JP5149785B2 - エタノールを得るためのバイオマスの処理 - Google Patents

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関連出願の相互参照

本出願は、２００５年４月１２日出願の米国仮特許出願第６０／６７０４３７号明細書の優先権を主張するものである。

政府の権利に関する声明
本発明は、エネルギー省によって授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４の下で米国政府後援でなされたものであった。政府は本発明における特定の権利を有する。

バイオマス処理から誘導される発酵性糖を用いてエタノールを生成する方法が提供される。詳細には、高固体濃度および低アンモニア濃度の条件下でのバイオマスの前処理、それに続く糖化によって得られる糖類が、生体触媒を生成するエタノールによる発酵において用いられる。

農業残渣、木材廃棄物、林業廃棄物、製紙汚泥、および都市および産業固体廃棄物などのセルロース系およびリグノセルロース系の供給原料および廃棄物は、化学物質、プラスチックス、燃料および飼料の生成を目的とした潜在的に大きいリサイクル可能供給原料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、グルカンおよびリグニンを含んでなる炭水化物ポリマーよりなる、セルロース系およびリグノセルロース系の供給原料および廃棄物は、一般に種々の化学的、機械的および酵素的手段によって処理されることで主にヘキソースおよびペントース糖が放出され、次いで有用な生成物に発酵されうる。

前処理方法を用いることで、糖化酵素に対してより容易に利用できるセルロース系およびリグノセルロース系材料の炭水化物ポリマーが作られる。歴史的に標準の前処理方法では、主に強酸が高温で用いられてきたが、高いエネルギーコスト、高い機器コスト、高い前処理用触媒のリサイクルコストおよび糖化酵素との不適合性が原因で、酵素による前処理、あるいは前処理の間にバイオマスの炭水化物ポリマーの加水分解の低下が生じる場合におけるより低温での酸または塩基の使用などの代わりの方法が開発されつつあり、これらにはセルロースとヘミセルロースの双方を糖化するための改善された酵素系が必要である。

塩基を用いる多数の前処理方法が提案されている。非特許文献１は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を用いる、リグノセルロース系バイオマスを対象とする前処理方法を開示している。処理は、Ｈ_２Ｏ_２を基質に対して少なくとも０．２５ｗｔ／ｗｔの量で用いると最も効率的である。

非特許文献２は、極めて低いバイオマス濃度を有する水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムの化学量論的量を用いる一連のバイオマスの前処理について開示した。バイオマスの溶液比は１４：１である。

非特許文献３では、ＮａＯＨを用いるコーンストーバーの前処理について検討された。

非特許文献４は、コーンストーバーの前処理を目的とした大量の水性アンモニアの使用について報告している。

特許出願の特許文献１では、リグノセルロースを、温度、圧力およびｐＨの適度な条件下で約９〜約１４のｐＨで炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの塩基でありうる化学物質と接触させることを含んでなる、リグノセルロースを加水分解するための方法が検討されている。

特許文献２および特許文献３は前処理プロセスについて記載したものであり、ここでは非澱粉多糖（ＡＸ／ＮＳＰ）全体に対するアラビノキシランの特定比率が評価され、供給原料を選択するために用いられている。

国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレット 米国特許第５，９１６，７８０号明細書 米国特許第６，０９０，５９５号明細書 ゴウルド（Ｇｏｕｌｄ）（Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｒ．（１９８４年）２６：４６−５２頁） テイキセイラ Ｌ．（Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｌ．）ら（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９年）７７−７９：１９−３４頁） エルシャフェイ Ａ．（Ｅｌｓｈａｆｅｉ Ａ．）ら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ．（１９９１年）３５：７３−８０頁） キム Ｔ．（Ｋｉｍ Ｔ．）およびＹ．リー（Ｙ．Ｌｅｅ）（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５年）９６：２００７−２０１３頁）

リサイクル可能資源バイオマスから燃料を生成するための商用プロセスには、経済的に競争力のあるプロセスであるように、少量の化学物質を使用して高収率の糖類を高濃度で提供し、燃料を生成する生体触媒によって用いられる低毒性を有する発酵性糖のソースを生成するのに、リグノセルロース系バイオマス中での炭水化物の加水分解が必要とされる。

本発明は、バイオマスを使用する、エタノールの生成方法を提供する。本発明のプロセスは、バイオマスの乾燥重量に対して低濃度のアンモニアを用いる、バイオマスの比較的高濃度での前処理を含む。バイオマスは、前処理後、糖化酵素コンソーシアムで処理されることで発酵性糖が生成される。次いで、糖類は、糖類を発酵させかつエタノールを生成することが可能な生体触媒と接触される。本発明の一実施形態では、本方法は、
ａ）バイオマスをアンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、ここで、アンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、該アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１２重量パーセント未満で存在し、さらにバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約１５重量パーセントの高固体濃度にあり、
ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、発酵性糖を生成せしめるのに適切な条件下で糖化酵素コンソーシアムと接触させ、
ｃ）適切な発酵条件下でステップｂ）の生成物を適切な生体触媒と接触させてエタノールを生成せしめる、
ことを含んでなる。

出願人らは、本開示中にすべての引用文献の内容全体を具体的に援用する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが、ある範囲、好ましい範囲、またはより高い好ましい値とより低い好ましい値のリストとして与えられる場合、これは、任意のより高い範囲限界または好ましい値と任意のより低い範囲限界または好ましい値との任意のペアから形成されるあらゆる範囲を、範囲が別々に開示されるか否かにかかわりなく具体的に開示するものとして理解されるべきである。本明細書中で数値の範囲が挙げられる場合、特に指定のない限り、同範囲は、その端点、ならびに範囲内のすべての整数および分数を含むように意図されている。本発明の範囲が範囲を規定する場合に挙げられる特定の値に限定されるようには意図されていない。

本発明は、以下の様式でバイオマスを利用するエタノールの生成方法を提供する。すなわち、糖類がバイオマスから誘導され、次いでエタノールをそれらの代謝産物の生成物として作製することが可能な微生物の成長のための炭素源として使用される。糖類は、バイオマスを比較的高濃度でバイオマスの乾燥重量に対して比較的低濃度のアンモニアで前処理することにより、バイオマスから放出される。次いで、アンモニアで処理されたバイオマスは、糖化酵素コンソーシアムで消化されて発酵性糖を生成する。糖類は、エタノール（エタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ））を生成可能な微生物の成長または生体触媒のための発酵基質として使用される。

定義
本開示では多数の用語が用いられる。以下の定義が提供される。
「発酵可能な糖」という用語は、発酵プロセス中の微生物による炭素源として使用可能なオリゴ糖および単糖を示す。

「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を示す。リグノセルロース系材料は、ヘミセルロースを含んでなる場合もある。

「セルロース系」という用語は、セルロースを含んでなる組成物を示す。

バイオマスの「乾燥重量」は、すべてまたは本質的にすべての水分が除去されたバイオマスの重量を意味する。乾燥重量は、典型的にはアメリカン・ソサエティー・フォー・テスティング・アンド・マテリアルズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＡＳＴＭ）基準Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｓｏｌｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ）またはテクニカル・アソシエーション・オブ・ザ・パルプ・アンド・ペイパー・インダストリー（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．）（ＴＡＰＰＩ）基準Ｔ−４１２ ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｉｎ Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に従って測定される。

「バイオマスから誘導可能な」エタノールは、バイオマスが加水分解されて発酵性糖を放出し、かつ発酵性糖が少なくとも１つの生体触媒を用いて発酵されてエタノールを生成するというプロセスによって生成されるエタノールである。

「可塑剤」および「柔軟剤」という用語は、ポリマー鎖に沿ったまたはポリマー鎖間での結合分子間力において還元を誘発する物質を示す。かかる物質は、例えば、結晶化度を低減するか、またはリグニン炭水化物繊維と非リグニン炭水化物繊維（例えば、セルロースまたはヘミセルロース）の間の結合を破壊するように作用しうる。

「糖化」という用語は、多糖からの発酵性糖の生成を示す。

「発酵性糖を生成せしめるのに適切な条件」とは、ｐＨ、培地の組成物、および温度などの条件を示し、同条件下では糖化酵素は活性を示す。

「適切な発酵条件」は、生体触媒による成長およびエタノールの生成を支持する条件を示す。かかる条件は、ｐＨ、栄養および他の培地成分、温度、雰囲気、および他の因子を含みうる。

「前処理されたバイオマス」という用語は、糖化に先立ち前処理を受けているバイオマスを示す。

「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を示し、セルロースを含んでなる、かつ場合によりヘミセルロース、リグニン、澱粉、オリゴ糖および／または単糖をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加成分を含んでなる場合もある。本発明によると、バイオマスは単一のソースから誘導されうるか、またはバイオマスは２つ以上のソースから誘導される混合物を含んでなる可能性がある。すなわち、例えばバイオマスであれば、トウモロコシ穂軸とコーンストーバーの混合物、または草と葉の混合物を含んでなる可能性がある。バイオマスは、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙汚泥、工場廃棄物、木材および林業廃棄物を含むがこれらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮などの作物残渣、コーンストーバー、草、小麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、まぐさ、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花ならびに動物糞尿が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、本発明にとって有用なバイオマスは、比較的高い炭水化物値を有し、比較的密度が高く、かつ／または回収、運搬、保存および／または処理を行うのが比較的容易であるバイオマスを含む。本発明の一実施形態では、有用なバイオマスは、トウモロコシ穂軸、コーンストーバーおよびサトウキビバガスを含む。

本発明の目的のための「アンモニアを含んでなる水溶液」は、水性培地内でのアンモニアガス（ＮＨ_３）、水酸化アンモニウムまたはアンモニウムサルフェートなどのアンモニウムイオン（ＮＨ_４ ^＋）を含んでなる化合物、尿素など、分解時にアンモニアを放出する化合物、およびこれらの組み合わせの使用を示す。

本方法にて用いられるアンモニアの濃度は、最低でバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性のｐＨを維持するのに十分な濃度であり、かつバイオマスの乾燥重量に対して最大で約１２重量パーセント未満である。アンモニアのこの低濃度は前処理にとって十分であり、かつ低濃度はバイオマスの乾燥重量に対して約１０重量パーセント未満でありうる。バイオマスの乾燥重量に対して６パーセントもしくはそれ以下の極めて低濃度のアンモニアもまた前処理において使用されうる。アルカリ性は７．０より大きいｐＨを意味する。特に適切なのは、ｐＨが８より大きいバイオマス−水性アンモニア混合物である。一実施形態では、アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１０重量パーセント未満で存在する。特に適切なのは、バイオマスの乾燥重量に対して約６重量パーセント未満のアンモニアである。

本プロセスにて用いられるアンモニアは、他の塩基よりも利点をもたらす。アンモニアは液相および気相に分かれる。気体アンモニアは、バイオマスを通して液体塩基よりも容易に拡散可能であり、その結果、より低濃度でより有効な前処理が行われる。アンモニアは、バイオマス中のアセチルエステルのアンモノリシスを介する加水分解と競合することでアセトアミドを形成するものとして本明細書の実施例１０でも示される。（本明細書の実施例１１で示されるように）アセトアミドは、チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの、エタノールを生成する特定の発酵生物に対して酢酸塩よりも毒性が低い。それ故、酢酸ではなくアセトアミドへのアセチルエステルの変換により、酢酸を除去する必要性が低下する。アンモニアの使用により、発酵の間に使用される成長培地に窒素源を補充する必要性も低下する。さらに、アンモニアが低コストの材料であることから、経済的なプロセスが得られる。アンモニアはまた、前処理の間に前処理反応器へリサイクルされうるか、またはそれ故に前処理後により経済的なプロセスが実現される。例えば、前処理後、温度が糖化に適する温度まで低下する時、アンモニアガスが場合により真空の存在下で放出され、かつリサイクルされうる。連続プロセスでは、アンモニアは連続的にリサイクルされうる。

本方法によると、アンモニアを含んでなる水溶液は、場合により、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムなど、少なくとも１つの追加塩基を含んでなる場合がある。少なくとも１つの追加塩基がアンモニウムと結合される量で添加されることで、バイオマスの乾燥重量に対して約２０重量パーセント未満の量の塩基全体が形成されうる。好ましくは、アンモニアを加えた第２の塩基全体は、約１５重量パーセント未満の量で存在する。追加塩基が用いられることで、例えば、バイオマス中の酸が中和され、糖化酵素における金属イオン、または発酵用成長培地における金属イオンがもたらされうる。

本方法では、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物の重量の少なくとも約１５％〜最大約８０％の初期濃度にある。より適切には、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物の重量の約１５％〜約６０％の濃度にある。バイオマス−水性アンモニア混合物中のバイオマスの百分率は高く保持され、発酵における使用としての前処理されたバイオマスの糖化から得られる糖類の濃度に対する要求は最小限になる。さらにバイオマス濃度が高いと、前処理材料の総容量が低下し、プロセスがより経済的なものになる。

バイオマスはソースから得られたものとして直接使用されるか、あるいはエネルギーがバイオマスに適用されることで、サイズが減少し、暴露された表面積が大きくなり、かつ／または本方法の第２のステップで使用されるアンモニアおよび糖化酵素に対するバイオマス中に存在するセルロース、ヘミセルロース、および／もしくはオリゴ糖の可用性が高まる可能性がある。サイズを減少させ、暴露された表面積を大きくし、かつ／あるいはアンモニアおよび糖化酵素に対するバイオマス中に存在するセルロース、ヘミセルロース、および／またはオリゴ糖の可用性を高めるのに有用なエネルギー手段は、ミリング、クラッシング、粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニング（ｄｉｓｋ ｒｅｆｉｎｉｎｇ）、超音波、およびマイクロ波を含むがこれらに限定されない。このエネルギー適用は、前処理の前または間、糖化の前または間、あるいはこれらの任意の組み合わせにおいて行われうる。

任意の適切な容器内でアンモニア溶液を用いたバイオマスの前処理が行われる。典型的には、容器は、耐圧性を有し、加熱に対する機構を有し、かつ内容物を混合するための機構を有するものである。市販の容器として、例えば、ジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応器（オートクレーブ・エンジニアーズ（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）、エリー（Ｅｒｉｅ）、ペンシルバニア州）、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器（ジャイゴ・マニュファクチュアリング（Ｊａｙｇｏ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、マーワー（Ｍａｈｗａｈ）、ニュージャージー州）、およびスチームガン（ｓｔｅａｍ ｇｕｎ）反応器（「一般的方法」に記載；オートクレーブ・エンジニアーズ（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）、エリー（Ｅｒｉｅ）、ペンシルバニア州）が挙げられる。同様の性能を有するはるかに大型の反応器が使用される場合がある。あるいは、バイオマスおよびアンモニア溶液は、１つの容器内で複合され、次いで別の反応器に移される場合がある。またバイオマスは、１つの容器内で前処理され、次いでスチームガン反応器（「一般的方法」に記載；オートクレーブ・エンジニアーズ（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）、エリー（Ｅｒｉｅ）、ペンシルバニア州）などの別の反応器内でさらに処理される場合がある。

バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触に先立ち、バイオマスを含有する容器に真空が適用されうる。バイオマスの気孔から空気を排出することにより、アンモニアのバイオマスへのより良い浸透が行われうる。真空を適用するための時間およびバイオマスに適用される負圧量は、バイオマスのタイプに依存することになり、かつ（糖化後における発酵性糖の生成による測定として）バイオマスの最適な前処理を実現するように経験的に決定可能である。

バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触は、約４℃〜約２００℃の温度で行われる。４℃でのバイオマスとアンモニアとの初期の接触は、この温度での注入を可能にするものであり、前処理されていない未変性バイオマスの場合よりも糖化の効率を高めることが判明した。別の実施形態では、バイオマスの前記接触は約７５℃〜約１５０℃の温度で行われる。さらに別の実施形態では、バイオマスの前記接触は約９０℃より高く約１５０℃に至るまでの温度で行われる。

バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触は、最大約２５時間の期間で行われる。より長期間の前処理はあり得るが、実用的および経済的理由のため、より短期間が好ましい場合がある。典型的には、アンモニアの接触処理期間は約８時間もしくはそれ以内である。期間が長くなるとバイオマス分解のためにエネルギーを適用する必要性が低下するという利点が得られうることから、最大約２５時間の期間が好ましい場合がある。

一実施形態では、前処理プロセスは、比較的短期間で比較的高温、例えば約５分〜約２時間で約１００℃〜約１５０℃にて実施されうる。別の実施形態では、前処理プロセスは、比較的長期間でより低温、例えば約２時間〜約８時間で約７５℃〜約１００℃にて実施されうる。さらに別の実施形態では、前処理プロセスは、約２４時間よりもさらに長い期間で室温（約２２〜２６℃）にて実施されうる。これらに対して中間の他の温度および時間の組み合わせもまた用いられうる。

前処理プロセスにおいては、温度、前処理のための時間、アンモニア濃度、１つもしくはそれ以上の追加塩基の濃度、バイオマス濃度、バイオマスタイプおよびバイオマス粒度が保持され、このようにこれらの変数を必要に応じて調節することで、糖化酵素コンソーシアムと接触されるべき最適な生成物が得られる場合がある。

ポリオール（例えばグリセロール、エチレングリコール）、ポリオールのエステル（例えばグリセロールモノアセテート）、グリコールエーテル（例えばジエチレングリコール）、アセトアミド、エタノール、およびエタノールアミンなどの、可塑剤、柔軟剤、またはこれらの組み合わせが、前処理プロセス（すなわちステップ（ａ））にて添加されうる。可塑剤は、水性アンモニア溶液の成分、分離溶液、または乾燥成分として添加されうる。

前処理反応は、バッチ式反応器または連続反応器などの任意の適切な容器内で実施されうる。当業者であれば、より高温（１００℃超）では圧力容器が必要であると理解するであろう。適切な容器は、バイオマス−水性アンモニア混合物を撹拌するためのインペラーなどの手段を具備しうる。反応器の設計については、リン Ｋ．Ｈ．（Ｌｉｎ，Ｋ．Ｈ．）およびヴァン・ネス Ｈ．Ｃ．（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．）（ペリー Ｒ．Ｈ．（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｈ．）およびチルトン Ｃ．Ｈ．（Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．）（編）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ'ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第５版（１９７３年）、第４章、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク州）の中で検討されている。前処理反応は、バッチ式プロセスまたは連続プロセスとして実施されうる。

窒素源が発酵の間における微生物の成長に必要であり、それ故、前処理の間にアンモニアを用いることで、窒素源が提供され、かつ窒素源を伴う発酵の間に使用される成長培地を補充する必要性が低下するかまたはなくなることは当業者には周知である。もし前処理生成物のｐＨが糖化酵素の活性時でのｐＨより大きいかまたは発酵における微生物の成長に適する範囲を超える場合、酸を用いることでｐＨが低下しうる。所望のｐＨを得るのに用いられる酸の量により、糖化酵素または微生物の成長に対して阻害性を示す濃度での塩の形成がもたらされうる。所望のｐＨを得るのに必要な酸の量を減少させ、かつ本前処理プロセスにおけるＮＨ_３の原料コストを低減するため、アンモニアガスを前処理反応器から排出してリサイクルすることが可能である。典型的には、アンモニアの少なくとも一部が除去され、これによりｐＨが低下するが、それに続く発酵における使用においてこの栄養をもたらすいくらかの窒素が残存する。

バイオマスから十分な量の糖類を得るため、バイオマスは水性アンモニア溶液で１回もしくはそれ以上の回数にわたり前処理されうる。同様に、糖化反応を１回もしくはそれ以上の回数行ってもよい。もしより高い収率の糖類を得ることが望ましい場合、前処理プロセスと糖化プロセスの双方が繰り返されうる。前処理および糖化プロセスの性能を別々にまたは併せて評価するのに、初期のバイオマスから誘導可能な糖類の理論収率を判定し、かつ測定された収率と比較してもよい。

糖化
前処理後、生成物は、アンモニア、部分的に分解されたバイオマスおよび発酵性糖の混合物を含んでなる。さらなる加工に先立ち、アンモニアは、真空の適用により前処理されたバイオマスから除去されうる。アンモニアの除去によりｐＨが低下することから、より少ない中和酸を用いることで糖化および発酵における所望のｐＨを得る。これは前処理混合物における塩負荷の低下を招く。典型的には、一部のアンモニアが残存し、それは発酵における窒素源をもたらすのに望ましい。

次いで、前処理混合物を糖化酵素コンソーシアムの存在下でさらに加水分解することで、加水分解物中にオリゴ糖および／または単糖が放出される。糖化酵素およびバイオマス処理のための方法については、リンド Ｌ．Ｒ．（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７頁）中でレビューされている。１つの好ましい実施形態では、可溶性および不可溶性画分の双方を含んでなる前処理混合物全体は、糖化反応において利用される。

別の実施形態では、糖化に先立ち、アンモニアおよび可溶性糖を含んでなる水性画分は、混合物中に残存する不可溶性微粒子から分離されうる。可溶物を不可溶性画分から分離するための方法は、デカンテーションおよび濾過を含むがこれらに限定されない。不可溶性微粒子は、前処理反応器へリサイクルされうる。不可溶性微粒子は、前処理反応器へリサイクルされるのに先立ち、場合により水性溶媒（例えば水）で洗浄されることで吸着糖類が除去されうる。次いで、不可溶性画分は、前処理において上記のように水性アンモニア溶液を用いたさらなる処理が施された後、糖化酵素コンソーシアムで糖化されうる。可溶性画分はまた、糖化に先立ち、蒸発などの適切なプロセスを用いて濃縮されうる。

糖化に先立ち、前処理生成物を処理し、糖化酵素コンソーシアムの酵素が活性を示すようにｐＨ、組成または温度を変更することにより、発酵性糖を生成せしめるのに適切な条件が得られうる。ｐＨは、酸の固体または液体形態での添加を通じて変更されうる。あるいは、二酸化炭素（ＣＯ_２）は、発酵から回収されうるものであり、使用によりｐＨが低下しうる。例えば、所望のｐＨが得られるまでｐＨを監視しながら、ＣＯ_２は発酵槽から回収されかつバブリングなどにより前処理生成物に供給されうる。下記のとおり、温度は糖化酵素の活性に適合する温度に誘導されうる。糖化にて用いられる酵素の活性にとって必要な任意の共同因子が追加されうる。

糖化酵素コンソーシアムは、主に、二糖、オリゴ糖、および多糖のエーテル結合を加水分解する群「グリコシダーゼ」より選択される（がこれらに限定されない）１つもしくはそれ以上の酵素を含んでなり、酵素分類として、一般群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）のＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カルフォルニア州に加え、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １（１９９３年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２（１９９４年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３（１９９５）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４（１９９７年）およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５［各々、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４年）２２３：１−５頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５年）２３２：１−６頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６年）２３７：１−５頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７年）２５０：１−６頁、およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９年）２６４：６１０−６５０頁］）において見出される。本方法において有用なグリコシダーゼを、それらが加水分解するバイオマス成分によって分類してもよい。本方法において有用なグリコシダーゼは、セルロース−加水分解性グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース−加水分解性グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、および澱粉−加水分解性グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）を含む。さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、ならびにフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素コンソーシアムに他の活性を付加することで多糖のバイオマスの他の成分からの放出を促進することは有用でありうる。多糖を加水分解する酵素を生成する微生物が、異なる基質特異性を有する数種の酵素または酵素群によって触媒される、セルロース分解などの活性を示すことが多いことは当該技術分野で周知である。したがって、微生物由来の「セルラーゼ」は、酵素群を含んでなる場合があり、それらのすべてはセルロース分解活性に寄与しうる。セルラーゼなどの商用または非商用の酵素製剤は、酵素を得るのに用いられる精製スキームに依存し、極めて多数の酵素を含んでなる場合がある。したがって、本方法の糖化酵素コンソーシアムは「セルラーゼ」などの酵素活性を含んでなる場合があるが、この活性は２種以上の酵素によって触媒されうると理解されている。

糖化酵素は、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）（登録商標）ＣＰセルラーゼ（ジェネンコア・インターナショナル（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）およびマルチフェクト（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ）（登録商標）キシラナーゼ（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））など、商用的に入手可能である。さらに、糖化酵素は、組換え微生物の使用を含む生物学的に生成されうる。

当業者であれば、コンソーシアム中で使用するための酵素の有効量を決定しかつ最適な酵素活性のための条件を調節する方法を知るであろう。当業者であれば、コンソーシアム中で必要とされる酵素活性のクラスを最適化しかつ選択された条件下での所定の前処理生成物の最適な糖化を得る方法も知るであろう。

好ましくは、糖化反応は、糖化酵素における最適な温度およびｐＨでまたはそれらの近傍で行われる。本方法における糖化酵素コンソーシアムの場合に用いられる最適な温度は約１５℃〜約１００℃の範囲である。別の実施形態では、最適な温度は約２０℃〜約８０℃の範囲である。ｐＨ最適値は約２〜約１１の範囲でありうる。別の実施形態では、本方法において糖化酵素コンソーシアムの場合に用いられるｐＨ最適値は約４〜約１０の範囲である。

約数分〜約１２０時間、および好ましくは約数分〜約４８時間の時間で糖化を行ってもよい。反応における時間は、酵素濃度および比活性、ならびに用いられる基質および温度およびｐＨなどの環境条件に依存することになる。当業者であれば、特定の基質および糖化酵素コンソーシアムの場合に用いられるべき温度、ｐＨおよび時間の最適な条件を容易に決定できる。

糖化をバッチ式または連続プロセスで行ってもよい。さらに、糖化を１ステップまたは多数のステップで行ってもよい。例えば、糖化に必要な異なる酵素は異なる最適なｐＨまたは温度を示しうる。ある温度およびｐＨで酵素を用いて一次処理を行った後、異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素を用いて二次または三次（またはさらなる）処理を行ってもよい。さらに、順次ステップで異なる酵素を用いた処理は、同じｐＨおよび／または温度で、あるいは、より高いｐＨおよび温度で安定でかつより活性のあるヘミセルラーゼ、次いでより低いｐＨおよび温度で活性のあるセルラーゼの使用など、異なるｐＨおよび温度で行われうる。

糖化後のバイオマスからの糖類の可溶化の度合いを、単糖およびオリゴ糖の放出の測定により監視してもよい。単糖およびオリゴ糖を測定するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（ミラー Ｇ．Ｌ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５９年）３１：４２６−４２８頁）を用いて還元糖の濃度を測定してもよい。あるいは、本明細書中の「一般的方法」の項に記載のように、適切なカラムを使用し、ＨＰＬＣにより糖類を測定してもよい。

バイオマスから放出された発酵性糖の適切な微生物による使用により、エタノールを生成してもよい。糖化後であるが発酵に先立ち、糖化混合物を例えば蒸発により濃縮することで、発酵性糖の濃度が増加しうる。場合により、糖化生成物中の液体は、バッチ式または連続的な方法で固体から分離されうる。場合により、液体または糖化生成物全体は、発酵に先立ち殺菌されうる。ｐＨについては、発酵の間に用いられる微生物および糖化の間に用いられるｐＨに依存し、発酵に適するｐＨに調節されうる。さらに、糖化混合物に微生物の成長にとって必要な追加の栄養を補充することが可能である。補充物は、例えば、酵母抽出物、特定のアミノ酸、リン酸塩、窒素源、塩、および微量元素を含みうる。抗生物質など、特定の生体触媒によって作製される特定の生成物の生成にとって必要な成分もまた含まれることで、酵素触媒反応において必要とされるプラスミドまたは共同因子の維持が可能である。さらに追加の糖類が含まれることで、全糖濃度が増加しうる。糖化混合物は発酵培養液の成分として用いられ、例えば最終培地の約１００％〜約１０％を構成しうる。適切な発酵条件は、生体触媒による成長およびエタノールの生成における、これらのタイプの因子の調節によって得られる。

温度および／またはヘッドスペースガスもまた、発酵微生物にとって有用な条件に応じて調節されうる。発酵は好気性または嫌気性でありうる。発酵は、糖化に続いて行われうるか、または同時糖化および発酵（ＳＳＦ）により、糖化と同時に行われうる。ＳＳＦにより、糖化によってもたらされる糖レベルが低く保持され、それにより、起こり得る糖化酵素の生成物の阻害が低下し、汚染微生物における糖の使用可能性が低下し、かつ前処理されたバイオマスの単糖および／またはオリゴ糖への変換が改善される可能性がある。

エタノールへの糖類の発酵が、単一または多段階の発酵において、１つもしくはそれ以上の適切な生体触媒により行われうる。生体触媒は、細菌、糸状真菌および酵母より選択される微生物でありうる。生体触媒は、野生型微生物または組換え微生物である場合があり、エシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、チモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む。別の実施形態では、生体触媒は、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジア・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）よりなる群から選択されうる。

エタノールを生成するための発酵にて用いられる生体触媒については記載がなされており、他のものは発見されるか、突然変異によって生成されるか、または組換え手段によって設計されうる。本方法にて生成される発酵性糖を用いる任意の生体触媒を用いることで、本方法における発酵によりエタノールの製造が可能である。

発溶媒性（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）によるエタノール、アセトン、およびブタノール（ＡＢＥ発酵）への炭水化物の発酵については周知である（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８６年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４頁）。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の変異株を用いる、ブタノール、アセトンおよびエタノールを生成するための発酵プロセスが、米国特許第５，１９２，６７３号明細書に記載されている。ブタノール、アセトンおよびエタノールを生成するためのクロストリジウム・バイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）の変異株の使用については、米国特許第６，３５８，７１７号明細書に記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子組換え株は、エタノール生成用の生体触媒としても用いられている（アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、（２００２年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２頁）。エタノールの生成を改善しているチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子組換え株については、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１Ａ１号明細書に記載されている。

バイオマスの発酵性糖への前処理および糖化と、その後の糖類のエタノールへの発酵は、生体触媒としてチモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を用いた、前処理されたトウモロコシ穂軸からのエタノールの生成についての本明細書中の実施例９にて例示される。

生体触媒による発酵にて生成されるエタノールは、当該技術分野で既知の様々な方法を用いて回収されうる。生成物は、遠心分離、濾過、精密濾過、およびナノ濾過により、他の発酵成分から分離されうる。生成物は、イオン交換、溶媒抽出、または電気透析により抽出されうる。凝集剤を使用することで、生成物の分離が促進される。具体例として、バイオ生成されたエタノールは、ＡＢＥ発酵についての当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、デュレ（Ｄｕｒｒｅ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８頁（１９９８年）、グルート（Ｇｒｏｏｔ）ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５頁（１９９２年）、およびそれらの中の参考文献を参照）。例えば、遠心分離、濾過、デカンテーションまたは同類のものにより、固体が発酵培地から除去されうる。次いで、エタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または透析蒸発などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。
以上本発明を要約すれば以下のとおりである。
１．ａ）バイオマスをアンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、ここで、アンモニアは
バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、該アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１２重量パーセント未満で存在し、かつさらにバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約１５重量パーセントの高固体濃度にあり、
ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、発酵性糖を生成せしめるのに適切な条件下で糖化酵素コンソーシアムと接触させ、
ｃ）適切な発酵条件下でステップ（ｂ）の生成物を適切な生体触媒と接触させ、エタノールを生成せしめる、
ことを含んでなるエタノールの製造方法。
２．適切な生体触媒が細菌、糸状真菌および酵母よりなる群から選択される前記１に記載の方法。
３．適切な生体触媒がエシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、チモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）よりなる群から選択される野生型微生物、変異微生物、または組換え微生物である前記１に記載の方法。
４．適切な生体触媒が組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）よりなる群から選択される前記１に記載の方法。
５．該適切な生体触媒が組換えチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）である前記１に記載の方法。
６．ステップ（ｂ）および（ｃ）を同時に実施する前記１に記載の方法。
７．バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨが８より大きい前記１に記載の方法。
８．バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触に先立ち、バイオマスに真空を適用する前記１に記載の方法。
９．該バイオマスの乾燥重量が少なくとも約１５％〜約８０％の高固体濃度にある前記１に記載の方法。
１０．該バイオマスの乾燥重量が少なくとも約１５％〜約６０％の高固体濃度にある前記９に記載の方法。
１１．該アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して約１０重量パーセント未満で存在する前記１に記載の方法。
１２．該アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して約６％もしくはそれ以下の重量パーセントで存在する前記１１に記載の方法。
１３．バイオマスがバイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、工場廃棄物、木材および林業廃棄物よりなる群から選択される前記１に記載の方法。
１４．バイオマスがスイッチグラス、紙くず、製紙汚泥、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮、コーンストーバー、草、小麦、小麦のわら、まぐさ、大麦、大麦のわら、稲わら、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花ならびに動物糞尿よりなる群から選択される前記１に記載の方法。
１５．バイオマスがトウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシの皮、サトウキビバガス、おがくず、スイッチグラス、小麦のわら、まぐさ、大麦のわら、稲わら、および草よりなる群から選択される前記１４に記載の方法。
１６．バイオマスがトウモロコシ穂軸、コーンストーバー、おがくず、およびサトウキビバガスよりなる群から選択される前記１５に記載の方法。
１７．アンモニアがアンモニアガス、水酸化アンモニウム、尿素、およびこれらの組み合
わせよりなる群から選択される前記１に記載の方法。
１８．（ａ）を約４℃〜約２００℃の温度で実施する前記１に記載の方法。
１９．（ａ）を約７５℃〜約１５０℃の温度で実施する前記１８に記載の方法。
２０．（ａ）を９０℃より高く約１５０℃までの温度で実施する前記１９に記載の方法。２１．（ａ）を最大約２５時間の期間実施する前記１に記載の方法。
２２．（ａ）を最大約８時間の期間実施する前記２１に記載の方法。
２３．（ａ）のアンモニアの少なくとも一部を（ｂ）に先立ち除去する前記１または６に記載の方法。
２４．（ａ）からのアンモニアをリサイクルする前記２３に記載の方法。
２５．（ｂ）の接触が少なくとも約１５％のバイオマス濃度の乾燥重量で行われる前記１に記載の方法。
２６．（ａ）、（ｂ）または（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回繰り返す前記１に記載の方法。
２７．（ａ）において少なくとも１種の可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせを添加することをさらに含んでなる前記１に記載の方法。
２８．該少なくとも１種の可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせがポリオール、ポリオールのエステル、グリコールエーテル、アセトアミド、エタノール、およびエタノールアミンよりなる群から選択される前記２７に記載の方法。
２９．（ａ）の前または間、（ｂ）の前または間、あるいはそれらの組み合わせにおいてエネルギーを適用することをさらに含んでなる前記１に記載の方法。
３０．該エネルギーがミリング、クラッシング、粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニング、超音波およびマイクロ波よりなる群から選択される前記２９に記載の方法。
３１．糖化に先立ち、発酵からの二酸化炭素を使用して前処理混合物のｐＨを調節する前記１に記載の方法。
３２．該糖化酵素コンソーシアムが少なくとも１種のグリコシダーゼを含んでなる前記１に記載の方法。
３３．該糖化酵素コンソーシアムがセルロース−加水分解性グリコシダーゼ、ヘミセルロース−加水分解性グリコシダーゼ、澱粉−加水分解性グリコシダーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含んでなる前記１に記載の方法。
３４．該糖化酵素コンソーシアムがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含んでなる前記１に記載の方法。
３５．（ｂ）を約１５℃〜約１００℃の温度および約２〜約１１のｐＨで実施する前記１に記載の方法。

一般的方法および材料
以下の略語が用いられる。
「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィー、「Ｃ」は摂氏、「ｋＰａ」はキロパスカル、「ｍ」はメートル、「ｍｍ」はミリメートル、「ｋＷ」はキロワット、「μｍ」はマイクロメートル、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｍｉｎ」は分、「ｍＭ」はミリモル、「ｃｍ」はセンチメートル、「ｇ」はグラム、「ｋｇ」はキログラム、「ｗｔ」は重量、「ｈｒ」は時間、「ｔｅｍｐ」または「Ｔ」は温度、「ｔｈｅｏｒｅｔ」は理論、「ｐｒｅｔｒｅａｔ」は前処理、「ＤＷＢ」はバイオマスの乾燥重量である。

硫酸、水酸化アンモニウム、酢酸、アセトアミド、酵母抽出物、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カリウムリン酸塩、グルコース、キシロース、トリプトン、塩化ナトリウムおよびクエン酸を、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）から入手した。

前処理反応器
ジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応器
４リットルのジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応器（オートクレーブ・エンジニアーズ（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）、エリー（Ｅｒｉｅ）、ペンシルバニア州）は、バイオマス負荷用の２．５リットルのハステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）筒状容器およびバイオマスを混合するための撹拌器を具備するバッチ式圧力容器である。反応容器は、所望の前処理温度で制御される電気ヒーターによって囲まれている。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。蒸気凝縮物を、ジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応器のヘッドプレート、容器および反応器の筒状容器と内壁との間に形成されるリザーバに通じる筒状容器ドレンの外側を加熱することによって形成し、前処理されたスラリーの過剰な希釈を阻止する。

ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器
ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器は、ハステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）Ｃ−２２合金製の１３０−リットル（直径約５１ｃｍ×長さ９１ｃｍ）の水平のパドル型反応器（ジャイゴ・マニュファクチュアリング（Ｊａｙｇｏ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、マーワー（Ｍａｈｗａｈ）、ニュージャージー州）である。反応器は約１７７℃（８６２ｋＰａ）に加熱可能な蒸気ジャケットを具備する。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。極めて多くのポートにより、他の溶媒および温液の注入が可能になる。

スチームガン反応器のバッチ式消化システム
４リットルのスチームガン反応器（オートクレーブ・エンジニアーズ（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）、エリー（Ｅｒｉｅ）、ペンシルバニア州）は、２つのボール弁によって閉鎖される長さ１０２ｍｍで計画された８０ハステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）パイプより構成される蒸気ジャケット付き反応器である。追加の電気ヒーターを、反応器のジャケットが付いていない露出された全表面上に設け、かつ前処理の定値温度に制御する。バイオマスを最高の前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いられる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。反応器の底部を５１ｍｍにネックダウンする。すべての前処理した材料を、反応器の底部で交換可能なダイを通して排出させ、厚肉のジャケット付き冷却フラッシュタンク内部で支持された０．２１ｍ^３のナイロン（ホットフィル（Ｈｏｔｆｉｌｌ）（登録商標））製バッグ内に回収する。

ディスクリファイナー
ディスクリファイナーは、１１ｋＷの電気モーターを具備するスプラウト・ワルドロン（Ｓｐｒｏｕｔ Ｗａｌｄｒｏｎ）モデルの３０．５ｃｍのリファイナー（アンドリッツ（Ａｎｄｒｉｔｚ，Ｉｎｃ．）、マンシー（Ｍｕｎｃｙ）、ペンシルバニア州）である。固定板と回転板の間の間隙は可変である。フィードオーガー（ｆｅｅｄ ａｕｇｅｒ）の速度もまた０〜８８ｒｐｍで可変である。リファイナーへの注入口を６つの注入ポートを用いて改良することで、回転するリファイナープレートのすぐ前方における蒸気、熱水、または他の掃引ガスおよび液体の導入が可能になる。リファイナーに、プレート（デュラメタル（Ｄｕｒａｍｅｔａｌ，Ｃｏｒｐ．）、テュラティン（Ｔｕｌａｔｉｎ）、オレゴン州）をＮｉ−ＨａｒｄでのパターンＤ２Ａ５０６またはＮｉ−Ｈａｒｄでのパターン１８０３４−Ａで装備した。

前処理および酵素加水分解反応器（ＰＥＨＲ）
９ＬのＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ（ＮＲＥＬ、ゴールデン（Ｇｏｌｄｅｎ）、コロラド州にて構築；同時係属中の米国特許出願第ＣＬ３４４７号明細書を参照）は、処理反応物の導入用の注入ランスを具備する約１５ｃｍ×５１ｃｍのステンレス鋼製の反応容器を有する。注入ランスは、容器の一端部上のカバー内のポートに回転ジョイントを用いて接続され、それは容器への接近手段として追加ポートを有する。４つのバッフルが容器壁の全長にわたり、壁に垂直に取り付けられる。容器内で浮遊状態にあるバッフルおよび３．２ｃｍＸ３．２ｃｍの２２個のセラミック製摩擦媒体シリンダー（Ｅ．Ｒ．アドバンスド・セラミックス（Ｅ．Ｒ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｒａｍｉｃｓ）、イーストパレスタイン（Ｅａｓｔ Ｐａｌｅｓｔｉｎｅ）、オハイオ州）は、容器の回転時にバイオマスと反応物との機械的混合を適用し、それにより反応物のバイオマスへの吸収が促進される。ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒを、回転のための機構を提供するベルコ・セル−プロダクション・ローラー・アパラタス（Ｂｅｌｌｃｏ Ｃｅｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｏｌｌｅｒ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）（ベルコ・テクノロジー（Ｂｅｌｌｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヴァインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）、ニュージャージー州）上に設置し、ローラー装置を具備する反応器を、熱を供給する温度制御チャンバー内に収容する。外部ソースをカバー内のランスに接続されたポートに取り付けることにより、反応容器に真空および圧力を印加できる。

分析法
セルロースの定量
各バイオマス出発試料中のセルロースの量を、ＡＳＴＭ Ｅ１７５８−０１「ＨＰＬＣにより炭水化物を測定するための標準的方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｂｙ ＨＰＬＣ）」などの当該技術分野で周知の方法を用いて測定した。

糖、アセトアミド、乳酸および酢酸含有量の測定
糖化液中の可溶性糖（グルコース、セロビオース、キシロース、ガラクトース、アラビノースおよびマンノース）、アセトアミド、乳酸ならびに酢酸を、適切なガードカラムを有するバイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＰＸ−８７Ｐおよびバイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（バイオ・ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州）を用い、ＨＰＬＣ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）モデル１１００、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州）によって測定した。試料のｐＨを測定し、必要に応じ硫酸を用いて５〜６に調節した。次いで、試料を直接に０．２μｍのシリンジフィルターを通してＨＰＬＣバイアルに通過させた。ＨＰＬＣの稼動条件は以下の通りであった。
バイオ・ラッド（Ｂｉｏｒａｄ）アミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｐ（炭水化物用）：
注入容量：１０〜５０μＬ、濃度および検出器の限界に依存
移動相：ＨＰＬＣグレードの水、０．２μｍに濾過および脱気
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：８０〜８５℃、ガードカラム温度＜６０℃
検出器温度：可能な限り主カラム温度に近い
検出器：屈折率
実行時間：３５分間のデータ収集に加え、実行後の１５分間（後の溶出化合物のために可能な調節を行う）

バイオ・ラッド（Ｂｉｏｒａｄ）アミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈ（炭水化物、アセトアミド、乳酸、酢酸、およびエタノールを対象）
注入容量：５〜１０μＬ、濃度および検出器の限界に依存
移動相：０．０１Ｎ硫酸、０．２μｍに濾過および脱気
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：５５℃
検出器温度：可能な限りカラム温度に近い
検出器：屈折率
実行時間：２５〜７５分間のデータ収集

実行後、試料中の濃度を各化合物における標準曲線から判定した。

実施例１
高いバイオマス濃度、高温でのストーバーの前処理およびアンモニア濃度の比較
バイオマス負荷の導入前に、ジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応容器およびヘッドプレートを、蒸気を反応器内に循環させかつ数回通風することにより、目的の前処理温度まで予備加熱した。前処理前に、予備加熱の間に形成される凝縮物を真空吸引により除去した。ハステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）筒状容器に０．６３５ｃｍ（１／４インチ）に粉砕したストーバー（１００ｇ、乾燥重量を基準）を負荷し、それを予熱した反応器に入れた。反応器の撹拌器を２０ｒｐｍに設定する一方、容器内部および負荷されたバイオマスに真空（約８５ｋＰａ）を適用した。バイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して３０重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量ならびに表１に挙げる所望のアンモニア濃度を与えるのに必要な強度の水酸化アンモニウムを、スプレー型ノズルを有する容器の底部付近に注入した。試験試料がバイオマスの乾燥重量に対して１２％の最終アンモニア濃度を有する一方、バイオマスの乾燥重量に対して３５％の最終アンモニア濃度を有する試料を比較として用いた。バイオマス負荷の温度が５０℃に達した場合、蒸気を反応器の底部付近に導入して流動化し、バイオマス負荷の温度を１４０℃または１７０℃に上昇させた。前処理の最後に、反応器の開放および前処理されたバイオマスの回収に先立ち、反応器をベントコンデンサを通して減圧し、真空（約８５ｋＰａ）を３分間適用し、温度を低下させ、追加のアンモニアを前処理されたスラリーから除去した。

０．５ｇのセルロース（初期供給原料組成物を基準）を含有する未洗浄の前処理スラリー全体を最終容量５０ｍＬ中で１２５ｍＬの振盪フラスコに添加した。酵素が高ｐＨ環境に感度を示すことから、酵素添加前に、酢酸（１０〜１００μＬ）の添加で滴定して、アンモニアで前処理したバイオマスのｐＨを５．０にした。糖化の間、５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液の添加によりｐＨを５．０に調節し、温度を５０℃で維持した。スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）（登録商標）ＣＰセルラーゼ（ジェネンコア・インターナショナル（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）を表１中の各試料において列挙する濃度まで添加した。９６時間の糖化後、生成された糖化液の糖含有量を「一般的方法」に記載の糖測定プロトコルに従って測定した。９６時間後の糖の放出について表２に示す。この実験における対照は、１）２３％のグルコースの理論収率（５６ｍｇのセルラーゼ／ｇのセルロースを使用）が得られる未処理のコーンストーバー、および２）４０％のグルコースの理論収率（５６ｍｇセルラーゼ／ｇセルロースを使用）が得られる蒸気（１４０℃）で前処理されたコーンストーバーであり、対照の場合、キシロースは測定されなかった。

これらの結果は、１２％アンモニアを使用した１４０℃で１５分間の前処理、その後の糖化により、前処理で３５％アンモニアが１４０℃で５分間用いられている場合よりも多いグルコースおよびキシロースが放出されることを示す。したがって、前処理時間を少し増やすことにより、使用するアンモニアを少なくするという利点を享受できる。

実施例２
高いバイオマス濃度、低温、および極めて少量のアンモニアでのストーバーの前処理
ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器に０．６３５ｃｍに粉砕したストーバー（１３ｋｇ、乾燥重量を基準）を負荷した。真空（６７．７ｋＰａ）を容器に適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、アンモニア６．２ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度およびバイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して３０重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。真空を解放し、蒸気をジャケットに適用してストーバーを１００℃まで加熱した。浸漬したストーバーの温度を３２ｒｐｍで常に混合しながら８時間保持し、次いで生成されたスラリーを連続混合しつつ一晩冷却しておいた。

０．５ｇのセルロース（初期供給原料組成物を基準）を含有する未洗浄の前処理スラリー全体を最終容量５０ｍＬ中で１２５ｍＬの振盪フラスコに添加した。酵素が高ｐＨ環境に感度を示すことから、酵素添加前に、必要に応じ、酢酸（１０〜１００μＬ）の添加で滴定して、アンモニアで前処理したバイオマスのｐＨを５．０にした。糖化の間、５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液の添加によりｐＨを５．０に調節し、温度を５０℃で維持した。スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）（登録商標）ＣＰセルラーゼ（ジェネンコア・インターナショナル（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）を５６ｍｇ／ｇセルロースに添加した。９６時間の糖化後に生成された糖化液の糖含有量を「一般的方法」に記載の糖測定プロトコルに従って測定したものを表２に示す。

結果は、これらの極めて低いアンモニア濃度および低温の前処理条件（８時間の期間）が１２％アンモニアを１４０℃で１５分間使用する場合と同様に有効であることを示す。

実施例３
高いバイオマス濃度、低温、および極めて低いアンモニア濃度でのトウモロコシ穂軸の前処理とその後の高いバイオマス濃度での糖化
全粒または粉砕トウモロコシ穂軸（約１３ｋｇ、乾燥重量を基準）をジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器に負荷した。トウモロコシ穂軸をプレートＣ−２９７５を具備するディスクリファイナーに通過させることにより粉砕した（「一般的方法」）。生成された粉砕トウモロコシ穂軸を１．２７ｃｍのスクリーンに通過させた。保持された任意の切片を、再びディスクリファイナーに０．５ｃｍのより小さい間隙で通過させた。反応器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、表３に示すように所望の最終アンモニア濃度（２％もしくは６％）および乾燥バイオマスの濃度（３０％もしくは４０％）が得られた。真空を解放し、全粒トウモロコシ穂軸試料に対して９３℃および粉砕トウモロコシ穂軸試料に対して８５℃の温度まで浸漬しながら、蒸気をジャケットに適用してトウモロコシ穂軸を加熱した。加熱速度を高める目的で、短時間、撹拌器速度を増加させた（最大９６ｒｐｍ）。浸漬したトウモロコシ穂軸の温度を、３２ｒｐｍで常に混合しながら４もしくは８時間保持し、次いで連続混合しつつ一晩冷却しておいた。

前処理されたバイオマスを反応器から取り出す前に、反応器を９０℃で真空下に置き、アンモニアを前処理されたバイオマスから外部に揮散させた。糖化前、前処理されたトウモロコシ穂軸のバイオマスのｐＨを固体クエン酸を用いて５．５に調節した。約１０ｋｇの前処理された全粒トウモロコシ穂軸を、５０℃のジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で糖化した。糖化においては、約１４００ｇの前処理された粉砕トウモロコシ穂軸を、２２個のセラミック製摩擦シリンダー（直径３．２ｃｍｘ長さ３．２ｃｍ；Ｅ．Ｒ．アドバンスド・セラミックス（Ｅ．Ｒ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｒａｍｉｃｓ）、イーストパレスタイン（Ｅａｓｔ Ｐａｌｅｓｔｉｎｅ）、オハイオ州）とともにＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに添加した。２８ｍｇ／ｇのセルロース、マルチフェクト・キシラナーゼ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｘｙｌａｎａｓｅ）（登録商標）を加えた未処理のストーバー中の２８ｍｇのスペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）／ｇのセルロースの酵素混合物を各糖化反応において使用した。各糖化の開始時におけるバイオマスの乾燥重量の最終濃度は、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０％であった。５０℃の温度を維持しながら、ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒを１９ｒｐｍで軸回転させた。生成された糖化液の糖含有量を、「一般的方法」における糖測定プロトコルに従って測定した。９６時間後の糖の放出について表３に示す。

実施例４
高いバイオマス濃度、高温、および極めて低いアンモニア濃度でのトウモロコシ穂軸の前処理とその後の高いバイオマス濃度での糖化
粉砕トウモロコシ穂軸（１３ｋｇ、乾燥を基準）をジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器に負荷した。反応器の真空を引いた後、２％のアンモニアおよび３０乾燥重量％のバイオマスの濃度を与えるのに適切な強度の水酸化アンモニウム溶液を、室温、３２ｒｐｍで混合しながら反応器にポンピングした。次いで、反応器の内容物を低圧のジャケット蒸気を用いて９５℃に加熱した。一旦反応器が９５℃に達すると、直接蒸気注入を用いて反応器の内容物を１４５℃に加熱した。反応器が１４５℃に達すると、反応器の内容物を、ジャケット蒸気および部分的に直接蒸気注入を用いてその温度で２０分間保持した。２０分後、反応器に至る通気口上で真空を引き、シュレッダーモーターを５分間作動させた。１時間後、ジャケットに対して冷却水を作動させた。ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器の内容物を３３℃〜３７℃に冷却し、次いで反応器をＣＯ_２を用いて１３８ｋＰａまで加圧した。加圧されたＣＯ_２雰囲気を３０分間維持した。反応器の内容物の最終温度は２７℃〜３１℃であった。浸漬／前処理されたバイオマスのｐＨは約７．５であった。

前処理されたバイオマスを、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器から取り出し、糖化の開始時に前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０％のバイオマスの乾燥重量の最終濃度にて、糖化用のＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに移した。次いで、ｐＨを固体クエン酸を用いて５．５に調節し、実施例３に記載のように、材料を、未処理のトウモロコシ穂軸中の２８ｍｇのスペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）／ｇセルロースおよび２８ｍｇのマルチフェクト・キシラナーゼ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｘｙｌａｎａｓｅ）（登録商標）／ｇセルロースで消化した。生成された糖化液の糖含有量を、「一般的方法」における糖測定プロトコルに従って測定した。消化の９６時間後における糖の放出について表４に示す。

実施例５
可塑剤の添加を伴う前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、実施例３に記載のように、可塑剤としての作用を意図して添加されるバイオマスの乾燥重量に対して３重量パーセントのグリセロールを有するジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して約３０％のバイオマスの乾燥重量の濃度、バイオマスの乾燥重量に対して２重量パーセントのアンモニアにて、１００℃で８時間かけて前処理した。前処理後、生成された材料のｐＨを固体クエン酸を用いて５に調節した。次いで、実施例３に記載のように前処理されたトウモロコシ穂軸を消化した。未処理のストーバー中の２８ｍｇのスペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）／ｇセルロースと未処理のトウモロコシ穂軸中の２８ｍｇ／ｇのセルロース、マルチフェクト・キシラナーゼ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｘｙｌａｎａｓｅ）（登録商標）との酵素混合物を使用した。消化の９６時間後、グルコース濃度は９２．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は５４．４ｇ／Ｌであった。

実施例６
前処理されたバイオマスのディスクリファイニング
実施例１に記載のように、ストーバーを、表５に挙げる、低いアンモニア濃度（１２％）または比較としてのアンモニア濃度（３５％）を有する異なる試料、温度、時間、ならびに酵素条件の下で前処理した。全粒トウモロコシ穂軸を、実施例３に記載のように、表５に挙げる、極めて少量のアンモニア（３％もしくは６％）を有する異なる試料および他の条件の下で前処理した。前処理後、試料をスプラウト・ワルドロン（Ｓｐｒｏｕｔ Ｗａｌｄｒｏｎ）ディスクリファイナーに通過させた。静止プレートと回転プレートの間の間隙を０．２５４ｍｍ（０．０１０インチ）、フィードオーガー速度を７ｒｐｍに設定した。実施例２に記載のように精製された材料を糖化し、生成された糖化液の糖含有量を「一般的方法」における糖測定プロトコルに従って測定した。９６時間後における糖化の結果を表５に示す。結果は、糖化に先立つディスクリファイニングの場合、より良い消化率が得られるかまたはより低い酵素濃度の使用が有効であることを示した。

実施例７
前処理されたバイオマスのスチームガン処理
実施例１に記載のように、ストーバーを、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して３０乾燥重量％のバイオマス、ＤＷＢに対して６重量パーセントのアンモニア、１００℃で８時間という条件を用いて前処理した。トウモロコシ穂軸を、実施例３に記載のように、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して４０乾燥重量％のバイオマス、ＤＷＢに対して６重量パーセントのアンモニア、９３℃で８時間という条件を用いて前処理した。前処理された各バイオマスの試料を４リットルのスチームガン反応器に別々に負荷した。前処理された材料に、ダイを通して放出される前に、１７０℃を５分間、または１４０℃を２０分間施した。生成された材料を実施例２に記載のように糖化した。結果を下記表６に示す。結果は、糖化に先立つスチームガン処理によりグルコースの放出が改善されることを示した。

実施例８
アンモニアリサイクルを伴う前処理のモデリング
低温（８５℃）、長い滞留時間（４時間）と高温（１３０℃）、短い滞留時間（２０分）という２つの前処理スキームにおいて、アンモニアリサイクルの利点についてアスペン（Ａｓｐｅｎ）モデル（アスペン・テクノロジーズ（Ａｓｐｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州、バージョン１２．１）を用いて検証した。各モデルでは、前処理反応器の後に順次低圧で作動する３つの一連のフラッシュタンクを設けることで、アンモニアリサイクルのための手段を提供した。供給流れが各タンクに入る時、それは圧力の低下に起因して気体および液体画分に分離した。気体画分が前処理へリサイクルされる一方、液体画分はプロセス内の次のステップに進んだ。前処理において、ＤＷＢに対して２重量パーセントのアンモニアおよびバイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して約２７乾燥重量％のバイオマスを仮定すると、各プロセスにおける新たに供給されるアンモニアとリサイクル流れからのアンモニアについて表７に示す。両モデルにおけるフラッシュタンクを、アンモニアリサイクルが類似するように同様に作動させた。両方のシナリオにおいて、必要なアンモニアの半分を超える量をリサイクルを通して供給することで、新たなアンモニアに対する必要性およびコストが低減された。

実施例９
少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸のバイオマスからのエタノールの生成、および多量のアンモニアで前処理され、糖化されたストーバーに対する比較
全粒トウモロコシ穂軸を、実施例３に記載のように、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で、バイオマスの乾燥重量に対して６重量パーセントのアンモニア、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して４０重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量の下で、９３℃で８時間前処理することにより、トウモロコシ穂軸の加水分解物を生成した。前処理後、反応器を真空下で９０℃に加熱することにより、アンモニアを除去した。次いで、前処理されたバイオマスのｐＨを硫黄酸を用いて５に調節した。前処理されたバイオマスを、ジャイゴ（Ｊａｙｇｏ）反応器内で、２８ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）（登録商標）セルラーゼおよび２８ｍｇ／ｇのセルロース、マルチフェクト（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ）（登録商標）キシラナーゼを用い、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０％にあるバイオマスの乾燥重量にて、５０℃およびｐＨ５で１６８時間かけて糖化した。生成された加水分解物を、シックスフォース（Ｓｉｘｆｏｒｓ）発酵器（インフォース（ＩＮＦＯＲＳ ＡＧ）、スイス）内でのチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂの発酵において使用した。チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂは、遺伝子操作により改善されてもはや野生型ではないエタノールの生成物を生成し、かつ米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１Ａ１号明細書に記載があるチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の株である（実施例ＩＶ、ＶＩおよびＸＩＩ）。トウモロコシ穂軸の加水分解物は、７８ｇ／Ｌのグルコース、５１ｇ／Ｌのキシロース、６ｇ／Ｌのアセトアミド、および７ｇ／Ｌの酢酸を含んでなるものであった。トウモロコシ穂軸の加水分解物を、最終スラリー中での酵母抽出物およびＫＨ_２ＰＯ_４の濃度がそれぞれ約５ｇ／Ｌおよび２ｇ／Ｌであるような量で、それらよりなる濃縮された水性培地が平衡した状態で、４０％および８０％の強度で使用した。さらに、４０％の加水分解物スラリー中にグルコースおよびキシロースを、それらの濃度を８０％の加水分解物スラリー中の場合と同じ濃度にするのに十分な量で添加した。発酵を３７℃で行った。発酵器内での撹拌は１００ｒｐｍであり、ｐＨを２Ｎ ＫＯＨの添加により５．５に維持した。結果を表８に示す。糖類およびエタノールを「一般的方法」に記載のように分析した。

比較のため、実施例１に記載のように、ジッパークレーブ（Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ）（登録商標）反応器中で、ストーバーを、バイオマス−水性アンモニア混合物の総重量に対して約３０重量パーセントの濃度にあるバイオマスの乾燥重量で、バイオマスの乾燥重量に対して３５重量パーセントのアンモニアの下、１７０℃で５分間前処理することにより、ストーバーの加水分解物を生成した。発酵試験において、前処理されたバイオマスを、５０℃およびｐＨ５で、２２４ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）セルラーゼを用い、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０％乾燥重量のバイオマスにて酵素消化し、高い糖濃度の加水分解物を生成した。生成された加水分解物は、８８ｇ／Ｌのグルコース、５２ｇ／Ｌのキシロース、９ｇ／Ｌの酢酸および１５ｇ／Ｌの乳酸を含んでいた。エタノールの生成において、チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂを、４０％もしくは８０％（ｖ／ｖ）の加水分解物スラリー上で発酵させた。残存容量は酵母抽出物、ＫＨ_２ＰＯ_４およびＭＥＳ緩衝液よりなる濃縮された水性培地からなり、量的にいえば最終スラリー中のそれらの濃度はそれぞれ約１０ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌおよび０．１Ｍであった。さらに、４０％の加水分解物スラリー中に、グルコースおよびキシロースを、それらの濃度が８０％の加水分解物スラリーにおける場合と同じ濃度になるのに十分な量で添加した。発酵を、２０ｍｌの実効容積を有する２５ｍｌの振盪フラスコ内で、３０℃およびｐＨ６で行った。撹拌を１５０ｒｐｍで維持した。トウモロコシ穂軸の加水分解物の発酵試料について分析した結果を表８に示す。

これらの結果は、少量のアンモニアで前処理されたトウモロコシ穂軸の加水分解物からエタノールを生成するための発酵が多量のアンモニアで前処理されたストーバーからの場合よりも効率的であることを示した。

実施例１０
前処理の間でのアセトアミドの形成
実施例３および実施例４に記載のプロセスに従って前処理したトウモロコシ穂軸から誘導された試料を分析し、バイオマス中のアセチル基の行方を判定した。前処理液（不可溶性固体が除去された前処理混合物）における酢酸およびアセトアミドの含有量について以下のようにアッセイした。各試料のｐＨをＨ_２ＳＯ_４（７２％）を用いて約３に調節した。アセトアミドの測定においては、下に挙げる条件に従い、試料を０．２μｍのフィルターに通過させ、ＨＰＬＣによって分析した。酢酸塩全体（酢酸およびアセトアミドとして存在する酢酸塩を含む）の測定においては、酸性化試料を１２１℃で１時間オートクレーブし、このステップの間にアセトアミドを酢酸に量的に変換した。オートクレーブ後、試料を冷却しておいた。次いで、下に挙げる条件に従い、試料を０．２μｍのフィルターに通過させて試料バイアルに入れ、分析した。酢酸およびアセトアミドの濃度を各々において生成された標準曲線から判定した。

移動相：０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、０．２μｍで濾過および脱気
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：５５〜６５℃
検出器温度：可能な限りカラム温度に近い
検出器：屈折率
実行時間：６０分
カラム：バイオ・ラッド（Ｂｉｏｒａｄ）アミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈカラムと対応するガードカラム

アッセイした３つの異なる前処理条件における結果を表９に示す。各々の場合、アセチル基のすべてが酢酸またはアセトアミドに可溶化された。

実施例１１に示すように、６％のアンモニア濃度を用いると、ほぼ半数のアセチル基が生体触媒の成長に対して非阻害性のアセトアミドに変換された。

実施例１１
アセトアミドおよび酢酸のチモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の成長に対する作用
アセトアミドおよび酢酸の毒性を試験するため、アセトアミドまたは酢酸を有する場合と有さない場合に、チモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株８ｂ（実施例９に記載）をｐＨ６．０の発酵培地で成長させた。発酵培地を、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、７０ｇ／Ｌのグルコース、４０ｇ／Ｌのキシロースおよび０．１ＭのＭＥＳ緩衝液より構成した。チモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂを、補充していない培地（対照）、６ｇ／Ｌのアセトアミドを補充した培地、または７．２ｇ／Ｌの酢酸を補充した培地内で、３０℃で、１５０ｒｐｍで回転する２５ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）振盪フラスコ内で成長させた。図１に示すように、アセトアミドの存在がチモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の成長速度または最終密度に対して全く作用しなかったのに対し、酢酸の存在は成長速度の減少および細胞収率の低下（乾燥細胞質量により測定されたもの）を招いた。

実施例１２
高いバイオマス濃度、高温、および極めて少量のアンモニアでのバガスの前処理、ならびに低濃度および高濃度での糖化
摩擦媒体を全く有しないＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ（「一般的方法」に記載）に１．２７ｃｍに粉砕したバガス（３７０ｇ、乾燥重量を基準）を負荷した。このサトウキビバガスは、元々ハワイ・シュガー・プランターズ・アソシエーション（Ｈａｗａｉｉ Ｓｕｇａｒ Ｐｌａｎｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、クニア（Ｋｕｎｉａ）支局、オアフ（Ｏａｈｕ）、ハワイ州から入手したサトウキビクローンＨ６５−７０５２由来のＮＩＳＴ参照材料ＲＭ８４９１であった。それを、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）製ミルで粉砕し、２ｍｍのスクリーンを通過させ、その際に微粉（＋７４メッシュ）を除去した。ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ容器を、外表面上で氷と接触状態で回転することにより４℃に冷却した。真空を反応容器に適用し、冷室内で４℃で予備冷却しかつ氷水槽内に浸漬したチュービングを通過させた希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、４ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度および４５ｇ／バイオマス−水性アンモニア混合物全体１００ｇの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。アンモニアおよびバガスを負荷した反応容器を、氷を回転する反応容器の表面に適用して４℃に冷却し、４℃で３０分間回転させた。この時点で、内容物を「一般的方法」に記載のスチームガン反応器に移した。一旦スチームガン反応器にアンモニア−バガス混合物を負荷し、温度を１４５℃に上昇させ、混合物の温度を２０分間保持した。前処理時間の最後に、バガスをスチームガン反応器から１インチの環状ダイを通してフラッシュタンクに排出した。次いで、前処理したバガスの試料を振盪フラスコ内で糖化し、別の試料（約１６３ｇの乾燥重量）をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ内で糖化した。振盪フラスコでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して５乾燥重量％のバイオマスにて行う一方、ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０乾燥重量％のバイオマスにて行った。温度を５０℃で維持した。

ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒでの糖化においては、約４７６ｇ（約１６３ｇの乾燥重量）の前処理したバイオマスおよび２２個のセラミック製の摩擦シリンダーを反応容器に添加した。ｐＨを固体クエン酸を用いて５．０〜５．５に調節した。反応容器を５０℃に制御したインキュベータ室内部で保持し、１９ｒｐｍで軸回転させた。前処理されていないバガスも、振盪フラスコ内で、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して５乾燥重量％のバイオマスにて糖化した。あらゆる糖化を、２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）セルラーゼおよび２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、マルチフェクト（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ）（登録商標）キシラナーゼを用い、５０℃およびｐＨ５．５で９６時間かけて行った。下記の表１１に示す収率は、理論収率の百分率として公表されたものである。

結果は、極めて少量のアンモニアを用いたバガスの前処理により、前処理されていない対照と比較した場合に大量の糖の放出が可能になり、かつＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ内での高い乾燥バイオマス濃度での糖化が糖類を放出する場合に極めて有効であることを示す。

実施例１３
高いバイオマス濃度、高温、および極めて少量のアンモニアでのイエロ−ポプラおがくずの前処理、ならびに低濃度および高濃度での糖化
摩擦媒体を有しないＰＥＨＲｅａｃｔｏｒにイエロ−ポプラおがくず（５９６ｇ、乾燥重量を基準；ソーミラー（Ｓａｗｍｉｌｌｅｒ Ｉｎｃ．）、ヘイデンヴィル（Ｈｅｙｄｅｎｖｉｌｌｅ）、オハイオ州から購入）を負荷した。反応容器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入し、６ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度および４４ｇ／バイオマス−水性アンモニア混合物全体１００ｇの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。実施例１２に記載のようにアンモニアおよびイエロ−ポプラおがくずを負荷した反応容器を４℃にし、４℃で３０分間回転させた。この時点で、内容物をスチームガン反応器に移した。一旦スチームガン反応器にアンモニア−ポプラ混合物を負荷すると、温度を１４５℃に上昇させ、混合物の温度を２０分間保持した。前処理時間の最後に、イエロ−ポプラおがくずをスチームガン反応器から１インチの環状ダイを通してフラッシュタンクに排出した。次いで、実施例１２に記載のように、振盪フラスコ内で前処理したイエロ−ポプラおがくずの試料を糖化し、別の試料をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ内で糖化した。振盪フラスコでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して５乾燥重量％のバイオマスにて行う一方、（約２７９ｇの乾燥重量の前処理されたおがくずを使用する）ＰＥＨＲｅａｃｔｏｒでの糖化を、前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して３０乾燥重量にて％のバイオマス行った。前処理されていないイエロ−ポプラおがくずもまた、振盪フラスコ内で前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物の総重量に対して５乾燥重量％のバイオマスにて糖化した。あらゆる糖化を、２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）セルラーゼおよび２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、マルチフェクト（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ）（登録商標）キシラナーゼを用い、５０℃およびｐＨ５．５で９６時間かけて行った。下記の表１１に示す収率は、理論収率の百分率として各糖について公表されたものである。

結果は、極めて少量のアンモニアを用いたイエロ−ポプラおがくずの前処理により、前処理されていない対照と比較した場合に大量の糖の放出が可能になり、かつＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ内のバイオマスの乾燥重量が大きい時の糖化が糖類の放出において振盪フラスコの場合よりも有効であることを示す。

実施例１４
極めて少量のアンモニアで前処理され、糖化されたトウモロコシ穂軸バイオマスから得られる加水分解物に対する酵母発酵によるエタノールの生成
トウモロコシ穂軸の前処理および糖化から生成された加水分解物を用い、酵母発酵によりエタノールを生成した。加水分解物を、スチームガン反応器内でトウモロコシ穂軸片を前処理することによって生成した。第１のトウモロコシ穂軸バイオマスをＰＥＨＲｅａｃｔｏｒ内に負荷し（「一般的方法」に記載）、真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、アンモニア４ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度およびバイオマスの乾燥重量３０ｇ／バイオマス−水性アンモニア混合物全体１００ｇの濃度にあるバイオマスの乾燥重量が得られた。アンモニアおよびトウモロコシ穂軸を負荷した反応容器を４℃で３０分間回転させた。内容物をスチームガン反応器に移し（「一般的方法」に記載）、温度を１４５℃に上昇させ、混合物の温度を２０分間保持した。スチームガンからの材料をフラッシュタンク内に排出し、フラッシュタンク上で真空を維持することでアンモニアの除去を促進した。ｐＨ調節後、前処理されたバイオマスを、２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（登録商標）セルラーゼおよび１０．１ｍｇの活性タンパク質／ｇのβ−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼよりなるセルロース酵素コンソーシアムを用い、バイオマスの乾燥重量３０ｇ／前処理されたバイオマス−糖化酵素コンソーシアム混合物１００ｇで、５０℃およびｐＨ５．５で７２時間かけて糖化した。

この加水分解物を、振盪フラスコ内で野生型サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によりエタノールに変換するための発酵可能な糖のソースとして使用した。加水分解物を、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および２０ｇ／Ｌのペプトンよりなる水性培地が平衡した状態で、１０％（ｖ／ｖ）の強度で使用した。酵母を２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ内の５０ｍＬの培地内で培養した。培養物を、２５０ｒｐｍの振盪下、３０℃で２４時間インキュベートした。生成されたエタノールの量を実施例９に記載のようにＨＰＬＣによって測定した、２つのフラスコからの結果を下記の表１２に挙げる。

実施例１５
より高い乾燥バイオマス濃度での極めて少量のアンモニアを用いたトウモロコシ穂軸の前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、約０．９５ｃｍのジョー間隔を有するジョークラッシャー（２．２ｋＷモーター）、その後にデランパー（ｄｅｌｕｍｐｅｒ）（１．５ｋＷモーター、フランクリン・ミラー（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｍｉｌｌｅｒ Ｉｎｃ．）、リビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）、ニュージャージー州）で処理し、その後に１．９ｃｍの米国標準スクリーンを備えたスウェコ（Ｓｗｅｃｏ）スクリーンでスクリーニングした。約８０５ｇの粉砕トウモロコシ穂軸をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約７％であった。負荷に先立ち、反応容器内の雰囲気を窒素で５回フラッシュした。実験開始前、全く摩擦媒体を有しない反応器を回転させずに７５℃に予備加熱した。反応容器内の温度が７５℃で安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、回転を１９ｒｐｍに調節した。次いで、アンモニア６ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度および固体濃度としてバイオマスの乾燥重量５０ｇ／バイオマス−アンモニア混合物の総重量１００ｇを得るために、適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。１ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのエタノールもまた溶液に添加した。アンモニア溶液を加熱ループを通して、２ガルのパール（Ｐａｒｒ）反応器を使用して作り上げた、約７５℃に加熱した水槽にポンピングした。加熱された希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。反応器を１９ｒｐｍで回転させながら７５℃で２時間維持した。その時間の最後に、真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に３０分間適用し、アンモニアを除去し、反応器の内容物の温度を約５０℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をＣＯ_２のゲージ圧が１０３ｋＰａになるまで加圧し、５０℃で３０分間圧力保持した。

この後、反応器を減圧し、開放し、摩擦媒体を添加した。内容物のｐＨを、注入ランスを使用してｐＨ４．８の１Ｍクエン酸緩衝液を注入して約５．５に調節し、クエン酸緩衝液の強度を約７５ｍｌに増加させるとともにクエン酸一水和物を添加した。真空ステップにおいて除去し、またはＣＯ_２で中和したのはアンモニアのすべてではなかった。クエン酸緩衝液を５０℃に加熱してから反応器に注入し、次いで反応器を５０℃および１９ｒｐｍで１時間インキュベートすることで内容物を平衡化しておいた。反応器を回転させながら注入ランスを使用してクエン酸緩衝液を注入することにより、緩衝液の前処理されたトウモロコシ穂軸粒子上へのさらに均一なスプレーおよび分布が可能であった。反応器をインキュベータから取り出し、開放し、試料のｐＨを測定した。もしｐＨが５．５より大きい場合、さらなる固体クエン酸一水和物を添加し、反応器を混合しながら５０℃でさらに１時間インキュベートした。このプロセスをｐＨが約５．５になるまで繰り返した。一旦所望のｐＨに達すると、１２．９ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））および５ｍｇの活性タンパク質／ｇの、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼよりなるセルロース酵素コンソーシアムを反応器に負荷した。反応器を５０℃および１９ｒｐｍで７２時間インキュベータ内で維持した。この前処理および糖化の後、単量体グルコースの収率は６２．０％および単量体キシロースの収率は３１．０％であった。全グルコースの収率は７５．２％および全キシロースは８０．３％であった。

実施例１６
トウモロコシ穂軸のより高い固体濃度での極めて少量のアンモニアを用いた前処理および代替条件
全粒トウモロコシ穂軸をハンマーミル（１０インチのハンマーミル、グレン・ミル（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ Ｉｎｃ．）、クリフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ）、ニューハンプシャー州）で処理し、１．２７ｃｍのスクリーンを通過させた。約８０５ｇの粉砕トウモロコシ穂軸をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約７％であった。２２個のセラミック製の摩擦シリンダー（直径３．２ｃｍ×長さ３．２ｃｍ；Ｅ．Ｒ．アドバンスド・セラミックス（Ｅ．Ｒ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｒａｍｉｃｓ）、イーストパレスタイン（Ｅａｓｔ Ｐａｌｅｓｔｉｎｅ）、オハイオ州）も反応器に添加した。実験開始前、反応器を回転させずに９５℃に予備加熱した。開始前に真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に適用し、容器を密封した。反応容器内の温度が９５℃で安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、かつ回転を１９ｒｐｍに調節した。次いで、アンモニア６ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度および固体濃度としてバイオマスの乾燥重量５０ｇ／バイオマス−アンモニア混合物の総重量１００ｇを得るために、適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。アンモニア溶液を加熱ループを通して、２ガルのパール（Ｐａｒｒ）反応器を使用して作り上げた、沸騰した水槽内にポンピングした。加熱した希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。反応器を１９ｒｐｍで回転させながら９５℃で２時間維持した。その時間の最後に、真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に３０分間適用し、アンモニアを除去しかつ反応器の内容物の温度を約５０℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をゲージ圧１０３ｋＰａまで加圧し、５０℃で３０分間圧力保持した。

この後、反応器を減圧し、開放し、内容物のｐＨを、ｐＨ４．８の１Ｍクエン酸緩衝液を注入することによって約５．５に調節し、その中にクエン酸一水和物を添加および溶解した。クエン酸緩衝液を５０℃に加熱してから反応器に注入し、次いで反応器を５０℃および１９ｒｐｍで１時間インキュベートすることで内容物を平衡化しておいた。反応器を回転させながら注入ランスを使用してクエン酸緩衝液を注入することにより、緩衝液の前処理されたトウモロコシ穂軸粒子上へのさらに均一なスプレーおよび分布が可能であった。反応器をインキュベータから取り出し、開放し、試料のｐＨを測定した。もしｐＨが５．５より大きい場合、さらなる固体クエン酸一水和物を添加し、反応器を混合しながら５０℃でさらに１時間インキュベートした。このプロセスをｐＨが約５．５になるまで繰り返した。一旦所望のｐＨに達すると、１２．９ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））および５ｍｇの活性タンパク質／ｇの、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼよりなるセルロース酵素コンソーシアムを反応器に負荷した。反応器を５０℃および１９ｒｐｍで７２時間インキュベータ内で維持した。この前処理および糖化の後、単量体グルコースの収率は５０．７％および単量体キシロースの収率は３５．７％であった。全グルコースおよび全キシロースの収率は、それぞれ７１．７％および８９．８％であった。

実施例１７
トウモロコシ穂軸の極めて少量のアンモニアおよび追加塩基を用いた前処理
全粒トウモロコシ穂軸を約０．９５ｃｍのジョー間隔を有するジョークラッシャー（２．２ｋＷモーター）、その後にデランパー（１．５ｋＷモーター、フランクリン・ミラー（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｍｉｌｌｅｒ Ｉｎｃ．））で処理し、その後に１．９ｃｍの米国標準スクリーンを備えたスウェコ（Ｓｗｅｃｏ）スクリーンでスクリーニングした。約４６０ｇの粉砕トウモロコシ穂軸をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約７％であった。実験開始前、反応器を回転させずに９５℃に予備加熱した。開始前に真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に適用し、容器を密封した。容器内の温度が９５℃で再安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、かつ回転を１９ｒｐｍに調節した。次いで、固体濃度としてバイオマスの乾燥重量３０ｇ／バイオマス−アンモニア混合物の総重量１００ｇを維持する一方、ＮａＯＨ１．９ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇの濃度を得るための、アンモニア３．２ｇ／バイオマスおよびＮａＯＨの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度を得るための適量の水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。アンモニアおよび追加塩基の溶液を加熱ループを通して、２ガルのパール（Ｐａｒｒ）反応器を使用して作り上げた、沸騰した水槽内にポンピングした。加熱した希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。注入後、容器における真空を大気圧に解放した。反応器を９５℃で３０分維持し、次いで温度を８５℃に低下させ、ここではそれを４時間維持した。その時間の最後に、真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に３０分間適用し、アンモニアを除去しかつ反応器の内容物の温度を約５０℃に低下させた。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をゲージ圧１０３ｋＰａまで加圧し、５０℃で３０分間圧力保持した。

この後、反応器を減圧し、開放し、内容物のｐＨを、ｐＨ４．８の１Ｍクエン酸緩衝液約７５ｍｌを注入することによって約５．５に調節し、その中にクエン酸一水和物を添加および溶解した。クエン酸緩衝液を５０℃に加熱してから反応器に注入し、次いで反応器を５０℃および１９ｒｐｍで１時間インキュベートすることで内容物を平衡化しておいた。反応器を回転させながら注入ランスを使用してクエン酸緩衝液を注入することにより、緩衝液の前処理されたトウモロコシ穂軸粒子上へのさらに均一なスプレーおよび分布が可能であった。反応器をインキュベータから取り出し、開放し、試料のｐＨを測定した。もしｐＨが５．５より大きい場合、さらなる固体クエン酸一水和物を添加し、反応器を混合しながら５０℃でさらに１時間インキュベートした。このプロセスをｐＨが約５．５になるまで繰り返した。一旦所望のｐＨに達すると、２８．４ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））および２８．４ｍｇ／ｇのセルロースのマルチフェクト（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ）を反応器に負荷した。反応器を５０℃および１９ｒｐｍで７２時間インキュベータ内で維持した。この前処理および糖化の後、単量体グルコースの収率は５６．１％および単量体キシロースの収率は３９．５％であった。全グルコースおよび全キシロースの収率は、それぞれ８２．８％および８４．２％であった。これらの値は２つの実験の平均である。

実施例１８
室温および極めて少量のアンモニアでの前処理
全粒トウモロコシ穂軸を、約３／８インチのジョー間隔を有するジョークラッシャー（２．２ｋＷモーター）、その後にデランパー（１．５ｋＷモーター、フランクリン・ミラー（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｍｉｌｌｅｒ Ｉｎｃ．））で加工した後、１．９ｃｍの米国標準スクリーンを具備したスウェコ（Ｓｗｅｃｏ）製スクリーンでスクリーニングした。約４６０ｇの粉砕トウモロコシ穂軸をＰＥＨＲｅａｃｔｏｒに負荷した。トウモロコシ穂軸中の含水率は約７％であった。２２個のセラミック製摩擦シリンダー（直径３．２ｃｍｘ長さ３．２ｃｍ；Ｅ．Ｒ．アドバンスド・セラミックス（Ｅ．Ｒ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｒａｍｉｃｓ）、イーストパレスタイン（Ｅａｓｔ Ｐａｌｅｓｔｉｎｅ）、オハイオ州）も反応器に添加した。開始前には真空（約８５ｋＰａ）を反応容器に適用し、容器を密封した。反応器内の温度が室温（２２〜２６℃）で再安定化した時、インキュベータ内の回転機構を作動させ、回転を１９ｒｐｍに調節した。次いで、固体濃度としてバイオマスの乾燥重量３０ｇ／バイオマス−アンモニア混合物の総重量を維持する一方、アンモニア４ｇ／バイオマスの乾燥重量１００ｇのアンモニア濃度を得るための適量の希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器内にポンピングした。希釈水酸化アンモニウム溶液を、注入ランスを介して反応容器に注入し、反応器内で回転し転がる粉砕トウモロコシ穂軸上にスプレーした。注入後、各容器における真空を大気圧に解放した。反応器を室温（２２〜２６℃）で２４時間維持した。その時間の最後に、真空（約８１ｋＰａ）を反応容器に３０分間適用し、アンモニアを除去した。次いで、二酸化炭素を反応器に注入して真空を解放し、反応器をＣＯ_２を用いて１０３ｋＰａゲージ圧に加圧し、室温で３０分間圧力保持した。

この後、反応器を減圧し、開放し、内容物のｐＨを、５０℃に加熱してからクエン酸一水和物を添加することによって約５．５に調節し、次いで反応器を５０℃および１９ｒｐｍでインキュベートすることで平衡化しておいた。反応器をインキュベータから取り出し、開放し、試料のｐＨを測定した。もしｐＨが５．５より大きい場合、さらなる固体クエン酸一水和物を添加し、反応器を混合しながら５０℃でインキュベートした。このプロセスをｐＨが約５．５になるまで繰り返した。一旦所望のｐＨに達すると、１２．９ｍｇ／ｇのセルロース、スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）ＣＰ（ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））および５ｍｇの活性タンパク質／ｇのβ−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼよりなるセルロース酵素コンソーシアムを反応器に負荷した。反応器を５０℃および１９ｒｐｍで７２時間インキュベータ内で維持した。この前処理および糖化の後、単量体グルコースの収率は４１．７％および単量体キシロースの収率は２５．４％であった。全グルコースおよび全キシロースの収率は、それぞれ５０．１％および５３．２％であった。これらの値は２つの実験の平均である。

アセトアミドおよび酢酸の存在下または非存在下でのチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１Ａ１号明細書、実施例ＩＶ、ＶＩおよびＸＩＩに記載）の成長を示す。

Claims (35)

1. ａ）バイオマスをアンモニアを含んでなる水溶液と接触させ、ここで、アンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを維持するために少なくとも十分な濃度で存在するが、該アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して１２重量パーセント未満で存在し、かつさらにバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも１５重量パーセントの高固体濃度にあり、
   ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、発酵性糖を生成せしめる条件下で糖化酵素コンソーシアムと接触させ、
   ｃ）発酵条件下でステップ（ｂ）の生成物を生体触媒と接触させ、エタノールを生成せしめる、
   ことを含んでなるエタノールの製造方法。
2. 生体触媒が細菌、糸状真菌および酵母よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. 生体触媒がエシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、チモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）よりなる群から選択される野生型微生物、変異微生物、または組換え微生物である請求項１に記載の方法。
4. 生体触媒が組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・スチピチス（
   Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
5. 該生体触媒が組換えチモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）である請求項１に記載の方法。
6. ステップ（ｂ）および（ｃ）を同時に実施する請求項１に記載の方法。
7. バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨが８より大きい請求項１に記載の方法。
8. バイオマスとアンモニアを含んでなる水溶液との接触に先立ち、バイオマスに真空を適用する請求項１に記載の方法。
9. 該バイオマスの乾燥重量が少なくとも１５％〜８０％の高固体濃度にある請求項１に記載の方法。
10. 該バイオマスの乾燥重量が少なくとも１５％〜６０％の高固体濃度にある請求項９に記載の方法。
11. 該アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して１０重量パーセント未満で存在する請求項１に記載の方法。
12. 該アンモニアがバイオマスの乾燥重量に対して６％もしくはそれ以下の重量パーセントで存在する請求項１１に記載の方法。
13. バイオマスがバイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、工場廃棄物、木材および林業廃棄物よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
14. バイオマスがスイッチグラス、紙くず、製紙汚泥、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮、コーンストーバー、草、小麦、小麦のわら、まぐさ、大麦、大麦のわら、稲わら、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花ならびに動物糞尿よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
15. バイオマスがトウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシの皮、サトウキビバガス、おがくず、スイッチグラス、小麦のわら、まぐさ、大麦のわら、稲わら、および草よりなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
16. バイオマスがトウモロコシ穂軸、コーンストーバー、おがくず、およびサトウキビバガスよりなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
17. アンモニアがアンモニアガス、水酸化アンモニウム、尿素、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
18. （ａ）を４℃〜２００℃の温度で実施する請求項１に記載の方法。
19. （ａ）を７５℃〜１５０℃の温度で実施する請求項１８に記載の方法。
20. （ａ）を９０℃より高く１５０℃までの温度で実施する請求項１９に記載の方法。
21. （ａ）を最大２５時間の期間実施する請求項１に記載の方法。
22. （ａ）を最大８時間の期間実施する請求項２１に記載の方法。
23. ａ）のアンモニアの少なくとも一部を（ｂ）に先立ち除去する請求項１または６に記載の方法。
24. （ａ）からのアンモニアをリサイクルする請求項２３に記載の方法。
25. （ｂ）の接触が少なくとも１５％のバイオマス濃度の乾燥重量で行われる請求項１に記載の方法。
26. （ａ）、（ｂ）または（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回繰り返す請求項１に記載の方法。
27. （ａ）において少なくとも１種の可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせを添加することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
28. 該少なくとも１種の可塑剤、柔軟剤またはこれらの組み合わせがポリオール、ポリオールのエステル、グリコールエーテル、アセトアミド、エタノール、およびエタノールアミンよりなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
29. （ａ）の前または間、（ｂ）の前または間、あるいはそれらの組み合わせにおいてエネルギーを適用することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
30. 該エネルギーがミリング、クラッシング、粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニング、超音波およびマイクロ波よりなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
31. 糖化に先立ち、発酵からの二酸化炭素を使用して前処理混合物のｐＨを調節する請求項１に記載の方法。
32. 該糖化酵素コンソーシアムが少なくとも１種のグリコシダーゼを含んでなる請求項１に記載の方法。
33. 該糖化酵素コンソーシアムがセルロース−加水分解性グリコシダーゼ、ヘミセルロース−加水分解性グリコシダーゼ、澱粉−加水分解性グリコシダーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含んでなる請求項１に記載の方法。
34. 該糖化酵素コンソーシアムがセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含んでなる請求項１に記載の方法。
35. （ｂ）を１５℃〜１００℃の温度および２〜１１のｐＨで実施する請求項１に記載の方法。

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