, consultadas em um BlastN contra o banco de dados de rDNA do Projeto de Banco de Dados Ribossômicos (Projeto de Banco de Dados Ribossômicos) (Cole et al., 2009). O banco de dados contém sequências de boa qualidade com pelo menos 12.00 bp de comprimento e uma associação taxonômica de NCBI. A liberação atual (RDP Release 10, Atualizada em 19 de setembro de 2012) contém 9.162 bactérias e 375 sequências de archaeal. Os resultados de BLAST foram filtrados para remover correspondências curtas e de baixa qualidade (identidade de sequência > 90%, cobertura de alinhamento > 90%).

[0232] Um total de 226 diferentes bactérias foram identificadas.

[0233] As bactérias predominantes na amostra de EC12B foram Paludibacter propionicigenes WB4, uma bactéria de produção de propionato (Ueki et al. 2006), que compreende 13% das bactérias totais identificadas. A distribuição das 13 bactérias predominantes identificadas (Paludibacter propionicigenes WB4, Proteiniphilum acetatigenes, Actinomyces europaeus, Levilinea saccharolytica, Cryptanaerobacter phenolicus, Sedimentibacter hydroxybenzoicus, Clostridium phytofermentans ISDg, Petrimonas sulfuriphila, Clostridium lactatifermentans, Clostridium caenicola, Garciella nitratireducens, Dehalobacter restrictus DSM 9455, Marinobacter lutaoensis) é mostrada na Figura 11.

[0234] A comparação das bactérias identificadas no nível de gênero mostrou que Clostridium, Paludibacter, Proteiniphilum, Actinomyces e Levilinea (todas anaeróbicas) representaram, aproximadamente, a metade dos gêneros identificados. O gênero Lactobacillus compreende 2% das bactérias identificadas. A espécie bacteriana predominante, P. propionicigenes WB4, pertence ao segundo gênero mais predominante (Paludibacter) na amostra de EC12B.

[0235] As bactérias patogênicas predominantes na amostra de EC12B foram as Streptococcus spp., que compreendem 0,028% das bactérias totais identificadas. Não foi encontrada nenhuma bactéria patogênica de formação de esporo no biolíquido.

[0236] A Streptococcus spp. foi a única bactéria patogênica presente no biolíquido no exemplo 9. As Streptococcus spp. são as bactérias com a maior tolerância à temperatura (das que não formam esporo) e maior D-valor, o que indica que a quantidade de tempo necessário, a uma determinada temperatura, para reduzir a quantidade de células vivas de Streptococcus spp. vezes dez é superior a qualquer uma das outras bactérias patogênicas reportadas por Déportes et al. (1998) em MSW. Tais resultados mostram que as condições aplicadas no exemplo 9 podem higienizar os MSW durante a separação no processo de REnescience a um nível em que apenas as Streptococcus spp. estejam presentes.

[0237] A competição entre organismos por nutrientes e o aumento na temperatura durante o processo diminuirá a quantidade de organismos patogênicos significativamente e, conforme mostrado acima, eliminar a presença de patogênicos em MSW separados no processo de REnescience. Outros fatores como pH, aw, tolerância ao oxigênio, CO2, NaCl e NaNO2 também influenciam o crescimento de bactérias patogênicas no biolíquido. A interação entre os fatores mencionado acima pode diminuir o tempo e temperatura necessários para reduzir a quantidade de células vivas durante o processo.

EXEMPLO 11. ANÁLISE DETALHADA DE CAPTURA ORGÂNICA COM O USO DE FERMENTAÇÃO MICROBIANA CONCORRENTE E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA COM O USO DE PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA DE MSW NÃO SEPARADO OBTIDA A PARTIR DE UM LOCAL GEOGRÁFICO DISTANTE

[0238] A usina de demonstração de REnescience descrita no exemplo 7 foi usada para processar os MSW importados da Holanda. Constatou-se que os MSW têm a seguinte composição: TABELA Y COMPOSIÇÃO DE RESÍDUO (5) DE TOTAL, ANALISADA PELA ECONET DURANTE O TESTE DE VAN GANSEWINKEL.

[0239] O material foi submetido à fermentação microbiana e hidrólise enzimática concorrente conforme descrito no exemplo exemplo 7 e 9 e testado para um ciclo de usina de 3 dias. As amostras de pasta fluida biodegradável obtida em vários pontos de tempo foram obtidas e caracterizadas. Os resultados são apresentados na Tabela 9. As porcentagens sdadas são a procentagem de peso total. TABELA 9. ANÁLISE DE BIOLÍQUIDO

[0240] O VS dissolvido foi corrigido com 9% de acordo com a perda de lactato durante a secagem.

EXEMPLO12.PRODUÇÃODEBIOMETANOCOMOUSODE BIOLÍQUIDOOBTIDOAPARTIRDEFERMENTAÇÃOMICROBIANA CONCORRENTEEHIDRÓLISEENZIMÁTICADEMSWNÃOSEPARADOSCOMO USO DE PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0241] A pasta fluida biodegradável obtida no experimento descrito no exemplo 9 foi congelada em tinas de 20 litros e armazenado a -18 °C para o uso posterior. Tal material foi testado em relação à produção de biometano com o uso de dois sistemas de digestão anaeróbica de filtro fixo bem preparados idênticos que compreendem um consórcio de digestão anaeróbica no interior de um biofilme imobilizado no suporte de filtro.

[0242] As amostras iniciais foram coletadas tanto para a alimentação quanto para o líquido no interior do reator. As concentrações de VFA, tCOD, sCOD e amônia são determinadas com o uso de testes de cuveta HACH LANGE com um Espectrofotômetro DR 2 800 e os VFAs detalhados foram determinados diariamente através de HPLC. As medições de TSVS também são determinadas através do Método Gravimétrico.

[0243] As amostras de gás para a análise de GC são tomadas diariamente. A verificação da taxa de alimentação é realizada através da medição de volume de folga no tanque de alimentação e, além disso, a quantidade de efluente que sai do reator. A amostragem durante o processo foi realizada através da coleta com uma seringa de líquido ou efluente”.

[0244] A produção de biogás estável foi observada com o uso de ambos os sistemas digestores durante um período de 10 semanas, que corresponde a entre 0,27 e 0,32 L/g de CO2.

[0245] A alimentação de pasta fluida foi, então, descontinuada em um dos dois sistemas e o retorno à linha de base foi monitorado conforme mostrado na Figura 13. O nível de produção de gás estável é mostrado pela linha horizontal indicada como 2. O ponto de tempo em que a alimentação foi descontinuada é mostrado nas linhas verticais indicadas como 3. Conforme mostrado, após meses de operação estável, permaneceu um material resiliente residual que foi convertido durante o período indicado entre as linhas verticais indicadas como 3 e 4. O retorno à linha de base ou “rampa para baixo” é mostrado no período após a linha vertical indicada como 4. Após um período de linha de base, a alimentação foi, novamente, iniciada no ponto indicado pela linha vertical indicada como 1. A elevação da produção de gás de estado estável ou “rampa para cima” é mostrada no período após a linha vertical indicada como 1.

[0246] Os parâmetros de produção de gás a partir do biolíquido, incluindo a “rampa para cima” e “rampa para baixo” medidas conforme descrito são mostrados abaixo.

*Tempo de rampa para cima é o tempo da primeira alimentação até a produção de gás deixar de aumentar e se estabilizar. O tempo de rampa para cima indica o nível de orgânicos facilmente convertidos na alimentação. **Tempo de rampa para baixo é o tempo da última alimentação até a produção de gás deixar de diminuir de maneira íngreme. O tempo de rampa para baixo mostra a produção de gás a partir dos orgânicos facilmente convertidos. ***Queima é o tempo após o Tempo de rampa para baixo até que a produção de gás pare completamente no nível de base. O tempo de queima mostra a produção de gás a partir dos orgânicos convertidos lentamente. ****Corrigido para produção de gás de plano de fundo de 2 l/dia.

EXEMPLO13.PRODUÇÃODEBIOMETANOCOMPARATIVACOMO USODEPASTAFLUIDABIODEGRADÁVELOBTIDAAPARTIRDE HIDRÓLISEENZIMÁTICADEMSWNÃOSEPARADOSCOMOUSODE PREPARAÇÕESDEENZIMAISOLADACOMESEMAFERMENTAÇÃO MICROBIANA CONCORRENTE

[0247] Os biolíquidos de “alto lactato” e “baixo lactato” obtido no exemplo 6 foram comparados para produção de biometano como o uso do sistema de digestão anaeróbico de filtro fixo descrito no exemplo 8. As medições foram obtidas e os tempos de “rampa para cima” e “rampa para baixo” foram determinados conforme descrito no exemplo 11.

[0248] A Figura 14 mostra a caracterização de “rampa para cima” e “rampa para baixo” do biolíquido de “alto lactato”. O nível de produção de gás estável é mostrado através da linha horizontal indicada como 2. O ponto de tempo em que a alimentação foi iniciada é mostrado nas linhas verticais indicadas como 1. A elevação na produção de gás de estado estável ou “rampa para cima” é mostrada no período após a linha vertical indicada como 1. O ponto de tempo em que a alimentação foi descontinuada é mostrado na linha vertical indicada como 3. O retorno à linha de base ou “rampa para baixo” é mostrada no período que segue a linha vertical indicada como 3 até o período na linha vertical indicada por 4.

[0249] A Figura 15 mostra a mesma caracterização do biolíquido de “baixo lactato”, com os pontos relevantes indicados conforme descrito para a Figura 14..

[0250] Os parâmetros comparativos da produção de gás a partir dos biolíquidos de “alto lactato” e “baixo lactato”, que incluem a “rampa para cima” e “rampa para baixo” medidas conforme descrito são mostrados abaixo.

[0251] A diferença nos tempos de “rampa para cima”/”rampa para baixo” mostram as diferenças na facilidade de biodegradabilidade. As biomassas mais facilmente convertidas, por fim, terão a taxa de conversão total mais alta em uma aplicação de bioprodução de gás. Ademais, os substratos de biometano “mais rápidos” são, mais idealmente adequados cara a conversão através de sistemas de digestão anaeróbica mais rápidos, tais como digestores de filtro fixo.

[0252] Conforme mostrado, o biolíquido de “alto lactato” exibe um tempo de “rampa para cima” e “rampa para baixo” na produção de biometano.

*Tempo de rampa para cima é o tempo da primeira alimentação até a produção de gás deixa de aumentar e se estabiliza. O tempo de rampa para cima indica o nível de orgânicos facilmente convertidos na alimentação. **Tempo de rampa para baixo é o tempo da última alimentação até a produção de gás deixa de diminuir de maneira íngreme. O tempo de rampa para baixo mostra a produção de gás a partir dos orgânicos facilmente convertidos. ***Queima é o tempo após o Tempo de rampa para baixo até a produção de gás parar completamente no nível de base. O tempo de queima mostra a produção de gás a partir dos orgânicos convertidos lentamente. ****Corrigido para a produção de gás de plano de fundo de 2 l/dia

EXEMPLO 14. PRODUÇÃO DE BIOMETANO COM O USO DE PASTA FLUIDA BIODEGRADÁVEL OBTIDA A PARTIR DA FERMENTAÇÃO MICROBIANA CONCORRENTE E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PALHA DE LÍQUIDO PRÉ-TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA COM O USO DE PREPARAÇÕES DE ENZIMA ISOLADA

[0253] A palha de trigo foi pré-tratada, separada em uma fração de fibra e uma fração de líquido e, então, a fração de fibra foi separadamente lavada. 5 kg de fibra lavada foram incubados em um reator de tambor giratório horizontal com dose de Cellic CTEC3 com um inóculo de microrganismos de fermentação consistem em pasta fluida biodegradável obtida do exemplo 7. A palha de trigo foi submetida à hidrólise e fermentação microbiana simultâneas durante 3 dias a 50 graus.

[0254] Tal biolíquido foi, então, testado em relação à produção de biometano com o uso do sistema de digestão anaeróbico de filtro fixo descrito no exemplo 8. As medições foram obtidas para o tempo de “rampa para cima” conforme descrito no exemplo 11.

[0255] A Figura 16 mostra a caracterização de “rampa para cima” do biolíquido de palha de trigo hidrolisado. O nível de produção de gás estável é mostrado através da linha horizontal indicada como 2. O ponto de tempo em que a alimentação foi iniciada é mostrado nas linhas verticais indicadas como 1. A elevação da produção de gás de estado estável ou “rampa para cima” é mostrada no período após a linha vertical indicada como 1.

[0256] Os parâmetros da produção de gás do biolíquido de hidrolisado de palha de trigo são mostrados abaixo.

[0257] Conforme mostrado, a biomassa lignocelulósica pré-tratada pode, também, ser prontamente usada para a prática de métodos de bioprodução de gás e para produzir os substratos de biometano inovadores da invenção.

* Tempo de rampa para cima é o tempo da primeira alimentação até a produção de gás deixar de crescer e se estabilizar. O tempo de rampa para cima indica o nível de orgânicos facilmente convertidos na alimentação. * *Tempo de rampa para baixo é o tempo da última alimentação até a produção de gás deixar de diminuir de maneira íngreme. O tempo de rampa para baixo mostra a produção de gás a partir de orgânicos facilmente convertidos. * **Queima é o tempo após o Tempo de rampa para baixo até a produção de gás parar completamente no nível de base. O tempo de queima mostra a produção de gás a partir dos orgânicos convertidos lentamente. * ***Corrigido para a produção de gás de plano de fundo de 2 l/dia.

EXEMPLO15.FERMENTAÇÃOMICROBIANACONCORRENTEE HIDRÓLISEENZIMÁTICADEMSWCOMOUSODEORGANISMOS SELECIONADOS

[0258] As reações concorrentes de hidrólise microbiana e enzimática com o uso de bactérias de mono cultura específicas foram executadas em escala de laboratório com o uso do MSW modelo (descrito no exemplo 5) e procedimento descrito no procedimento seguinte no exemplo 5. As condições de reação e dosagem de enzima são especificadas na Tabela 10.

[0259] As cepas bacterianas de Lactobaccillus amylophiles (DSMZ No. 20533) e propionibacterium acidipropionici (DSMZ No. 20272) (DSMZ, Braunsweig, Alemanha) (armazenadas a 4 °C durante 16 horas até o uso) foram usadas como inóculo para determinar o efeito das mesmas na conversão de matéria seca no MSW modelo com ou sem a adição de CTec3. Os metabólitos principais produzidos através das mesmas são ácido láctico e ácido propanoico, respectivamente. A concentração de tais metabólitos foi detectada com o uso do procedimento de HPLC (descrito no exemplo 5).

[0260] Devido ao fato de que a propionibacterium acidipropionici é um anaeróbio, o tampão aplicado nas reações em que tal cepa foi aplicada, foi purgado com o uso de nitrogênio gasoso e a cultura viva foi inoculada aos tubos de reação no interior de uma câmara anaeróbica móvel (Atmos Bag, Sigma Chemical CO, St. Louis, MO, EUA), também purgada com nitrogênio gasoso. Os tubos de reação com P. propionici foram fechados antes de serem transferidos para o incubador. As reações foram inoculadas com 1 ml tanto de P. propionici quanto de L. amylophilus.

[0261] Os resultados exibidos na tabela 4 mostram, claramente, que os metabólitos esperados foram produzidos; o ácido propanoico foi detectado nas reações inoculada com p. acidipropionic enquanto o ácido propanoico não foi detectado no controle que continha o MSW modelo com ou sem CTec3. A concentração de ácido láctico na reação de controle com apenas MSW modelo adicionado foi quase igual às reações com apenas L. amylophilus adicionada. A produção de ácido láctico em tal reação de controle é atribuída às bactérias nativas ao MSW modelo. Algumas bactérias de plano de fundo foram esperadas devido ao fato de que os componentes individuais do resíduo modelo foram produzidos frescos, congeladas, porém, não foram adicionalmente esterilizadas de nenhuma maneira antes da preparação do MSW modelo. Quando a L. amylophilus foi adicionada simultaneamente com CTec3, a concentração de ácido láctico foi quase dobrada (Tabela 10).

[0262] O efeito positivo sobre a liberação de DM para o sobrenadante após a hidrólise foi demonstrado como uma conversão de DM superior nas reações com tanto L. amylophilus quanto P. propionici adicionados em conjunto com CTec3 (30 a 33% de aumento em comparação com as reações com apenas CTec3 adicionado).

[0263] Tabela 10. Culturas bacterianas testadas em escala de laboratório sozinhas ou concorrentemente com a hidrólise enzimática. A temperatura, pH e dosagem de CTec3 de 96 mg/g são mostrados. As reações de controle com MSW em tampão com ou sem CTec3 foram realizadas em paralelo para avaliar o plano de fundo de metabólitos bacterianos em reação. (A média e desvio padrão de 4 reações são mostradas com a exceção dos controles de MSW que foram realizados unitariamente). Nd. Não detectado, abaixo do limite de detecção.

EXEMPLO 16. IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS QUE CONTRIBUEM PARA A FERMENTAÇÃO CONCORRENTE NO EXEMPLO 11

[0264] As amostras do biolíquido “EC12B” e da água recirculada “EA02” foram tomadas durante o teste descrito no exemplo 11 (a amostragem foi realizada em 21 e 22 de março). As amostras de líquido foram congeladas em 10% de glicerol e armazenadas a -20 °C para o propósito de realização de análise de rDNA de 16S para identificar os microrganismos em que é amplamente usado para a identificação e análise filogênica de procariontes com base no componente 16S da pequena subunidade ribossômica. As amostras congeladas foram enviadas em gelo seco para o GATC Biotech AB, Solna, SE, onde a análise de rDNA de 16S foi realizada (GATC_Biotech). A análise compreende:

[0265] extração de DNA genômico, preparação de biblioteca de amplificação com o uso de par de iniciadores de iniciadores universais que abrangem as regiões hipervariáveis V1 a V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp de comprimento), etiquetagem de PCR com adaptadores de GS FLX, sequenciamento em um instrumento de Sequenciador de Genoma FLX para obter uma quantidade de 104.000 a 160.000 de leitura por amostra. As sequências resultantes foram, então, consultadas em um BlastN contra o banco de dados de rDNA do Projeto de Banco de Dados Ribossômicos (Cole et al., 2009). O banco de dados contém sequências de boa qualidade com pelo menos 12.00 bp de comprimento e uma associação taxonômica de NCBI. A liberação atual (RDP Release 10, Atualizada em 19 de setembro de 2012) contém 9.162 bactérias e 375 sequências de archaeal Os resultados de BLAST foram filtrados para remover as correspondências curtas e de baixa qualidade (identidade de sequência > 90%,cobertura de alinhamento >90%).

[0266] Nas amostras EC12B-21/3, EC12B-22/3 e EA02B 21/3, EA02-22/3 um total de 452, 310, 785, 594 diferentes bactérias foram identificadas.

[0267] A análise mostrou, claramente, a um nível de espécie, que a Lactobacillus amylolyticus foi, de longe, a bactéria mais dominante correspondendo de 26% a 48% de toda a microbiota detectada. A microbiota nas amostras de EC12B foi similar; a distribuição das 13 bactérias predominantes (Lactobacillus amylolyticus DSM 11664, subespécie de Lactobacillus delbrueckii, delbrueckii, Lactobacillus amylovorus, subespécie de Lactobacillus delbrueckii, indicus, Lactobacillus similis JCM 2765, subespécie de Lactobacillus delbrueckii, Lactis DSM 20072, Bacillus coagulans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus pontis, Lactobacillus buchneri) foi, praticamente, a mesma nas duas datas diferentes de amostragem.

[0268] As amostras de EA02 foram similares à EC12B, embora, a L. amylolyticus tenha sido menos dominante. A distribuição das 13 bactérias predominantes (Lactobacillus amylolyticus DSM 11664, a subespécie de Lactobacillus delbrueckii, delbrueckii, Lactobacillus amylovorus, subespécie de Lactobacillus delbrueckii, Lactis DSM 20072, Lactobacillus similis JCM 2765, subespécie de Lactobacillus delbrueckii, indicus, Lactobacillus paraplantarum, Weissella ghanensis, Lactobacillus oligofermentans LMG 22743, Weissella beninensis, Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811, Weissella soli, Lactobacillus paraplantarum) também foi similar com a exceção da ocorrência de Pseudomonas extremaustralis 14-3 nas 13 espécies bacterianas predominantes. Tal Pseudomonas encontrada em EA02 (21/3) foi isolada, com antecedência, de um charco temporário na Antarctica e deve ter a capacidade para produzir polihidroxialcanoato (PHA) tanto de octanoato quanto glicose (Lopez et al. 2009; Tribelli et al., 2012).

[0269] A comparação dos resultados a um nível de gênero mostrou que lactobacillus compreendem 56 a 94% das bactérias identificadas nas amostras. Novamente, a distribuição através dos gêneros é extremamente similar entre as duas datas de amostragem de EC12B e EA02. De modo interessante, nas amostras de EA02, os gêneros Weisella, Leuconostoc e Pseudomonas estão presentes em grande extensão (1,7 a 22%) embora sejam apenas encontrados como constituintes de menor importância da amostra de EC12B (> 0,1%). Weisella e Leuconostoc, ambos pertencem à ordem de lactobacillales, a mesma que os lactobacillus.

[0270] As bactérias patogênicas predominantes na EC12B e EA02 amostradas durante o teste descrito no exemplo 11 compreendem 0,281 a 0,539% e 0,522 a 0,592%, respectivamente, das bactérias totais identificadas. As bactérias patogênicas predominantes nas amostras de EC12B foram Aeromonas spp., Bacillus cereus, Brucella sp., Citrobacter spp., Clostridium perfrigens, Klebsiells sp., Proteus sp., Providencia sp., Salmonella spp., Serratia sp., Shigellae spp. e Staphylococcus aureus (Vide Figura 3). Nenhuma bactéria patogênica de formação de esporo foi identificada na EC12B e EA02 descrita no exemplo 11. A quantidade total de bactérias patogênicas identificadas tanto na EC12B quanto EA02 foi reduzida ao longo do tempo, de modo a quase dispensar a quantidade de bactérias totais em EC12B em um dia.

[0271] Em Déportes et al. (1998), uma visão geral dos patogênicos conhecidos por estarem presentes nos MSW foi realizada. Os patogênicos presentes nos MSW descritos nos exemplos 7, 9 e 11 são mostrados na Tabela 11 (Déportes et al. (1998) e análise de rDNA de 16S). Além dos patogênicos descritos por Déportes et al. (1998), Proteua sp. e Providencia sp. foram, ambos, encontrados em EC12B e EA02 amostradas durante o teste descrito no exemplo 11. Enquanto a Streptococcus spp., a única bactéria patogênica presente no biolíquido no exemplo 5, não esteve, então, presente. Isso indica que uma outra comunidade bacteriana está presente em EC12B e EA02 no exemplo 9, o que pode ser devido à concorrência entre os organismos por nutrientes e uma ligeira diminuição na temperatura durante o processo que favorecerá o crescimento de uma outra comunidade de bactérias. TABELA 12. VISÃO GERAL DE PATOGÊNICOS PRESENTES NOS EXEMPLOS 7, 9 E 11

IDENTIFICAÇÃO DE CEPA E DEPÓSITOS DE DSMZ

[0272] As amostras de EA02 de 21 e 22 de março retiradas do teste descrito no exemplo 7, foram enviadas para a disposição em placa no Novo Nordic Centre for Biosustainability (NN Center) (Hoersholm, Denmark) com o propósito de identificar e obter monoculturas de bactérias isoladas. Mediante a chegada no centro NN, as amostras foram incubadas de um dia para o outro a 50 °C, então, emplacadas em diferentes placas (GM17, caldo de soja tríptico e extrato de extrato de bife (GM17 ágar: 48,25 g/l m17 ágar, após 20 min. de autoclave com glicose adicionada à concentração final em 0,5%, Ágar de soja tríptico: 30 g/l de caldo de soja tríptico, ágar de 15 g/l, Caldo de bife (Statens Serum Institute, Copenhagen, Dinamarca) de 15 g/l de agarose adicionados) e crescido de maneira aeróbica a 50 °C.

[0273] Após um dia, as placas foram visualmente inspecionadas e as colônias selecionadas foram ressemeadas nas placas correspondentes e enviadas para a DSMZ para a identificação.

[0274] As cepas seguintes isoladas da água recirculada da EA02 foram colocadas no depósito de patente em DMSZ, DSMZ, Braunsweig, Alemanha: AMOSTRAS IDENTIFICADAS Amostra ID: 13-349 (Bacillus safensis) oriunda de (EA02-21/3), DSM 27312 Amostra ID: 13-352 (Brevibacillus brevis) oriunda de (EA02-22/3), DSM 27314 Amostra ID: 13-353 (Bacillus subtilis sp. subtilis) oriunda de (EA02-22/3), DSM 27315 Amostra ID: 13-355 (Bacillus licheniformis) oriunda de (EA02-21/3), DSM 27316 Amostra ID: 13-357 (Actinomyces bovis) oriunda de (EA02-22 3), DSM 27317 +-AMOSTRAS NÃO Amostra ID: IDENTIFICADAS 13-351 oriunda de (EA02-22/3), DSM 27313 Amostra ID: 13-362A oriunda de (EA02-22/3), DSM 27318 Amostra ID: 13-365 oriunda de (EA02-22/3), DSM 27319 Amostra ID: 13-367 oriunda de (EA02-22/3), DSM 27320 REFERÊNCIAS: Cole, J. R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R. J., & Tiedje, J. M. (2009). The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. 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Claims

1. MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE RESÍDUO SÓLIDO URBANO (MSW), caracterizado por compreender as etapas de - provisão de um fluxo de MSW não separado a um reator de fermentação microbiana no qual o MSW é fermentado com agitação em um teor não aquoso entre 10 e 50% em peso e em uma temperatura entre 35 e 75°C por um período entre 1 e 72 horas sob condições suficientes para manter uma concentração de bactérias de ácido láctico vivas de pelo menos 1,0 x 1010 UFC/L, em que uma atividade de celulase derivada microbianamente de pelo menos 30 FPU/L é provida por um consórcio microbiano que provê fermentação microbiana, e - remoção de um fluxo de MSW não separado fermentado do reator e submeter este a uma etapa de separação pela qual sólidos não degradáveis são removidos para prover uma pasta fluida de componentes biodegradáveis.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fluxo de MSW de entrada ser inoculado com um inóculo de micro-organismos de ocorrência natural no resíduo, e “elevado” em resíduo local ou componentes de resíduo local como uma fonte de alimento em condições de fermentação de temperatura dentro da variação de 37 a 55°C, ou 40 a 55°C, ou 45 a 50°C, e em um pH dentro da variação 4,2 e 6,0.

3. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo teor de água ter sido adicionado ao resíduo, a fim de atingir um teor não aquoso adequado, e/ou em que um teor não aquoso adequado é alcançado ao adicionar ao MSW uma proporção de massa constante de água entre 0,5 e 2,5 kg de água por kg de MSW.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela atividade de celulase ser adicionada por inoculação com um micro-organismo selecionado que apresenta atividade de celulase extracelular.

5. MÉTODO, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela pasta fluida de componentes biodegradáveis ser submetida a pós-fermentação após a separação de sólidos não degradáveis.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela inoculação do fluxo de MSW de entrada ser provida ao reciclar águas de lavagem ou soluções de processo utilizadas para recuperar material orgânico residual de sólidos não degradáveis e/ou em que a inoculação do fluxo de MSW de entrada é provida antes ou concomitantemente à adição de atividades enzimáticas.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por pelo menos 40% em peso dos sólidos voláteis dissolvidos da pasta fluida de componentes biodegradáveis compreenderem lactato e/ou em que pelo menos 40% em peso do teor não aquoso da pasta fluida de componentes biodegradáveis compreender sólidos voláteis dissolvidos.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela fermentação microbiana ser conduzida dentro da variação de temperatura 45-50°C.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo MSW ter sido aquecido a uma temperatura não maior que 75°C.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelos sólidos não biodegradáveis separados compreenderem pelo menos cerca de 20% do peso seco do MSW, e/ou em que os sólidos não biodegradáveis separados compreendem pelo menos 20% em peso seco de materiais recicláveis.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela separação de sólidos não biodegradáveis ser realizada dentro de 36 horas do início da hidrólise enzimática, ou em que a separação de sólidos não biodegradáveis é realizada dentro de 24 horas do início da hidrólise enzimática.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo etanol ou lactato serem, primeiro, removidos da pasta fluida de componentes biodegradáveis antes da digestão anaeróbica para produzir biometano.