KR20150028812A - 바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들 - Google Patents

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야콥 바그너 얀센
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Abstract

도시 고형물 폐기물들(MSW)의 가공 방법들이 제공되며, 이에 따라 폐기물의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효가 생분해성 성분들의 액화와 미생물 메타볼라이트들의 축적을 야기한다. 액화된 생분해성 성분들은 그 다음에, 많은 부분이 아세테이트, 에탄올, 부티레이트, 락테이트, 포르메이트 또는 프로피오네이트의 일부 조합을 포함하는, 용해된 고형물들의 많은 퍼센트를 포함하는 특징이 있는 바이오리퀴드를 생산하기 위하여 비분해성 고형물들로부터 분리된다. 이 바이오리퀴드, 그 자체는, 신규한 바이오메탄 기질 조성물로, 바이오메탄으로의 매우 빠른 전환을 허용한다. 이 바이오리퀴드를 이용하여 그리고 유기 물질들의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 다른 바이오메탄 기질 조성물들을 이용하여 바이오메탄 생산 방법들이 더 제공된다.

Description

바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들{METHODS AND COMPOSITIONS FOR BIOMETHANE PRODUCTION}
바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들이다.
특히 가정 가사 폐기물들(domestic household wastes)을 포함하는 도시 고형 폐기물(Municipal solid wastes) (MSW), 레스토랑 및 식품 가공시설들의 폐기물들 및 오피스 건물들의 폐기물들은 에너지, 연료들 및 다른 유용한 산물들로 더 가공될 수 있는 유기 물질들의 매우 큰 성분(component)을 구성한다. 현재 이용가능한 MSW 중 작은 부분만이 재활용되며, 대다수는 쓰레기 매립지로 넣어진다.
그것들의 내재하는 에너지 잠재력의 회복 및, 또한 재활용할 수 있는 물질들의 회복을 최대화하기 위하여, 상당한 관심이 고형 폐기물들을 가공하는 효율적이며 친환경적인 방법들의 개발에서 생겼다. "폐기물을 에너지로의" 공정에서 하나의 중요한 도전은 MSW의 불균일한(heterogeneous) 성질이었다. 고형 폐기물들은 전형적으로 플라스틱들, 유리, 금속들 및 다른 비-분해성 물질들로 섞인(intermingled) 유기, 분해성 물질의 상당한 성분을 포함한다. 분류되지 않은 폐기물들은 엄격한 난방 시스템에 의존하는 덴마크 및 스웨덴과 같은 국가들에서 널리 수행되는, 소각에 직접 이용될 수 있다(Strehlik 2009). 그러나 소각 방법들은 부정적인 환경적 결과들과 연관되고, 원료(raw material)들의 효과적인 재활용을 달성하지 않는다. 재활용과 결합된 MSW의 분해성 성분의 깨끗하고 효율적인 이용은 비-분해성 물질로부터 분해성을 분리하기 위한 일부 분류 방법을 요구한다.
MSW의 분해성 성분은 열화학 및 생물학적 방법들 모두를 이용한 "폐기물에서 에너지로의" 가공에 이용될 수 있다. MSW는 열분해(pyrolysis) 또는 열화학적 가스화(gasification)의 다른 모드들의 대상이다. 극단적으로 높은 온도들에서 열 분해(thermally decompose)되는 유기 폐기물들은 타르 및 메탄, 게다가 고형 잔여물 또는, 직접적인 소각과 결합된 그것들보다 덜 독성인 결과를 갖고 탈 수 있는 "코크(coke)"와 같은 휘발성(volatile) 성분들을 생산한다. 대체하여, 유기 폐기물들은 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함하는 "합성가스(syngas)"로 열적으로 전환될 수 있는데, 이는 나아가 합성연료들(synthetic fuel)로 전환될 수 있다. 리뷰를 위하여 예컨대 Malkow 2004 참조.
MSW의 분해성 성분들의 전환을 위한 생물학적 방법들은 에탄올과 같은 특정 유용한 최종 산물들을 생산하기 위한 발효를 포함한다. 예컨대 WO2009/150455; WO2009/095693; WO2007/036795; Ballesteros et al. 2010; Li et al 2007 참조.
대체하여, 생물학적 전환은 바이오메탄(biomethane) 또는 "바이오가스(biogas)"를 생산하는 혐기성(anaerobic) 소화(digestion)에 의하여 달성될 수 있다. 리뷰를 위하여 예컨대, Hartmann and Ahring 2006 참조. MSW의 전-분류된(pre-sorted) 유기 성분은 바이오메탄으로 직접, 예컨대 US2004/0191755 참조, 또는 첨가된 물의 존재 하 가는(mincing) 것을 수반하는 상대적으로 단순한 "펄핑(pulping)" 공정 후, 예컨대 US2008/0020456 참조, 전환될 수 있다.
그러나, 유기 성분을 얻기 위한 MSW의 전-분류는 전형적으로 비용이 들며, 비효율적이거나 또는 비실용적(impractical)이다. 소스-분류(Source-sorting)는 큰 사회 기반 시설(infrastructure ) 및 운영 비용에 더하여 적극적 참여 및 폐기물이 수거되는 지역사회(community)로부터의 지지를 요구한다-현대 도시 사회에서 달성하기 어렵다고 입증된 활동. 기계적 분류는 전형적으로 자본 집약적이며, 나아가 적어도 대략 30% 및 자주 그 보다 높게, 유기 물질의 큰 손실과 관련된다. 예컨대 Connsonni 2005 참조.
분류 시스템이 갖는 이러한 문제점들 중 일부는 분류되지 않은 폐기물 내 유기, 분해성 성분들의 액화(liquefaction)의 이용을 통해 성공적으로 회피되어 왓다. 액화된(Liquefied) 유기 물질은 비-분해성 물질들로부터 쉽게 분리될 수 있다. 일단 펌프로 퍼낼 수 있는(pumpable) 슬러리(slurry)로 액화되면, 유기 성분은 쉽게 열화학적 또는 생물학적 전환 공정들로 이용될 수 있다. 분해성 성분들의 액화는 고압, 고온 "오토클레이브(autoclave)" 공정들을 이용하여 넓게 보고되어 왔다, 예컨대 US2013/0029394; US2012/006089; US20110008865; WO2009/150455; WO2009/108761; WO2008/081028; US2005/0166812; US2004/0041301; US 5427650; US 5190226 참조.
분해성 유기 성분들의 액화에의 근본적으로(radically) 다른 접근은, 특히 효소 가수분해를 통한, 생물학적 공정들을 이용하여 달성될 수 있다, Jensen et al. 2010; Jensen et al. 2011; Tonini and Astrup 2012; WO2007/036795; WO2010/032557 참조.
효소 가수분해는 분해성 유기 성분들의 액화를 위한 "오토클레이브" 방법들에 비하여 고유한 이점들을 제공한다. 효소적 액화를 이용하여, MSW 공정(processing)은 상대적으로 저렴한 장비 및 상대적으로 낮은 온도에서 운영되는 비-가압(non-pressurized) 반응들을 이용하여 연속적 방식으로 수행될 수 있다. 그에 반하여, "오토클레이브" 공정들은 뱃치(batch) 모드에서 수행되어야 하며, 그리고 일반적으로 훨씬 높은 자본 비용을 수반한다.
MSW-탄(bourne) 병원성 미생물들에 의하여 제기되는 가능한 건강 위험들을 감소시키시 위한 "멸균(sterilization)"의 인지된 필요성은 "오토클레이브" 액화 방법들의 우세를 지지하는 지배적 주제였다. 예컨대 WO2009/150455; WO2000/072987; Li et al. 2012; Ballesteros et al. 2010; Li et al. 2007 참조. 유사하게, 효소적 액화가 적어도 90 - 95 ℃의 상대적으로 높은 온도들로의 열의 전처리를 요구한다는 것도 이전에 믿어져왔다. 이 고온은 분류되지 않은 MSW의 "멸균"을 가져오고, 분해성 유기 성분들이 부드러워지고 종이 산물들이 "펄프화되는(pulped)"데, 어느 정도는 필수적이라고 생각되었다. Jensen et al. 2010; Jensen et al. 2011; Tonini and Astrup 2012 참조.
도시 고형 폐기물(municipal solid waste) (MSW)의 가공 방법을 제공한다.
우리는 분류되지 않은 MSW의 안전한 효소적 액화가 고온 전처리 없이 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 정말로, 예상과는 반대로, 고온 전처리는 불필요할 뿐 아니라, 이 기술이 폐기물 내에서 잘 자라는 주변(ambient) 미생물들을 죽이기 때문에 적극적으로 해로울 수 있다. 호열성(thermophillic) 조건들 > 45 ℃에서 효소 가수분해와 동시에 미생물 발효를 촉진하는 것은 "주변" 미생물들을 이용하거나 또는 선택적으로 "접종된(inoculated)" 생물(organism)들을 이용하여 "유기 포획(organic capture)"를 개선한다. 즉, 동시의 호열성 미생물 발효는 "바이오리퀴드(bioliquid)"의 유기 수율(yield)를 안전하게 증가시키는데, 이는 효소 가수분해에 의하여 수득되는 액화된 분해성 성분들에 대한 우리의 용어이다. 이러한 조건들 하, MSW에서 전형적으로 발견되는 병원성 미생물들은 잘 자라지 않는다. 예컨대, Hartmann and Ahring 2006; Deportes et al. 1998; Carrington et al. 1998; Bendixen et al. 1994; Kubler et al. 1994; Six and De Baerre et al. 1992 참조. 이러한 조건들 하, 전형적인 MSW-탄(bourne) 병원균들은 흔히 있는 락트산 박테리아 및 다른 안전한 생물들에 의하여 쉽게 경쟁력을 갖는다(outcompeted).
효소 가수분해로부터 "유기 포획"을 개선하는데 더하여, 락트산 박테리아, 또는 아세테이트(acetate)-, 에탄올(ethanol)-, 포르메이트(formate)-, 부티레이트(butyrate)-, 락테이트(lactate)-, 펜타노에이트(pentanoate)- 또는 헥사노에이트(hexanoate)- 생산 미생물들 중 임의의 조합을 이용한 동시의 미생물 발효는 바이오리퀴드를 바이오메탄 생산을 위한 기질로서 그것을 더 효율적으로 만들기 위하여 "전-컨디셔닝한다"(pre-conditions)". 미생물 발효는 액화 단독에 의하여 생산된 바이오리퀴드에 상대적으로, 현탁(suspended) 고형물(solids)과 비교하여 용해된 것(dissolved)을 일반적으로 증가된 퍼센트로 갖는 바이오리퀴드를 생산한다. 더 높은 체인(chain) 다당류(polysaccharide)들은 일반적으로 미생물 "전-컨디셔닝(conditioning)" 때문에 더 완전히 분해된다. 동시에 일어나는 미생물 발효 및 효소 가수분해는 바이오폴리머들을 쉽게 이용가능한 기질들(substrates)로 분해하고, 그리고 나아가, 짧은 체인 카르복실산들 및/또는 에탄올로의 1차(primary) 기질들의 물질대사(metabolic) 전환(conversion)을 달성한다. 미생물 메타볼라이트(metabolite)들을 높은 퍼센트로 포함하는, 그 결과인 바이오리퀴드는 속도 제한(rate limiting) "가수분해(hydrolysis)" 단계를 효과적으로 피하는 바이오메탄 기질을 제공하며, 예컨대, Delgenes et al. 2000; Angelidaki et al. 2006; Cysneiros et al. 2011 참조, 그리고 이는 나아가, 특히 매우 빠른 "고정 필터(fixed filter)" 혐기성(anaerobic) 소화 시스템들을 이용한 메탄 생산을 위한 이점들을 제공한다.
도시 고형물 폐기물들(MSW)의 가공 방법들이 제공되며, 이에 따라 폐기물의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효가 생분해성 성분들의 액화와 미생물 메타볼라이트들의 축적을 야기한다. 액화된 생분해성 성분들은 그 다음에, 많은 부분이 아세테이트, 에탄올, 부티레이트, 락테이트, 포르메이트 또는 프로피오네이트의 일부 조합을 포함하는, 용해된 고형물들의 많은 퍼센트를 포함하는 특징이 있는 바이오리퀴드를 생산하기 위하여 비분해성 고형물들로부터 분리된다. 이 바이오리퀴드, 그 자체는, 신규한 바이오메탄 기질 조성물로, 바이오메탄으로의 매우 빠른 전환을 허용한다. 이 바이오리퀴드를 이용하여 그리고 유기 물질들의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 다른 바이오메탄 기질 조성물들을 이용하여 바이오메탄 생산 방법들이 더 제공된다.
도 1. 실험예 5로부터의 EC12B 바이오리퀴드로의 접종에 의하여 자극된 동시의 효소 가수분해 and 미생물 발효에서 총 건조물의 존재로서 상청액 내 회수된 건조물로 표현된 건조물의 전환.
도 2. 실험예 5로부터의 바이오리퀴드의 첨가에 의하여 유도되는 동시의 효소 가수분해 및 발효 후 상청액 내 회수된 박테리아 메타볼라이트들.
도 3. REnescience 테스트-반응기의 그래픽 표현.
도 4. 시범(demonstration) 시설 설치(set-up)를 위한 개략도.
도 5 가공되는 kg MSW 당 kg VS으로 표현된 다른 시간 기간 동안 바이오리퀴드 내 유기 포획.
도 6. 바이오리퀴드 내 용해된 VS의 퍼센트로서 표현된 박테리아 메타볼라이트들과 더불어 실험 동안 다른 시간 포인트들에서 호기성 박테리아 수치.
도 7. 실험예 3으로부터의 바이오리퀴드 내 학인된 박테리아 종들의 분포.
도 8. 실험예 5에 기재된 테스트로부터 표본추출된 EC12B 내 13개 우세한 박테리아의 분포.
도 9. 실험예 5로부터의 바이오리퀴드를 이용한 바이오메탄 생산 증가(ramp up) 및 감소(Ramp down).
도 10. 실험예 2로부터의 “높은 락테이트” 바이오리퀴드의 바이오메탄 생산 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)" 특성분석.
도 11. 실험예 2로부터의 “낮은 락테이트” 바이오리퀴드의 바이오메탄 생산 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)" 특성분석.
도 12는 가수분해된 밀짚 바이오리퀴드의 바이오메탄 생산 "증가(ramp up)" 특성분석을 보여준다.
개요
실시예의 자세한 설명
일부 실시예들에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 도시 고형 폐기물(municipal solid waste) (MSW)의 가공 방법을 제공한다
(i) 섭씨 45 및 75 도 사이의 온도에서 5 및 40% 사이의 비-수분(non-water) 함량(content)에서 MSW를 제공하는 단계,
(ii) 섭씨 45 및 75 도 사이의 온도에서 MSW의 생분해성 부분들을 미생물 발효로 동시에 효소적으로 가수분해하여, 미생물 메타볼라이트들의 축적 및 폐기물의 생분해성 부분들의 액화를 야기하는 단계, 뒤이어
(iii) 비-생분해성 고형물(solids)들로부터 폐기물의 액화된, 생분해성 부분들을 분류하여, 적어도 25 중량%(% by weight)에서 아세테이트(acetate), 부티레이트(butyrate), 에탄올, 포르메이트(formate), 락테이트(lactate) 및/또는 프로피오네이트(propionate)의 임의의 조합(combination)을 포함하는 용해된 휘발성 고형물들을 포함하는 것에 특징이 있는 바이오리퀴드를 생산하는 단계, 뒤이어
(iv) 바이오리퀴드를 혐기성 소화시켜 바이오메탄을 생산하는 단계.
일부 실시예에서, 본 발명은 하기와 같은 특징이 있는, 도시 고형 폐기물(municipal solid waste) (MSW)의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 유기 액체(liquid) 바이오가스(biogas) 기질을 제공한다
-적어도 40 중량%(% by weight)의 비-수분 함량이 용해된 휘발성 고형물들로서 존재하는데, 이는, 용해된 휘발성 고형물들이 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량% 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 바이오가스(biogas)의 생산 방법을 제공한다
(i) 미생물 발효에 의하여 전-컨디셔닝(pre-conditioned)된 유기 액체 바이오가스 기질을 제공하여, 비-수분 함량의 적어도 40 중량%가 용해된 휘발성 고형물들로서 존재하게 하며, 이 용해된 휘발성 고형물들은 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량%로 포함하는 단계;
(ii) 상기 액체 기질을 혐기성 소화 시스템으로 옮기는(transferring) 단계, 뒤이어
(iii) 액체 기질의 혐기성 소화를 수행하여 바이오메탄(biomethane)을 생산하는 단계.
혐기성 소화 내 고용된(engaged) 미생물 미생물 군집들(microbial communities)의 물질대사 역학(metabolic dynamics)은 복잡하다. Supaphol et al. 2010; Morita and Sasaki 2012; Chandra et al. 2012 참조. 메탄 바이오가스의 생산을 위한 전형적인 혐기성(anaerobic) 소화(digestion) (AD)에서, 미생물에 의하여 매개되는 생물학적 과정들은 4개의 주된 단계들을 달성한다-생물학적 고분자들(marcomolecules)의 구성 성분(constituent) 모노머들 또는 다른 메타볼라이트들로의 가수분해; 산발효(acidogenesis), 이로써 짧은 체인 탄화수소(hydrocarbon) 산(acid)들 및 알코올들이 생산됨; 초산생성(acetogenesis), 이로써 이용가능한 영양분들이 아세트산, 수소 및 이산화탄소로 이화(catabolized)됨; 및 메탄생성(methanogenesis), 이로써 아세트산 및 수소가 전문화된(specialized) 고세균류(archaea)에 의하여 메탄 및 이산화탄소로 이화됨. 상기 가수분해 단계는 전형적으로 속도(rate)-제한(limiting)이다. 예컨대 Delgenes et al. 2000; Angelidaki et al. 2006; Cysneiros et al. 2011 참조.
그러므로, 이것들이 어떤 형태의 전처리를 통하여 미리 가수분해되는 것이 바이오메탄 생산을 위한 기질들을 준비하는데 유리하다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법들은, 최종적인 바이오메탄 생산을 위한 급한 생물학적 전처리에 더하여 그 외 분류되지 않은 MSW로부터 분해성 유기 성분들을 분류하는 방법 모두로서, 미생물 발효를 MSW의 효소 가수분해와 조합(combine)한다.
생물학적 전처리들은 MSW의 소스(source)-분류된 유기 성분을 포함하는 고형 바이오메탄 기질들을 이용하는 것이 보고되었다. 예컨대 Fdez-Guelfo et al. 2012; Fdez-Guelfo et al. 2011 A; Fdez-Guelfo et al. 2011 B; Ge et al. 2010; Lv et al. 2010; Borghi et al. 1999 참조. 혐기성 소화로부터 최종적인 메탄 수율들의 개선은 복잡한 바이오폴리머들의 증가된 분해 및 휘발성 고형물들의 증가된 가용화(solubilisation)의 결과로서 보고되었다. 그러나 휘발성 고형물들의 가용화의 레벨 및 이들 보고된 방법들에 의하여 달성된 휘발성 지방산들로의 전환 레벨은 본 발명의 방법들에 의하여 달성되는 레벨들에 다가가지도 못한다. 예를 들어, Fdez-Guelfo et al. 2011, MSW로부터 전-분류도니 유기 부분(fraction)의 다양한 생물학적 전처리들을 통하여 달성한 휘발성 고형물들의 가용화에서 10-50% 상대적인 개선을 보고하는데-이는 휘발성 고형물들의 약 7 내지 10% 사이의 가용화(solubilisation)의 최종 절대 레벨들(absolute level)에 부합한다. 그에 반하여, 본 발명의 방법들은 적어도 40% 용해된 휘발성 고형물들을 포함하는 액체 바이오메탄 기질들을 생산한다.
2-단계(stage) 혐기성 소화 시스템들이 보고되어 왔는데, 이 때 첫 번째 단계는 공정은 MSW의 소스-분류된 유기 성분 및 다른 전문화된(specialized) 유기물에 의하여 생긴(biogenic) 기질들을 포함하는 바이오메탄 기질들을 가수분해한다. 전형적으로 호열성(thermophillic)인 첫 번째 혐기성 단계 동안, 더 높은 체인 폴리머들이 분해되고 휘발성 지방산들이 생산된다. 이 후 메탄 생성(methanogenesis) 및 초산 생성이 중요한 특징이 되는 물리적으로 분리된 반응기 내에서 수행되는 두 번째 단계 혐기성 단계가 계속된다. 보고된 2-단계 혐기성 소화 시스템들은 전형적으로 소스-분류된, 전문화된(specialized), 유기물에 의하여 생긴(biogenic), 총 고형물들 7% 미만을 갖는, 기질들을 이용하여 왔다. 예컨대 Supaphol et al. 2011; Kim et al. 2011; Lv et al. 2010; Riau et al. 2010; Kim et al. 2004; Schmit and Ellis 2000; Lafitte-Trouque and Forster 2000; Dugba and Zhang 1999; Kaiser et al. 1995; Harris and Dague 1993 참조. 더욱 최근에, 몇몇 2 단계(stage) AD 시스템들이 보고되었는데, 이는 10% 총 고형물들만큼 높은 레벨들에서 소스-분류된, 전문화된 유기물에 의하여 생긴(biogenic) 기질들을 이용한다. 예컨대 Yu et al. 2012; Lee et al. 2010; Zhang et al.2007 참조. 분명히 보고된 2-단계(stage) 혐기성 소화 시스템들 중에는, 높은 고형물들 액체 바이오메탄 기질을 생산하기 위한 것은 커녕 , 기질로서 분류되지 않은 MSW의 이용을 고려한 것이 없다. 2 단계(stage) 혐기성 소화는 고형 기질들을, 연속적으로 추가적인 고형물들을 주면서 그리고 연속적으로 첫 단계 반응기로부터 휘발성 지방산들을 제거하면서 전환시키는 것을 추구한다.
임의의 적절한 고형 폐기물이 본 발명의 방법들을 실행하는데(practice) 이용될 수 있다. 당업자에 의하여 이해될 것과 같이, 용어 "도시 고형 폐기물(municipal solid waste)" (MSW)은 전형적으로 도시에서 이용가능하지만, 임의의 지방자치제(municipality) 그 자체로부터 올 필요는 없는 폐기물 부분들(fractions)을 가리킨다. MSW는 하기를 포함하는 셀룰로스(cellulosic), 식물, 동물, 플라스틱, 금속 또는 유리 폐기물의 임의의 조합일 수 있으나 하기의 임의의 하나 또는 그 이상에 제한되는 것은 아니다: Dewaster® 또는 reCulture®와 같은 몇몇 중앙(central) 분류(sorting), 쉬레딩(shredding) 또는 펄핑(pulping) 장치 내에서 선택적으로 가공되는, 정상적인 도시 수거 시스템에서 수거되는 쓰레기; 유기 부분들(fractions) 및 종이가 풍부한 부분들(fractions) 모두를 포함하는, 가계(households)로부터 분류된 고형 폐기물; 레스토랑 산업, 식품 가공 산업, 일반 산업체(general industry)와 같은 산업으로부터 파생된 폐기물 부분들(fractions); 제지 산업으로부터의 폐기물 부분들(fractions); 재활용 시설들로부터의 폐기물 부분들(fractions); 식품 또는 사료 산업으로부터의 폐기물 부분들(fractions); 의료 산업으로부터의 폐기물 부분들(fractions); 농업 또는 영농(farming) 관련 분야들로부터 유래한 폐기물 부분들(fractions); 당 또는 녹말 풍부 산물들의 가공으로부터의 폐기물 부분들(fractions); 오염되거나 또는, 식품 또는 사료 목적들로 이용할 수 없는(not exploitable) 곡물, 감자들 및 비트들과 같이 다른 식으로 망쳐진 농업 산물들; 정원 쓰레기.
MSW는 본디 이질적(heterogeneous)이다. 폐기물 물질들의 조성에 관한 통계는 국가들 간 비교를 위한 확고한 기초를 제공하기에 널리 알려져 있지 않다. 정확한 샘플링(sampling) 및 특성분석(characterisation)를 위한 표준들 및 작동 절차들(operating procedure)들은 표준화가 되지 않은 채(unstandardized)로 남아 있다. 정말로, 몇몇의 표준화된 샘플링 방법들이 보고되어 왔을 뿐이다. 예컨대 Riber et al., 2007 참조. 적어도 가계(household) 폐기물의 경우에, 조성물은 계절적 지리적 변화를 보인다. 예컨대, Dahlen et al., 2007; Eurostat, 2008; Hansen et al., 2007b; Muhle et al., 2010; Riber et al., 2009; Simmons et al., 2006; The Danish Environmental Protection agency, 2010 참조. 지방자치단체(municipalities)들 간 200 - 300 km의 작은 거리들에서도, 가계 폐기물 조성물 내 지리적 변화 또한 보고되어 왔다(Hansen et al., 2007b).
일부 실시예에서, MSW는 "분류되지 않은(unsorted)" 폐기물들로서 가공된다. 여기에서 사용된 용어 "분류되지 않은(unsorted)"는 MSW가 분리된 부분들(fractions)로 상당히 분별(fractionated)되지 않아, 유기물 유래(biogenic) 물질이 상당히 플라스틱 및/또는 다른 무기 물질로부터 분리되지 않은 공정을 가리킨다. 폐기물들은 몇몇 큰 물체들 또는 금속 물질들의 제거에도 불구하고 그리고 플라스틱 및/또는 무기 물질의 일부 분리에도 불구하고 여기에서 사용된 대로 "분류되지 않을" 수 있다. 여기에서 사용된 대로 "분리되지 않은(unsorted)" 폐기물은, 건조 중량의 15% 미만이 비-유기물 유래 물질인, 유기물 유래(biogenic) 부분(fraction)을 제공하기 위하여, 상당히 분별(fractionate)되지 않은 폐기물을 가리킨다. 건조 중량의 15% 초과가 비-유기물 유래 물질인, 유기물 유래(biogenic) 및 비-유기물 유래 물질의 혼합물을 포함하는 폐기물은 여기에 사용된 대로 "분류되지 않은" 것이다. 전형적으로 분류되지 않은 MSW는 유기물 유래(biogenic) 폐기물들을 포함하는데, 이는 식품 및 주방 폐기물, 종이- 및/또는 판지-포함 물질들, 식품 폐기물들 등; 유리, 병들, 캔들, 금속들 및 특정 플라스틱들을 포함하는 재활용 물질들; 사실상 재활용가능한 것 자체는 아니지만 쓰레기 유래 연료들의 형태로 발열량(heat value)을 줄 수 있는 다른 가연성(burnable) 물질들; 게다가, 세라믹들, 바위들, 및 잔해들(debris)의 다양한 형태들을 포함하는 불활성(inert) 물질들을 포함하는, 생물학적으로 전환가능한 물질들(substances)로 분해될 수 있는 폐기물들을 의미한다.
일부 실시예들에서, MSW는 "분류된(sorted)" 폐기물로서 가공될 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "분류된"은 유기물 유래(biogenic) 물질이 상당히 플라스틱 및/또는 다른 무기 물질로부터 분리되기 위하여 분리된 부분들(fractions)로 MSW가 상당히 분별되는(fractionated) 공정을 가리킨다. 건조 중량의 15% 미만이 비-유기물 유래 물질인, 유기물 유래(biogenic) 및 비-유기물 유래 물질의 혼합물을 포함하는 폐기물은 여기에서 사용된 대로 "분류된" 것이다.
일부 실시예들에서, MSW는 대부분 과일, 채소 및/또는 동물 폐기물들을 포함하는 소스(source)-분리된 유기 폐기물일 수 있다. 가계가 서로 다른 폐기물 물질들을 따로따로 처리하는 소스 분류를 포함하는, 여러 가지 서로 다른 분류 시스템들이 일부 실시예들에서 사용될 수 있다. 소스 분류 시스템들은 현재 오스트리아, 독일, 룩셈부르크, 스웨덴, 벨기에, 네덜란드, 스페인 및 덴마크의 몇몇 지방자치단체들에서 가동 중이다. 대체하여, 산업적 분류 시스템이 사용될 수 있다. 기계적 분류 및 분리의 수단들은 당업계에 알려진 임의의 방법들을 포함할 수 있으나, US2012/0305688; WO2004/101183; WO2004/101098; WO2001/052993; WO2000/0024531; WO1997/020643; WO1995/0003139; CA2563845; US5465847에 기재된 시스템들에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시예들에서, 폐기물들은 가볍게 분류될 수 있고, 아직 여기에 기재된 대로 "분류되지 않은" 폐기물 부분(fraction)을 여전히 생산할 수 있다. 일부 실시예들에서, 분류되지 않은 MSW가 사용되며, 이 때 건조 중량의 15% 초과가 비-유기물 유래 물질이고, 또는 18% 초과, 또는 20% 초과, 또는 21% 초과, 또는 22% 초과, 또는 23% 초과, 또는 24% 초과, 또는 25% 초과이다.
본 발명의 방법의 실행에서, MSW는 10 및 45% 사이, 또는 일부 실시예들에서 12 및 40% 사이, 또는 13 및 35% 사이, 또는 14 및 30% 사이, 15 및 25% 사이의 비-수분 함량에서 제공되어야 한다. MSW는 전형적으로 상당한 수분 함량을 포함한다. MSW를 포함하는 모든 다른 고형물들은 여기에서 사용된 대로 "비-수분(non-water) 함량(content)"로 칭해진다. 본 발명의 방법들을 시행하는데 사용되는 수분 함량의 레벨은 몇몇의 서로 관련된 변수들과 관련된다. 본 발명의 방법들은 액체 유기물 유래(biogenic) 슬러리를 생산한다. 당업자에 의하여 쉽게 이해되듯이, 고형 성분들을 액체 슬러리로 만드는 능력(capacity)은 증가된 수분 함량과 함께 증가된다. 전형적인 MSW의 상당한 부분(fraction)을 포함하는 종이 및 판지의 효과적인 펄핑(pulping)은, 전형적으로 수분 함량이 증가된 때 개선된다. 게다가 당업계에 알려진 바와 같이 가수분해가 낮은 수분 함량을 갖는 조건 하 수행될 때, 효소 활성들은 감소된 활성을 보일 수 있다. 예를 들어, 셀룰라제들(cellulases)은 약 10%보다 더 높은 비-수분 함량을 갖는 가수분해 혼합물들에서 전형적으로 감소된 활성을 보인다. 종이 및 판지를 분해하는 셀룰라제들의 경우에, 효과적으로 선형(linear) 역(inverse) 관계가 기질 농도 및 그람 기질 당 효소 반응으로부터의 수율 사이에서 보고되어 왔다. Kristensen et al. 2009 참조. 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스 전환을 위해 최적화도니 상업적으로 이용가능한 분리된 효소 제제들(enzyme preparations)을 이용하여, 우리는 파일럿(pilot) 스케일(scale) 연구들에서 비-수분 함량이 명확하게 해로운 효과를 보이지 않고 15% 만큼 높을 수 있다는 것을 관찰하여 왔다.
일부 실시예들에서, 보통 약간의 수분 함량이 적절한 비-수분 함량을 달성하기 이하여 페기물에 첨가되어야 한다. 예를 들어 분류되지 않은 덴마크의 가계 폐기물의 부분(fraction)을 생각하라. Riber et al. (2009) "Chemical composition of material fractions in Danish household waste," Waste Management 29:1251. Riber et al.에 의하여 보고된 분류되지 않은 MSW의 특유의 조성물을 기재하고 있는 표1은 2001년 어느 날 덴마크에서 2220 가정들로부터 수득된 가계 폐기물들의 성분 부분들(fractions)울 특징짓는다. 이 보고된 조성물이 단순히 대표적인 예이며, 본 발명의 방법을 설명하기에 유용하다는 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 표 1에 기재된 실험예에서, 가벼운(mild) 가열 전 수분 함량의 임의의 첨가 없이, 채소, 종이 및 동물 폐기물을 포함하는 유기, 분해성 부분(fraction)은 평균적으로 거의 47% 가까이 비-수분 함량을 가질 것으로 예상되었다. [(절대 % 비-수분)/(% 습윤 중량(wet weight))=(7.15 + 18.76 + 4.23)/(31.08 + 23.18 + 9.88) = 47% 비-수분 함량.] 가공되는 폐기물 부분(fraction)의 1(one) 중량(weight) 당량(equivalent)에 상응하는 수분 부피의 첨가는 폐기물 자체의 비-수분 함량을 29.1% (58.2%/2)까지 감소시키고, 반면, 분해성 성분의 비-수분 함량을 약 23.5% (47%/2)까지 감소시킬 것이다. 가공되는 폐기물 부분(fraction)의 2 중량(weight) 당량(equivalent)에 상응하는 수분 부피의 첨가는 폐기물 자체의 비-수분 함량을 19.4% (58.2%/3)까지 감소시키고, 반면 분해성 성분의 비-수분 함량을 약 15.7% (47%/3)까지 감소시킬 것이다.
표 1은 덴마크 2011로부터의 폐기물 부분들의 질량(mass) 분포(distribution)를 요약한 것이다
(a) 순수한 부분(fraction)
(b) 신문, 잡지들, 광고들, 책들, 업무용 및 깨끗한/더러운 종이, 종이 및 곽(carton) 용기(container)들, 판지, 플라스틱 곽(carton), Al 호일 곽, 더러운 판지 및 주방 화장지들:의 총합.
(c) 연질(soft) 플라스틱, 플라스틱 병들, 다른 경질(hard) 플라스틱 및 재활용가능하지 않은 플라스틱:의 총합.
(d) 흙, 암석 등, 재, 세라믹들, 캣 리터(cat litter, 고양이 배설용 상자에 까는 점토) 및 다른 불연성 재료들(non combustibles):의 총합.
(e) Al 용기(containers), Al 호일, 금속-유사 호일, 금속 용기들 및 다른 금속:의 총합.
(f) 투명, 녹색, 갈색 및 다른 유리:의 총합.
(g) 남아 있는 13 물질 부분들:의 총합.
Figure pct00001

당업자는 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 만약 임의의, 폐기물에 첨가하기 위한 수분 함량의 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 전형적으로 실질적인 문제로, 가공되는 MSW의 조성물에서 일부 변동성에도 불구하고, 일부 실시예들에서, kg MSW 당 0.8 및 1.8 kg 물 사이의, 또는 kg MSW 당 0.5 및 2.5 kg 물 사이의, 또는 kg MSW 당 1.0 및 3.0 kg 물 사이의, 물의 상대적으로 일정한(constant) 질량( mass) 비율(ratio)을 첨가하는 것이 편리하다. 그 결과, 공정 동안 MSW의 실제 비-수분 함량은 적절한 범위 내에서 다양할 수 있다. 효소 가수분해를 달성하기 위하여 사용되는 수단들에 의존하여, 비-수분 함량의 적절한 레벨은 다양할 수 있다.
효소 가수분해는 서로 다른 수단들을 여러 가지 이용하여 달성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 효소 가수분해는 분리된 효소 제제(preparation)들을 이용하여 달성될 수 있다. 여기에 사용된 대로, 용어 "분리된(isolated) 효소 제제"는 추출되었고, 분리되었고, 또는 그렇지 않으면 생물학적 소스로부터 수득되고, 선택적으로 부분적으로 또는 광범위하게(extensively) 정제된(purifies),효소 활성들을 포함하는 제제를 가리킨다.
서로 다른 효소 활성들 여러가지가 본 발명의 방법을 실행하는데 안성맞춤으로 사용될 수 있다. 예컨대, 표 1에 나타난 MSW의 조성물을 고려하면, 종이-포함 폐기물들은, 유기물 유래(biogenic) 물질들 중, 건조 중량에 의하여 가장 큰 단일 성분을 포함하는 것이 쉽게 분명할 것이다. 그러므로, 당업자에게 쉽게 분명할 것이 듯, 전형적인 가계 폐기물들을 위하여, 셀룰로스(cellulose)-분해 활성이 특히 유리하다. 종이-함유 폐기물들에서, 셀룰로스는 먼저 공정을 거치며, 리그닌 및 헤미셀룰로스를 혼합한, 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스의 성분으로서, 그것의 자연적 발생으로부터 분리된다. 그러므로, 종이-함유 폐기물은 비교적 "단순한" 셀룰라제(cellulase) 제제를 이용하여 유리하게 분해될 수 있다.
"셀룰라제 활성"은 셀룰로스의 1,4-B-D-글리코시드(1,4-B-D-glycosidic) 결합들(linkages)의 효소 가수분해를 가리킨다. 박테리아, 진균(fungal) 또는 다른 소스로부터 수득되는, 분리된(isolated) 셀룰라제 효소 제제들에서, 셀룰라제 활성은 전형적으로, 엑소글루카나제(exoglucanase) 가수분해의 올리고당 산물을 단당류들로 가수분해하는 B-글루코시다제들(glucosidases)과 함께, 각각 1,4-B-D-글리코시드(glycosidic) 결합들의 엔도(endo)- 및 엑소(exo)- 가수분해를 촉매 작용하는(catalyse), 엔도글루카나제들(endoglucanases) 및 엑소글루카나제들(exoglucanases) (또한 셀로비오하이드로라제들(cellobiohydrolases)로 명칭됨)을 포함하는 서로 다른 효소 활성들의 혼합물을 포함한다. 불용성(insoluble) 셀룰로스의 완전한 가수분해는 전형적으로 서로 다른 활성들 간의 상조(synergistic) 작용을 요구한다.
실질적인 문제로, 일부 실시예들에서는 리그노셀루로스(lignocellulosic) 바이오매스 전환을 위하여 최적화된, 상업적으로 이용가능한 분리된 셀루라제 제제를 간단히 사용하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 이것들이 비교적 낮은 비용으로 쉽게 이용가능하기 때문이다. 이들 제제들은 분명히 본 발명의 방법들을 실행하는데 적합하다. 용어 "리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화된"은 효소 혼합물이 선택되고 가수분해 수율들의 개선 및/또는 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 발효성(fermentable) 당들로의 가수분해에서의 효소 소비의 감소의 특정 목적들을 위하여 변형되어 온, 산물 개발 공정을 가리킨다.
그러나, 리그노셀룰로스 바이오매스의 가수분해를 위하여 최적화된 상업적 셀룰라제 혼합물들은 전형적으로 추가적 및 전문화된 효소 활성들의 높은 레벨들을 포함한다. 예를 들어, 우리는 리그노셀룰로스 바이오매스 전환을 위하여 최적화되고, 상표 CELLIC CTEC2 TM and CELLIC CTEC3TM 로 NOVOZYMES TM 에 의하여 제공되는 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제들에 더하여, 상표 ACCELLERASE 1500 TM로 GENENCOR TM 에 의하여 제공되는 유사한 제제들 내 존재하는 효소 활성들을 결정하고, 이들 제제들 각각이 200 U/g을 넘는 엔도자일라나제(endoxylanase) 활성, 85 U/g를 넘는 레벨들에서 자일로시다제(xylosidase) 활성, 9 U/g를 넘는 레벨들에서 B-L-아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase) 활성, 15 U/g를 넘는 레벨들에서 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 활성, 및 2 U/g를 넘는 레벨들에서 a-아밀라제(amylase) 활성을 포함한다는 것을 발견하였다.
더 단순한 분리된 셀룰라제 제제들이 본 발명의 방법들을 실행하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 적절한 셀룰라제 제제들이 호기성 및 혐기성 박테리아, 백색 부후 진균(rot fungi), 부패병 진균(soft rot fungi) 및 혐기성 진균을 포함하는, 여러가지 미생물들로부터 당업계에 잘 알려진 방법들에 의하여 수득될 수 있다. 전부 참고문헌으로서 여기에 명확히 포함된, ref. 13, R. Singhania et al., "Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases," Enzyme and Microbial Technology (2010) 46:541-549에 기재된 바와 같이, 셀룰라제들을 생산하는 생물들은 전형적으로 리그노셀룰로스계 기질들의 가수분해를 위하여 적합하도록 적절한 비율들인 서로 다른 효소들의 혼합물을 생산한다. 리그노셀룰로스 바이오매스의 전환에 유용한 셀룰라제 제제들의 선호되는 소스들은 트리코더마(Trichoderma), 페니실리움(Penicillium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 파네로차에트(Phanerochaete)의 종들과 같은 진균들을 포함한다.
셀룰라제 활성들에 더하여, 본 발명의 방법들을 실행하는데 이로운 것으로 증명될 수 있는 몇몇 추가적인 효소 활성들은 프로테아제들(proteases), 글루코아밀라제들(glucoamylases), 엔도아밀라제들(endoamylases), 프로테아제들(proteases), 펙틴 에스테라제들(pectin esterases), 펙틴 리아제들(pectin lyases), 및 리파제들(lipases), 및 자일라나제들(xylanases)과 같은 정원 폐기물들에 따라 작용하는 효소들, 및 자일로시다제들(xylosidases)과 같은, 식품 폐기물들에 따라 작용하는 효소들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 라미나라제들(laminarases), 케타티나제들(ketatinases) 또는 라카제들(laccases)과 같은 다른 효소 활성들을 포함하는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시예들에서, 하기 호열성(thermophillic), 셀룰로스를 가수분해할 수 있는(cellulytic) 생물들 중 임의의 한 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포밖(extra-cellular) 셀룰라제 활성을 보이는 선택된 미생물은 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효를 수행하는데 직접 접종될 수 있고, 단독으로 또는 다른 생물들 패니바실러스(Paenibacillus) 바시노넨시스(barcinonensis), Asha et al 2012 참조, 클로스티리디움(Clostridium) 써모셀룸(thermocellum), Blume et al 2013 및 Lv and Yu 2013 참조, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 마이크로비스포라(Microbispora), 및 패니바실러스(Paenibacillus)의 선택된 종들, Eida et al 2012 참조, 클로스트리디움(Clostridium) 스트라미니솔벤스(straminisolvens), Kato et al 2004 참조, 퍼미큐테스(Firmicutes), 악티노박테리아(Actinobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria) 및 박테로이데테스(Bacteroidetes)의 종들, Maki et al 2012 참조, 클로스트리디움(Clostridium) 클라리플라붐(clariflavum), Sasaki et al 2012 참조, 클로스트리디움(Clostridium) 써모셀룸(thermocellum) 및 클로스트리디움(Clostridium) 스트라미니솔벤스(straminisolvens)와 계통발생적으로 및 생리학적으로 관련된 클로스트리디아레스(Clostridiales)의 신규 종들, Shiratori et al 2006 참조, 클로스트리디움(Clostridium) 클라리플라붐(clariflavum) sp. nov. 및 클로스트리디움(Clostridium) 캐니콜라(Caenicola), Shiratori et al 2009 참조, 게오바실러스(Geobacillus) 써모레오보란스(Thermoleovorans), Tai et al 2004 참조, 클로스트리디움(Clostridium) 스테르코라리움(stercorarium), Zverlov et al 2010 참조, 또는 호열성(thermophillic) 진균들 스포로트리춤(Sporotrichum) 써모필(thermophile), 스시탈리디움(Scytalidium) 써모필룸(thermophillum), 클로스트리디움(Clostridium) 스트라미니솔벤스(straminisolvens) 및 써모노스포라(Thermonospora) 쿠르바타(curvata)의 임의의 하나 또는 그 이상, 리뷰를 위하여 Kumar et al. 2008,과 결합하여 접종될 수 있다. 일부 실시예들에서, 다른 유용한 세포밖 효소 활성들을 보이는 생물들은 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 공헌하기 위하여 접종될 수 있는데, 예컨대 단백질분해(proteolytic) 및 케라틴분해(keratinolytic) 진균들, Kowalska et al. 2010 참조, 또는 세포밖 리파제(lipase) 활성을 보이는 락트산(lactic acid) 박테리아, Meyers et al. 1996 참조, 이다.
앞서 언급된 그것들 중 임의의 것을 포함하는 여러가지 효소 제제들 중 임의의 하나 또는 그 이상을 포함하는, 하나 또는 그 이상의 분리된 효소 제제들을 이용하여, 또는 희망하는 효소 가수분해에 영향을 미칠 수 있는 하나 또는 그 이상의 선택된 생물들로 공정 MSW를 접종함으로써, 효소 가수분해는 당업계에 널리 알려진 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 일부 실시예들에서, 효소 가수분해는 셀룰라제, B-글루코시다제, 아밀라제, 및 자일라나제(xylanase) 활성들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 분리된 효소 제제들의 효과적인 양을 이용하여 수행될 수 있다. 양(an amount)은, 종합적으로, 사용된 유기 제제가, 사용된 조건들 하 18 시간의 가수분해 반응 시간 내에서, MSW 내 존재하는 분해성 유기물 유래(biogenic) 물질의 건조 중량의 적어도 40%의 가용화(solubilisation)를 달성하는, "효과적인 양"이다. 일부 실시예들에서, 종합적으로, 다양한 효소 활성들의 상대적인 비율이 하기와 같은 하나 또는 그 이상의 분리된 효소 제제들이 이용된다: 효소 활성들의 혼합물이 사용되어, 1 FPU 셀룰라제 활성은 적어도 31 CMC U 엔도글루카나제(endoglucanase) 활성과 관련되고, 1 FPU 셀룰라제 활성은 적어도 7 pNPG U 베타 글루코시다제(glucosidase) 활성과 관련된다. CMC U가 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethycellulose) 단위들(units)을 가리킨다는 것은 당업자에 의하여 쉽게 이해될 것이다. 활성의 1(One) CMC U는, 50 ℃ 및 pH 4.8의 특정 어세이(assay) 조건들 하 1 분에, 환원당들의 1 umol(글루코스(glucose) 당량(equivalent)으로 표현됨)을 유리시킨다(liberate). pNPG U가 pNPG 단위들(units)을 가리킨다는 것은 당업자에 의하여 쉽게 이해될 것이다. 활성의 1(One) pNPG U은 50 ℃ 및 pH 4.8에서 파라-니트로페닐-B-D-글루코피라노사이드(para-nitrophenyl-B-D-glucopyranoside)로부터 분 당 니트로페놀(nitrophenol) 1 umol을 유리시킨다. "필터(filter) 종이(paper) 단위들"의 FPU가 셀룰라제 활성의 척도(measure)를 제공한다는 것을 당업자들은 나아가 쉽게 이해할 것이다. 여기에 사용된 대로, 전체가 여기에 참고문헌으로서 명확히 포함된, Adney, B. and Baker, J., Laboratory Analytical Procedure #006, "Measurement of cellulase activity", August 12, 1996, the USA National Renewable Energy Laboratory (NREL)의 방법에 의하여 결정된 대로, FPU는 필터 종이 단위들을 가리킨다.
본 발명의 실시예를 실행하는데 있어, 효소 가수분해를 시작하기 전에 MSW의 온도를 조정하는 것이 유리할 수 있다. 당업계에 널리 알려져 있는 바와 같이, 셀루라제들 및 다른 효소들은 전형적으로 최적의 온도 범위를 보인다. 대략 섭씨 60 또는 심지어 70 도인 최적 온도들을 갖는, 극단적으로 호열성인(thermohillic) 생물들로부터 분리된 효소들의 예들이 분명히 알려진 반면, 효소 최적 온도 범위들은 전형적으로 35 내지 55 도들의 범위 내로 들어간다. 일부 실시예들에서, 효소 가수분해는 30 내지 35 도 C, 또는 35 내지 40 도 C, 또는 40 내지 45 도 C, 또는 45 내지 50 도 C, 또는 50 내지 55 도 C, 또는 55 내지 60 도 C, 또는 60 내지 65 도 C, 또는 65 내지 70 도 C, 또는 70 내지 75 도 C의 온도 범위 내에서 수행된다. 일부 실시예들에서, 효소 가수분해 및 동시의 미생물 발효를 적어도 섭씨 45 도의 온도에서 수행하는 것이 유리한데, 왜냐하면 이것이 MSW-탄(bourne) 병원균들의 성장을 막는데 유리하기 때문이다. 예컨대 Hartmann and Ahring 2006; Deportes et al. 1998; Carrington et al. 1998; Bendixen et al. 1994; Kubler et al. 1994; Six and De Baerre et al. 1992 참조.
셀룰라제 활성을 이용한 효소 가수분해는 전형적으로 셀룰로스(cellulosic) 물질을 당화시킬(sacchartify) 것이다. 그러므로, 효소 가수분해 동안, 고형 폐기물들은 모두 당화되고(saccharified) 액화되는데(liquefied), 즉, 고형 형태(form)으로부터 액체 슬러리로 전환된다.
미리, 유기물 유래(biogenic) 성분의 액화(liquefaction)를 달성하기 위하여 효소 가수분해를 이용한 MSW 가공 방법들은, 분명히 폐기물의 "멸균"을 달성하기 위하여, 가열된 폐기물을 효소 가수분해에 적합한 온도로 다시 낮추기 위하여, 필요한 냉각 단계가 뒤따르는, 효소 가수분해에 요구되는 것보다 상당히 더 높은 온도로 MSW를 가열할 필요를 상상해왔다(envision). 본 발명의 방법들을 실행하는데 있어서, MSW를 효소 가수분해들에 적합한 온도로 단순히 이끄는 것으로 충분하다. 일부 실시예들에서, 효소 가수분해에 적합한 온도로 MSW를 가져가기 위하여 이러한 식으로 관리된, 가열된 물을 이용하여 단순히 MSW를 적절한 비-수분 함량으로 조정하는 것이 유리하다. 일부 실시예들에서, 가열된 물 함량 또는 스팀(steam)을 첨가함으로써, 또는 가열의 다른 수단으로, 반응기 용기(vessel) 내에서, MSW는 가열된다. 일부 실시예들에서, MSW는 반응기 용기(vessel) 내에서 30 ℃보다 더 높으나, 85 ℃보다 낮은, 또는 84℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 80℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 75℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 70℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 65℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 60℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 59℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 58℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 57℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 56℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 55℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 54℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 53℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 52℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 51℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 50℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 49℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 48℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 47℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 46℃ 또는 그 미만의 온도까지, 또는 45℃ 또는 그 미만의 온도까지의 온도까지 가열된다. 일부 실시예들에서, MSW는 효소 가수분해가 수행되는 가장 높은 온도보다 10 ℃ 보다 높지 않은 온도까지 가열된다.
여기에서 사용된 대로, MSW는 "온도까지 가열"되는데, 이는 MSW의 평균 온도가 반응기 내에서 상기 온도까지 증가한다. 여기에서 사용된 대로, MSW가 가열되는 데까지의 온도는 상기 반응기 내에서 달성되는 MSW의 가장 높은 평균 온도이다. 일부 실시예들에서, 가장 높은 평균 온도는 전체 기간 동안 유지되지 않을 수도 있다. 일부 실시예들에서, 가열 반응기는 서로 다른 구역(zone)들을 포함하여, 가열이 서로 다른 온도들에서 단계적으로 발생한다. 일부 실시예들에서, 가열은 효소 가수분해가 수행되는 동일한 반응기를 이용하여 달성될 수 있다. 가열의 목적은 효소 가수분해에 최적인 조건으로 셀룰로스(cellulosic) 폐기물들의 다수 및 식물 폐기물들의 상당 부분(fraction)을 만드는 것이다. 효소 가수분해에 최적인 조건 내이기 위하여, 폐기물들은 이상적으로 효소 가수분해에 사용되는 효소 활성들에 적합한 수분 함량 및 온도를 가져야 한다.
일부 실시예들에서, 균등하게 가열된 폐기물을 달성하기 위하여 가열 동안 교반하는 것(agitate)이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 교반(agitation)은 상당히 수평인 축(axis)을 따라 회전하는 챔버(chamber)를 갖는 반응기 내에서, 또는 MSW를 들어 올리는(lifting) 회전 축(rotary axis)을 갖는 믹서(mixer) 내에서, 또는 MSW를 들어올리는 패들(paddle)들 또는 수평 축(shafts)을 갖는 믹서 내에서, 혼합하는(mixing) 것과 같은, 자유낙하(free-fall) 혼합을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 교반(agitation)은 흔들기(shaking), 휘젓기(stirring) 또는 수송(transport) 스크류(screw) 콘베이어(conveyor)를 통한 수송(conveyance)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 교반은 MSW가 원하는 온도까지 가열된 후에 계속된다. 일부 실시예들에서, 교반은 1 및 5 분 사이, 또는 5 및 10 분 사이, 또는 10 및 15 분 사이, 또는 15 및 20 분 사이, 또는 20 및 25 분 사이, 또는 25 및 30 분 사이, 또는 30 및 35 분 사이, 또는 35 및 40 분 사이, 또는 40 및 45 분 사이, 또는 45 및 50 분 사이, 또는 50 및 55 분 사이, 또는 55 및 60 분 사이, 또는 60 및 120 분 사이 동안 수행된다.
효소 가수분해는 분리된 효소 제제들이 첨가된 그 시점에 시작된다. 대체하여, 만약 분리된 효소 제제가 첨가되지 않고, 그러나 대신 원하는 세포밖(extracellular) 효소 활성들을 보이는 미생물들이 사용되면, 효소 가수분해는 원하는 미생물이 참가되는 시점에서 시작된다.
본 발명의 방법들을 실행하는데 있어, 효소 가수분해는 미생물 분해와 동시에 수행된다. 동시의 미생물 발효는 여러가지 다른 방법들을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 실시예들에서, MSW에 자연적으로 존재하는 미생물들은 반응 조건들에서 단순히 잘 자라는 것이 허용되는데, 이는 가공된 MSW이 "멸균"을 가져오기에 충분한 온도까지 미리 가열되지 않은 것이다. 전형적으로 MSW에 존재하는 미생물들은 지역 환경에 적응한 생물들을 포함할 것이다. 동시의 미생물 발효의 일반적인 이로운 영향은 비교적 탄탄한데(robust), 이는 매우 넓은 여러가지의 다른 생물들이 개별적으로 또는 집합적으로, MSW의 효소 가수분해를 통하여 유기 포획에 공헌할 수 있다. 이론에 구속되는 것을 원하지 않고, 우리는 함께 발효되는(co-fermenting) 미생물들이 개별적으로 셀룰라제 효소에 의하여 반드시 가수분해되지 않는 식품 폐기물들의 분해에 동일한 직접적 영향을 갖는 것을 생각한다. 동시에, 특히, 셀룰라제 가수분해에 의하여 방출된 탄수화물 모노머들 및 올리고머들이 거의 임의의 미생물 종들에 의하여 쉽게 소비된다. 이는 아마 효소 활성들의 산물 억제의 방출을 통하여, 그리고 또한 아마 즉시 분명하지 않은 다른 이유들로, 셀룰라제 효소로 유리한 시너지(synergy) 효과를 준다. 임의의 케이스에서 미생물 물질 대사(metabolism)의 최종 산물들은 전형적으로 바이오메탄 기질로서 적합하다. 미생물 메타볼라이트들 내 효소 가수분해된 MSW의 강화(enrichment)는, 이런 식으로, 이미, 그 자체에서 및 그 자체 내에서, 그 결과인 바이오메탄 기질의 질의 개선이다. 특히 락트산 박테리아는 사실상 어디에나 있고, 락트산 생산은 45-50의 온도 범위 내에서 10 및 45% 사이의 비-수분 함량에서 MSW가 효소 가수분해될 때 전형적으로 관찰된다. 더 높은 온도들에서, 아마 자연적으로 발생하는 미생물들의 다른 종들이 우세할 수 있고, 락트산 보다 다른 미생물 메타볼라이트들(metabolites)이 더 일반적일 수 있다.
일부 실시예들에서, 미생물 발효는 하나 또는 그 이상의 미생물 종들을 이용한 직접적 접종에 의하여 달성될 수 있다. MSW의 동시의 효소 가수분해 및 발효를 제공하기 위하여 접종에 사용되는 하나 또는 그 이상의 박테리아 종들이 사용되는 효소 활성들에 최적이거나 그 근방인 온도에서 잘 자랄 수 있는 박테리아 종들로부터 유리하게 선택될 수 있다는 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
미생물 발효를 유도하기 위한 가수분해 혼합물의 접종은 여러가지 다른 수단들에 의하여 달성될 수 있다.
일부 실시예들에서, 효소 활성들의 첨가 전, 후 또는 동시에, 또는 세포밖(extra-cellular) 셀룰라제 활성을 보이는 미생물들의 첨가와 함께, MSW에 접종하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서, 하기의 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종(variants)들 중 임의의 하나 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는, LAB의 하나 또는 그 이상의 종들을 이용하여 접종하는 것이 유리할 수 있다: 락토바실러스(Lactobacillus) 플란타룸(plantarum), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 락티스(lactis), 락토바실러스(Lactobacillus) 카세이(casei), 락토바실러스(Lactobacillus) 락티스(lactis), 락토바실러스(Lactobacillus) 쿠르바투스(curvatus), 락토바실러스(Lactobacillus) 사케(sake), 락토바실러스(Lactobacillus) 헬베티쿠스(helveticus), 락토바실러스(Lactobacillus) 주구르티(jugurti), 락토바실러스(Lactobacillus) 페르멘툼(fermentum), 락토바실러스(Lactobacillus) 카니스(carnis), 락토바실러스(Lactobacillus) 피시콜라(piscicola), 락토바실러스(Lactobacillus) 코리니포르미스(coryniformis), 락토바실러스(Lactobacillus) 람노서스(rhamnosus), 락토바실러스(Lactobacillus) 말타로미쿠스(maltaromicus), 락토바실러스(Lactobacillus) 슈도플란타룸(pseudoplantarum), 락토바실러스(Lactobacillus) 아질리스(agilis), 락토바실러스(Lactobacillus) 바바리쿠스(bavaricus), 락토바실러스(Lactobacillus) 알리멘타리우스(alimentarius), 락토바실러스(Lactobacillus) 우나마나시엔시스(uamanashiensis), 락토바실러스(Lactobacillus) 아밀로필루스(amylophilus), 락토바실러스(Lactobacillus) 파르시미니스(farciminis), 락토바실러스(Lactobacillus) 샤패(sharpeae), 락토바실러스(Lactobacillus) 디버젠스(divergens), 락토바실러스(Lactobacillus) 알락토서스(alactosus), 락토바실러스(Lactobacillus) 파라카세이(paracasei), 락토바실러스(Lactobacillus) 호모히오치(homohiochii), 락토바실러스(Lactobacillus) 산프란시스코(sanfrancisco), 락토바실러스(Lactobacillus) 프럭티보란스(fructivorans), 락토바실러스(Lactobacillus) 브레비스(brevis), 락토바실러스(Lactobacillus) 폰티(ponti), 락토바실러스(Lactobacillus) 루테리(reuteri), 락토바실러스(Lactobacillus) 부크네리(buchneri), 락토바실러스(Lactobacillus) 비리데센스(viridescens), 락토바실러스(Lactobacillus) 콘퍼서스(confusus), 락토바실러스(Lactobacillus) 마이너(minor), 락토바실러스(Lactobacillus) 칸들레리(kandleri), 락토바실러스(Lactobacillus) 할로톨레랑스(halotolerans), 락토바실러스(Lactobacillus) 힐가르디(hilgardi), 락토바실러스(Lactobacillus) 케피르(kefir), 락토바실러스(Lactobacillus) 콜리노이즈(collinoides), 락토바실러스(Lactobacillus) vaccinostericus, 락토바실러스(Lactobacillus) 델브뤠키(delbrueckii), 락토바실러스(Lactobacillus) 불가리커스(bulgaricus), 락토바실러스(Lactobacillus) 라이흐마니(leichmanni), 락토바실러스(Lactobacillus) 액시도필루스(acidophilus), 락토바실러스(Lactobacillus) 살리바리우스(salivarius), 락토바실러스(Lactobacillus) 살리시너스(salicinus), 락토바실러스(Lactobacillus) 가세리(gasseri), 락토바실러스(Lactobacillus) 수에비커스(suebicus), 락토바실러스(actobacillus) 오리스(oris), 락토바실러스(Lactobacillus) 브레비스(brevis), 락토바실러스(Lactobacillus) 바기날리스(vaginalis), 락토바실러스(Lactobacillus) 펜토서스(pentosus), 락토바실러스(Lactobacillus) 파니스(panis), 락토코커스(Lactococcus) 크레모리스(cremoris), 락토코커스(Lactococcus) 덱스트라니쿰(dextranicum) , 락토코커스(Lactococcus) 가비애(garvieae), 락토코커스(Lactococcus) 호르디니애(hordniae), 락토코커스(Lactococcus) 라피노락티스(raffinolactis), 스트렙토코커스(Streptococcus) 디아세틸락티스(diacetylactis), 류코노스톡(Leuconostoc) 메센테로이즈(mesenteroides), 류코노스톡(Leuconostoc) 덱스트라니쿰(dextranicum), 류코노스톡(Leuconostoc) 크레모리스(cremoris), 류코노스톡(Leuconostoc) 외노스(oenos), 류코노스톡(Leuconostoc) 파라메센테로이즈(paramesenteroides), 류코노스톡(Leuconostoc) 슈도에센테로이즈(pseudoesenteroides), 류코노스톡(Leuconostoc) 시트레움(citreum), 류코노스톡(Leuconostoc) 겔리둠(gelidum), 류코노스톡(Leuconostoc) 카르노숨(carnosum), 페디오코커스(Pediococcus) 담노서스(damnosus), 페디오코커스(Pediococcus) 액시디락티시(acidilactici), 페디오코커스(Pediococcus) 세르비지애(cervisiae), 페디오코커스(Pediococcus) 파불러스(parvulus), 페디오코커스(Pediococcus) 할로필러스(halophilus), 페디오코커스(Pediococcus) 펜토사슈스(pentosaceus), 페디오코커스(Pediococcus) 인터메디우스(intermedius), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 롱검(longum), 스트렙토코커스(Streptococcus) 써모필러스(thermophilus), 외노코커스(Oenococcus) 외니(oeni), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 브레브(breve), 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 프로덴라이치(freudenreichii), 또는 LAB의 몇몇 나중에 발견된 종들로, 또는 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 젖산(lactic acid)를 생산하는 물질대사 공정들의 유용한 능력(capacity)을 보이는 Carnobacterium 속들로부터의 다른 종들로.
접종에 사용되는 박테리아 제제가 다른 생물들의 군집(community)를 포함할 수 있다는 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 일부 실시예들에서, 임의의 주어진 지리적 지역에 존재하고, 상기 지역으로부터의 MSW에서 잘 자라도록 적응된, 자연적으로 발생한 박테리아가 사용될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있듯이, LAB은 흔하며, MSW 내 임의의 자연적으로 발생하는 박테리아 군집(community)의 주된 성분을 전형적으로 포함할 것이다.
일부 실시예들에서, 비분해성 고형물들 유래의 잔여(residual) 유기 물질을 회수하기 위하여 사용되는 가공(process) 용액들 또는 세정수(wash water)의 연속적인 재활용에 의하여, MSW는 자연적으로 발생하는 박테리아로 접종될 수 있다. 세정수들 또는 가공 용액들이 재활용되면서, 그것들은 점차 더 높은 미생물 레벨들을 수득한다. 일부 실시예들에서, 미생물 발효는, 특히 메타볼라이트들이 짧은 체인 카르복실산들/포르메이트, 아세테이트, 부티레이트, 프로프리오네이트(proprionate), 또는 락테이트(lactate)와 같은 지방산들을 포함할 때, pH 저하 효과를 갖는다. 일부 실시예에 따라 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효 혼합물의 pH를 조정하고 모니터링하는 것이 유리할 수 있다. 세정수들 및 가공 용액들이 효소 가수분해 전 들어오는 MSW의 수분 함량을 증가시키기 위하여 사용될 때, 분리된 효소 제제들로서 또는 세포밖 셀룰라제 활성을 보이는 미생물들로서, 효소 활성들의 추가에 앞서, 유리하게 접종이 이루어진다. 일부 실시예들에서, 특정 지역으로부터의 MSW 상에서 잘 자라도록 적응된 자연적으로 발생하는 박테리아는 MSW 상에, 또는 MSW의 효소 가수분해에 의하여 수득되는 액화된 유기 성분 상에 배양될 수 있다. 일부 실시예들에서, 배양된 자연적으로 발생하는 박테리아는, 재활용된 세정수들 또는 가공 용액들을 이용한 접종에 추가적으로 또는 분리하여, 그 다음에 접종원(inoculum)으로서 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에서, 박테리아 제제들은 분리된 효소 제제들의 첨가 전에 또는 동시에, 또는 가수분해-전(pre-hydrolysis)의 약간의 초기 기간 후에, 첨가될 수 있다.
일부 실시예들에서, 특정 균주들은 효소 가수분해 반응 조건들 하 잘 자라도록 및/또는 특정 대사 과정들을 강조하거나 덜 강조하기 위하여, "훈련된(trained)" 또는 특별히 변형되어 온 균주들을 포함하는, 접종을 위하여 배양될 수 있다. 일부 실시예들에서, 유일한(sole) 탄소원으로서 프탈레이트들(phthalate) 상에서 생존할 수 있는 것으로 확인된 박테리아 균주들을 이용하여 MSW를 접종하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 균주들은 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 크리세오마크로비움(Chryseomicrobium) 인테첸스(intechense) MW10T, 리시니바실러스(Lysinibaccillus) 푸시포르미스(fusiformis) NBRC 157175, 트로피시박터(Tropicibacter) 프탈리커스(phthalicus), 고르도니아(Gordonia) JDC-2, 아르트르보박터(Arthrbobacter) JDC-32, 바실러스(Bacillus) 서브틸리스(subtilis) 3C3, 코마모나스(Comamonas) 테스토스테로니(testosteronii), Comamonas(코마모나스) sp E6, 델프티아(Delftia) 추루하텐시스(tsuruhatensis), 로도코커스(Rhodoccoccus) 조스티(jostii), 부르콜데리아(Burkholderia) 세파시아(cepacia), 마이코박테리움(Mycobacterium) 반발레니(vanbaalenii), 아토박터(Arthobacter) 케이세리(keyseri), 바실러스(Bacillus) sb 007, 아토박터(Arthobacter) sp. PNPX-4-2, 고르도니아(Gordonia) 나미비엔시스(namibiensis), 로도코커스(Rhodococcus) 페놀리커스(phenolicus), 슈도모나스(Pseudomonas) sp. PGB2, 슈도모나스(Pseudomonas) sp. Q3, 슈도모나스(Pseudomonas) sp. 1131, 슈도모나스(Pseudomonas) sp. CAT1-8, 슈도모나스(Pseudomonas) sp. 니트로레두센스(Nitroreducens), 아토박터(Arthobacter) sp AD38, 고르도니아(Gordonia) sp CNJ863, 고르도니아(Gordonia) rubripertinctus, 아토박터(Arthobacter) 옥시단스(oxydans), 아시네토박터(Acinetobacter) 게노모스프(genomosp), 및 아시네토박터(Acinetobacter) 칼코아세티커스(calcoaceticus). 예컨대 Fukuhura et al 2012; Iwaki et al. 2012A; Iwaki et al. 2012B; Latorre et al. 2012; Liang et al. 2010; Liang et al. 2008; Navacharoen et al. 2011; Park et al. 2009; Wu et al. 2010; Wu et al. 2011 참조. 많은 상업적 폴리 비닐(vinyl) 클로라이드(chloride) 제제들에서 가소제들(plasticizers)로서 사용되는 프탈레이트(Phthalates)들은 여과 가능하고, 우리 경험으로는 바람직하지 않은 레벨에서 액화된 유기 성분 내에 자주 존재한다. 일부 실시예들에서, 균주들은 대사 과정들을 강조하기 위하여 그리고/또는 글루코스(glucose), 자일로스(xylose) 또는 아라비노스(arabinose)를 소비하는 과정들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 대사 과정들을 덜 강조하기 위하여, 당업계에 잘 알려진 방법들에 의하여 유전적으로 변형되어온 대로 유리하게 이용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 리그닌(lignin)을 분해할 수 있다고 확인된 박테리아 균주들을 이용하여 MSW을 접종하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 균주들은 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 코마모나스(Comamonas) sp B-9, 시트로박터(Citrobacter) 프론디(freundii), 시트로박터(Citrobacter) sp FJ581023, 판도레아(Pandorea) 노림버젠시스(norimbergensis), 아미콜라톱시스(Amycolatopsis) sp ATCC 39116, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 비리도스포루스(viridosporous), 로도코커스(Rhodococcus) 조스티(jostii), 및 스핀고비움(Sphingobium) sp. SYK-6. 예컨대 Bandounas et al. 2011; Bugg et al. 2011; Chandra et al. 2011; Chen et al. 2012; Davis et al. 2012 참조. 우리의 경험 상, MSW는 전형적으로 상당한 리그닌 함량을 포함하는데, 이는 AD 후 소화되지 않은 잔여물로서 전형적으로 회수된다.
일부 실시예들에서, 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 아세테이트-생산 박테리아 균주를 이용하여 MSW를 접종하는 것이 유리할 수 있다: 아세티토마컬럼(Acetitomaculum) 루미니스(ruminis), 아내로스티페스(Anaerostipes) 카캐(caccae), 아세토아내로비움(Acetoanaerobium) 노테래(noterae), 아세토박테리움(Acetobacterium) 카비노리쿰(carbinolicum), 아세토박테리움(Acetobacterium) 비어린개(wieringae), 아세토박테리움(Acetobacterium) 우디(woodii), 아세토게니움(Acetogenium) 키부이(kivui), 아시다미노코커스(Acidaminococcus) 페르멘탄스(fermentans), 아내로비브리오(Anaerovibrio) 리폴리티카(lipolytica), 박테로이즈(Bacteroides) 코프로수이스(coprosuis), 박테로이즈(Bacteroides) 프로피오니시파시엔스(propionicifaciens), 박테로이즈(Bacteroides) 셀룰로솔벤스(cellulosolvens), 박테로이즈(Bacteroides) 자일라놀리티쿠스(xylanolyticus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 카테눌라눔(catenulatum), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 비피둠(bifidum), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 아돌레센티스(adolescentis), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 안굴라툼(angulatum), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 브레브(breve), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 갈리쿰(gallicum), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 인판티스(infantis), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 롱검(longum), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 슈도롱검(pseudolongum), 부티리비브리오(Butyrivibrio) 피브리솔벤스(fibrisolvens), 클로스트리디움(Clostridium) 아세티쿰(aceticum), 클로스트리디움(Clostridium) 아세토부틸리쿰(acetobutylicum), 클로스트리디움(Clostridium) 아시두리치(acidurici), 클로스트리디움(Clostridium) 비퍼멘탄스(bifermentans), 클로스트리디움(Clostridium) 보툴리눔(botulinum), 클로스트리디움(Clostridium) 부틸리쿰(butyricium), 클로스트리디움(Clostridium) 셀로비오파룸(cellobioparum), 클로스트리디움(Clostridium) 포르미카세티쿰(formicaceticum), 클로스트리디움(Clostridium) 히스토리티쿰(histolyticum), 클로스트리디움(Clostridium) 로해디(lochheadii), 클로스트리디움(Clostridium) 메틸펜토숨(methylpentosum), 클로스트리디움(Clostridium) 파스테리아눔(pasteurianum), 클로스트리디움(Clostridium) 페르프린겐스(perfringens), 클로스트리디움(Clostridium) 프로피오니쿰(propionicum), 클로스트리디움(Clostridium) 푸트레파시엔스(putrefaciens), 클로스트리디움(Clostridium) 스포로게네스(sporogenes), 클로스트리디움(Clostridium) 테타니(tetani), 클로스트리디움(Clostridium) 테타노모르품(tetanomorphum), 클로스트리디움(Clostridium) 써모셀룸(thermocellum), 데설포토마쿨룸(Desulfotomaculum) 오리엔티스(orientis), 엔테로박터(Enterobacter) 애로게네스(aerogenes), 대장균(Escherichia coli), 유박테리움(Eubacterium) 리모숨(limosum), 유박테리움(Eubacterium) 루미난티움(ruminantium), 피브로박터(Fibrobacter) 숙시노게네스(succinogenes), 라흐노스피라(Lachnospira) 멀티파루스(multiparus), 메가스패라(Megasphaera) 엘스데니(elsdenii), 무렐라(Moorella) 써모아세티카(thermoacetica), 펠로박터(Pelobacter) 아세틸레니커스(acetylenicus), 펠로박터(Pelobacter) 아시디갈리치(acidigallici), 펠로박터(Pelobacter) 마실리엔시스(massiliensis), 프레보텔라(Prevotella) 루미노콜라(ruminocola), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 프로덴라이치(freudenreichii), 루미노코커스(Ruminococcus) 플라베파시엔스(flavefaciens), 루미노박터(Ruminobacter) 아밀로필러스(amylophilus), 루미노코커스(Ruminococcus) 알버스(albus), 루미노코커스(Ruminococcus) 브로미(bromii), 루미노코커스(Ruminococcus) 참파넬렌시스(champanellensis), 셀레노모나스(Selenomonas) 루미난티움(ruminantium), 스포로무사(Sporomusa) 퍼시보란스(paucivorans), 숙시니모나스(Succinimonas) 아밀롤리티카(amylolytica), 숙시니비브리오(Succinivibrio) 덱스트리노솔벤(dextrinosolven), 신트로포모나스(Syntrophomonas) 볼페이(wolfei), 신트로퍼스(Syntrophus) 아시디트로피커스(aciditrophicus), 신트로퍼스(Syntrophus) 겐티아내(gentianae), 트레포네마(Treponema) 브리얀티(bryantii) 및 트레포네마(Treponema) 프리미티아(primitia).
일부 실시예들에서, 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 부티레이트(butyrate)-생산 박테리아 균주를 이용하여 MSW를 접종하는 것이 유리할 수 있다: 아시다미노코커스(Acidaminococcus) 퍼멘탄스(fermentans), 아내로스티페스(Anaerostipes) 카캐(caccae), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 아돌레센티스(adolescentis), 부티리비브리오(Butyrivibrio) 크로소투스(crossotus), 부티리비브리오(Butyrivibrio) 피브리솔벤스(fibrisolvens), 부티리비브리오(Butyrivibrio) 헌가테이(hungatei), 클로스트리디움(Clostridium) 아세토부틸리쿰(acetobutylicum), 클로스트리디움(Clostridium) 오란티부틸리쿰(aurantibutyricum), 클로스트리디움(Clostridium) 베이저린키(beijerinckii), 클로스트리디움(Clostridium) 부틸리시움(butyricium), 클로스트리디움(Clostridium) 셀로비오파룸(cellobioparum), 클로스트리디움(Clostridium) 디피실레(difficile), 클로스트리디움(Clostridium) 이노쿰(innocuum), 클로스트리디움(Clostridium) 클루베리(kluyveri), 클로스트리디움(Clostridium) 파스퇴리아눔(pasteurianum), 클로스트리디움(Clostridium) 퍼프린겐스(perfringens), 클로스트리디움(Clostridium) 프로테오클라스티쿰(proteoclasticum), 클로스트리디움(Clostridium) 스포로스패로이즈(sporosphaeroides), 클로스트리디움(Clostridium) 심비오숨(symbiosum), 클로스트리디움(Clostridium) 터티움(tertium), 클로스트리디움(Clostridium) 티로부틸리쿰(tyrobutyricum), 코프로코커스(Coprococcus) 유탁투스(eutactus), 코프로코커스(Coprococcus) 코메스(comes), 대장균(Escherichia coli), 유박테리움(Eubacterium) 발커리(barkeri), 유박테리움(Eubacterium) 비포름(biforme), 유박테리움(Eubacterium) 셀룰로솔벤스(cellulosolvens), 유박테리움(Eubacterium) 실린드로이즈(cylindroides), 유박테리움(Eubacterium) 돌리춤(dolichum), 유박테리움(Eubacterium) 하드룸(hadrum), 유박테리움(Eubacterium) 할리(halii), 유박테리움(Eubacterium) 리모숨(limosum), 유박테리움(Eubacterium) 모닐리포름(moniliforme), 유박테리움(Eubacterium) 옥시도레두센스(oxidoreducens), 유박테리움(Eubacterium) 라물루스(ramulus), 유박테리움(Eubacterium) 렉탈레(rectale), 유박테리움(Eubacterium) 사부레움(saburreum), 유박테리움(Eubacterium) 토투오숨(tortuosum), 유박테리움(Eubacterium) 벤트리오숨(ventriosum), 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 프로스니치(prausnitzii), 푸소박테리움(Fusobacterium) 프로스니치(prausnitzii), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptoccoccus) 바기날리스(vaginalis), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptoccoccus) 테트라디우스(tetradius), 슈도부티리비브리오(Pseudobutyrivibrio) 루미니스(ruminis), 슈도부티리비브리오(Pseudobutyrivibrio) 자일라니보란스(xylanivorans), 로세부리아(Roseburia) 세시콜라(cecicola), 로세부리아(Roseburia) 인테스티날리스(intestinalis), 로세부리아(Roseburia) 호미니스(hominis) 및 루미노코커스(Ruminococcus) 브로미(bromii).
일부 실시예들에서, 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 프로피오네이트(propionate)-생산 박테리아 균주를 이용하여 MSW를 접종하는 것이 유리할 수 있다: 아내로비브리오(Anaerovibrio) 리폴리티카(lipolytica), 박테로이즈(Bacteroides) 코프로수이스(coprosuis), 박테로이즈(Bacteroides) 프로피오니시파엔스(propionicifaciens), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 아돌레센티스(adolescentis), 클로스트리디움(Clostridium) 아세토부틸리쿰(acetobutylicum), 클로스트리디움(Clostridium) 부틸리시움(butyricium), 클로스트리디움(Clostridium) 멘틸펜토숨(methylpentosum), 클로스트리디움(Clostridium) 파스퇴리아눔(pasteurianum), 클로스트리디움(Clostridium) 퍼프린겐스(perfringens), 클로스트리디움(Clostridium) 프로피오니쿰(propionicum), 대장균(Escherichia coli), 푸소박테리움(Fusobacterium) 뉴클레아툼(nucleatum), 메가스패라(Megasphaera) 엘스데니(elsdenii), 프레보텔라(Prevotella) 루미노콜라(ruminocola), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 프로덴라이치(freudenreichii), 루미노코커스(Ruminococcus) 브로미(bromii), 루미노코커스(Ruminococcus) 참파넬렌시스(champanellensis), 셀레노모나스(Selenomonas) 루미난티움(ruminantium) 및 신트로포모나스(Syntrophomonas) 볼페이(wolfei).
일부 실시예들에서, 하기의 임의의 하나 또는 그 이상, 또는 그것들의 유전적으로 변형된 변종들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 에탄올(ethanol)-생산 박테리아 균주를 이용하여 MSW를 접종하는 것이 유리할 수 있다: 아세토박테리움(Acetobacterium) 카비놀리쿰(carbinolicum), 아세토박테리움(Acetobacterium) 비어린개(wieringae), 아세토박테리움(Acetobacterium) woodii, 박테로이즈(Bacteroides) 셀룰로솔벤스(cellulosolvens), 박테로이즈(Bacteroides) 자일라놀리티쿠스(xylanolyticus), 클로스트리디움(Clostridium) 아세토부틸리쿰(acetobutylicum), 클로스트리디움(Clostridium) 베이저린키(beijerinckii), 클로스트리디움(Clostridium) 부틸리시움(butyricium), 클로스트리디움(Clostridium) 셀로비오파룸(cellobioparum), 클로스트리디움(Clostridium) 로헤디(lochheadii), 클로스트리디움(Clostridium) 파스퇴리아눔(pasteurianum), 클로스트리디움(Clostridium) 퍼프린겐스(perfringens), 클로스트리디움(Clostridium) 써모셀룸(thermocellum), 클로스트리디움(Clostridium) 써모피드로설푸리쿰(thermohydrosulfuricum), 클로스트리디움(Clostridium) 써모사카롤리티쿰(thermosaccharolyticum), 엔테로박터(Enterobacter) 애로게네스(aerogenes), 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라(Klebsiella) 옥시토카(oxytoca), 클렙시엘라(Klebsiella) 뉴모니아(pneumonia), 라흐노스피라(Lachnospira) 멀티파루스(multiparus), 락토바실러스(Lactobacillus) 브레비스(brevis), 류코노스톡(Leuconostoc) 메센테로이즈(mesenteroides), 패니바실러스(Paenibacillus) 마세란스(macerans), 펠로박터(Pelobacter) 아세틸레니쿠스(acetylenicus), 루미노코커스(Ruminococcus) 알부스(albus), 써모아내로박터(Thermoanaerobacter) 마트라니(mathranii), 트레포네마(Treponema) 브리얀티(bryantii) 및 지모모나스(Zymomonas) 모빌리스(mobilis).
일부 실시예들에서, 선택적으로 박테리아 및/또는 진균의 다른 종들을 포함하는, 서로 다른 미생물들의 컴소시움(consortium)이 동시의 미생물 발효를 달성하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 의도한 반응 조건들에서 원하는 대사 결과를 제공하기 위하여 적절한 미생물들이 선택될 수 있고, 그 다음에 자연적으로 발생하는 균주들을 더 성공적으로 하기 위하여(outcompete) 높은 용량(dose) 레벨에서 접종될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서 단발효성(homofermentive) 락테이트(lactate) 생산자(producer)를 이용하여 접종하는 것이 유리할 수 있는데, 왜냐하면 이것이 그 결과인 바이오메탄 기질에서, 다발발효성(heterofermentive) 락테이트 생산자에 의하여 제공될 수 있는 것보다, 더 높은 최종적(eventual) 메탄 잠재성을 제공하기 때문이다.
일부 실시예들에서, 효소 가수분해 및 동시의 미생물 발효는 WO2006/056838, 및 WO2011/032557에 기재된 대로 자유 낙하(free-fall) 혼합에 의하여 교반을 제공하는 가수분해 반응기를 이용하여 수행한다.
일정 시간의 효소 가수분해 및 동시의 미생물 발효 다음에, 10 and 45% 사이의 비-수분(non-water) 함량에서 제공되는 MSW는 변형되어(transformed), 유기물 유래(biogenic) 또는 "발효성" 성분들이 액화되고 그리고 미생물 메타볼라이트들이 수상(aqueous phase)에서 축적된다. 일정 시간의 효소 가수분해 및 동시의 미생물 발효 후, 폐기물의 상기 액화된, 발효성 부분들은 비발효성 고형물들로부터 분리된다. 일단 비발효성 고형물들로부터 분리된, 상기 액화된 물질이 우리가 명명한 "바이오리퀴드(bioliquid)"이다. 일부 실시예들에서, 바이오리퀴드의 비-수분 함량의 적어도 40%는 용해된(dissolved) 휘발성 고형분들을 포함하고, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 25%이다. 일부 실시예들에서, 바이오리퀴드 내 상기 용해된 휘발성 고형물들의 적어도 25 중량%(% by weight)은 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트, 및/또는 프로피오네이트(propionate)의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용해된 휘발성 고형물들의 적어도 70 중량%(% by weight)는 락테이트를 포함하고, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 25%이다.
일부 실시예들에서, 적어도 25 중량%(% by weight)에서 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합(combination)을 포함하는, 용해된 휘발성 고형물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리퀴드를 생산하기 위하여, MSW의 액화된 발효성 부분들로부터 비발효성 고형물들의 분리는 효소 가수분해의 시작(initiation) 후 16 시간 미만으로, 또는 18시간 미만으로, 또는 20 시간 미만으로, 또는 22시간 미만으로, 또는 24시간 미만으로, 또는 30 시간 미만으로, 또는 34 시간 미만으로, 또는 36 시간 미만으로 수행된다.
비발효성(non-fermentable) 폐기물의 액화된, 발효성 부분들의 분리는 여러가지 수단들에 의하여 달성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 나사 압착기(screw press) 작동들, 발리스틱(ballistic) 분리기(separator) 작동들(operations), 진동체(vibrating sieve) 작동들, 또는 당업계에 알려진 다른 분리 작동들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 적어도 두 가지 서로 다른 분리 작동들의 임의의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 폐기물의 발효성 부분들로부터 분리된 비발효성 고형물들은 MSW의 건조 중량의 적어도 약 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%를 포함한다. 일부 실시예들에서, 폐기물의 발효성 부분들로부터 분리된 비발효성 고형물들은 재활용 가능한 물질들의 건조 중량에 대하여 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%를 포함한다. 일부 실시예들에서, 적어도 두 개의 분리 작업들을 이용한 분리는 가공된 kg MSW 당 적어도 0.15 kg 휘발성 고형물들, 또는 적어도 010을 포함하는 바이오리퀴드를 생산한다. MSW의 내재된 유기물 유래(biogenic) 조성물이 가변적이라는 것은 당업자가 쉽게 이해할 것이다. 그럼에도 불구하고, 가공되는 kg MSW 당 0.15 kg 휘발성 고형물들 수치(figure)는 적어도 80%의 전형적인 분류되지 않은 MSW 내 유기물 유래(biogenic) 물질의 총 포획을 반영한다. 가공되는 kg MSW 당 바이오리퀴드 내 포획된 kg 휘발성 고형물들의 계산은 총 수율들 및 가공된 총 MSW가 결정되는 기간 동안 추산될 수 있다.
일부 실시예들에서, 바이오리퀴드를 생산하기 위하여 MSW의 액화된, 발효성 부분들로부터 비발효성 부분들의 분리 후, 바이오리퀴드는 서로 다른 온도 또는 pH를 포함하는, 서로 다른 조건들 하 발효 후(post-fermentation)로 될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "용해된 휘발성 고형물들"은 하기와 같이 계산된 간단한 수치(measurement)를 가리킨다: 바리오리퀴드의 샘플은 펠렛(pellet) 및 상청액(supernatant)을 생산하기 위하여 50 ml 팔콘 튜브에서 10 분 동안 6900 g으로 원심분리된다. 상청액은 부어지고(decanted) 펠렛의 습윤 중량(wet weight)은 상기 액체 샘플의 총 초기 중량의 퍼센트 부분(fraction)으로서 표현되었다. 상청액 샘플은 건조물 함량을 결정하기 위하여 48 시간 동안 60 도에서 건조되었다. 상청액 샘플의 휘발성 고형물들 함량은 건조물 수치(measurement)로부터 550 ℃에서 고로(furnace) 태움(burning) 후 남은 재(ash)를 뺌(subtract)으로써 결정되며, %인 용해된 휘발성 고형물들로서 질량(mass) 퍼센트로서 표현되었다. 용해된 휘발성 고형물들의 독립적인 척도(measure)은 펠렛의 휘발성 고형물들 함량에 기초한 계산에 의하여 결정된다. 펠렛의 습윤 중량 부분(fraction)은 총 초기 부피의 용해되지 않은 고형물들 부피 비율의 적은(fractional) 추산(estimate)으로서 적용된다. 펠렛의 건조물 함량은 48 시간 동안 섭씨 60 도에서 건조됨으로써 결정된다. 펠렛의 휘발성 고형물들 함량은 건조물 수치(measurement)로부터 550 ℃에서 고로(furnace) 태움(burning) 후 남은 재(ash)를 뺌(subtract)으로써 결정된다. 펠렛의 휘발성 고형물들 함량은 (1-습윤(wet) 부분(fraction) 펠렛)x(측정된 상청액 휘발성 고형물 %)에 의하여 주어진 상청액 액체로부터 추산된 기여(contribution)에 의하여 수정된다. 원래의 액체 내 측정된 총 휘발성 고형물들 %로부터 %로서 용해된 휘발성 고형물들의 독립적인 추산을 주기 위하여 샘플이 (펠렛의 수정된 휘발성 고형물들 %)x(총 초기 부피의 용해되지 않은 고형물들 부피 비율의 적은(fractional) 추산)를 뺀다. 두 개의 추산들 중 더 높은 것이 박테리아 메타볼라이트들에 의하여 대표되는 용해된 휘발성 고형물들의 퍼센트를 과대평가하지 않기 위하여 사용된다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들을 제공한다. MSW의 가공(processing) 방법들의 실시예들에 대한 이전의 자세한 논의는 바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들을 제공하는 실시예들에 선택적으로 적용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 바이오메탄을 생산하는 방법은 하기 단계들을 포함한다
(i) 비-수분 함량의 적어도 40 중량%(% by weight)가 용해된 휘발성 고형물들이 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, lactate 및/또는 propionate의 임의의 조합의 적어도 25 중량%(% by weight)를 포함하는, 용해된 휘발성 고형물들로 존재하도록, 미생물 발효에 의하여 전-컨디셔닝된(pre-conditioned) 유기 액체 바이오메탄 기질을 제공하는 단계,
(ii) 액체 기질을 혐기성 소화 시스템으로 옮기는(transferring) 단계, 뒤이어
(iii) 액체 기질의 혐기성 소화를 수행하여 바이오메탄을 생산하는 단계.
일부 실시예들에서, 본 발명은 대체하여, 효소 가수분해되고 미생물적으로 발효된 MSW를 포함하는, 또는 하기의 특징이 있는 효소 가수분해되고 미생물적으로 발효된 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스를 포함하는, 도시 고형 폐기물(MSW), 또는 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 유기 액체 바이오메탄 기질을 제공한다
- 비-수분 함량의 적어도 40 중량%(% by weight)가 용해된 휘발성 고형물들이 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량%(% by weight) 포함하는, 용해된 휘발성 고형물들로서 존재한다.
여기에 사용된 대로 용어 "혐기성(anaerobic) 소화(digestion) 시스템"은 메탄 가스가 그 시스템을 포함하는 반응기들의 각각 내에서 생산되는 통제된 통기(aeration) 조건들 하 하나 또는 그 이상의 반응기들을 포함하는 발효 시스템을 가리킨다. 메탄 가스는 "혐기성 소화 시스템" 내 발효 혼합물의 수상 내 대사작용으로 생성된 용해된 메탄의 농도가 사용된 조건들에서 포화되는 정도까지 생산되고, 메탄 가스는 시스템으로부터 내뿜어진다(emit).
일부 실시예들에서, "혐기성 소화 시스템"은 고정된 필터 시스템이다. "고정된 필터 혐기성 소화 시스템"은 혐기성 소화 컨소시엄(consortium)이 물리적(physical) 지지(support) 매트릭스(matrix) 상에서, 선택적으로 바이오필름(biofilm) 내에 고정된 시스템을 가리킨다.
일부 실시예들에서, 액체 바이오메탄 기질은 적어도 8% 총 고형물들, 또는 적어도 9% 총 고형물들, 또는 적어도 10% 총 고형물들, 또는 적어도 11% 총 고형물들, 또는 적어도 12% 총 고형물들, 또는 적어도 13% 총 고형물들을 포함한다. 여기에서 사용된 "총 고형물들"은 가용성(soluble) 및 불용성 고형물들 모두를 가리키며, 효과적으로는 "비-수분 함량"을 의미한다. 총 고형물들은 항량(constant weight)이 달성될 때까지 60 ℃에서 건조에 의하여 측정된다.
일부 실시예들에서, 미생물 발효는 메탄 생성 미생물들(methanogens)에 의한 메탄 생성을 막는 조건들 하 수행되는데, 예컨대, 6.0 미만의 pH에서, 또는 5.8 미만의 pH에서, 또는 5.6 미만의 pH에서, 또는 5.5 미만의 pH에서이다. 일부 실시예들에서, 액체 바이오메탄 기질은 용해된 메탄의 포화된 농도들보다 적게 포함한다. 일부 실시예들에서, 액체 바이오메탄 기질은 15 mg/L 미만 용해된 메탄, 또는 10 mg/L 미만, 또는 5 mg/L 미만으로 포함한다.
일부 실시예들에서, 바이오메탄을 생산하기 위하여 혐기성 소화 전에, 용해된 휘발성 고형물들 중 하나 또는 그 이상의 성분들이 증류, 여과, 전기투석(electrodialysis), 특정 결합(binding), 침전(precipitation) 또는 당업계에 잘 알려진 다른 수단들에 의하여 액체 바이오메탄 기질로부터 제거될 수 있다. 일부 실시예들에서, 에탄올 또는 락테이트가 바이오메탄을 생산하기 위하여 혐기성 소화 전에 액체 바이오메탄 기질로부터 제거될 수 있다.
일부 실시예들에서, 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 MSW 또는 섬유(fiber) 부분(fraction)으로서, 고형 기질이 미생물 발효에 의하여 전 컨디셔닝된(pre-conditioned) 액체 바이오메탄 기질을 생산하기 위하여 미생물 발효와 동시에 효소 가수분해에 가해져, 적어도 40 중량%(% by weight)의 비-수분 함량이 용해된 휘발성 고형물들로서 존재하는데, 용해된 휘발성 고형물들은 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량%(% by weight) 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 언급한 특성들을 갖는 액체 바이오메탄 기질은 오토클레이브 공정에 의하여 분류되지 않은 MSW로부터 수득되는 액화된 유기 물질의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산된다. 일부 실시예들에서, MSW 및 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스 모두로부터 유래된 합성(composite) 액체 바이오메탄 기질을 생산하기 위하여 선택적으로 MSW-유래된 바이오리퀴드로부터의 효소 활성이 리그노셀룰로스 기질의 가수분해를 위한 효소 활성을 제공하는 식으로, 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스는 효소 가수분해되고 미생물 발효된 MSW와 혼합될 수 있다.
"연질(Soft) 리그노셀룰로스 바이오매스"는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌을 포함하는 목재(wood) 외 식물 바이오매스를 가리킨다. 임의의 적절한 연질(soft) 리그노셀룰로스 바이오매스가 사용될 수 있으며, 적어도 밀짚(wheat straw), 옥수수대(corn stover), 옥수수 속대들(corn cobs), 빈(empty) 과실(fruit) 송이들(bunches), 볏짚(rice straw), 귀리짚(oat straw), 보리짚(barley straw), 카톨라짚(canola straw), 호밀짚(rye straw), 수수(sorghum), 사탕수수(sweet sorghum), 대두(soybean) 여물(stover), 스위치그라스(switch grass), 버뮤다그라스(Bermuda grass) 및 다른 풀들, 바개스(bagasse), 사탕무(beet) 박(pulp), 옥수수 섬유, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 바이오매스들을 포함한다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 종이, 신문인쇄용지, 판지와 같은 다른 리그노셀룰로스 물질들, 또는 다른 도시 또는 사무실 폐기물들을 포함할 수 있다. 리그노셀룰로스 바이오매스는 서로 다른 공급원료들(feedstocks)로부터 유래하는 물질들의 혼합물로서 사용될 수 있는데, 신선하고, 특히 건조된, 완전히 건조되거나 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 방법들은 적어도 약 0 kg 바이오매스 공급원료, 또는 적어도 100 kg, 또는 적어도 500 kg를 이용하여 실행된다.
리그노셀룰로스 바이오매스는 일반적으로 효소 가수분해 및 미생물 전-컨디셔닝(pre-conditioning) 전에 당업계에 알려진 방법들에 의하여 전처리되어야 한다. 일부 실시예들에서, 바이오매스는 열수(hydrothermal) 전처리에 의하여 전처리된다. "열수 전처리"는 산 또는 다른 화학물질(chemicals)들의 첨가와 함께 또는 없이, 120 ℃의 온도에서, 바이오매스를 "요리"하기 위하여 고온 액체 또는 스팀(steam) 또는 양쪽 모두를 포함하는 뜨거운 액체, 증기 스팀(vapor steam) 또는 가압 스팀(steam)으로서, 물의 이용을 가리킨다. 일부 실시예들에서, 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료들은 자가가수분해에 의하여 전처리된다. "자가가수분해"는 전처리 동안 헤미셀룰로스 가수분해에 의하여 유리된(liberated) 아세트산이 더 헤미셀룰로스 가수분해를 촉매화하는 전처리 공정을 가리키며, 3.5 및 9.0 사이의 pH에서 수행되는 리그노셀룰로스 바이오매스의 임의의 열수 전처리에 적용된다.
일부 실시예들에서, 열수 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스는 액체 부분(fraction) 및 고형 부분으로 분리될 수 있다. "고형 부분" 및 "액체 부분"은 고체/액체 분리에 있어 전처리된 바이오매스의 분별(fractionation)을 가리킨다. 분리된 액체는 "액체 부분(fraction)"으로 총괄하여 가리켜진다. 상당한 불용성 고형 함량을 포함하는 잔여 부분(fraction)은 고형 부분"으로 가리켜진다. 고형 부분(fraction) 또는 액체 부분(fraction) 또는 조합된 이들 모두는 본 발명의 방법들을 실행하는데 또는 본 발명의 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 고형 부분(fraction)은 세척될 수 있다.
실험예(Example) 1. 동시의 미생물 발효는 분류되지 않은 MSW의 효소 가수분해에 의한 유기 포획을 개선한다.
실험실(Laboratory) 벤치(bench) 규모(scale) 반응들이 실험예 5에 기재된 테스트로부터의 바이오리퀴드 샘플로 수행되었다.
실험실 규모 반응들을 위한 모델 MSW 기질이 도시 고형 폐기물의 (셀룰로스, 동물 및 채소 부분들로서 정의된) 유기 부분(fraction)을 포함하기 위하여 신선한 생산물(produce)을 이용하여 준비되었다.
모델 MSW는 -20 ℃에서 부분 표본(aliquots)에서 보관되었고, 4 ℃에서 밤새 해동되었다. 반응은 50 ml 원심관(centrifuge tube)에서 되었고, 총 반응 부피는 20g이었다. 모델 MSW는 (60 ℃에서 2일 후 남은 건조물 함량으로서 측정된) 5% 건조물(dry matter)(DM)에 첨가되었다.
가수분해에 적용된 셀룰라제는 Cellic CTec3였다(VDNI0003, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) (CTec3). pH5에서 pH를 조정하고 유지하기 위하여, 시트레이트(citrate) 버퍼(buffer)가 총 부피를 20g으로 만들기 위하여 적용되었다.
반응들은 가열(heating) 오븐(oven) 내에 위치하는 (4RPM에서 도는) Stuart Rotator SB3 상에서 24시간 동안 인큐베이션(incubate)되었다. 음성 대조군들은 인큐베이션(incubation) 동안 기질로부터 건조물의 배경(background) 방출(release)을 평가하기 위하여 평행으로 되어졌다. 인큐베이션(incubation) 후에, 튜브들이 4 ℃에서 10 분간 1350g에서 원심분리되었다. 상청액은 그 다음에 부어지고(decanted off), HPLC 분석을 위하여 1 ml가 제거되었고, 남아있는 상청액 및 펠렛은 60 ℃에서 2 일간 건조되었다. 건조 물질의 중량이 기록되었으며, 건조물의 분포를 계산하기 위하여 이용되었다. 모델 MSW 내 DM의 전환이 이들 숫자들에 기초하여 계산되었다.
250nm에서 굴절률 검출기(refractive index detector) (Shodex® RI-101) 및 UV 검출기를 갖춘 UltiMate 3000 HPLC (Thermo Scientific Dionex)를 이용하여 농도들 유기산들 및 에탄올이 측정되었다. 분리는 0.6ml/분의 유속에서 용리제(eluent)로서 5mM H2SO4으로 80 ℃에서 Rezex RHM 단당류 칼럼(Phenomenex) 상에서 수행되었다. 그 결과는 크로멜론(Chromeleon) 소프트웨어 프로그램(Dionex)을 이용하여 분석되었다.
동시의 발효 및 가수분해의 효과를 평가하기 위하여, 실험예 5(12월 15일 및 16일의 샘플)에 기재된 테스트로부터 바이오리퀴드의 2ml/20g이 CTec3와 함께 또는 없이 반응들에 첨가되었다(24mg/g DM).
MSW 내 DM 의 전환.
고형물들의 전환이 총 건조물의 퍼센트로서 상청액 내 발견되는 고형물들의 함량으로서 측정되었다. 도 1은 MSW 블랭크(blank), 분리된 효소 제제, 미생물 접종원(inoculum) 단독, 및 미생물 접종원 및 효소의 조합에 대한 전환을 보여준다. 그 결과들은 실험예 5로부터의 EC12B의 첨가가 반응 블랭크(blank)(MSW Blank) 내 건조물의 배경(background) 방출과 비교하여 건조물의 상당히 더 높은 전환을 야기하는 것을 보여준다(스튜던트(Students) t-검정 p<0.0001). CTec3를 이용한 효소 가수분해 및 EC12B 샘플의 첨가에 의하여 유도된 동시의 미생물 발효는 CTec3 만으로 가수분해된 반응 및 EC12B 만이 첨가된 반응들에 비교하여 건조물의 상당히 더 높은 전환을 야기하였다(p<0.003).
글루코스 , 락테이트 , 아세테이트 및 EtOH 의 HPLC 분석
상청액 내 측정된 글루코스 및 미생물 메타볼라이트들(락테이트, 아세테이트 및 에탄올)의 농도가 도 2에 나타나 있다. 나타낸 바와 같이, 모델 MSW 블랭크 내 이것들의 낮은 배경(background) 농도가 있고, 젖산 함량은 아마 모델 MSW가 원산인 박테리아로부터 오는데, 왜냐하면 기질을 창조하기에 사용한 물질이 결코 살균된 것(sterile)이거나 박테리아를 죽이기 위하여 가열된 것이 아니기 때문이다. CTec3 첨가의 효과는 상청액 내 글루코스 및 젖산의 증가를 야기하였다. 글루코스 및 박테리아 메타볼라이트의 가장 높은 농도들은 실험예 5로부터의 EC12B 바이오리퀴드가 CTec3와 동시에 첨가된 반응에서 발견되었다. 동시의 발효 및 가수분해는 이와 같이 모델 MSW 내 건조물의 전환을 개선하고 액체 내 박테리아 메타볼라이트들의 농도를 증가시킨다.
참고문헌: Jacob Wagner Jensen, Claus Felby, Henning Jørgensen, Georg Ørnskov Rønsch, Nanna Dreyer Nørholm. Enzymatic processing of municipal solid waste. Waste Management. 12/2010; 30(12):2497-503.
Riber, C., Petersen, C., Christensen, T.H., 2009. Chemical composition of material fractions in Danish household waste. Waste Management 29, 1251-1257.
실험예 2: 동시의 미생물 발효는 분류되지 않은 MSW의 효소 가수분해에 의한 유기 포획을 개선한다.
테스트들은 도 3에 나타난 특별히 설계뙨 뱃치(batch) 반응기에서 수행되었는데, 이는 실험실 규모 실험들에서 수득된 결과들을 입증하려는 목적으로 분류되지 않은 MSW를 이용하였다. 실험들은 동시의 미생물 발효 및 효소 가수분해를 달성하기 위하여 실험예 3 박테리아로부터 수득된 바이오리퀴드를 포함하는 미생물의 접종원(inoculum) 첨가의 효과를 테스트하였다. 테스트들은 분류되지 않은 MSW를 이용하여 수행되었다.
작은-규모 시험을 위하여 사용된 MSW는 REnescience에서의 연구개발에서 초점이었다. 가치있는 시험 결과들을 위하여, 폐기물이 대표적이고 재현가능할 것이 요구되었다.
폐기물은 2012년 3월 노미(Nomi) I/S 홀스테브로(Holstebro)로부터 수집되었다. 폐기물은 분류되지 않은, 각각의 지역으로부터의 도시 고형 폐기물(MSW)였다. 폐기물은 작은-규모 시험들에서의 사용을 위하여 그리고 시험들을 위한 대표적 샘플의 수집을 위하여 30x30mm로 채썰어졌다(shredded). 샘플 추출(sampling)의 이론은 22-리터 양동이들(buckets) 내 채썰어진(shredded) 폐기물의 이단추출(sub-sampling)에 의하여 채썰어진(shredded) 폐기물에 적용되었다. 양동이들은 사용 전까지 -18℃에서 냉동 용기(freezer container) 내에서 보관되었다. "진짜 폐기물"은 수집품으로부터의 폐기물의 8 양동이로 구성되었다. 이들 양동이들의 내용물들은 서로 섞이고, 반복들 간의 변동성(variability)이 가능한 한 낮다는 것을 보장하기 위하여 재추출(resample)되었다.
모든 샘플들은 물, 온도, 교대(rotation) 및 기계적 영향에 관한 유사한 조건들 하 운영되었다. 6개의 챔버(chamber)들이 사용되었다: 접종 없는 3 및 접종을 한 3. 실험 동안 설계된 비-수분 함량은 물 첨가에 의하여 15 % 비-수분 함량으로 세팅되었다. 접종하는 물질 내 건조물이 설명되어(accounted), 그래서 접종된 챔버 내 신선한 물 첨가가 더 작았다. 6 kg의 MSW가 각각의 챔버에 첨가되고, 상업적 셀룰라제 제제인 84 g CTEC3도 그러하였다. 2 리터의 접종원(inoculum)이, 첨가된 물의 상응하는 감소와 함께, 접종된 챔버들에 첨가되었다.
pH는, 각각 pH 증가를 위하여 20% NaOH 및 pH 감소를 위하여 72% H2SO4의 첨가를 이용하여, 접종된 챔버들 내에서 5.0 에서, 접종되지 않은 챔버들 내에서 pH 4.2에서 유지되었다. 접종되지 않은 챔버 내의 더 낮은 pH는 내재된(intrinsic) 박테리아가 잘 자라지 않을(flourish) 것이란 것을 보정하는 것을 돕는다. 우리는 전에, MSW 가수분해의 맥락 내에서, CTEC3 Tm, 사용한 효소 제제를 이용하여, pH 4.2 및 pH 5.0 사이에서 활성 간 차이가 포착될 수 없다는 것을 보였었다. 일정한 회전(rotary) 교반을 제공하는 파일럿 반응기으로, 반응은 3일 간 섭씨 50도에서 계속되었다.
반응 마지막에, 챔버들은 MSW의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 액화된 물질을 포함하는 체(sieve) 및 바이오리퀴드를 통하여 비워졌다.
건조물(TS) 및 휘발성 고형물들(VS)이 건조물(DM) 방법에 의하여 결정되었다:
샘플들은 48 시간 동안 60 ℃에서 건조되었다. 건조 전후 샘플의 중량이 DM 퍼센트를 계산하기 위하여 사용되었다.
샘플 DM (%)
Figure pct00002

휘발성 고형물들 방법:
휘발성 고형물들이 재(ash) 함량을 뺀(subtracted) 퍼센트로서 계산되고 나타내어진다. 샘플의 애쉬 함량은 최소 4 시간 동안 고로(furnace)에서 550 ℃에서 전(pre)-건조된 샘플을 태움으로써 발견되었다. 그 다음에 재가 하기와 같이 계산되었다:
건조물의 샘플 재(ash) 퍼센트:
Figure pct00003

휘발성 고형물들 퍼센트:
(1 - 샘플 재 퍼센트) x 샘플 DM 퍼센트
결과들은 하기에 나타낸 바와 같다. 나타낸 바와 같이, 더 높은 총 고형물들 함량이 접종된 챔버들 내 수득되는 바이오리퀴드 내에서 수득되었는데, 이는 동시의 미생물 발효 and 효소 가수분해가 효소 가수분해 단독보다 뛰어났다는 것을 가리킨다.
Figure pct00004

Figure pct00005

실험예 3. 동시의 미생물 발효는 분류되지 않은 MSW의 효소 가수분해에 의한 유기 포획을 개선한다.
Amager ressource center (ARC), 코펜하겐, 덴마크에 위치한 REnescience 시범(demonstration) 시설(plant)에서 실험들이 수행되었다. 시설의 원리(principle) 특징(feature)을 보여주는 도식 그림(schematic drawing)이 도 4에 나타나 있다. ARC REnescience 폐기물(Waste) 정제(Refinery)의 개념은 4개 산물들로 MSW를 분류하는 것이다. 바이오가스 생산을 위한 바이오리퀴드, 재활용을 위한 비활성 성분(inerts)(유리 및 ahfho) 및 RDF 생산에 적합한 무기 물질들의 2D 및 3D 부분들(fractions) 또는 금속들, 플라스틱 및 나무의 재활용.
대도시로부터의 MSW는 비닐봉지 내로서 수집된다. MSW는 가공 때까지 그것이 사일로(silo)에서 보관되는, REnescience Waste Refinery로 수송된다. MSW의 특성에 의존하여, 분류 단계가 (600 mm를 넘는) 너무 큰 입자들을 꺼내기(take out) 위하여 REnescience 시스템 앞에 설치될 수 있다.
이 실험예에서 테스트된대로 REnescience 기술은 3 단계들을 포함한다. 첫 번째 단계는 20-60 분의 기간 동안 40-75 ℃의 범위 내의 온도로의, 열수에 의한 MSW의 (도 4에 나타낸대로, 전처리) 가벼운(mild) 가열이다. 이 가열 및 혼합 기간은 비닐봉지를 열고, 효소들의 첨가 전 더욱 균질한(homogenous) 유기 상(phase)을 준비하는 분해성 성분들의 적절한 펄핑(pulping)을 제공한다. 온도 및 pH가 가열 기 내에 효소 가수분해에 사용되는 분리된 효소 제제들의 최적의 것으로 조정된다. 열수는 깨끗한 수돗물 또는 세척 드럼(washing drums)에서 처음으로 사용된 세정수(washing water)로서 첨가되고, 그 다음에 도 4에서 표시한 대로 가벼운 가열로 재순환될 수 있다.
두 번째 단계는 효소 가수분해 및 발효이다(도 4에 나타낸대로, 액화). REnescience 공정의 두 번째 단계에서, 효소들이 첨가되고 미생물들이 선택적으로 선택된다. 효소 액화 및 발효는 효소 수행을 위한 최적의 온도 및 pH에서, 거의(app.) 16시간의 체류 시간에서 계속하여 수행된다. 이 가수분해 및 발효에 의하여, MSW의 유기물 유래(biogenic) 부분이 비분해성 물질들 간 건조물이 높은 바이오리퀴드로 액화된다. pH는 CaCO3의 첨가에 의하여 통제된다.
이 실험예에서 실행된 대로 REnescience 기술의 세 번째 단계는 바이오리퀴드가 비분해성 부분들로부터 분리되는, 분리 단계이다. 분리는 발리스틱(ballistic) 분리기(separator), 세척 드럼(washing drums) 및 유압(hydraulic) 공정들에서 수행된다. 발리스틱 분리기는 효소 처리된 MSW를 바이오리퀴드, 2D 비분해성 물질들의 부분(fraction) 및 3D 비분해성 물질들의 부분(fraction)들로 분리한다. 3D 부분(fraction)(깡통들 및 플라스틱 병들인 물리적으로 3차원 물체들)은 다량의 바이오리퀴드에 결합하지 않아, 단일의 세척 단계가 3D 부분(fraction)을 씻는데 충분하다. 2D 부분(fraction)(실험예들로 직물들 및 호일들)은 상당한 양의 바이오리퀴드에 결합한다. 그러므로 2D 부분(fraction)은, 바이오리퀴드의 회수에 최적화되고, "깨끗"하고 건조된 2D 부분을 수득하기 위하여, 나사 압착기(screw press)을 이용하여 압착되고, 세척되고 다시 압착된다. 모래 및 유리인 불활성 물질은 바이오리퀴드로부터 체에 걸러진다. 모든 세척 드럼들(washing drums)에서 사용된 물은 재순환되고, 가열되고, 그리고 나서 가열을 위하여 첫 번째 단계에서 열수로서 사용될 수 있다.
이 실험예의 기록된 시험은 표 1에 나타낸 바와 같이 3개의 구획(section)들로 나누어진다.
Figure pct00006

7 일 시험에서, 덴마크, 코펜하겐으로부터 수득된, 분류되지 않은 MSW는 REnescience 데모(demo) 시설(plant) 내로 335 kg/h로 계속해서 로딩(load)된다. 가벼운 가열에서, 536 kg/h 물(수돗물 또는 세정수)가 가벼운 가열 반응기에 들어가기 전에 거의(app.) 75 ℃까지 가열된다. 온도는 이로써 MSW 내에서 거의 50 ℃로 조정되고, pH는 CaCO3의 첨가에 의하여 거의(app.) 4.5로 조정된다.
첫 번째 구획에서, 계면 활성 항균제 Rodalon TM(벤질(benzyl) 알킬(alkyl) 암모늄(ammonium) 클로라이드(chloride))가 kg MSW 당 3 g 유효성분으로, 첨가된 물에 포함된다.
액화 반응기에서 MSW의 젖은(wet) 톤(ton) 당 Cellic Ctec3(노보자임(Novozymes)의 상업적으로 이용가능한 셀룰라제 제제)은 거의(app.) 14 kg 첨가된다. 온도는 45-50 ℃로부터의 범위 내에 유지되었고, pH는 CaCO3의 첨가에 의하여 4.2 - 4.5로부터의 범위 내로 조정되었다. 효소 반응기 머무름(retention) 시간은 거의( app.) 16 시간이다.
발리스틱 분리기, 압착기들 및 세척 드럼들(washing drums)의 분리 시스템에서, 바이오리퀴드(액화된 분리성 물질)은 비분해성 물질들로부터 분리된다.
세정수들(Wash water)은 흘러 나오고(poured out), 유기 함량을 기록하고, 또는 재순환되고 그리고 가벼운 가열에 들어오는 MSW로 재사용되었다. 세정수의 재순환은 초기에 존재하였던 것보다 더 높은 레벨들로 50 ℃ 반응 조건들에서 잘 자라는 생물들을 이용하여 박테리아 접종을 달성하는 효과를 갖는다. 사용된 공정 계획에서, 재순환된 세정수는 들어오는 MSW를 효소 가수분해에 적합한 온도, 이 경우 약 50 ℃로 가져가기 위하여, 거의 70 ℃로 처음 가열되었다. 특히, 젖산 박테리아의 경우, 70C까지의 가열은 열 내성(tolerance) 발현(expression)의 "유인(inducement)" 및 선택을 제공하는 것으로 전에 보여졌다.
샘플들은 하기 장소들에서 선택된 시간에서 수득되었다:
- "EC12B"로 칭해진, 작은 체를 남기는(leaving) 바이오리퀴드
- 보관 탱크 내 바이오리퀴드
- 유장(whey) 체(sieves)들 후 세정수
- 2D fraction
- 3D fraction
- 세척 단위들 양쪽 다로부터의 불활성 바닥 부분(fraction)
바이오리퀴드의 생산은 보관 탱크 상 로드(load) 셀(cell)들로 측정되었다. 신선한 물들의 투입(input) 흐름(flow)이 유량계로 측정되었고, 재활용 또는 물을 빼낸 세정 폐기물(washing waste)이 로드 셀들로 측정되었다.
박테리아 수들은 하기와 같이 시험되었다: 바이오리퀴드의 선택된 샘플들이 SPO (peptone salt solution) 내에서 10-배 희석되었고, 그리고 1 ml의 희석들이 소고기(beaf) 추출물(Extract) 한천(Agar) 상에 파종깊이에서 플레이팅(plate)되었다(3.0 g / L의 소고기 추출물(Fluka, Cas.: B4888), 10.0 g / L 트립톤(Tryptone)(Sigma, cas.no.: T9410), 5.0 g / L NaCl (Merck, cas.no. 7647-14-5), 15.0 g / L 한천(Sigma, cas. no. 9002-18-0)). 플레이트(plates)들은 50 도에서 각각 인큐베이션되었다. 호기성 및 혐기성 분위기. 적절한 용기(containers) 내에서 이루어진 혐기성 배양은 아녹시마트(Anoxymat)로의 가스처리(gassing) 및 iltfjernende 레터들(letters)(AnaeroGen from Oxoid, cat.no AN0025A)을 첨가함으로써 혐기성이 유지되었다. 호기성 콜로니들은 16 시간 후 및 다시 24 시간 후 수가 세어졌다. 혐기성 성장하는 박테리아는 64-72 시간 후 수량화되었다.
도 5는 가공되는 kg MSW 당 kg으로의 EC12B에서 바이오리퀴드 샘플들 내 총 휘발성 고형물들을 보여준다. 포인트 추산들은 분리된 시간 기간으로서 3개의 분리된 실험 기간들의 각각을 고려함으로써 실험 동안 서로 다른 시간 포인트들에서 수득되었다. 이와 같이, 기간 1 (Rodalon) 동안 포인트 추산은 기간 1 동안의 물질 흐름들 및 물질(mass) 밸런스들(balance)들에 관련하여 표현된다. 시설 내 문제들(complications) 때문에 연장된(prolonged) 정지(stop) 후에 시작된, 기간 1 동안 도 5에 나타난 대로, 바이오리퀴드 내 포획된 총 고형물들은 RodalonTM의 약간의 항균 효과와 일치하여, 꾸준히 떨어지는 것으로 보인다. 기간 2 동안, 총 포획된 고형물들은 약간 더 높은 레벨들로 돌아간다. 재순환이 들어오는 MSW의 효과적인 "접종"을 제공하는, 기간 3 동안, 바이오리퀴드 kg VS/kg 폐기물(affald)은 약 12%의 상당히 더 높은 레벨들까지 증가한다.
도 5에 나타난 10 타임 포인트들 각각에 대하여, 바이오리퀴드(EC12B) 샘플들이 취해지고, 총 고형물들, 휘발성 고형물들, 용해된 휘발성(voilatile) 고형물들, 및 추정되는 박테리아 메타볼라이트들 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 및 프로피오네이트의 농도들이 HPLC에 의하여 결정되었다. 글리세롤 농도들을 포함하는 이러한 결과들은 하기 표 1에 나타나 있다.
표 1. 바이오리퀴드 샘플들의 분석.
Figure pct00007

10 개의 타임 포인트들의 각각에서 취해진 바이오리퀴드 샘플들에 대하여, 도 6은 호기성 조건들(confitions) 하 결정된 살아 잇는 박테리아 수치들 및 또한 용해된 휘발성 고형물들의 퍼센트로 표현된 (아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 및 프로피오네이트의 총합을 의미하는) 중량 퍼센트 "박테리아 메타볼라이트들" 모두를 보여준다. 보여진 바와 같이, 중량 퍼센트 박테리아 메타볼라이트들은 증가된 박테리아 활성과 함께 분명히 증가하며, 바이오리퀴드 내 고형물들의 증가된 포획과 관련된다.
실험예 4. 실험예 3에서 동시 발효에 기여하는 미생물들의 확인
실험예 3에서 수득된 바이오리퀴드 샘플들이 미생물 조성물을 위하여 분석되었다.
샘플 내 존재하는 미생물 종들이 잘-특징지어진 종들(참고 종들)의 16S rRNA 유전자 서열들과 그것들의 16S rRNA 유전자 서열들의 비교에 의하여 확인되었다. 종들 확인을 위한 정상적인 중단(cut-off) 값은 참고 종들과 97% 16S rRNA 유전자 서열 유사도(similarity)이다. 만약 유사도(similarity)가 97% 밑이면, 그것은 아마도 다른 종들일 것이다.
그 결과인 서열들은 NCBI 데이터베이스들와 대비하여(against) BlastN 내에서 쿼리(queried)되었다. 데이터베이스는 적어도 1200bp 길이의 좋은 질의 서열들 및 NCBI 분류상(taxonomic) 연계(association)를 포함한다. BLAST 히트(hits)만 ≥ 95% 동일성(identity)이 포함되었다.
표본조사된(sampled) 바이오리퀴드는 DNA 추출 전 동결 없이 분석으로 직접 이동되었다.
총 7개의 박테리아 종들이 확인되었고(도 7) 그리고 고세균(Archea)의 7 종들이 확인되었다. 일부 경우들에서, 박테리아 종들 아종들(subspecies)은 배치될 수 없었다(L. 아시도필루스(acidophilus), L. 아밀로보러스(amylovorus), L. 소브리우스(sobrius), L. 루테리(reuteri), L. 프루멘티(frumenti), L. 퍼멘툼(fermentum), L. 파비퍼멘탄스(fabifermentans), L. 플란타룸(plantarum), L. 펜토수스(pentosus))
실험예 5. 분류되지 않은 MSW의 동시의 미생물 발효 and 효소 가수분해를 이용한 유기 포획의 자세한 분석.
실험예 1에 기재된 REnescience 시범(demonstration) 플랜트는 분류되지 않은 MSW의 동시의 박테리아 발효 및 효소 가수분해를 이용하여 총 유기 포획의 자세한 연구를 하기 위하여 사용되었다.
코펜하겐으로부터의 쓰레기(Trash)는 그것의 내용물(content)을 결정하기 위하여 에코넷(Econet)에 의하여 특징된다.
폐기물 분석은 내용물(content) 및 변화(variation)를 결정하기 위하여 분석되어 왔다. MSW의 큰 샘플이 폐기물 분석을 수행하는 Econet A/S로 배달왔다. 주된(primary) 샘플은 약 50 - 200 kg의 부표본( sub sample)으로 감소되었다. 이 부표본은 15개의 폐기물 부분들(fractions)로 훈련된 인원들에 의하여 분류되었다. 각각의 부분(fraction)의 중량이 기록되었고 분포가 계산되었다.
표(Table) x 폐기물(Waste)
300 시간 테스트 동안 에코넷(Econet)에 의하여 분석된, 총 (%)로서의 조성물
Figure pct00008

표 2에 나타나 있는, 폐기물의 조성물은 가끔 다르며, 300 시간이 넘게 수집된 다른 샘플들로부터의 폐기물 분석 결과이다. 가장 큰 변화는 포획될 수 있는 유기 물질의 함량에 영향을 미치는 모든 부분들인 기저귀들(diaper) 플라스틱 및 판지 포장 및 식품 폐기물 부분들 내에서 보인다.
"300 시간 테스트"의 전체 과정(course) 동안, 가공된(processed) kg MSW 당 kg VS으로 표현된, 평균 "포획된(captured)" 생분해성 물질은 0.156 kg VS/kg MSW 투입이었다.
바이오리퀴드의 대표적 샘플들이, 시설이 안정적 운영 중인 기간인, 실험 과정(course) 동안 다양한 시간 포인트들에서 취해졌다. 샘플들은 HPLC에 의하여 분석되어, 실험예 3에 기재된 대로 휘발성 고형물들, 총 고형물들, 및 용해된 고형물들이 결정되었다. 결과들은 하기 표 2에 나타난다.
표 2. 바이오리퀴드 샘플들의 분석
Figure pct00009

실험예 6. 실험예 5의 동시 발효에 기여하는 미생물들의 확인.
바이오리퀴드 "EC12B"의 샘플이 2012년 12월 15일 및 16일 실험예 5에 기재된 테스트 동안 중단되고(withdrawn) 그리고 샘플 내 미생물들을 확인하기 위하여 16S rDNA 분석을 수행하는 목적으로 -20 ℃에서 저장되었다. 16S rDNA 분석은 작은 라이보좀 소단위체의 16S 성분에 기초한 원핵생물들의 확인 및 계통분석에 널리 사용된다. 동결된 샘플들은 16S rDNA 분석이 수행되는(GATC_Biotech), GATC Biotech AB, Solna, SE로 드라이아이스 상에서 수송되었다. 분석을 하기를 포함한다: 게놈 DNA의 추출, 초가변(hypervariable) 영역들 V1 내지 V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp 길이)에 걸치는 보편적인(universal) 프라이머들 프라이머 쌍을 이용한 앰플리콘(amplicon) 라이브러리 준비, GS FLX 어댑터들(adaptors)을 갖는 PCR 태깅들(tagging), 104.000-160.000 수의 리드들(reads) pr. 샘플을 수득하기 위한 게놈(Genome) 시퀀서(Sequencer) FLX 장치 상 시퀀싱(sequencing). 그 결과인 서열들은 그 다음에 Ribosomal Database Project로부터 rDNA 데이터베이스에 대비하여(against) BlastN에서 쿼리되었다(queried)(Cole et al., 2009). 데이터베이스는 적어도 1200bp 길이의 좋은 질의 서열들 및 NCBI 분류상(taxonomic) 연계(association)를 포함한다. 현재의 방출(2012년 9월 19일 업데이트된, RDP 방출(Release) 10)은 9,162 박테리아 및 375 고세균(archaeal) 서열들을 포함한다. BLAST 결과들은 짧고 낮은 질 히트(hits)들을 제거하기 위하여 여과되었다(서열 동일성(identity) ≥ 90%, 정렬(alignment) 범위(coverage) ≥90%).
총 226 개의 다른 박테리아가 확인되었다.
EC12B 샘플에서 우세한 박테리아는 프로피오네이트(propionate) 생산 박테리아(Ueki et al. 2006)인 팔루디박터(Paludibacter) 프로피오니시게네스(propionicigenes) WB4였는데, 이는 확인된 총 박테리아들의 13%로 포함되었다. 확인된 13개의 우세한 박테리아들의 분포는 (팔루디박터(Paludibacter) 프로피오니시게네스(propionicigenes) WB4, 프로테이니필룸(Proteiniphilum) 아세타티게네스(acetatigenes), 악티노미세스(Actinomyces) 유로파에우스(europaeus), 레빌리니아(Levilinea) 사카롤리티카(saccharolytica), 크립타내로박터(Cryptanaerobacter) 페놀리쿠스(phenolicus), 세디멘티박터(Sedimentibacter) 하이드록시벤조이쿠스(hydroxybenzoicus), 클로스트리디움(Clostridium) 피토퍼멘탄스(phytofermentans) ISDg, 페트리모나스 설퍼리필라(sulfuriphila), 클로스트리디움(Clostridium) 락타티퍼멘탄스(lactatifermentans), 클로스트리디움(Clostridium) 카에니콜라(caenicola), 갈시엘라(Garciella) 니트라티레두센스(nitratireducens), 데할로박터(Dehalobacter) 리스트릭투스(restrictus) DSM 9455, 마리노박터(Marinobacter) 루타오엔시스(lutaoensis))는 도 8에 보인다.
속(genus) 레벨에서 확인된 박테리아들의 비교는 클로스트리디움(Clostridium), 팔루디박터(Paludibacter), 프로테이니필룸(Proteiniphilum), 악티노미세스(Actinomyces) and 레빌리니아(Levilinea)(모두 혐기성 생물들)이 확인된 속(genera)의 거의 반을 대표한다는 것을 보였다. 락토바실러스(Lactobacillus) 속은 확인된 박테리아들의 2%로 포함되었다. 우세한 박테리아 종(specie) P. 프로피오니시게네스(propionicigenes) WB4는 EC12B 샘플에서 두 번째로 우세한 종(genera)(팔루디박터(Paludibacter))에 속한다.
EC12B 샘플 내 우세한 병원성 박테리아는 확인된 총 박테리아의 0.028%를 차지하는, 스트렙토코커스(Streptococcus) spp.였다. 바이오리퀴드에서 포자(spore) 형성 병원성 박테리아는 발견되지 않았다.
스트렙토코커스(Streptococcus) spp.는 실험예 5의 바이오리퀴드 내 존재하는 유일한 병원성 박테리아였다. 스트렙토코커스(Streptococcus) spp.는 (포자를 형성하지 않는(non-spore) 것들 중) 가장 높은 온도 저항성 및 D-값(value)을 갖는 박테리아인데, 이는 살아 있는 스트렙토코커스(Streptococcus) spp. 세포들의 양을 10배 감소시키기 위하여 주어진 온도에서 필요한 시간의 양이, MSW에서 Deportes et al. (1998)에 의하여 보고된 다른 병원성 박테리아 중 임의의 것보다 더 높다는 것을 가리킨다. 이러한 결과들은 실험예 5에서 적용된 조건들이 스트렙토코커스(Streptococcus) spp.만이 존재하는 레벨로의 REnescience 공정에서 분류 동안 MSW를 살균(sanitize)할 수 있다는 것을 보여준다.
영양분들을 위한 생물들간의 경쟁, 및 공정 동안 온도 증가는 병원성 생물들의 수를 상당히 감소시킬 것이며, 상기 보여진 바와 같이, REnescience 공정에서 분류된 MSW 내 병원균들의 존재를 제거할 것이다. pH, aw, 산소 내성, CO2, NaCl, 및 NaNO2와 같은 다른 요인들 또한 바이오리퀴드 내 병원성 박테리아의 성장에 영향을 미친다. 상기 언급한 요인들 간의 상호작용은 공정 동안 살아있는 세포들의 양을 감소시키기 위하여 필요한 시간 및 온도를 낮출지도 모른다.
실험예 7. 먼 지리적 위치로부터 수득된 분류되지 않은 MSW의 동시의 미생물 발효 및 효소 가수분해를 이용한 유기 포획의 자세한 분석.
실험예 3에 기재된 REnescience 시범 시설이 네덜란드로부터 수입된 MSW를 가공하는데 사용되었다. MSW는 하기 조성물을 갖는 것으로 찾아졌다:
표 Y. 반(van) 그란스빙켈(Gansewinkel) 테스트 동안 총, 에코넷(Econet)에 의하여 분석된 폐기물 조성물(5)
Figure pct00010

물질은 실험예 3 및 5에 기재된 바와 같이 동시의 효소 가수분해 and 미생물 발효이 가해졌고, 3일의 시설 운영(run)을 위하여 테스트되었다. 다양한 시간 포인트들에서 수득된 바이오리퀴드의 샘플들이 수득되었고 특성분석되었다. 결과들은 표 3에 나타나 있다.
표 3. 바이오리퀴드의 분석.
Figure pct00011

실험예 8. 분류되지 않은 MSW의 동시의 미생물 발효 및 효소 가수분해로부터 수득되는 바이오리퀴드를 이용한 바이오메탄 생산.
실험예 5에 기재된 실험에서 수득된 바이오리퀴드는 20 리터 양동이에서 동결되었고, 후에 사용되기 위하여 -18 ℃에서 저장되었다. 이 물질은, 필터 지지대(suppor) 상에 고정화된 바이오필름 내 혐기성 소화 컨소시엄(consortium)을 포함하는, 두 개의 동일한 잘 준비된 고정된 필터 혐기성(anaerboic) 소화 시스템을 이용하여 바이오메탄 생산을 위하여 테스트되었다.
초기 샘플들이 원료(feed) 및 반응기 내 액체 모두에 대하여 수집되었다. VFA, tCOD, sCOD, 및 암모니아 농도들이 DR 2800 분광 광도계(Spectrophotometer)로 HACH LANGE 큐벳(cuvette) 테스트들을 이용하여 결정되었고, 자세한 VFA들이 HPLC에 의하여 매일 결정되었다. TSVS 수치들(measurements) 또한 Gravimetric 방법에 의하여 결정된다.
GC 분석을 위하여 가스 샘플들이 매일 취해진다. 원료(feed) 속도(rate)의 검사(Verification)는 원료 탱크 내 공간부분(headspace) 부피 및, 또한 반응기 밖으로 나가는 폐수(effluent)의 양을 측정함으로서 수행된다. 공정 동안 샘플 채취는 액체 또는 폐수의 흡입기(syringe)로 수집함으로써 수행되었다.
안정적 바이오가스 생산은 0.27 및 0.32 L/g COD 사이, 또는 R 및 Z L/g VS 사이에 상응하는 10 주간의 기간 동안 침지기(digester) 시스템들 양쪽 모두를 이용하여 관찰되었다.
바이오리퀴드의 원료는 그 다음에 두 개 시스템 중 하나 상에서 중단되며(discontinued) 그리고 도 9에 나타낸 바와 같이, 모니터링되는 기초 선(baseline)으로 돌아간다. 안정적인 가스 생산 레벨은 2로 나타낸 수평선에 의하여 보여진다. 원료가 중단된 시간 포인트는 3으로 표시된 수직선들로 나타낸다. 보여지는 바와 같이, 안정적인 운용 몇 달 후, 3 및 4로 표시된 수직선들 사이에 표시된 기간 동안 전환된 잔여 탄성(resilient) 물질이 남아 있다. 기초선으로 돌아가는 것 또는 "감소(ramp down)"은 4로 표시된 수직선 후 기간에 보여진다. 기초선 기간 후, 원료(feed)는 1로 표시된 수직선에 의하여 표시된 포인트에서 다시 시작된다. 안정된(steady) 상태 가스 생산으로의 상승(rise) 또는 "증가(ramp up)"은 1로 표시된 수직선 뒤 기간에 나타나 있다.
기재된 바와 같이 측정된 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)"를 포함하는, 바이오리퀴드로부터의 가스 생산의 파라미터들(Parameters)이 하기에 나와 있다.
Figure pct00012
*증가(ramp-up) 시간은 첫 번째 원료(feed)로부터 가스 생산이 증가를 포착하고(seize) 안정화될 때까지 시간이다. 증가(ramp-up) 시간은 원료 내 쉽게 전환가능한 유기물들(organics)의 레벨을 가리킨다.
**감소(Ramp-down) 시간은 마지막 원료로부터 가스 생산이 급격히 떨어지는 것을 포착할 때까지의 시간이다. 감소(Ramp-down) 시간은 쉽게 전환가능한 유기물들(organics)로부터 가스 생산을 보여준다.
***태워버림(burn-down)은 감소(Ramp-down) 시간 후 가스 생산이 완전히 바닥(base) 레벨에 포착될 때까지의 시간이다. 태워버림(burn-down) 시간은 천천히 전환가능한 유기물들로부터의 가스 생산을 보여준다.
*** 2 L/일(day)의 배경(background) 가스 생산의 수정.
실험예 9. 동시의 미생물 발효와 함께 또는 없이, 분류되지 않은 MSW의 효소 가수분해로부터 수득되는 바이오리퀴드를 이용한 비교를 통한 바이오메탄 생산.
실험예 2로부터 수득된 "높은(high) 락테이트(lactate)" 및 "낮은(low) 락테이트" 바이오리퀴드가 실험예 8에 기재된 고정된 필터 혐기성 소화 시스템들을 이용하여 바이오메탄 생산을 비교하였다. 수치들(Measurements)이 수득되었고 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)" 시간이 실험예 8에 기재된 바와 같이 결정되었다.
도 10은 "높은 락테이트" 바이오리퀴드의 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)" 특성분석(characterization)을 보여준다. 안정적 가스 생산 레벨은 2로 표시된 수평선에 의하여 나타내어진다. 원료가 시작되는 시간 포인트는 1로 표시되는 수직선에서 보여진다. 안정적 가스 생산으로의 상승(rise) 또는 "증가(ramp up)" 는 1로 표시된 수직선 후 기간에 보여진다. 원료가 중단(discontinued)되는 시간 포인트는 3으로 표시되는 수직선에서 보여진다. 기초선(baseline)으로 돌아가는 것 또는 "감소(ramp down)"는 4로 표시되는 수직선에서의 기간에 대하여 3으로 표시되는 수직선 후 기간에 나타낸다.
도 11은 도 11에 기재된 대로 표시된 관련된 포인트들에서, "낮은 락테이트" 바이오리퀴드의 동일한 특성분석을 보여준다.
기재된 바와 같이 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)"를 포함하는 "높은 락테이트" 및 "낮은 락테이트" 바이오리퀴드로부터 가스 생산의 비교되는 파라미터들이 하기에 나타내어진다.
"증가(ramp up)"/"감소(ramp down)" 시간들의 차이는 생분해성의 용이성의 차이를 보여준다. 가장 빠른 생물 전환성(bioconvertible) 바이오매스들은 결국 바이오가스 생산 적용에 있어 가장 높은 총 유기 전환 속도를 가질 것이다. 게다가, "더 빠른" 바이오메탄 기질들은 고정된 필터 침지기들(digesters)과 같은 매우 빠른 혐기성 소화 시스템들에 의하여 더욱 이상적으로 전환에 적합하다.
보여지는 바와 같이, "높은 락테이트" 바이오리퀴드는 바이오메탄 생산에 있어, 훨씬 더 빠른 "증가(ramp up)" 및 "감소(ramp down)" 시간을 보인다.
Figure pct00013
*증가(ramp-up) 시간은 첫 번째 원료로부터 가스 생산이 증가하는 것이 포착되고 안정화되기까지의 시간이다. 증가(ramp-up) 시간은 원료 내 쉬운 전환가능한 유기물들의 레벨을 가리킨다.
**감소(Ramp-down) 시간은 마지막 원료부터 가스 생산이 급격히 떨어지는 때까지의 시간이다. 감소(Ramp-down) 시간은 쉽게 전환가능한 유기물들로부터 가스 생산을 보여준다.
***태워버림(Burn-down)은 감소(Ramp-down) 시간 후 가스 생산이 완전히 바닥 레벨에서 포착되는 때까지의 시간이다. 태워버림(burn-down) 시간은 천천히 전환가능한 유기물로부터의 가스 생산을 보여준다.
***2 L/일(day)의 배경(background) 가스 생산의 수정(corrected).
실험예 11. 열수에 의하여 전처리된 밀짚의 동시의 미생물 발효 및 효소 가수분해로부터 수득된 바이오리퀴드를 이용한 바이오메탄 생산.
밀짚은 전처리되고, 섬유 부분(fraction) 및 액체 부분으로 분리되고, 그 다음에 섬유(fiber) 부분이 분리되어 세척되었다. 5 kg의 세척된 섬유가 그 다음에 실험예 3으로부터 수득된 바이오리퀴드(biov∞ske)로 구성되는 발효되는(fermenting) 미생물들의 접종원(inoculum)으로 Cellic CTEC3의 용량으로 수평(horizontal) 회전식(rotary) 드럼(drum) 반응기 내에서 배양되었다. 밀짚(wheat straw)는 50 도에서 3일 동안 동시의 가수분해 및 미생물 발효에 가해졌다.
바이오리퀴드는 그 다음에 실험예 8에서 기재된 고정된 필터 혐기성 소화 시스템을 이용하여 바이오메탄 생산이 평가되었다. 수치들(Measurements)이 실험예 8에 기재된 바와 같이 "증가(ramp up)" 시간 동안 수득되었다.
도 12는 가수분해된 밀짚(wheat straw) 바이오리퀴드의 "증가(ramp up)" 특성분석을 보여준다. 안정적 가스 생산 레벨은 2로 표시된 수평선에 의하여 나타내어진다. 원료가 시작되는(initiated) 시간 포인트는 1로 표시되는 수직선에서 보여진다. 안정적 상태 가스 생산으로의 상승(rise) 또는 "증가(ramp up)"는 1로 표시되는 수직선 후 기간에 보여진다.
밀짚(wheat straw) 가수분해물 바이오리퀴드로부터의 가스 생산의 파라미터들은 하기에 보여진다.
보여지는 바와 같이, 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스는 또한 바이오가스 생산 방법들을 실시하기 위하여 그리고 본 발명의 신규 바이오메탄 기질들을 생산하기 위하여 쉽게 이용될 수 있다.
Figure pct00014

*증가(ramp-up) 시간은 첫 번째 원료로부터 가스 생산이 증가하는 것이 포착되고 안정화될 때까지의 시간이다. 증가(ramp-up) 시간은 원료 내 쉽게 전환가능한 유기물들의 레벨을 가리킨다.
**감소(Ramp-down) 시간은 마지막 원료공급(feed)로부터 가스 생산이 급격히 떨어지는 것이 포착될 때까지의 시간이다. 감소(Ramp-down) 시간은 쉽게 전환가능한 유기물들로부터 가스 생산을 보여준다.
***태워버림(Burn-down)은 감소(Ramp-down) 시간 후 가스 생산이 바닥 레벨에서 완전히 포착될 때까지의 시간이다. 태워버림(burn-down) 시간은 천천히 전환가능한 유기물들로부터 가스 생산을 보여준다.
***2 L/일(day)의 배경 가스 생산의 수정.
실험예 12. 선택된 생물들을 이용한 MSW의 동시의 미생물 발효 및 효소 가수분해.
특정, 단일배양(monoculture) 박테리아를 이용한 동시의 미생물 및 효소 가수분해 반응들은 (실험예 1에 기재된 대로) 모델 MSW 및 실험예 1의 절차를 따라 기재된 절차를 이용하여 실험실 규모로 수행되었다. 반응 조건들 및 효소 용량은 표 4에 특정되어 있다.
락토바실러스(Lactobaccillus) 아밀로필레스(amylophiles) (DSMZ No. 20533) 및 (사용될 때까지 16시간 동안 4 ℃에서 보관된) 프로피오니박테리움(propionibacterium) 액시디프로피오니치(acidipropionici)(DSMZ No. 20272) (DSMZ, Braunsweig, Germany)의 살아 있는 균주들이 CTec3의 첨가와 함께 또는 없이, 모델 MSW 내 건조물의 전환에 대한 이들의 영향을 결정하기 위하여 접종원(inoculum)으로 사용되었다. 이것들에 의하여 생산된 주요 메타볼라이트들은 각각 젖산 및 프로피오닉(propionic)산이다. 이들 메타볼라이트들의 농도가 (실험예 1에 기재된) HPLC 절차를 이용하여 검출되었다.
프로피오니박테리움(propionibacterium) 액시디프로피오니치(acidipropionici)가 혐기성 미생물이기 때문에, 이 균주가 적용된 반응들에 적용된 버퍼는 질소가스(gaseous nitrogen)를 이용하여 제거(purge)되었고, 살아있는 배양물은 이동식(mobile) 혐기성 챔버 내 반응 튜브들로 접종되고(Atmos Bag, Sigma Chemical CO, St. Louis, MO, US) 또한 질소가스로 제거(purged)되었다. P. 프로피오니치(propionici)를 갖는 반응 튜브들은 배양기로 이동되기 전에 닫혀졌다. 반응들은 1 ml의 P. 프로피오니치(propionici) 또는 L. 아밀로필루스(amylophilus)로 접종되었다.
표 4에 나타난 결과들은 예상되는 메타볼라이트들이 생산된 것을 보여준다; p. 액시도프로피오닉(acidipropionic)이 접종된 반응들에서 프로피온산이 검출된 반면, CTec3과 함께 또는 없이, 모델 MSW을 포함하는 대조군 내에서는 프로피온산이 검출되지 않았다. 모델 MSW만이 첨가된 대조군 반응에서는 젖산 농도가 거의 L. 아밀로필루스(amylophilus)만이 첨가된 반응들에서와 동일하였다. 대조군 반응 내 젖산의 생산은 모델 MSW에 고유한(indigenous) 박테리아에 기인한다. 일부(Somce) 배경 박테리아가 예상되는데 왜냐하면 모델 폐기물의 개별적인 성분들이 신선한 산물, 동결되었으나, 모델 MSW의 준비 전 임의의 방법으로 더 살균되지 않았기 때문이다. L. 아밀로필루스(amylophilus)가 CTec3와 동시에 첨가될 때, 젖산의 농도는 거의 두 배가 된다(표 4).
가수분해 후 상청액으로 DM의 방출(release)에 대한 긍정적 효과는 CTec3와 함께 L. 아밀로필루스(amylophilus) 또는 P. 프로피오니치(propionici)가 첨가된 반응들에서 더 높은 DM 전환이 입증되었다(CTec3만이 첨가된 반응에 비교할 때 30-33% 증가).
표 4. 단독으로 또는 효소 가수분해와 동시에 실험실 규모로 테스트된 박테리아 배양들. 온도, pH 및 CTec3 용량 96mg/g이 보여진다. CTec3와 함께 또는 없이 버퍼 내 MSW로의 대조군 반응들은 반응 내 박테리아 메타볼라이트들의 배경(background)을 평가하기 위하여 동시에(in parallel) 이루어졌다.(4 반응들의 평균 및 표준 편차가 하나로(as singles) 수행된 MSW 대조군을 제외하고 보여진다).
Nd. 검출되지 않음, 검출 한계 미만.
Figure pct00015

실험예 13. 실험예 7의 동시 발효에 기여하는 미생물들의 확인.
바이오리퀴드 "EC12B" 및 재순환된 물 "EA02"의 샘플들이 실험예 7에 기재된 테스트 동안 취해졌다(표본 수집은 3월 21일 및 22일에 이루어졌다). 액체 샘플들은 10% 글리세롤에서 동결되었고, 미생물들을 확인하기 위하여, 작은 라이보좀 소단위체의 16S 성분에 기초한 원핵생물들의 확인 및 계통 분석에 널리 사용되는, 16S rDNA 분석을 수행할 목적으로 -20 ℃에서 보관되었다. 동결된 샘플들은 16S rDNA 분석이 수행되는 GATC Biotech AB, Solna, SE 로 드라이아이스 상으로 수송되었다(GATC_Biotech). 분석은 하기를 포함한다:
게놈 DNA의 추출, 초가변(hypervariable) 영역들 V1 내지 V3 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG / 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG; 507 bp 길이)에 걸치는 보편적인(universal) 프라이머들 프라이머 쌍을 이용한 앰플리콘(amplicon) 라이브러리 준비, GS FLX 어댑터들(adaptors)을 갖는 PCR 태깅들(tagging), 104.000- 160.000 수의 리드들(reads) pr. 샘플을 수득하기 위한 게놈(Genome) 시퀀서(Sequencer) FLX 장치 상 시퀀싱(sequencing). 그 결과인 서열들은 그 다음에 Ribosomal Database Project로부터 rDNA 데이터베이스에 대비하여(against) BlastN에서 쿼리되었다(queried)(Cole et al., 2009). 데이터베이스는 적어도 1200bp 길이의 좋은 질의 서열들 및 NCBI 분류상(taxonomic) 연계(association)를 포함한다. 현재의 방출(2012년 9월 19일 업데이트된, RDP 방출(Release) 10)은 9,162 박테리아 및 375 고세균(archaeal) 서열들을 포함한다. BLAST 결과들은 짧고 낮은 질 히트(hits)들을 제거하기 위하여 여과되었다(서열 동일성(identity) ≥ 90%, 정렬(alignment) 범위(coverage) ≥90%).
EC12B-21/3, EC12B-22/3 및 EA02B 21/3, EA02-22/3 샘플들에서, 총 452, 310, 785, 594 개의 다른 박테리아들이 확인되었다.
분석은, 종 레벨에서, 락토바실러스(Lactobacillus) 아밀로리티쿠스(amylolyticus)가 확실히 검출된 전체 미생물군(microbiota)의 26% 내지 48%를 차지하는 가장 우세한 박테리아였다는 것을 명확히 보여주었다.
EC12B 샘플들 내 미생물군(microbiota)은 유사하였다; 13개의 우세한 박테리아의 분포(락토바실러스(Lactobacillus) 아밀로리티쿠스(amylolyticus DSM 11664, 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) 아종(subsp.) 델브루엑키(delbrueckii), 락토바실러스(Lactobacillus) 아밀로보러스(amylovorus), 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) subsp 인디쿠스(indicus), 락토바실러스(Lactobacillus) 시밀리시(similis) JCM 2765, 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) 아종(subsp.) 락티스(Lactis) DSM 20072, 바실러스(Bacillus) 코아굴란스(coagulans), 락토바실러스(Lactobacillus) 햄스테리(hamsteri), 락토바실러스(Lactobacillus) 파라부츠네리(parabuchneri), 락토바실러스(Lactobacillus) 플란타룸(plantarum), 락토바실러스(Lactobacillus) 브레비스(brevis), 락토바실러스(Lactobacillus) 폰티스(pontis), 락토바실러스(Lactobacillus) 부츠네리(buchneri))가 두 개의 서로 다른 표본추출(sampling) 날짜를 비교하여 사실상 동일하였다.
L. 아밀로리티쿠스(amylolyticus)가 덜 우세한 것에도 불구하고, EA02 샘플들은 EC12B와 유사하였다. 13개의 우세한 박테리아의 분포((Lactobacillus 아밀로리티쿠스(amylolyticus) DSM 11664, 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) 아종(subsp) 델브루엑키(delbrueckii), 락토바실러스(Lactobacillus) 아밀로보러스(amylovorus), 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) 아종(subsp.) 락티스(Lactis) DSM 20072, 락토바실러스(Lactobacillus) 시밀리시(similis) JCM 2765, 락토바실러스(Lactobacillus) 델브루엑키(delbrueckii) 아종(subsp.) 인디쿠스(indicus), 락토바실러스(Lactobacillus) 파라플란타룸(paraplantarum), 와이셀라(Weissella) 가넨시스(ghanensis), 락토바실러스(Lactobacillus) 올리고퍼멘탄스(oligofermentans) LMG 22743, 와이셀라(Weissella) 베니넨시스(beninensis), 류코노스톡(Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811, 와이셀라(Weissella) soli, 락토바실러스(Lactobacillus) 파라플란타룸(paraplantarum)) 또한 13개의 우세한 박테리아 종들 내 슈도모나스(Pseudomonas) 엑스트레마우스트랄리스(extremaustralis) 14-3 의 발생의 제외의 존재를 제외하고 유사하였다. EA02 (21/3)에서 발견된 이 슈도모나스(Pseudomonas)는 이전에 남극대륙의 일시적인 연못으로부터 분리된 바 있으며, 옥타노에이트(octanoate) 및 글루코스 모두로부터 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate)(PHA)를 생산할 수 있어야 한다(Lopez et al. 2009; Tribelli et al., 2012).
속(genus) 레벨에서의 결과들을 비교하는 것은 락토바실러스(lactobacillus)가 샘플들 내에서 확인된 박테리아들의 56-94 %를 차지한다는 것을 보여주었다. 다시 모든 속(genera)에 걸친 분포가 EC12B 및 EA02의 두 개의 표본추출 날짜들 간에 극히 유사하다. 흥미롭게도, EA02 샘플들에서, 와이셀라(Weisella), 류코노스톡(Leuconostoc) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속들이 큰 규모로 존재하는데(1.7-22%), 반면 이것들은 EC12B 샘플에서는 적은 성분들로만 발견된다(>0.1%). 와이셀라(Weisella) 및 류코노스톡(Leuconostoc) 모두 락토바실러스목(lactobacillales) 목에 속하는데, 이는 락토바실러스와 같다.
실험예 7에 기재된 테스트 동안 표본추출된 EC12B 및 EA02 내 우세한 병원성 박테리아는 확인된 총 박테리아의 각각 0.281-0.539% 및 0.522-0.592%을 차지하였다. EC12B 샘플들 내 우세한 병원성 박테리아들은 아에로모나스(Aeromonas) spp., 바실러스(Bacillus) 세레우스(cereus), 브루셀라(Brucella) sp., 시트로박터(Citrobacter) spp., 클로스트리디움(Clostridium) 퍼프리겐스(perfrigens), 클렙시엘라(Klebsiells) sp., 프로테우스(Proteus) sp., Providencia sp., 살모넬라(Salmonella) spp., 세라티아(Serratia) sp., 쉬겔래(Shigellae) spp. and 스타필로코커스(Staphylococcus) 아우레우스(aureus)였다. 포자(spore)를 형성하는 병원성 박테리아는 실험예 7에 기재된 EC12B 및 EA02에서 확인되지 않았다. EC12B 및 EA02 모두에서 확인된 병원균 박테리아의 총 양은, 하루 EC12B 내 총 박테리아의 양을 거의 일축시킬 정도로(dismissing), 시간 동안 감소되었다.
Deportes et al. (1998)에서, MSW 내 존재하는 것으로 아는 병원균들의 개요가 만들어졌다. 실험예 3, 5 및 7에서 기재된 MSW 내 존재하는 병원균들은 표 5에 나타나 있다(Deportes et al. (1998) 및 16S rDNA 분석). Deportes et al. (1998)에 기재된 병원균들에 추가하여, 프로테우아(Proteua) sp. 및 프로비덴시아(Providencia) sp.가 양쪽 모두 실험예 7에서 기재된 테스트 동안 표본추출된 EC12B 및 EA02에서 발견되었다. 반면, 실험예 5의 바이오리퀴드 내 존재하는 유일한 병원성 박테리아인 스트렙토코커스(Streptococcus) spp.는 여기에 존재하지 않았다. 이는 실험예 7의 EC12B 및 EA02에 또다른 박테리아 군집(community)이 존재한다는 것을 가리키는데, 이는 영양분을 위한 생물들 간의 경쟁 및 또다른 박테리아 군집의 성장에 조력하는 공정 동안 온도의 약간의 감소 때문일 수 있다.
표 5. 실험예들 3, 5 및 7 내 존재하는 병원균들의 개요.
Figure pct00016

균주 확인 및 DSMZ 기탁들( deposits )
실험예 7에 기재된 테스트로부터 회수된 3월 21 및 22일의 EA02 샘플들은, 분리된 박테리아의 단일배양(monocultures)을 수득 및 확인 목적으로 Novo Nordic Centre for Biosustainability (NN 센터)(Hoersholm, Denmark)의 플레이팅(plating)으로 보내졌다. NN 센터에 도착하자마자, 샘플들은 밤새 50 ℃에서 배양되었고, 그 다음에 서로 다른 플레이트들 상으로 플레이팅(plate)되었고(GM17, 트립신(tryptic) 콩(soy) 브로쓰(broth), 및 소고기(beef) 추출물 (GM17 한천: 48.25g/L m17 한천, 20 분 후. 0.5%, 트립신(Tryptic) 콩(soy) 한천에서 최종 농도까지 글루코스 첨가된 오토클레이브: 30g/L 트립신(Tryptic) 콩 브로쓰, 15g/L 한천, 15 g/l 아가로스(agarose) 첨가된 소고기 브로쓰 (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark)), 50 ℃에서 호기성으로 성장하였다.
1일 후, 플레이트들이 시각적으로(visually) 검사되었고 선택된 콜로니들이 대응하는 플레이트들 상에서 다시 스트리킹(streaked)되었고, 확인을 위하여 DSMZ로 보내졌다.
EA02로부터 재순환된 물로부터 분리된 하기 균주들은 DMSZ, DSMZ, Braunsweig,독일에 특허 기탁되었다:
확인된 샘플들
샘플 ID: 13-349 (바실러스(Bacillus) 사펜시스(safensis)), (EA02-21/3), DSM 27312 유래
샘플 ID: 13-352 (브레비바실러스(Brevibacillus) 브레비스(brevis)), (EA02-22/3), DSM 27314 유래
샘플 ID: 13-353 (바실러스(Bacillus) 서브틸리스(subtilis) sp. 서브틸리스(subtilis)), (EA02-22/3), DSM 27315 유래
샘플 ID: 13-355 (바실러스(Bacillus) 리체니포르미스(licheniformis)), (EA02-21/3), DSM 27316 유래
샘플 ID: 13-357 (액티노미세스(Actinomyces) 보비스(bovis)), (EA02-22/3), DSM 27317 유래
확인되지 않은 샘플들
샘플 ID: 13-351, (EA02-22/3), DSM 27313 유래
샘플 ID: 13-362A, (EA02-22/3), DSM 27318 유래
샘플 ID: 13-365, (EA02-22/3), DSM 27319 유래
샘플 ID: 13-367, (EA02-22/3), DSM 27320 유래
참고문헌들:
Cole, J. R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R. J., & Tiedje, J. M. (2009). The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic acids research, 37 (suppl 1), (D141-D145).
GATC_Biotech supporting material. Defining the Microbial Composition of Environmental Samples Using Next Generation Sequencing. Version 1.
Tribelli, P. M., Iustman, L. J. R., Catone, M. V., Di Martino, C., Reyale, S., Mendez, B. S., Lopez, N. I. (2012). Genome Sequence of the Polyhydroxybutyrate Producer 슈도모나스(Pseudomonas) extremaustralis, a Highly Stress-Resistant Antarctic Bacterium. J. Bacteriol. 194(9):2381.
Nancy I. Lopez, N. I., Pettinari, J. M., Stackebrandt, E., Paula M. Tribelli, P. M., Potter, M., Steinbuchel, A., Mendez, B. S. (2009). 슈도모나스(Pseudomonas) 엑스트레마우스트랄리스(extremaustralis) sp. nov., a Poly(3-hydroxybutyrate) Producer Isolated from an Antarctic Environment. Cur. Microbiol. 59(5):514-519.
예들 및 실험예들은 대표적인 것들일 뿐이며 청구항들의 범위를 한정하려는 의도가 아니다.
<110> Renescience A/S <120> Methods and compositions for biomethane production <130> 49906PC02 <160> 2 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <220> <221> source <222> (1)..(20) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16S rDNA hypervariable region V1 primer 27F" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <220> <221> source <222> (1)..(17) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16S rDNA hypervariable region V3 primer 534R" /organism="Artificial Sequence" <400> 2 attaccgcgg ctgctgg 17

Claims (11)

  1. 하기 단계들을 포함하는 바이오메탄 생산 방법
    (i) 비-수분 함량의 적어도 40 중량%(% by weight)가 용해된 휘발성 고형물들로서 존재하도록 미생물 발효에 의하여 전-컨디셔닝된(pre-conditioned) 유기 액체 바이오메탄 기질을 제공하는 단계로, 용해된 휘발성 고형물들이 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량%(% by weight) 포함하는 단계,
    (ii) 혐기성 소화 시스템으로 액체 기질을 옮기는 단계, 뒤이어
    (iii) 액체 기질의 혐기성 소화를 수행하여 바이오메탄을 생산하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 미생물 발효는 pH 5.5 미만(beneath)의 조건 하 수행되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 유기 액체 바이오메탄 기질은 분류되지 않은 MSW의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유기 액체 바이오메탄 기질은 전처리된 리그노셀룰로스(lignocellulosic) 바이오매스의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유기 액체 바이오메탄 기질은 오토클레이브 공정에 의하여 분류되지 않은 MSW로부터 수득된 액화된 유기 물질의 동시의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 유기 액체 바이오메탄 기질은 적어도 8% 총 고형물들을 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 혐기성(anaerobi) 소화(digestion) 시스템은 고정된(fixe) 필터 혐기성 침지기(digester)인 방법.
  8. 하기로 특징되는 전처리된 리그노셀룰로스 바이오매스의 효소 가수분해 및 미생물 발효에 의하여 생산되는 유기 액체 바이오메탄 기질
    - 비-수분 함량의 적어도 40 중량%(% by weight)가 용해된 휘발성 고형물들로서 존재하고, 용해된 휘발성 고형물들이 적어도 아세테이트, 부티레이트, 에탄올, 포르메이트, 락테이트 및/또는 프로피오네이트의 임의의 조합을 적어도 25 중량%(% by weight)로 포함한다.
  9. 적어도 8%의 총 고형물들 함량을 갖는 제 7항의 액체 바이오메탄 기질.
  10. 15 mg/L 미만의 섭씨 25도에서 용해된 메탄 함량을 갖는 제 7항의 액체 바이오메탄 기질.
  11. 적어도 10%의 총 고형물들 함량을 갖는 제 7항의 액체 바이오메탄 기질.
KR1020157000658A 2012-06-12 2013-06-12 바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들 KR20150028812A (ko)

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