KR101640303B1 - 유산균을 이용한 매몰된 가축사체 분해방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 생석회를 처리하는 단계; 및
상기 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양의 염기성 환경에서도 강한 생존력을 나타내는 혐기성 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하면 가축사체를 조기에 분해할 수 있으며 가축사체 분해 대사산물로 생성된 산을 통하여 매몰지의 초염기성 pH를 중화시킴으로써 토양 세균의 생장 및 토양 생태계의 물질순환 과정을 회복시켜 매몰지 토양을 조기에 안정화시킬 수 있으며, 이를 통하여 매몰지 토지의 빠른 재활용을 가능하게 할 수 있다.

Description

유산균을 이용한 매몰된 가축사체 분해방법{Method for decomposing buried livestock carcasses using lactic acid bacteria}
본 발명은 생석회 처리에 의해 강한 염기성을 나타내는 토양 및 가축사체로 구성된 매몰지내의 가축사체를 빠르게 분해하기 위해 유산균을 이용하는 가축사체 분해방법에 관한 것이다.
구제역과 조류인플루엔자는 제 1종 가축 전염병으로, 치료법이 없기 때문에 발생시 우리나라 '가축전염병예방법' 제20조 살처분 명령에 의해 해당 가축을 살처분하고 있다. 살처분된 가축 사체는 소각 및 매몰 등으로 처리될 수 있는데, 다량으로 발생한 가축 사체의 신속한 처리 및 처리비용 감소를 위해 국내에서 발생하는 가축사체 대부분을 매몰에 의해 처리하고 있다. 이렇게 가축이 매몰된 토양에는 가축전염병예방법과 환경부의 매몰기준에 따라 가축 사체 투입전과 후에 생석회를 투입하고, 복토 후 표면과 주변에 생석회를 포설하도록 규정하고 있다.
생석회의 주성분은 산화칼슘(CaO)으로, 물에 용해되면, 물과 반응하여 소석회(Ca(OH)2)를 생성하고, 이어 이온화되면서 용액은 pH 12 이상의 강 염기성을 나타낸다. 또한 생석회가 수분과 반응하여 소석회를 생성할 때, 200℃ 이상의 열을 발생시켜 수분이 있는 환경에 생석회 포설은 강 염기성 수용액 형성에 의해 병원체의 생장 저해 효과와 열 소독으로 인한 병원체 살균효과를 발휘하므로, 가축 사체 및 매몰지 주변환경의 살균 목적으로 생석회를 처리한다.
그러나 사체와 토양에 살포된 생석회는 토양 및 사체의 pH를 매우 높게 만들어 토양 세균의 생태학적 기능 소실을 유발하거나 일반적인 사체 분해활성을 나타내는 토양 세균을 사멸시켜 매몰된 사체의 분해가 진행되지 않거나, 매우 느리게 진행된다. 이에 따라 매몰지내 가축사체의 부패 지연으로 인한 이차적 오염 병원체 및 화합물의 지속적인 발생으로 인하여, 생물학적 위해성이 지속되어 매몰지 토지의 활용도를 저해하는 요소로 작용할 수 있다.
이러한 사체 매몰지내 생석회의 염기성 효과는 생물학적 및 비생물학적 과정에 의해 중화될 수 있으나 생석회의 강한 살균력에 의해 세균을 이용한 생물학적 중화작용은 거의 기대할 수 없고, 강우와 같은 비생물학적 과정에 의한 생석회 중화작용은 한국의 연평균 강수량을 가정하면, 일반적인 세균의 생장이 가능한 pH 9 정도의 토양으로 중화되려면 최소 21년의 시간이 소요되어지는 것으로 보고되어 짐에 따라, 생석회가 처리된 사체와 토양으로 구성된 가축사체 매몰지내에서 생물학적 활성에 의해 사체의 분해가 진행되려면, 최소 20년 이상의 시간이 소요될 것으로 사료된다. 이에 따라 가축사체 매몰지의 염기성 효과를 조기에 안정화시켜 토양 생태계의 물질 순환을 회복하고 토지의 빠른 재사용을 유도할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제10-2012-0103790호
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 이용하여 생석회 처리로 형성된 초염기성 매몰지 내부의 가축사체를 신속하게 분해하는 방법을 제공하여, 매몰지의 염기성 pH를 신속히 중화하고 생물학적 사체분해 대사과정 및 물질 순환을 회복시켜 매몰지 토지의 빠른 재사용을 유도하고자 한다.
본 발명은 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 생석회를 처리하는 단계; 및
상기 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법을 제공한다.
상기 생석회 처리는 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 가축사체 매몰 전 또는 매몰 후 0.1 내지 20 중량%로 생석회 처리될 수 있다.
상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)은 105 CFU/g 내지 1012 CFU/g 농도로 처리될 수 있다.
또한 상기 매몰된 가축사체 분해방법은 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 재처리하는 단계를 더 포함될 수 있다.
상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 재처리는 30일 내지 80일마다 처리될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 염기성 환경에서도 강한 생존력을 나타내는 혐기성 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하여 가축사체를 조기에 분해할 수 있다.
보다 상세하게는 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양의 염기성 환경에서도 강한 생존력을 나타내는 혐기성 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하면 가축사체를 조기에 분해할 수 있으며 가축사체 분해 대사산물로 생성된 산을 통하여 매몰지의 초염기성 pH를 중화시킴으로써 토양 세균의 생장 및 토양 생태계의 물질순환 과정을 회복시켜 매몰지 토양을 조기에 안정화시킬 수 있으며, 이를 통하여 매몰지 토지의 빠른 재활용을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 매몰지에서 분리된 균의 GTG5 rep-PCR 후 전기영동으로 확인한 결과로 레인 1은 기준주(type strain)인 류코노스톡 젤리둠(L. gelidum) KCTC3527이며, 레인 2는 H71L1이며; 레인 3은 H71L2; 레인 4는 H71L12; 레인 5는 H71L4; 레인 M은 1 kb 사이즈 마커이다.
도 2는 H71L1 및 H71L4 균주의 16S rRNA 유전자에 의한 계통수를 Maximum Likelihood 방법 및 Hasegawa-Kishino-Yano model, bootstrap 1,000회로 확인한 결과이다.
도 3은 H71L1 및 H71L4 균주의 배지 pH에 따른 성장율을 확인한결과이다.
도 4는 류코노스톡 젤리둠균의 16S rRNA 유전자만을 특이적으로 증폭하는 p프라이머인 Lgel-F(5-TCG TAT CGC ATG ATA CAAG-3)와 Lgel-R(5-TAG ACG GTT CCC TCC TTAC-3)를 사용하여 PCR 반응을 수행한 후 PCR 반응물을 전기영동하여 확인한 결과로, 레인 1 내지 5는 류코노스톡 젤리둠균을 처리한 가축사체 토양 시료이며, 레인 6은 H71L1; 레인 7은 H71L4; 레인 8은 음성대조군 1인 엔테로코쿠스 듀란(Enterococcus durans)을 처리한 가축사체 토양 시료이며; 레인 9는 음성대조군 2인 멸균된 증류수를 처리한 가축사체 토양 시료이며; 레인 M은 100 bp 사이즈 마커이다.
도 5는 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum)인 H71L1과 H71L4를 각각 108 CFU/g와 106 CFU/g농도로 닭 가슴살에 처리한 후 시간경과에 따른 닭 사체의 중량 감소를 확인한 결과이다.
본 발명은 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 생석회를 처리하는 단계; 및
상기 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법을 제공한다.
상기 생석회 처리는 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 가축사체 매몰 전 또는 매몰 후 0.1 내지 20 중량%로 생석회 처리될 수 있다.
생석회가 0.1 중량% 이하로 처리될 경우 충분한 염기성 환경이 만들어지지 않고 다양한 육류 부패 미생물이 생장할 수 있으므로, 유산균 처리에 의한 효과가 저감될 수 있다. 또한 생석회가 20 중량% 이상 처리될 경우, 토양의 pH 중화 및 안정화에 더 오랜 시일이 요구된다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 생석회 및 돼지 사체가 함유된 토양 혼합물을 16℃에서 1개월간 배양하면서 토양 내 세균 종의 조성 변화를 확인한 결과, 생석회가 처리에 의한 초염기성 토양 및 사체 환경에서 106 - 107 CFU/g에 달하는 토양세균 중 거의 모든 토양세균이 사체 분해 활성을 잃고 사멸하였으며 102 - 103 CFU/g 정도의 포자형태의 균만이 생석회 처리를 견디고 생존력을 나타내었다. 그 중 생석회 처리 14일째부터 혐기성 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 군집이 우점적으로 형성되는 것이 확인되었다.
또한 다른 일실시예에 따르면, 닭 사체에 106 CFU/g 또는 108 CFU/g농도로 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 처리한 후 80일까지 닭 사체 중량을 확인한 결과, 도 5와 같이 시간경과에 따라 닭 사체 중량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 염기성 환경에서 강한 생존력 및 사체 분해효과를 나타내는 혐기성 유산균인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)은 염기성 환경의 토지에 매몰된 가축 사체를 빠르게 분해하기 위해 적합한 세균임이 확인됨에 따라, 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 가축사체 조기 분해를 위한 세균으로 이용할 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)은 H71L1(KCTC 12518BP) 또는 H71L4(KCTC 12519BP)일 수 있다.
상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)은 105 CFU/g 내지 1012 CFU/g 농도로 처리될 수 있다.
보다 상세하게는 세균 처리시 상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 처리 농도범위의 이하로 처리될 경우 매몰지내 균이 작용지점에서 균체의 농도가 증가할 때까지 보다 오랜 시간이 소요되어 가축 사체의 분해속도가 느려지거나 사체 이외의 매몰지 구성요소에 흡착되어 매몰지내 균의 작용지점에 도달하지 못하는 문제점이 야기될 수 있다.
또한 상기 매몰된 가축사체 분해방법은 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 재처리하는 단계를 더 포함될 수 있다.
상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 재처리는 30일 내지 80일마다 처리될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 생석회가 처리된 토양에서 106 CFU/g 농도로 처리된 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)의 생존 여부를 분석한 결과 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)이 1개월 이상 생존할 수 있음이 확인되었으나, 가축사체 매몰지의 토양특성과 기후에 따라, 처리된 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)이 연중 또는 다년간 생존하지 못하는 경우가 있으므로, 개별 매몰지에 대하여 일정기간 후 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)의 잔류 여부를 확인한 후 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)이 검출되지 않을 경우 재처리하여 지속적인 사체의 분해를 유도해야한다.
따라서, 처리된 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 유산균의 생존이 어려운 토양환경과 기후가 일시적으로 만들어진 매몰지에서 상기 유산균 재처리 기간을 경과하여 검출 시험과 재처리가 이루어지지 않으면, 사체의 분해가 정지되는 문제점이 야기될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 생석회가 처리된 토양-사체 혼합물에서 생존균의 분리 및 동정
생석회를 0.1 내지 20%(w/w)와 돼지 사체가 함유된 토양 혼합물을 16℃에서 1개월간 배양하면서 16S rRNA 유전자 염기서열의 조성변화에 따라 세균의 종 조성이 변화하는 정도를 파악하였다.
그 결과 3%(w/w)의 생석회가 처리된 조건에서 14일째부터 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) 이라는 유산균 군집이 우점적으로 형성되는 것을 확인하였다.
유산균을 분리하기 위해 강원도 홍천군에 조성된 구제역 관련하여 조성된 가축매몰지 인근에서 채취한 토양을 사용하였고, 육류의 비율은 무게비로 2:3의 비율로 혼합하였다. 생석회의 비율은 토양의 무게에 1% 또는 3%(w/w)로 정하여 토양과 생석회, 육류가 골고루 혼합되도록 한 뒤, 폴리프로필렌 재질의 15 ml 시험관에 밀봉하여, 16℃에서 5일 동안 배양하였다.
해당 시료에서 유산균을 분리하기 위해서 유산균을 선택적으로 배양할 수 있는 MRS 평판배지(BD Difco, Germany)를 사용하여 생석회 1% 또는 3%(w/w)와 육류가 함유된 토양 혼합물 0.6 g을 MRS 액체배지 1 ml에 넣은 뒤 vortex 교반기에서 5분간 최고 속도로 교반하고, 1분간 방치하였다. 상등액을 MRS 액체배지에 여러 농도로 희석한 뒤, 희석액 0.1 ml을 MRS 평판배지에 넣고 도말한 후 평판배지를 16℃에서 5일간 배양 후, 형성된 집락(colony)을 확인하고 분리하였다.
분리된 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 판정하기 위해서 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사가 제공한 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. 세균의 16S rRNA 유전자 부분을 증폭시키기 위해 27F primer (5’-AGA GTT TGA TYN TGG CTC AG-3’; 서열목록 1), 1492R primer(5’-TAC CTT GTT ACG ACT T-3’; 서열목록 2)를 사용하였다. PCR(polymerase chain reaction) 반응은 1 Unit Dr.Taq DNA 폴리머라아제(바이오알앤디, 한국), 1 × Dr.Taq buffer, 0.2 μM dNTP, 0.5 μM 27F, 1492R 프라이머 DNA 1 μl를 첨가하여 총 반응액이 50 μl가 되게 사용하였다.
PCR의 진행은 PCT-100 (MJ Research , USA)을 사용하여 진행하였다. PCR 조건은 95℃ 2분 동안 변성처리 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 전기영동으로 PCR 산물의 크기를 확인하고, Mini Elute purification kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 DNA를 정제한 후 마크로젠사(한국)에 의뢰하여 Sanger방법으로 염기서열 분석하였다.
확인된 염기서열을 Ribosomal Database Project(RDP, http://rdp.cme.msu.edu)와 GenBank(http://ncbi.nlm.nih.gov)의 database와 CLUSTAL W로 정렬하였다. 그 이후 MEGA5를 이용하여 Maximum Likelihood 방법과 Hasegawa-Kishino-Yano model, bootstrap 1,000회로 계통도를 작성하였다.
16S rRNA 유전자의 염기서열을 판정한 결과인 도 2와 같이 분리된 균주 4개의 균주가 GenBank accession no. KF577567, KF577568 및 NR_102984와 100% 일치하여, 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)으로 판정되었다.
류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)으로 판정된 균주 중 동일한 균주, 즉 클론(clone)인지 구분하기 위하여 유전체 지문분석을 실시하였다.
그 방법으로 여러 가지 생물종을 대상으로 구분 능력이 높은 primer인 GTG5 primer(5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3'; 서열목록 3)를 이용하여 rep-PCR을 진행하였다. GTG5 rep-PCR의 반응 용액은, 최종 농도로 1 × EX Taq buffer, 200 μM dNTP, 800 nM GTG5 primer, 1.25unit EX Taq polymerase(TaKaRa, Japan)로 만들어졌고, 주형 DNA 1 μl를 첨가하여 총 반응액이 50 μl가 되게 사용하였다.
핵산 증폭을 위해 95℃에서 5분 동안 변성처리한 후 94℃에서 45초, 52℃에서 1분 65℃에서 10분씩 35회 반복하고 65℃에서 20분간 반응하였다. 0.75% agarose gel에 rep-PCR 증폭 산물을 전기영동하여 증폭여부를 확인하고, 각 시료 별로 전기영동 된 밴드 패턴(electrophoretic type, ET)을 시각적으로 비교하여 밴드의 상동성을 확인하였다. 동일한 밴드 패턴을 가진 시료는 동일한 균주로 구분할 수 있는데, 그 결과 도 1과 같이 4 균주에서 2개의 ET로 분류되었다. 동일 ET로 분류되는 균주들 중, 각 ET를 대표하는 균주로 H71L1과 H71L4 균주를 선별하였다.
H71L1과 H71L4 균주를 pH 7, 8, 8.5 또는 9로 조정된 GYP(Glucose-Yeast Extract-Peptone) 액체배지(D-글루코즈 20 g/L, 효모추출물 10 g/L, 폴리펩톤 5 g/L, 소디움 아세테이트 2 g/L, 트윈 80 0.5 g/L, MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g/L, MnSO4ㆍ4H2O 0.01 g/L, FeSO4ㆍ 7H2O 0.01 g/L, NaCl 0.01 g/L)에 접종한 후, 시간별로 흡광도를 측정하여 생장속도를 구하였다.
그 결과 도 3과 같이 H71L1는 pH 8의 액체 배지에서 생장속도가 가장 빨랐으며, H71L4는 pH7, 8, 8.5 또는 9에서 생장속도가 비슷하게 나타났다.
비교적 빠른 성장과 8 이상의 pH에서 생장속도가 크게 감소하지 않는 H71L1과 H71L4 균주를 내염기성 균주로 선발하고, 두 분리 균주는 각각 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) KCTC 12518BP와 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) KCTC 12519BP로, 부타페스트 협약에 따라, 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다.
< 실시예 2> 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum )균 배양
류코노스톡 젤리둠균을 pH 8로 맞춘 평판 또는 액체 형태의 GYP(Glucose-Yeast Extract-Peptone) 배지를 이용하여 25℃에서 48 시간 이상 배양하였다.
배양된 균체는 3,000×g에서 15분간 원심분리하거나, 여과구경 0.4 또는 0.2μm의 막필터(membrane filter)를 이용하여 농축하였다.
< 실시예 3> 생석회 토양에서 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum )균의 생존 확인 및 처리기간 확인
3-1. 생석회 토양에 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum )균 처리
3% 이하로 생석회 농도가 조성된 가축사체 매몰지 영역에 실시예 2의 배양된 류코노스톡 젤리둠 균주를 >106 CFU/g의 농도로 주입하였다. 류코노스톡 젤리둠 생존 여부 분석한 후, 류코노스톡 젤리둠 검출이 되지 않을 시, 균체를 재주입하였다.
3-2. 균주 분리 동정을 통한 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum )균 생존 분석
실시예 3-1의 방법으로 균 처리된 매몰지 시료 0.1 ~ 0.2 g을 GYP 액체배지 1 ml에 넣은 뒤 vortex 교반기에서 5분간 최고 속도로 교반하고, 1분간 방치하였다. 상등액을 GYP 액체배지에 여러 농도로 희석한 뒤, 희석액 0.1 ml을 GYP 평판배지에 넣고 도말하였다. 평판배지를 25℃에서 48시간 배양 후, 형성된 집락(colony)을 확인하고 분리하였다.
분리한 균주는 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)균과 동일한 균주임을 확인하기 위하여 유전체 지문분석을 실시하였다. HiGene Genomic DNA Prep Kit (BIOFACT, Korea)를 사용하여 제조사가 제공한 매뉴얼에 따라서 DNA를 추출하고 GTG5 primer(5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3'; 서열목록 3)를 이용하여 rep-PCR을 진행하였다.
GTG5 rep-PCR의 반응 용액은, 최종 농도로 1 × EX Taq buffer, 200 μM dNTP, 800 nM GTG5 primer, 1.25unit EX Taq polymerase(TaKaRa, Japan)로 만들어졌고, 주형 DNA 1 μl를 첨가하여 총 반응액이 50 μl가 되게 사용하였다. 핵산 증폭을 위해 95℃에서 5분 동안 변성처리한 후 94℃에서 45초, 52℃에서 1분 65℃에서 10분씩 35회 반복하고 65℃에서 20분간 반응하였다. 0.75% 아가로스 겔에 rep-PCR 증폭 산물을 전기영동하여 증폭여부를 확인하고, 각 시료 별로 전기영동 된 밴드 패턴(electrophoretic type, ET)을 시각적으로 비교하여 밴드의 상동성을 확인하였다.
3-3. PCR 검출법을 이용한 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum )균 생존 분석
실시예 3-1의 방법으로 균 처리된 매몰지 시료에서 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)을 탐지하기 위해서 PCR을 실시하였다. 시료 1 g을 Ultraclean Soil DNA Isolation Kit(MoBio, USA)를 사용하여 제조사가 제공한 매뉴얼에 따라 메타게놈(metagenome) DNA를 추출하였다. 그 후, 류코노스톡 젤리둠균의 16S rRNA 유전자만을 특이적으로 증폭하는 primer인 Lgel-F(5-TCG TAT CGC ATG ATAC AAG-3; 서열목록 4)와 Lgel-R(5-TAG ACG GTT CCC TCC TTAC-3; 서열목록 5)를 사용하여 PCR를 진행하였고, 이때 류코노스톡 젤리둠을 선택적으로 증폭했을 시 예상되는 PCR 산물의 크기는 1290 bp이었다. PCR(polymerase chain reaction) 반응은 2 Unit EX Taq 폴리머라아제(TaKaRa, Japan), 1 × Dr.Taq buffer, 0.2 μM dNTP, 0.5 μM Lgel-F, Lgel-R 프라이머, 주형 DNA 1 μl를 첨가하여 총 반응액이 20 μl가 되게 사용하였다. PCR의 진행은 PCT-100 (MJ Research , USA)을 사용하여 진행하였다. PCR 조건은 94℃ 2분 동안 변성처리 후, 94℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하였다.
그 결과 도 4와 같이 전기영동으로 균 처리된 매몰지 시료에서 추출한 DNA와 H71L1, H71L4의 PCR 산물의 크기가 약 1300 bp가 되는 것을 확인하였다. 균 처리된 매몰지 시료에서 류코노스톡 젤리둠을 검출하여, 매몰지에서 H71L1와 H71L4가 생존하는 것을 확인하였다.
3-4. 결과
상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum)균 배양을 통한 균주 분리 동정 방법 및 류코노스톡 젤리둠균의 16S rRNA 유전자만을 특이적으로 증폭하는 PCR을 적용하여 검출하는 비배양적 방법으로 류코노스톡 젤리둠균의 생석회 매몰지 생존여부를 분석한 결과, 류코노스톡 젤리둠은 1개월 이상 사체와 토양이 혼합된 환경에서 생존할 수 있음이 확인되었다.
상기 결과로부터 류코노스톡 젤리둠균을 1개월 이상의 간격으로 생석회 매몰지에 재처리하는 것이 바람직함을 확인하였다.
< 실시예 4> 가축 사체에 대한 유산균 류코노스톡 젤리둠( Leuconostoc gelidum ) 처리 효과 확인
류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) H71L1과 H71L4 분리 균주를 실시예 2의 방법으로 배양하여 각각 108 CFU/g와 106 CFU/g의 농도로 농축하였다. 멸균된 닭가슴살 40 g에 류코노스톡 젤리둠균의 농축된 균 배양액 10 ml씩 처리 후, 폴리프로필렌 재질의 50 ml 시험관에 담고 25℃ 배양기에서 배양하였다. 그 후 80일까지 시간 경과에 따른 닭가슴살의 중량의 감소를 확인하였다.
그 결과 도 5와 같이 >106 CFU/g의 농도로 처리하였을 때, 측정가능한 수준의 중량 감소를 보였으며, 처리 농도에 비례하여 중량감소가 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12518BP 20131112 한국생명공학연구원 KCTC12519BP 20131112
<110> KYUNGSUNG UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> Method for decomposing buried livestock carcasses using lactic acid bacteria <130> ADP-2014-0173 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat yntggctcag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taccttgtta cgactt 16 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtggtggtgg tggtg 15 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcgtatcgca tgatacaag 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tagacggttc cctccttac 19

Claims (5)

  1. 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 생석회를 처리하는 단계; 및
    상기 생석회가 처리된 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에, 염기성 환경에서 생장하는 유산균 분리주(strain)인 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) H71L1 또는 H71L4를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 생석회 처리는 가축사체 매몰지 및 그 주변 토양에 가축사체 매몰 전 또는 매몰 후 0.1 내지 20 중량%로 생석회 처리되는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) H71L1 또는 H71L4는 105 CFU/g 내지 1012 CFU/g 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 매몰된 가축사체 분해방법은 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) H71L1 또는 H71L4를 재처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gelidum) H71L1 또는 H71L4 재처리는 30일 내지 80일마다 처리하는 것을 특징으로 하는 매몰된 가축사체 분해방법.
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