BRPI0612937A2

BRPI0612937A2 - sistema de processamento de biomassa em bateladas, processos de tratamento de biomassa, processo de tratamento prévio de biomassa, processo de sacarificação de biomassa e método de otimização de processo de tratamento

Info

Publication number: BRPI0612937A2
Application number: BRPI0612937-4A
Authority: BR
Inventors: James B Dunson; Melvin Tucker; Richard Elander; Robert C Lyons
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2010-12-07
Also published as: EP1869201B1; WO2006110891A3; JP4991700B2; JP2008537886A; EP1869194A2; US7932063B2; CN101155928A; CA2603128C; US20070037259A1; WO2006110901A2; CN101155925A; CA2604964C; CN101160388B; US7998713B2; CN101160409A; CN101160405B; BRPI0612966B1; WO2006110899A2; EP1869202A2; US7910338B2

Abstract

SISTEMA DE PROCESSAMENTO DE BIOMASSA EM BATELADAS, PROCESSOS DE TRATAMENTO DE BIOMASSA, PROCESSO DE TRATAMENTO PRéVIO DE BIOMASSA, PROCESSO DE SACARIFICAçãO DE BIOMASSA E MéTODO DE OTIMIZAçãO DE PROCESSO DE TRATAMENTO. é apresentado um sistema que inclui um aparelho para tratamento de biomassa que permite o tratamento bem sucedido de biomassa em alto peso seco de sólidos de biomassa na mistura de biomassa. O projeto do sistema fornece extensa distribuição de reagente por meio da difusão do reagente sobre a biomassa à medida que o reagente é introduzido através de lança de injeção, enquanto a biomassa é girada utilizando pás (18). O sistema de aparelho fornece extensa assimilação do reagente na biomassa utilizando pás (18) para erguer e deixar cair a biomassa, bem como meios de atrito (19) que caem sobre a biomassa para melhorar o processo de tratamento.

Description

"SISTEMA DE PROCESSAMENTO DE BIOMASSA EM BATELADAS,PROCESSOS DE TRATAMENTO DE BIOMASSA, PROCESSO DETRATAMENTO PRÉVIO DE BIOMASSA, PROCESSO DE SACARIFICAÇÃODE BIOMASSA E MÉTODO DE OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE TRATAMENTO"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioNorte-Americano n° 60/670437, depositado em doze de abril de 2005.

Declaração de Direitos Governamentais

A presente invenção foi realizada com apoio do governo dosEstados Unidos com base no Contrato n° 04-03-CA-70224 concedido peloDepartamento de Energia. O governo detém certos direitos na presenteinvenção.

Campo da Invenção

É fornecido um sistema que inclui um aparelho para o tratamentode biomassa, incluindo tratamento prévio bem como sacarificação. Tambémsão fornecidos processos de tratamento prévio e sacarificação de biomassa emalto peso seco de biomassa em uma mistura de biomassa, utilizando o sistema.Além disso, são fornecidos métodos de otimização de processos de tratamentode biomassa.

Antecedentes da Invenção

Estoques de alimentação e resíduos celulósicos elignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos florestais,lodo de fabricação de papel e resíduos sólidos municipais e industriaisfornecem estoque de alimentação de biomassa renovável potencialmentegrande para a produção de substâncias, plásticos, combustíveis e alimentos.Estoques de alimentação e resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostosde polímeros de carboidrato que compreendem celulose, hemicelulose,glucanos e Iignina são geralmente tratados por uma série de meios químicos,mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente açúcares de hexose epentose, que podem ser fermentados em seguida em produtos úteis. Acomplexidade e a eficiência destes tratamentos variam. Além disso, existemvários esforços contínuos para identificar novos processos comercialmenterobustos e para otimizar processos conhecidos para gerar produtosfermentativos úteis a partir de estoques de alimentação celulósicos elignocelulósicos.

Para que seja um processo economicamente competitivo, umprocesso comercial de produção de açúcares fermentáveis a partir debiomassa de recursos renováveis requer a hidrólise de carboidratos embiomassa lignocelulósica para fornecer altos rendimentos de açúcares em altasconcentrações, utilizando baixas quantidades de substâncias, para produziruma fonte de açúcares fermentáveis com baixa toxicidade para organismosfermentativos que convertem açúcares em substâncias com valor agregado ecombustíveis.

Para conduzir estes processos, empregou-se uma série deaparelhos para diferentes tipos de biomassa, bem como para diferentestratamentos, incluindo desenvolvimento de processo em pequena escala ealgum equipamento de produção em larga escala. Alguns tipos de aparelhosque vêm sendo utilizados incluem reator agitado em bateladas (Gusakov eSinitsyn (1985), Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), reator agitado de fluxocontínuo (US 4.257.818), reator de atrito (Ryu e Lee (1983), Biotechnol.Bioeng. 25: 53-65), reator de extrusão (US 6.176.176), reator de leito decontração NREL (Lee et al (2001), Appl. Biochem. Biotech. 91-93: 331-340) ereator com agitação intensiva induzida por campo eletromagnético (Gusakov etal (1996), Appi Biochem. Biotechnol., 56: 141-153).

É particularmente necessário um reator que seja capaz defornecer meios de tratamento prévio eficiente de biomassa e/ou sacarificaçãoem alto peso seco de biomassa em mistura.

Permanece a necessidade de um aparelho simples mas eficazpara uso em processos de tratamento de biomassa, que possam ser utilizadosem formato de pequena escala para testar condições de processo, commecanismos de amostragem que imitam operações em larga escala comercial.

Além disso, existe necessidade não atendida de equipamentos e processoscomercialmente robustos para conduzir esses processos, que incluemsacarificação em alto peso seco de biomassa em mistura de biomassa.

Descrição Resumida da Invenção

Em uma realização, a presente invenção fornece sistema queinclui aparelho para processamento de biomassa em bateladas, quecompreende:

a. um aparelho que compreende:

i. um recipiente de reação cilíndrico com abertura em pelomenos uma extremidade;

ii. uma ou mais pás fixadas ao lado interno do mencionadorecipiente;

iii. meios de atrito que compreendem pelotas em livreflutuação no interior do recipiente de reação;

iv. um tampa para a extremidade aberta do mencionadorecipiente, que compreende uma ou mais portas; e

v. uma lança de injeção que compreende meio defornecimento de reagente de processamento, em que o mencionado meio éuma lança de injeção que se estende pelo comprimento do recipiente dereação e conecta-se a primeira porta na tampa de iv); e

b. meios de rotação das pás do recipiente.

Em outra realização, a presente invenção fornece um processo detratamento de biomassa que compreende:a. introdução de biomassa no recipiente de reação doaparelho de acordo com a reivindicação 1;

b. introdução de um reagente de processamento no recipientede reação; e

c. assimilação do mencionado reagente de processamento namencionada biomassa por meio de rotação das pás do recipiente de rotação,por meio do quê as pás erguem e deixam cair os meios de atrito.

Em outra realização, a presente invenção fornece processo detratamento de biomassa que compreende:

a. tratamento prévio de biomassa no recipiente de reação doaparelho de acordo com a reivindicação 1, produzindo biomassa previamentetratada;

b. ajuste da temperatura e do pH da biomassa previamentetratada de a) no recipiente de reação; e

c. sacarificação da biomassa previamente tratada ajustada deb) no recipiente de reação.

Em ainda outra realização, a presente invenção fornece métodode otimização de processo de tratamento que compreende:

a. introdução de biomassa no recipiente de reação doaparelho de acordo com a reivindicação 1;

b. variação das condições de tratamento no recipiente dereação;

c. amostragem da biomassa tratada por meio da mencionadauma ou mais portas sob as mencionadas condições de tratamento variáveis; e

d. teste das mencionadas amostras para determinarcondições de tratamento ideais para o processamento de biomassa.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe representação esquemática de realização dosistema de tratamento de biomassa.

A Figura 2A exibe desenho detalhado de realização do sistema detratamento de biomassa. A Figura 2B exibe desenho da tampa do recipiente dereação.

Descrição Detalhada da Invenção

Os Depositantes incorporam especificamente o conteúdo integralde todas as referências mencionadas no presente relatório descritivo. Alémdisso, quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro forfornecido na forma de faixa, faixa preferida ou lista de valores preferíveissuperiores e valores preferíveis inferiores, deve-se compreender isso comodescrevendo especificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer parde qualquer limite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixainferior ou valor preferido, independentemente de se as faixas são descritasseparadamente. Quando uma série de valores numéricos for indicada nopresente, a menos que informado em contrário, a faixa destina-se a incluir osseus pontos finais e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Nãose pretende que o escopo da presente invenção seja limitado aos valoresespecíficos indicados ao definir faixa.

A presente invenção fornece um sistema que inclui aparelhoutilizado em processos de tratamento de biomassa, bem como processos detratamento de biomassa e métodos de otimização de processo de tratamentoque são conduzidos no aparelho. O projeto do sistema fornece extensadistribuição de reagente por meio de difusão do reagente sobre a biomassa àmedida que o reagente é introduzido ou o reator é conduzido. O sistemafunciona para fornecer extensa assimilação do reagente introduzido nabiomassa para melhorar o processo de tratamento. Estas característicaspermitem tratamento em alto peso seco de biomassa em mistura debiomassa.Definições:

No presente relatório descritivo, é utilizada uma série de termos.São fornecidas as definições a seguir:

A expressão "açúcar fermentável" designa oligossacarídeos emonossacarídeos que podem ser utilizados como fonte de carbono pormicroorganismo em processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" designa composição que compreendelignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreenderhemicelulose.

O termo "celulósico" designa uma composição que compreendecelulose.

Por "peso seco" de biomassa, indica-se o peso da biomassa quepossui toda ou essencialmente toda a água removida. Peso seco é tipicamentemedido de acordo com o Padrão E1756-01 da Sociedade Norte-Americana deTestes e Materiais (ASTM) (Standard Test Method for Determination of TotalSolids in Biomass) ou o Padrão T-412 om-02 da Technical Association of thePulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) (Moisture in Pulp, Paper andPaperboard).

O termo "sacarificação" designa a produção de açúcaresfermentáveis a partir de polissacarídeos.

A expressão "biomassa previamente tratada" indica biomassa quetenha sido submetida a tratamento prévio antes da sacarificação.

"Biomassa" indica qualquer material celulósico ou lignocelulósicoe inclui materiais que compreendem celulose, compreendendo aindaopcionalmente hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/oumonossacarídeos. Biomassa pode também compreender componentesadicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Segundo a presente invenção,biomassa pode ser derivada de uma única fonte, ou biomassa podecompreender mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa poderácompreender, por exemplo, mistura de espigas de milho e forragem de milhoou mistura de grama e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safrasbioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólidoindustrial, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardins, resíduos demadeira e de florestas. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se agrãos de milho, espigas de milho, resíduos de safras tais como cascas demilho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, cevada, palha decevada, feno, palha de arroz, brotos de grama, resíduos de papel, bagaço decana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos por meio do processamentode cereais, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem,arbustos e moitas, legumes, frutas, flores e esterco animal. Em uma realização,biomassa que é útil para a presente invenção inclui biomassa que possui valorde carboidrato relativamente alto, é relativamente densa e/ou de coleta,transporte, armazenagem e/ou manipulação relativamente fácil. Em umarealização da presente invenção, biomassa que é útil inclui espigas de milho,forragem de milho e bagaço de cana de açúcar.

"Solução aquosa que compreende amônia" designa o uso de gásamônia (NH3), compostos que compreendem íons de amônio (NH/) tais comohidróxido de amônio ou sulfato de amônio, compostos que liberam amôniamediante degradação tais como uréia e suas combinações em meio aquoso.

O termo "tratamento" indica processo de ação de reagente sobrematerial, em que as propriedades físicas e/ou químicas do material sãoalteradas.

O termo "reagente" indica composição que é capaz de alterar aspropriedades físicas e/ou químicas de material alvo sob condições utilizadasem processo de tratamento.

"Associação de enzimas" para sacarificação é uma combinaçãode enzimas que são capazes de agir como mistura de biomassa para produziraçúcares fermentáveis. Tipicamente, associação de enzimas de sacarificaçãopode compreender uma ou mais glicosidases; as glicosidases podem serselecionadas a partir do grupo que consiste de glicosidases hidrolisantes decelulose, glicosidases hidrolisantes de hemicelulose e glicosidaseshidrolisantes de amido. Outras enzimas na associação de enzimas desacarificação podem incluir peptidases, lipases, Iigninases e feruloil esterases.

Sistema de tratamento de biomassa:

O sistema de processamento de biomassa do presente pode sermelhor compreendido por meio de referência ao desenho esquemático daFigura 1, que exibe uma realização do sistema. O aparelho do sistemacompreende um recipiente de reação cilíndrico (10) que contém umaextremidade fechada (11) e uma extremidade aberta (12). Uma tamparemovível (13) encaixa-se sobre a extremidade aberta e pode ser fixadaseguramente à extremidade aberta do recipiente. Na cobertura existe pelomenos uma porta. Uma lança de injeção (14) estende-se através da porta, quese encontra no centro da tampa (15) para o recipiente de reação. A lança deinjeção é um tubo que se estende a partir da porta através do centrolongitudinal do recipiente de reação cilíndrico. A extremidade da lança deinjeção que é mais distante da porta (16) é vedada. A lança de injeção contémorifícios ao longo do seu comprimento que são dispostos em forma de V (17).

Estes orifícios permitem a fuga de conteúdo do interior da lança de injeção parao recipiente de reação em direção vertical a cerca de dez horas e duas horas.

Além disso, fonte de vácuo pode ser aplicada através da porta à qual éconectada a lança, de forma a criar vácuo no interior do recipiente. Fixadas àsuperfície interna do recipiente de reação, encontram-se pás (18) que seestendem para o espaço aberto no recipiente e não tocam a lança de injeção.No lado interno do recipiente de reação, encontram-se meios de atrito em livreflutuação (19). O aparelho é colocado horizontalmente sobre rolos (20) que sãoutilizados para girar o recipiente de reação no sistema de processamento debiomassa.

Durante o processamento de biomassa, o aparelho é mantido emposição horizontal e são aplicados meios de rotação das pás do recipiente dereação em volta do eixo longitudinal do recipiente para formar sistema deprocessamento de biomassa. As pás podem ser fixadas à superfície interna daparede do recipiente de reação, caso em que todo o recipiente é girado.

Alternativamente, as pás podem ser fixadas a tipo de manga de superfíciesobre o lado interno do recipiente de reação, caso em que o próprio recipienteé estacionário enquanto a manga gira. A rotação do recipiente ou da mangapode ser realizada por meio de qualquer método que forneça rotação. Paragirar o recipiente, por exemplo, ele pode ser colocado sobre rolos externos,cintas, rodas, mancais de pino ou outras plataformas indutoras de movimentorolante. O aparelho pode ser abrigado em reator que proporcione rotação aorecipiente, ou o mecanismo de rotação pode ser integrado ao aparelho. Podehaver eixo de direcionamento que se estende através do recipiente que éfixado à parede do recipiente ou à manga para aplicar rotação. A velocidade derotação pode variar, dependendo do processo de tratamento específico sendoutilizado e do tamanho do aparelho. A velocidade de rotação é suficiente parapromover cascata de meios de atrito, conforme descrito abaixo no presente, epode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto.

A tampa para a extremidade aberta do recipiente de reação podeser fixada ao recipiente por meios conhecidos na técnica, tais como comparafusos, grampos, barras, cães ou outros fixadores. O recipiente de reaçãopode ser aberto nas duas extremidades, com tampa para cada extremidade.A(s) porta(s) na tampa (ou ambas as tampas, caso haja uma em cadaextremidade) é (são) abertura(s) para acesso ao lado interno do recipiente dereação. Porta pode ser local de fixação de equipamento interno, tal como alança, e/ou de equipamento externo, tal como aparelho de injeção de gás ouvácuo. A fixação do equipamento externo pode ser temporária, somentequando necessário durante o processo de tratamento, ou permanente. A portapode, portanto, possuir conector, bem como tampa para fechar a porta quandofora de uso. Conectores convencionais são utilizados para unir a(s) porta(s)na(s) tampa(s), incluindo conector ramificado e junta giratória. Porta podetambém ser abertura na tampa para fornecer acesso ao lado interno, tal comopara tomada de amostras ou liberação de pressão, e pode também possuirtampa.

Para processamento de biomassa, a temperatura do aparelho étrazida para a temperatura desejada e controlada. O controle da temperaturado aparelho pode ser obtido por meio de qualquer método pelo qual se apliquecalor, tal como por meio de aplicação de revestimento de aquecimento, injeçãode gás quente através da lança de injeção ou através de outra porta, ignição degás inflamável ou uso de aquecimento a gás de cano de resíduos deaquecedor. Alternativamente, o aparelho pode ser abrigado em forno, banho deóleo ou outro tipo de reator que forneça calor para o aparelho. A temperaturainterna do aparelho pode ser determinada por meio de inserção de dispositivode medição de temperatura, tal como termopar, através da porta na tampa queé conectada à lança de injeção e para baixo pela lança de injeção. Inserindo-seo dispositivo de medição de temperatura a meio caminho para baixo da lançade injeção, pode ser determinada a temperatura no centro aproximado dorecipiente de reação. Pode-se impor o resfriamento do recipiente por meio demétodos tais como aplicação de gelo ou outro refrigerante em revestimento deresfriamento, passagem de gás frio através da lança de injeção, colocação doreator em banho refrigerante ou resfriamento (refrigeração) da caixa externa naqual assenta-se o recipiente de reação. Isso pode ser feito por mecanismoexterno ou por mecanismo do aparelho.

A lança de injeção fornece meios de introdução e distribuição desoluções ou gases ao longo do comprimento do recipiente de reação.Nitrogênio, CO2, vapor, reagente(s) de processamento e solução de ajuste dopH, por exemplo, podem ser introduzidos através da lança de injeção. Osreagentes de processamento que são introduzidos através da lança de injeçãopodem ser previamente aquecidos antes da injeção, utilizando qualquermétodo conhecido dos técnicos no assunto. O aquecimento de reagentes podeser conseguido, por exemplo, passando-se o reagente de processamentoatravés de bobina de aquecimento que é conectada à lança de injeção atravésda porta central na tampa. A bobina de aquecimento é imersa em banho deágua aquecida, que é mantido sob temperatura desejável para aquecimento doreagente de processamento.

Pode-se aplicar vácuo ao recipiente de reação do aparelho pormeio de porta na tampa. Fonte de vácuo pode ser conectada a porta na tampa,tipicamente à porta que é conectada à lança de injeção. Conector ramificado oujunção giratória fornece conexão para o vácuo e acesso para o reagente àlança injetora. Pode-se utilizar vácuo para auxiliar na infiltração de reagente deprocessamento em biomassa do recipiente de reação. Aplicando-se vácuo aorecipiente que contém biomassa, pode-se evacuar ar da biomassa, o quepermite melhor penetração do reagente de processamento quando adicionado.

Além disso, ar no reator pode ser substituído com atmosfera inerte tal como N2ou argônio. Pode-se aplicar vácuo para ajudar a resfriar o conteúdo dorecipiente de reação, ao utilizar-se processo que seja adequado pararesfriamento evaporativo. Os gases criados durante processo de tratamento debiomassa podem ser recuperados por meio da aplicação de vácuo e utilizandocondensador de ventilação. Fonte de vácuo e condensador de ventilaçãopodem ser fixados a porta na tampa, de tal forma que os vapores passematravés da porta e para o interior do condensador. Reagentes deprocessamento recuperados condensados, tais como amônia, podem serreutilizados em processos de tratamento de biomassa posteriores. A remoçãode amônia, quando utilizada em processamento de tratamento prévio, reduz opH da biomassa previamente tratada e, desta forma, economiza substânciasnecessárias para neutralizar a biomassa previamente tratada até pH ideal parasacarificação enzimática e fermentação de biocatalisador. O uso mais baixo desubstâncias também aumenta a fermentação subseqüente ao reduzir a cargade sal em contato com o microorganismo, de forma a aumentar o rendimento ea produtividade.

O recipiente de reação do aparelho pode também serpressurizado por meio de injeção através de porta na tampa. Fonte de CO2, porexemplo, pode ser conectada à porta na tampa que é conectada à lança deinjeção e o CO2 é injetado, por exemplo, para liberar vácuo no interior dorecipiente de reação, reduzir o pH e/ou promover de outra forma o processo detratamento de biomassa. Conector ramificado pode servir para conexão dafonte de CO2, fonte de vácuo e acesso para reagente à lança de injeção, tudoatravés da mesma porta.

Pás fixadas à superfície interna no recipiente de reação podemapresentar-se em qualquer forma, número e disposição que promova aassimilação de reagente de processamento na biomassa quando na presençade meios de atrito (descritos abaixo no presente). Os meios de atrito e abiomassa são erguidos pelas pás à medida que as pás giram em volta do fundodo recipiente e depois deslizam das pás à medida que giram em volta do topodo recipiente. As pás podem estender-se em orientação perpendicular àsuperfície interna ou podem estar em ângulo, com ângulo que permita oerguimento e deslizamento, ou movimento em cascata dos meios. As páspodem correr pelo comprimento do recipiente de reator de forma ininterrupta,ou pás com o comprimento parcial do reator podem ser colocadas em linha oucompensadas entre si. As pás estendem-se para o lado interno do recipiente,formando superfície que é suficientemente larga para erguer os meios de atritoe suficientemente estreita para que os meios de atrito deslizem facilmente àmedida que as pás movem-se em direção ao topo do recipiente. Os técnicos noassunto compreenderão que uma série de formas, posicionamento e númerosde pás será eficaz no movimento em cascata dos meios de atrito e biomassa àmedida que as pás giram para promover assimilação do reagente deprocessamento para a biomassa e que diferentes disposições serão ideais emrecipientes de reação com diferentes tamanhos.

O aparelho é fabricado com material geralmente não corrosivoque suportará pressões, temperaturas e reagentes de processamento que sãocomumente utilizados em processos de tratamento de biomassa. Exemplos demateriais não corrosivos incluem aço inoxidável, Hatelloy®, cerâmica,Inconel®, aço inoxidável duplex, zircônio e aço carbono. Diferentes processosde tratamento de biomassa são conduzidos sob temperaturas que variam de -10 0C a cerca de 220 0C, em que temperaturas típicas variam de 4 0C a 170 0C.

Além disso, processos de temperatura de biomassa podem ser conduzidos sobtemperaturas que variam da temperatura ambiente (cerca de 25 0C) a cerca de170 0C. As pressões utilizadas em processos de tratamento de biomassageralmente variam entre a atmosférica e cerca de 1200 kPa, com pressõestípicas variando da atmosférica a cera de 310 kPa e, mais tipicamente, decerca da atmosférica a 138 kPa. Os materiais utilizados em realizaçãoespecífica do aparelho são aqueles que suportam as condições do processo detratamento de biomassa específico a ser utilizado, como bem sabem ostécnicos no assunto. Em uma realização, material particularmente apropriadopara o recipiente de reação é aço inoxidável de espessura programada 10 quepode ser utilizado com pressões da atmosférica a cerca de 310 kPa etemperaturas de até cerca de 145 0C. Alternativamente, o aparelho pode serfabricado com outros materiais que suportem temperaturas e pressões maisaltas, bem como reagentes de processamento altamente corrosivos tais comoácidos fortes. Estas condições mais duras de tratamento de biomassa incluemtemperaturas de até cerca de 220 0C1 com pressões de até cerca de 1216 kPa,e reagentes ácidos fortes tais como ácido sulfúrico. Ao utilizar estas condiçõesde processamento, materiais tais como Hastelloy® e zircônio seriam eficazes.

O diâmetro do recipiente de reação é suficientemente grande paraque o recipiente possa englobar a lança de injeção e as pás, tendo ainda lugarpara meios de atrito que caem livremente em cascata à medida que as pásgiram. O recipiente de reação pode possuir diâmetro interno de cerca de 10cm, em que diâmetro interno típico é de pelo menos cerca de 15 cm, e podeser escalonado ainda mais, incluindo até tamanho comercial.

Os meios de atrito são introduzidos no aparelho e encontram-seem livre flutuação no recipiente de reação. Meios de atrito são adicionados detal forma que menos de cerca de 10% do volume do recipiente de reaçãosejam ocupados pelos meios de atrito. Tipicamente, os meios de atrito ocupamcerca de 3% a cerca de 7% do volume do recipiente de reação. Os meios deatrito podem ser de diferentes formas e tamanhos e são utilizados emdiferentes quantidades, dependendo do tamanho do recipiente de reação. Osmeios de atrito apropriados em tamanho, forma, quantidade e composição parauso em realização específica do aparelho podem ser determinados pelostécnicos no assunto. São particularmente úteis pelotas tais como cilindros feitosde material denso pesado com superfície dura, não porosa e resistente alascas que é resistente à erosão. Meios de atrito são disponíveiscomercialmente, por exemplo, por meio da E. R. Advanced Ceramics (EastPalestine, OH). À medida que as pás giram, os meios de atrito são erguidospelas pás e caem em seguida sobre a biomassa. A velocidade em que as pásgiram é ajustada de tal forma que os meios passam por este movimento emcascata, em vez de deslizarem pela parede do recipiente como ocorre emvelocidade muito baixa, ou permanecerem ao lado da parede do recipientecomo ocorre em velocidade muito alta. Sem desejar restrições à teoria,acredita-se que os meios de atrito depositados sobre a biomassa forneçampressão de esmagamento, que resulta em exudação de líquido que incluimistura de reagente de processamento e componentes de biomassasolubilizados. Líquido a granel substitui em seguida o líquido exudado gasto.

Erguimento do peso dos meios de atrito da biomassa, à medida que as pásgiram, permite a expansão da biomassa, em que a mistura de reagente deprocessamento infiltra-se na biomassa. A repetição desse esmagamento dabiomassa da mistura de reagentes de processamento e sua infiltração nela criaação de bombeamento. O bombeamento de mistura de reagentes para dentroe para fora da biomassa é tipo especializado de processo de mistura mecânicaque promove a assimilação de reagente na biomassa e, desta forma, melhora oprocesso de tratamento de biomassa. Esta troca de líquidos permiteconcentração mais alta de reagentes a serem trocados nos poros por líquidoesgotado que já tenha reagido nos poros da biomassa.

A descrição a seguir de uma realização da presente invenção nãose destina a ser limitadora, mas a fornecer estrutura de aparelhoparticularmente apropriada. Em uma realização, conforme exibido na Figura 2,o aparelho possui capacidade de cerca de nove litros em recipiente de reação(10) que possui 51 cm de comprimento com diâmetro interno de 15 cm. Ele éfabricado a partir de 304 canos e encaixes de aço inoxidável. A extremidadeaberta do recipiente (11) possui diâmetro de 10 cm, com quatro locais defixação de tampa igualmente espaçados (12), cada qual estendendo-se a 2,54cm para fora da abertura. A tampa (13) é placa circular com 15,2 cm dediâmetro. Existem duas portas na tampa, primeira porta no centro (14) esegunda porta entre o centro e uma extremidade (15), cada qual com 1,9 cmde diâmetro. A lança de injeção (16) estende-se através da porta central natampa e é conectada a junta giratória (17). Existe conector ramificado (18)fixado à junta giratória. A lança de injeção é fabricada com tubulação de açoinoxidável com 0,64 cm de diâmetro. Os orifícios na lança (19) possuemdiâmetro de 0,165 cm e estão localizados em intervalos de 2,54 cm em padrãode V. O ângulo entre as linhas de orifícios é de cerca de 120°. Existem duaslinhas de orifícios, com os orifícios em uma única linha localizada a 5,1 cm dedistância, e os orifícios nas duas linhas são compensados em 2,54 cm, deforma que, efetivamente, existe um orifício a cada 2,54 cm sobre ladosalternados da lança. A segunda porta na tampa fornece acesso para a tomadade amostras e adição de reagentes sem remoção da tampa. Existem quatropás (20), em que cada uma corre pelo comprimento da parede do recipiente dereação à qual são fixadas e estendem-se até 3,8 cm a partir da parede derecipiente interno, perpendicular àquela superfície. Vinte e dois cilindros demeios de atrito de 3,2 cm χ 3,2 cm (21), feitos de zircônia ou alumina(adquiridos da E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) são adicionadosao recipiente de reação, ocupando cerca de 5,5% do volume do recipiente. Oaparelho gira a cerca de 19 rpm durante processo de tratamento, colocando-seo aparelho sobre suporte de rolo (22; Bellco Cell Production Roller Apparatus,Bellco Technology, Vineland, NJ, Estados Unidos), para formar o sistema deprocessamento de biomassa. O suporte de rolo e aparelho são colocados nointerior de câmara incubadora (23) para controle da temperatura.

Equipamento externo é fixado ao aparelho da Figura 2 paraformar sistema, como nos exemplos a seguir. Para introdução de reagente detratamento prévio, bomba de HPLC capaz de velocidade de fluxo de cerca de800 ml/min sob pressão medida de 10342 kPa é conectada ao conectorgiratório de porta de lança de injeção ramificada na tampa. A bomba de HPLCé conectada por meio de bobina de aquecimento construída com tubulação deaço inoxidável de 0,32 cm que é imersa em água em recipiente de reator Parrde oito litros. O controlador de aquecedor de reator Parr é configurado acimado ponto de ebulição de água em Golden, CO (cerca de 93 0C) com entrada deaquecedor de 3 kW para manter ebulição rápida. Fonte de vácuo é fixada aoconector giratório de porta de lança de injeção ramificado na tampa. A fonte devácuo pode ser conectada a condensador de ventilação que é conectado abanho de água resfriada em operação a cerca de 1,5 0C. O condensador deventilação inclui frasco de dois litros revestido com Teflon® que é imerso embanho de água com gelo e é conectado a condutor a vácuo evacuado até cercade 85 kPa. Fonte de CO2 pode também ser conectada ao conector giratório deporta de lança de injeção.

Compreender-se-á que o sistema que inclui o aparelho pode serescalonado, com base nas características e princípios descritos no presente.

Aparelho que possui recipiente de reação com cerca de três a quatro metros dediâmetro e cerca de quinze a dezoito metros de comprimento é particularmenteapropriado para tratamento de biomassa em escala comercial. Aparelhos comrecipientes de reação com tamanhos intermediários ao descrito na Figura 2 eeste tamanho de escala comercial também são realizações do presenteaparelho.

Métodos de uso do aparelho no tratamento de biomassa:

O sistema do presente é projetado para o tratamento debiomassa, incluindo diferentes tipos de tratamento utilizando diferentesprocessos. Em uma realização, o sistema é utilizado em u m processo detratamento prévio de biomassa. Em outra realização, o sistema é empregadoem um processo de sacarificação de biomassa. Estes dois tipos de tratamentode biomassa podem ser conduzidos sucessivamente sobre a mesma amostrade biomassa, ou individualmente sobre diferentes amostras de biomassa. Umaamostra de biomassa pode ser previamente tratada em outro aparelho esacarificada no aparelho do presente sistema, ou amostra de biomassa podeser previamente tratada no presente aparelho e sacarificada em seguida emaparelho separado.

O presente sistema que inclui o aparelho é particularmenteapropriado para o tratamento de biomassa e particularmente para sacarificaçãode biomassa, em alto peso seco de biomassa na mistura de biomassa ereagente. O peso seco inicial de biomassa pode ser de até cerca de 80% dopeso da mistura de biomassa e reagente. Mais adequadamente, o peso secode biomassa é de até cerca de 60% do peso da mistura de biomassa ereagente. Prefere-se concentração inicial de biomassa que é de cerca de 15%a cerca de 50% do peso da mistura de biomassa e reagente. A introdução dereagente através da lança de injeção e o funcionamento dos meios de atrito epás proporciona assimilação do reagente na biomassa, de tal forma que oprocessamento em altas concentrações de biomassa seja eficaz. No contextode sacarificação, em que enzimas tais como celulases e hemicelulaseshidrolisam a biomassa para produzir açúcares fermentáveis, as enzimas sãoassimiladas na biomassa na mistura por meio de movimento em cascata dabiomassa e meios de atrito pelas pás giratórias do recipiente. Os efeitos dosmeios em cascata sobre a biomassa permitem o tratamento de biomassa emalto peso seco de biomassa na mistura de biomassa.

Em um processo de tratamento prévio, a biomassa é introduzidano presente aparelho através da extremidade aberta do recipiente de reação.Antes da introdução da biomassa no aparelho, pode-se aplicar energia àbiomassa para reduzir o tamanho e/ou aumentar a extensão exposta, tal comopor meio de moagem, fragmentação, quebra, retalhamento, corte, refino emdisco, ultrassom e microondas. A quantidade de biomassa introduzida dependedo tamanho do recipiente de reação e do processo de tratamento específico aser utilizado, e pode ser determinada pelos técnicos no assunto. O aparelhopode ser previamente aquecido até temperatura de processamento desejada.

Um reagente de processamento é injetado através de porta natampa de recipiente fixada e através da lança de injeção para o interior dorecipiente de reação. Em uma realização, o reagente é previamente aquecido eintroduzido por meio de pulverização através de orifícios na superfície superiorda lança de injeção enquanto as pás giram, de forma que o reagente entre emcontato com a biomassa à medida que passa acima da pulverização. Oreagente de processamento pode ser qualquer composição que seja utilizadaem processo de tratamento prévio de biomassa e que seja compatível com omaterial com o qual é construído o aparelho. Os reagentes de tratamentoprévio típicos incluem agentes oxidantes, desnaturantes, detergentes,solventes orgânicos e bases, cujas listas são fornecidas em US 2004/0231060,bem como ácidos. Alguns reagentes apropriados incluem ácido peracético(Teixeira et al (1999), Appl. Biochem. and Biotech. 77-79: 19-34), peróxido dehidrogênio (Gould (1983), Biotech. and Bioeng. 26: 46-52), hidróxido de sódio eperóxido de hidrogênio (Curreli et al (2002), Process Biochem. 37: 937-941),amônia aquosa (Kim e Lee (2005), Bioresource Tech. 96: 2007-2013) e amôniaanidra líquida (Teymouri et al (2005), Bioresource Tech. 96: 2014-2018). Umreagente de processamento particularmente apropriado para tratamento préviode biomassa no presente aparelho é amônia aquosa. É de maior preferênciasolução aquosa que compreende amônia utilizada em mistura de biomassa eamônia aquosa, em que a amônia está presente em concentração pelo menossuficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa e amônia aquosa,mas em que a amônia está presente em menos de cerca de 12% em peso comrelação ao peso seco de biomassa, conforme descrito no pedido copendenteCL2825.

A quantidade de reagente de processamento adicionada e,portanto, a concentração de biomassa podem variar, dependendo do processode tratamento prévio utilizado. É particularmente apropriado no presenteaparelho tratamento prévio em alta concentração de biomassa, em que o pesoseco de biomassa encontra-se em concentração inicial de pelo menos cerca de15% em peso com relação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa.A alta concentração de biomassa reduz o volume total de material previamentetratado, tornando o processo mais econômico. Além disso, com altaconcentração de biomassa, a necessidade de concentração de açúcares apósa sacarificação da biomassa previamente tratada para permitir altos títulos nafermentação é minimizada. O modo de compressão e infiltração de misturamecânica no presente aparelho, descrito acima, é particularmente apropriadopara processo de tratamento de biomassa em alto peso seco de biomassa namistura de biomassa.

Antes do carregamento de biomassa no presente aparelho, aatmosfera no recipiente do reator pode receber fluxo de nitrogênio ou qualqueroutro gás selecionado. Vácuo, por exemplo, é puxado e N2 é introduzidoatravés de porta para substituir o ar. Isso pode ser repetido tantas vezesquantas forem necessárias para substituir substancialmente o ar.

O aparelho que contém a biomassa e o reagente de tratamentoprévio possui sua temperatura controlada, conforme descrito acima nopresente. As pás do recipiente de reação são giradas, conforme descrito acimano presente. O período de tempo permitido para o processo de tratamentoprévio depende do processo específico sendo utilizado e varia tipicamente decerca de cinco minutos a cerca de oito horas. À medida que a reação éconduzida, amostras podem ser retiradas de porta na cobertura do aparelho.Estas amostras podem ser analisadas para determinar o término da reação detratamento prévio. Vários métodos analíticos podem ser utilizados, dependendodo processo de tratamento prévio sendo utilizado, tal como espectroscopiaperto de infravermelho (NIR)1 análise química completa ou por meio decondução de pequena sacarificação sobre amostra.

Ao utilizar um reagente que forma vapor sob as condições detratamento prévio, o vapor reagente pode ser recolhido por meio de aplicaçãode vácuo fixado a condensador de ventilação, conforme descrito acima nopresente. Tipicamente, após o término do processo de tratamento prévio, ovapor reagente é recolhido e condensado para que possa ser reutilizado. Umexemplo é a coleta de vapor de amônia ao utilizar-se amônia líquida comoreagente. O vapor de amônia recolhido pode ser liqüefeito e utilizado noreagente de processo para o tratamento prévio de biomassa adicional.

Biomassa previamente tratada pode ser removida do aparelho ouo segundo tipo de tratamento de biomassa, sacarificação, pode ser realizadosem a remoção da biomassa previamente tratada. Alternativamente, amostrade biomassa que tenha sido previamente tratada em aparelho separado podeser introduzida no presente aparelho para tratamento por sacarificação. Aquantidade de reagente de sacarificação adicionada e, portanto, aconcentração de biomassa, pode variar dependendo do processo desacarificação utilizado. O reagente de sacarificação é tipicamente injetadodiretamente no recipiente de reação utilizando a lança de injeção do presenteaparelho. A introdução de reagente de sacarificação por meio da lança deinjeção e o funcionamento dos meios de atrito e pás promovem assimilação doreagente na biomassa, de tal forma que a sacarificação em altasconcentrações de biomassa seja eficaz. Um reagente de sacarificação podeser introduzido através de porta na tampa ou no recipiente com a tampa aberta,em forma seca.

O peso seco de biomassa durante a sacarificação pode ser de atécerca de 80% do peso da mistura de biomassa e reagente. Maisadequadamente, o peso seco de biomassa é de até cerca de 60% do peso damistura de biomassa e reagente. Prefere-se concentração de biomassa inicialque seja de cerca de 15% a cerca de 40% do peso da mistura de biomassa ereagente. A alta concentração de biomassa reduz o volume total de materialsacarificado, o que torna o processo mais econômico. Ela demonstra a eficáciada associação de enzimas de sacarificação sob alto teor de biomassa em queos níveis de impurezas, substratos iniciais e produtos não são diluídos, em quevários processos de inibição e desativação poderão ter lugar. Sob baixaconcentração de biomassa, conforme utilizado tipicamente em sacarificação, aos potenciais processos de inibição e desativação são significativamentereduzidos ou inexistentes, devido ao alto fator de diluição. Além disso, com altaconcentração de biomassa, a necessidade de concentração de açúcares apósa sacarificação para produzir altos títulos em fermentação é minimizada. Omodo de infiltração e compressão da mistura mecânica no presente aparelho,descrito acima, é particularmente adequado para sacarificação em alto pesoseco de biomassa na mistura de biomassa.

O reagente de processamento de sacarificação compreendeenzimas que são capazes de hidrolisar a biomassa previamente tratada paraliberar oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Enzimas de sacarificação èmétodos de tratamento de biomassa com enzimas de sacarificação sãoanalisados em Lynd, L. R. et al (Microbiol. Mol. BioL Rev. (2002) 66: 506-577).

Tipicamente, é utilizada associação de enzimas de sacarificação,que compreende uma ou mais enzimas selecionadas principal mas nãoexclusivamente a partir do grupo "glicosidases" que hidrolisam as ligações éterde di, oligo e polissacarídeos e são encontradas na classificação de enzimasEC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA comSuplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento4 (1997) e Suplemento 5 (em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1-5, Eur. J.Biochem. (1995) 232: 1-6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1-5, Eur. J. Biochem.(1997) 250: 1-6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610-650, respectivamente)) dogrupo geral "hidrolases" (EC 3). As glicosidases úteis no presente processopodem ser categorizadas pelo componente de biomassa que hidrolisam. Asglicosidases úteis para o presente processo incluem glicosidases hidrolisantesde celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases,celobiohidrolases, /?-glucosidases), glicosidases hidrolisantes de hemicelulose(por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, /?-xilosidases,arabinoxilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), eglicosidases hidrolisantes de amido (por exemplo, amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode serútil adicionar outros aditivos à associação de enzimas de sacarificação, taiscomo peptidases (EC 3.4.x.y), Iipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), Iigninases (EC1.11.1.x) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73) para ajudar a liberar polissacarídeosde outros componentes da biomassa. Sabe-se bem na técnica que osmicroorganismos que produzem enzimas hidrolisantes de polissacarídeosfreqüentemente exibem atividade, tal como degradação de celulose, que écatalisada por várias enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentesespecificidades de substratos. Desta forma, "celulase" de microorganismo podecompreender grupo de enzimas, todas as quais podem contribuir com aatividade de degradação de celulose. Preparações de enzimas comerciais ounão comerciais, tais como celulase, podem compreender numerosas enzimas,dependendo do esquema de purificação utilizado para a obtenção da enzima.

Desta forma, a associação de enzimas de sacarificação do presente processopode compreender atividade de enzimas, tais como "celulase", mas reconhece-se que esta atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima. Enzimas desacarificação podem ser obtidas comercialmente, tais como celulaseSpezyme® CP (Genencor International, Rochester, NY) e xilanase Multifect®(Genencor).Os técnicos no assunto saberão como determinar a quantidadeeficaz de enzimas para uso na associação e ajustar as condições de atividadeenzimática ideal. Os técnicos no assunto também saberão como otimizar asclasses de atividades enzimáticas necessárias na associação para obtersacarificação ideal de dada biomassa previamente tratada sob as condiçõesselecionadas.

Ao tratar previamente e sacarificar em seguida biomassa nopresente aparelho, antes do tratamento de sacarificação, o pH e a temperaturada biomassa previamente tratada no presente aparelho são ajustados para quesejam favoráveis para determinar a atividade das enzimas de sacarificação aserem utilizadas. Durante o tratamento prévio com ácido ou base, o pH dabiomassa previamente tratada pode ser elevado ou reduzido, respectivamente,por meio da introdução de sólido ou solução de ajuste de pH ao recipiente dereação. Para boa distribuição de solução de ajuste de pH na biomassapreviamente tratada, ela é injetada através da lança enquanto as pás norecipiente de reação estiverem girando. A solução pode ser previamenteaquecida, tipicamente até temperatura compatível com a associação deenzimas de sacarificação, tal como até cerca de 50 °C. Alternativamente, pode-se introduzir solução de ajuste de pH através de porta na tampa. As pás dorecipiente podem ser giradas para promover a assimilação da solução deajuste de pH na biomassa fornecida pelos meios de atrito e pás e a biomassatestada periodicamente por meio de remoção de amostra através da porta deamostras para teste de pH até atingir-se o pH desejado. O pH alvo pode ser decerca de 2 a 11, dependendo das enzimas sendo utilizadas para sacarificação,pois enzimas diferentes podem exibir diferentes pHs ideais, como sabem ostécnicos no assunto. Mais tipicamente, o pH desejado é de cerca de 4 a 10, emque pH de cerca de 5,5 é o mais típico.

A temperatura de sacarificação encontra-se geralmente na faixade cerca de 15 0C a cerca de 100 0C1 também dependendo das enzimas sendoutilizadas para sacarificação, pois enzimas diferentes podem exibir diferentestemperaturas ideais, como sabem os técnicos no assunto. Tipicamente, atemperatura é de cerca de 20 0C a cerca de 100 0C. A sacarificação é realizadaenquanto as pás do recipiente de reação giram. O modo de compressão einfiltração de assimilação do reagente na biomassa no presente aparelho,descrito acima no presente, melhora o acesso do reagente de sacarificação àbiomassa, de forma a fornecer processo de sacarificação altamente eficiente.

Este processo é conduzido por período de cerca de vários minutos a cerca de120 horas e, preferencialmente, cerca de várias horas a cerca de 72 horas. Otempo de reação dependerá da concentração de enzimas e atividadeespecífica, bem como do substrato utilizado e das condições ambientais, taiscomo temperatura e pH. Os técnicos no assunto podem determinar facilmenteas condições ideais de temperatura, pH e tempo a serem utilizadas comsubstrato de biomassa específico e associação de enzimas de sacarificação.

O presente aparelho é particularmente útil para otimizarprocessos de tratamento de biomassa. Existem muitas condições detratamento que podem variar em processo de tratamento de biomassa, seja eletratamento prévio ou processo de sacarificação. Condições variáveis incluem,mas sem limitar-se a pH, temperatura, tipos de reagentes de processamento econcentrações de reagentes de processamento, percentual em peso seco debiomassa na mistura de biomassa e reagente, estratégias de alimentação paraadição de reagentes, pressões, tipo de atmosfera inerte, forma e tipo debiomassa utilizada e tempo de processamento. O presente aparelho pode serconstruído em pequena escala, conforme descrito em realização acima nopresente (exibida na Figura 2), que é particularmente apropriada para otimizarcondições de tratamento. As condições podem variar independente ouparalelamente utilizando projeto estatístico de experimentação e amostrastomadas da porta de amostras enquanto o processo é conduzido. Em processode sacarificação ou processo combinado de tratamento prévio e sacarificação,açúcares nas amostras podem ser analisados diretamente. Em processo detratamento prévio isoladamente, amostras são sacarificadas e, em seguida, oproduto de sacarificação é analisado para determinar o teor de açúcar e outroscomponentes de interesse, tais como ácido acético, furfurais e sais. Podemtambém ser utilizados outros métodos de análise, tais como para hemicelulose.A otimização pode ser baseada em uma série de critérios, que incluemrendimento de monômero de açúcar, rendimento total de açúcar liberado, baixouso de enzimas, baixo ácido acético, baixos furfurais, baixas impurezasformadas ou otimização global com base em diversas destas variáveis. Sãodeterminados, por exemplo, os percentuais de glicose e xilose teoricamentepresentes na biomassa inicial que são liberados no processo de tratamentosendo determinado. Rendimentos de monômeros de açúcar de cerca de 50%ou mais indicam bons resultados, com rendimentos ainda mais altos sendopreferidos. Rendimentos totais de açúcar, incluindo oligômeros liberados, depelo menos 70% indicam bons rendimentos. Métodos de análise dos açúcaressão bem conhecidos dos técnicos no assunto, tais como HPLC. Além disso,outros componentes de amostras de biomassa tratada podem ser analisados,também por meio de HPLC, tal como ácido acético, furfurais ou ácido láctico,na determinação da qualidade do produto.

Açúcares fermentáveis liberados de biomassa podem serutilizados por microorganismos apropriados, que são biocatalisadores, paraproduzir substâncias alvo, tal como descrito nos Pedidos de Patente Norte-Americanos copendentes CL3435 e CL 3436.

Exemplos

Métodos gerais e materiais:

São utilizadas as abreviações a seguir:"HPLC" é Cromatografia de Líquidos de Alta E ficiência, "C" écentígrado, "kPa" é quiloPascal, "m" é metro, "mm" é milímetro, "kW" équilowatt, 'Vm" é micrômetro, V1" é microlitro, "ml" é mililitro, "I" é litro, "min" éminuto, "mM" é milimolar, "cm" é centímetro, "g" é grama, "kg" é quilograma,"wt" é peso, "h" é hora, "temp." ou "T" é temperatura, "teór." é teórico, "pretreat"é tratamento prévio, "DWB" é peso seco de biomassa. Ácido sulfúrico,hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato de potássio, glicose, xilose, triptona,cloreto de sódio e ácido cítrico foram obtidos por meio da Sigma-Aldrich (St.Louis1 MO).

Reator de hidrólise enzimática e tratamento prévio ÍPEHR):

Um aparelho de tratamento de biomassa com dimensões ecaracterísticas exibidas na Figura 2 e descritas no presente acima édenominado Reator PEHR e foi utilizado nos Exemplos a seguir.

Resumidamente, reator PEHR de nove litros (construído na NREL, Golden,CO) possui recipiente de reação de aço inoxidável de cerca de 15 cm x 51 cmcom lança de injeção para introdução de reagentes de processamento. A lançade injeção é conectada utilizando uma junta giratória para porta em tampasobre uma extremidade do recipiente, que possui porta adicional para acesso arecipientes. Quatro pás correm no comprimento da parede de recipiente e sãofixados perpendicularmente à parede. As pás e 22 cilindros de meios de atritocerâmicos de 3,2 cm x 3,2 cm (E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH),em livre flutuação no recipiente, aplicam mistura mecânica de biomassa ereagente à medida que o recipiente gira, promovendo assimilação de reagentena biomassa. O reator PEHR é colocado sobre Aparelho de Rolo de ProduçãoCelular Bellco (Bélico Technology, Vineland, NJ), que fornece mecanismo derotação e o reator com aparelho de rolo é abrigado em câmara comtemperatura controlada que fornece calor. A câmara com temperaturacontrolada consiste de quadro de alumínio para sustentar almofadas isolantesde cortiça em volta do Aparelho de Produção Celular Bélico, ao qual é ligadoaquecedor que é controlado por termopares inseridos através do centro dalança de injeção no reator PEHR. Pode-se aplicar vácuo e pressão aorecipiente de reação fixando-se fontes externas à porta conectada a lança natampa.

Sistema de digestão de bateladas do Reator de Pistola de Vapor:

O reator de pistola de vapor de quatro litros (Autoclave Engineers,Erie1 PA) é um reator revestido com vapor que consiste de comprimento decano de Hastelloy® programa 80 de 102 mm fechado por duas válvulas debolas. Aquecedores elétricos adicionais são colocados sobre todas assuperfícies expostas sem revestimento do reator e controlados até atemperatura de ponto de ajuste de tratamento prévio. Injeção direta de vaportambém é utilizada para trazer rapidamente a biomasa até a temperatura detratamento prévio. A pressão de vapor é ajustada e controlada para manter atemperatura de tratamento prévio desejada. O fundo do reator é estreitado para51 mm. Todo o material tratado previamente sai através de molde substituívelno fundo do reator e é recolhido em saco de nylon (Hotfill®) de 0,21 m3sustentado em um tanque de ignição pesado com paredes, com revestimento eresfriado.

Métodos analíticos:

Medição do teor de acúcar. acetamida. ácido láctico e ácido acético:

Açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinose emanose), acetamida, ácido láctico e ácido acético em líquido de sacarificaçãoforam medidos por meio de HPLC (Agilent Modelo 1100, Agilent Technologies,Palo Alto, CA) utilizando colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA) com colunas de guarda apropriadas. O pH da amostrafoi medido e ajustado em 5-6 com ácido sulfúrico se necessário. A amostrapassou em seguida através de filtro de seringa de 0,2 um diretamente paraampola de HPLC. As condições de condução de HPLC foram as seguintes:

HPX-87P (para carboidratos):

Volume de injeção: 10 a 50 jil, dependendo daconcentração e dos limites do detector.

Fase móvel: HPLC grau água, 0,2 ^im filtrado e com gasesretirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

Temperatura da coluna: 80-85 0C, temperatura da colunade guarda < 60 0C.

Temperatura do detector: o mais perto possível datemperatura da coluna principal.

Detector: índice de refração.

Tempo de condução: 35 minutos de coleta de dados maisquinze minutos após a condução (com possível ajuste para compostoseluentes posteriores).

Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, acetamida, ácidoláctico e ácido acético):

Volume de injeção: 5 a 10 jal, dependendo da concentração e doslimites do detector.

Fase móvel: 0,01 N ácido sulfúrico, 0,2 um filtrado e seus gasesretirados.

Velocidade de fluxo: 0,6 ml/minuto.

Temperatura da coluna: 55 0C.

Temperatura do detector: o mais perto possível da temperatura dacoluna.

Detector: índice de refração.

Tempo de condução: 25 a 75 minutos de coleta de dados.Após a condução, as concentrações da amostra foramdeterminadas a partir de curvas padrão para cada um dos compostos.

Exemplo 1

Sacarificação de Bagaço em Alta Concentração de Biomassa no ReatorPEHR: Comparação com Sacarificação sob Baixa Concentração

O reator PEHR (descrito em Métodos Gerais), sem meios deatrito, foi carregado com bagaço moído a 1,27 cm (370 g, com base em pesoseco). Este bagaço de cana de açúcar foi o Material de Referência NISTRM8491, do clone de cana de açúcar H65-7052, obtido originalmente por meioda Associação de Plantadores de Açúcar do Havaí, subestação de Kunia,Oahu, Hl. Ele foi moído em moinho Wiley para passar através de peneira de 2mm, com os finos (+74 mesh) removidos. O recipiente do reator foi resfriado a4 0C por meio de rotação em contato com gelo sobre a superfície externa.

Aplicou-se vácuo ao recipiente de reator e solução de hidróxido de amôniodiluído, que foi previamente resfriada em sala fria a 4 0C e passou através detubulação imersa em banho de água com gelo, foi injetada para gerarconcentração de amônia de 4 g/100 g de peso seco de biomassa e peso secode concentração de biomassa de 45 g/100 g de mistura de biomassa e amôniaaquosa total. O recipiente de reator carregado com amônia e bagaço foiresfriado a 4 0C por meio de aplicação de gelo à superfície do recipiente dereator giratório e girado a 4 0C por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdofoi transferido para o reator de pistola de vapor que é descrito nos MétodosGerais. Após o carregamento do reator de pistola de vapor com a mistura debagaço e amônia, a temperatura aumentou para 145 0C e a mistura foi mantidanessa temperatura por vinte minutos. Ao final do tempo de tratamento prévio, obagaço foi descarregado do reator de pistola de vapor através de moldecircular de 2,54 cm em tanque de ignição. Amostra de bagaço previamentetratado foi sacarificada em seguida em frasco de agitação e outra amostra(cerca de 163 g de peso seco) foi sacarificada no reator PEHR. A sacarificaçãodo frasco de agitação foi conduzida a 5% em peso seco de biomassa comrelação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificação debiomassa previamente tratada, enquanto a sacarificação do reator PEHR foiconduzida a 30% de peso seco de biomassa com relação ao peso total damistura de associação de enzimas de sacarificação de biomassa previamentetratada. O pH foi controlado em 5,5 durante a sacarificação por meio da adiçãode 50 mM de tampão de citrato e a temperatura foi mantida em 50 0C.

Para a sacarificação do reator PEHR, cerca de 476 g (cerca de136 g de peso seco) de biomassa previamente tratada e 22 cilindros de atritocerâmicos foram adicionados ao recipiente do reator. O pH foi ajustado em 5,0-5,5 com ácido cítrico sólido. O recipiente do reator foi mantido no interior decâmara incubadora controlada a 50 0C e girada axialmente a 19 rpm. Bagaçonão tratado previamente também foi sacarificado a 5% em peso seco debiomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimas desacarificação de biomassa previamente tratada em frasco de agitação. Todasas sacarificações foram realizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP®de celulose e 28,4 mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 0C e pH 5,5 por96 horas. Os rendimentos fornecidos na Tabela 1 abaixo são a liberação naforma de percentual de rendimento teórico.

Tabela 1

Rendimentos Após o Tratamento Prévio e Sacarificação de Bagaço

<table>table see original document page 32</column></row><table>ND: não determinado.

Os resultados demonstram que o tratamento prévio de bagaçocom amônia muito baixa permite liberação substancial de açúcar emcomparação com o controle não tratado previamente e que sacarificação emalta concentração de sólidos no reator PEHR é muito eficaz na liberação deaçúcares.

Exemplo 2

Sacarificação de Serragem de Álamo Amarelo com Alta Concentração deBiomassa no Reator PEHR: Comparação com Sacarificação sob Baixa

Concentração

O reator PEHR, sem meios de atrito, foi carregado comserragem de álamo amarelo (596 g, base de peso seco; adquirido daSawmiller, Inc., Haydenville1 OH). Aplicou-se vácuo ao recipiente do reator einjetou-se solução diluída de hidróxido de amônio para gerar concentraçãode amônia de 6 g/100 g de peso seco de biomassa e peso seco deconcentração de biomassa de 44 g/100 g de mistura total de biomassa eamônia aquosa. O recipiente do reator carregado com amônia e serragemde álamo amarelo foi trazido para 4 0C conforme descrito no Exemplo 1 egirado a 4 0C por trinta minutos. Nesse momento, o conteúdo foi transferidopara o reator de pistola de vapor. Após o carregamento do reator de pistolade vapor com a mistura de álamo e amônia, a temperatura aumentou para145 0C e a mistura foi mantida sob temperatura por vinte minutos. Ao final dotempo de tratamento prévio, a serragem de álamo amarelo foi descarregadado reator de pistola de vapor através de molde circular de 2,54 cm emtanque de ignição. Amostra de serragem de álamo amarelo previamentetratada foi sacarificada em seguida conforme descrito no Exemplo 1 emfrasco de agitação e outra amostra foi sacarificada no reator PEHR. Asacarificação do frasco de agitação foi conduzida a 5% em peso seco debiomassa com relação ao peso total da mistura de associação de enzimasde sacarificação e biomassa previamente tratada, enquanto a sacarificaçãoem reator PEHR (utilizando cerca de 279 g em peso seco de serragempreviamente tratada) foi conduzida a 30% em peso seco de biomassa comrelação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificaçãoe biomassa previamente tratada. Serragem de álamo amarelo não tratadapreviamente também foi sacarificada a 5% em peso seco de biomassa comrelação ao peso total da mistura de associação de enzimas de sacarificaçãoe biomassa previamente tratada em frasco com agitação. Todas assacarificações foram realizadas com 28,4 mg/g de celulase Spezyme CP®de celulose e 28,4 mg/g de xilanase Multifect® de celulose a 50 0C e pH 5,5por 96 horas. Os rendimentos fornecidos na Tabela 2 abaixo são a liberaçãona forma de percentual de rendimento teórico.

Tabela 2

Rendimentos Após o Tratamento Prévio e Sacarificação de Serragem deÁlamo Amarelo

<table>table see original document page 34</column></row><table>

ND: não determinado.

Os resultados demonstram que o tratamento prévio de serragemde álamo amarelo com amônia muito baixa permite liberação substancial deaçúcar em comparação com o controle não tratado previamente e que asacarificação em peso seco alto de biomassa no reator PEHR é mais eficaz naliberação de açúcares que o frasco de agitação.Exemplo 3

Tratamento Prévio e Sacarificação de Espigas de Milho em Concentraçãode Biomassa Seca Mais Alta em Reator PEHR

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordente de cerca de 0,95cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston,NJ), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneirapadrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadasforam carregados no reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cercade 7%. A atmosfera no recipiente do reator recebeu fluxo por cinco vezes comnitrogênio antes do carregamento. O reator, sem meios de atrito, foi aquecidopreviamente a 75 0C antes do início do experimento, sem rotação. Quando atemperatura no interior do recipiente do reator estabilizou-se a 75 0C1 omecanismo de rolamento no incubador foi ligado e a rotação ajustada em 19rpm. A quantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio paragerar concentração de amônia de 6 g de amônia/100 g de peso seco debiomassa e concentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 gde peso total de mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida parao reator. Etanol a 1 g/100 g de peso seco de biomassa também foi adicionadoà solução. A solução de amônia foi bombeada através de circuito aquecido embanho de água aquecido a cerca de 75 0C, fabricado utilizando reator Parr dedois galões. A solução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada pormeio de lança de injeção no recipiente do reator e pulverizada sobre as espigasfraturadas em rotação e tombamento no reator. O reator foi mantido a 75 0C porduas horas mediante rotação a 19 rpm. Ao final daquele período, aplicou-sevácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator por trinta minutos para removeramônia e reduzir a temperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 0C.Dióxido de carbono foi injetado em seguida no reator para liberar o vácuo e oreator foi pressurizado até pressão medida de CO2 de 103 kPa e mantido sobpressão por trinta minutos a 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e foramadicionados meios de atrito. O pH do conteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 pormeio de injeção de 1 M tampão ácido cítrico sob pH 4,8 utilizando a lança deinjeção, para aumentar a resistência de tampão ácido cítrico para cerca de 75mM, mais adição de monoidrato de ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foiinjetado no reator após aquecimento a 50 0C e, em seguida, permitiu-se oequilíbrio do conteúdo por meio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpm poruma hora. A injeção do tampão de ácido cítrico ao girar o reator utilizando alança de injeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampãosobre as partículas de milho tratado previamente. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de maisde 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foiincubado com mistura a 50 0C por uma hora adicional. Este processo foirepetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Ao atingir-se o pH desejado, 12,9mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por gramade associação de enzimas de celulose que consiste de (3-glucosidase, xilanase,p-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O reatorpermaneceu no incubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de62,0% e o rendimento de xilose de monômero foi de 31,0%. O rendimento deglicose total foi de 75,2% e xilose total foi de 80,3%.

Exemplo 4

Tratamento Prévio de Espigas em Concentração de Biomassa Mais Altacom Amônia Muito Baixa e Condições Alternadas

Espigas de milho inteiras foram processadas com moinho martelo(moinho martelo de 25,4 cm, Glen Mills Inc., Clifton, NH) para passar atravésde tela de 1,27 cm. Cerca de 805 g de espigas fraturadas foram carregados noreator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte e doiscilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm x comprimento de 3,2 cm; E.R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionados aoreator. O reator foi previamente aquecido a 95 0C antes do início doexperimento, sem rotação. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente doreator antes do início e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura nointerior do recipiente do reator estabilizou-se em 95 °C 1 o mecanismo derolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. Aquantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerarconcentração de amônia de 6 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa econcentração de sólidos de 50 g de peso seco de biomassa/100 g de peso totalde mistura de biomassa e amônia foi bombeada em seguida para o reator. Asolução de amônia foi bombeada através de circuito aquecido em banho deágua fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões. A solução dehidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lança de injeçãono recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadas em rotação etombamento no reator. O reator foi mantido em 95°C por duas horas enquantogira a 19 rpm. Ao final daquele tempo, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) aorecipiente do reator por trinta minutos para remover amônia e reduzir atemperatura do conteúdo do reator para cerca de 50°C . Dióxido de carbono foiinjetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizadoaté pressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50°C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da injeção de 1 M tampão deácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidrato de ácidocítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reator após aquecimento a 500C e, em seguida, permitiu-se que o conteúdo se equilibrasse por meio deincubação do reator a 50 0C e 19 rpm por uma hora. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de maisde 5,5, agregou-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foiincubado com mistura a 50 0C por uma hora adicional. Este processo foirepetido até que o pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado,12,9 mg/g de celulose Spezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa porgrama de associação de enzimas de celulose que consiste de p-glucosidase,xilanase, p-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. Oreator permaneceu no incubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após essetratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de50,7% e o rendimento de xilose de monômero foi de 35,7%. Os rendimentostotais de glicose e xilose foram de 71,7% e 89,8%, respectivamente.

Exemplo 5

Tratamento Prévio de Espigas com Amônia Muito Baixa e Base Adicional

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 0,95cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopor peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregadasno reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. O reatorfoi aquecido previamente a 95 0C antes do início do experimento, sem rotação.

Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes do início e orecipiente foi lacrado. Quando a temperatura no interior do recipientereestabilizou-se em 95 0C, o mecanismo de rolamento no incubador foi ligado ea rotação foi ajustada em 19 rpm. A quantidade apropriada de solução dehidróxido de amônio para gerar concentração de amônia de 3,2 g deamônia/100 g de peso seco de biomassa e NaOH para gerar concentração de1,9 g de NaOH/IOO g de peso seco de biomassa, mantendo ao mesmo tempoconcentração de sólidos de 30 g de peso seco de biomassa/100 g de peso totalde mistura de biomassa e amônia foram bombeados em seguida no reator. Aamônia e solução base adicional foi bombeada através de circuito aquecido embanho de água fervente fabricado utilizando reator Parr de dois galões. Asolução de hidróxido de amônio diluído aquecida foi injetada por meio de lançade injeção para o recipiente do reator e pulverizada sobre as espigas fraturadasem rotação e tombamento no reator. Após a injeção, o vácuo sobre o recipientefoi liberado até pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95 0C por trintaminutos e, em seguida, a temperatura foi reduzida para 85 0C1 que foi mantidapor quatro horas. Ao final desse período, aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa)ao recipiente de reação por trinta minutos para remover amônia e reduzir atemperatura do conteúdo do reator para cerca de 50 °C. Dióxido de carbono foiinjetado em seguida no reator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizadoaté pressão medida de 103 kPa e mantido sob pressão por trinta minutos a 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado a cerca de 5,5 por meio de injeção de cerca de 75 ml de1 M tampão de ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-semonoidrato de ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado no reatorapós aquecimento a 50 0C e o conteúdo foi mantido em seguida até o equilíbriopor meio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpm por uma hora. Injeção dotampão de ácido cítrico mediante rotação do reator utilizando a lança deinjeção permitiu pulverização e distribuição mais regular do tampão sobre aspartículas de espigas previamente tratadas. O reator foi removido do incubador,aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de mais de 5,5,agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foi incubadocom mistura a 50 0C por uma hora adicional. Este processo foi repetido até queo pH fosse de cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 28,4 mg/g decelulose Spezyme CP (Genencor) e 28,4 mg/g de celulose Multifect foramcarregados no reator. O reator permaneceu no incubador a 50 0C e 19 rpm por72 horas. Após esse tratamento prévio e sacarificação, o rendimento de glicosede monômero foi de 56,1% e o rendimento de xilose de monômero foi de39,5%. Os rendimentos de glicose e xilose total foram de 82,8% e 84,2%,respectivamente. Estes valores são as médias de dois experimentos.

Exemplo 6

Tratamento Prévio e Sacarificacão de Espigas de Milho em AltaConcentração de Biomassa Seca em Reator PEHR à Temperatura Ambiente

Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordentes de cerca de 0,95cm seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc.), seguidopor peneiramento com peneira Sweco equipada com peneira padrão norte-americana de 1,9 cm. Cerca de 460 g de espigas fraturadas foram carregadosno reator PEHR. O teor de umidade nas espigas foi de cerca de 7%. Vinte edois cilindros de atrito cerâmicos (diâmetro de 3,2 cm x comprimento de 3,2cm; E. R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH) também foram adicionadosao reator. Aplicou-se vácuo (cerca de 85 kPa) ao recipiente do reator antes doinício e o recipiente foi vedado. Quando a temperatura no interior do reatorreestabilizou-se à temperatura ambiente (22 a 26 0C), o mecanismo derolamento no incubador foi ligado e a rotação foi ajustada em 19 rpm. Aquantidade apropriada de solução diluída de hidróxido de amônio para gerarconcentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de peso seco de biomassa,mantendo ao mesmo tempo concentração de sólidos de 30 g de peso seco debiomassa/peso total de mistura de biomassa e amônia foi bombeada emseguida para o reator. A solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada pormeio de lança de injeção para o recipiente do reator e pulverizada sobre asespigas fraturadas em rotação e tombamento no reator. Após a injeção, ovácuo sobre cada recipiente foi liberado até a pressão atmosférica. O reator foimantido à temperatura ambiente (22-26 0C) por 24 horas. Ao final daqueleperíodo, aplicou-se vácuo (cerca de 81 kPa) ao recipiente de reação por trintaminutos para remover amônia. Dióxido de carbono foi injetado em seguida noreator para liberar o vácuo e o reator foi pressurizado até pressão medida de103 kPa com CO2 e mantido sob pressão por trinta minutos à temperaturaambiente.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio da adição de monoidrato deácido cítrico após aquecimento a 50 0C e mantido em seguida em equilíbrio pormeio de incubação do reator a 50 0C e 19 rpm. O reator foi removido doincubador, aberto e o pH de amostra foi determinado. Caso o pH fosse de maisde 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólido adicional e o reator foiincubado com mistura a 50 0C. Este processo foi repetido até que o pH fossede cerca de 5,5. Após atingir-se o pH desejado, 12,9 mg por grama de celuloseSpezyme CP (Genencor) e 5 mg de proteína ativa por grama de associação deenzimas de celulose que consiste de p-glucosidase, xilanase, p-xilosidase earabinofuranosidase foram carregados no reator. O reator permaneceu noincubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Após esse tratamento prévio esacarificação, o rendimento de glicose de monômero foi de 41,7% e orendimento de xilose de monômero foi de 25,4%. Os rendimentos totais deglicose e xilose foram de 50,1% e 53,2%, respectivamente. Estes valores foramas médias de dois experimentos.

Exemplo 7

Tratamento Prévio e Sacarificação de Biomassa Combinada que ContémEspigas de Milho e Diferentes Amostras de Grãos Esgotados em Reator

PEHR

As amostras de grãos esgotados foram preparadas a partir de:1. Grãos de milho inteiros com dentes amarelos n° 2(adquiridos da Agway).

2. Grãos de milho com gérmen retirado por meio do processoQuick Germ desenvolvido na Universidade de Illinois (Singh e Eckoff (1996),Cereal Chem. 74: 462-466). Material de partida foi obtido por meio de VijaySingh da Universidade de Illinois.

3. Grãos de milho processados por meio do processo QuickFiber para remover o gérmen e a fibra da casca (US 6.254.914). Material departida foi obtido por meio de Vijay Singh da Universidade de Illinois.

4. Farelos de cerveja foram obtidos por meio da Cargill(Mineápolis, MN).

Grãos esgotados designam sólidos residuais do processamentode grãos em que o amido é convertido em açúcar. Os grãos esgotados foramproduzidos essencialmente por meio de processo de uísque básico. Osdiferentes materiais de partida foram tratados com enzimas degradantes deamido para produzir açúcares e o mingau resultante foi filtrado para recuperaros sólidos aglomerados de filtragem ou grãos esgotados.

Os materiais de partida foram moídos em moinho de amostrasFoss (sede norte-americana: Eden Prarie, MN) Cyclotec 1093 (materiais departida 1 e 2 acima) até 250 um ou em misturador (materiais de partida 3 e 4acima), combinados em seguida com água e 200 mM de CaCI2*H20 emrecipiente de reação de vidro agitado com revestimento de dois litros. O pH damistura foi ajustado em 6,5 com 1 N NaOH e adicionou-se metade da a-amilase total (Spezyme HPA, Genencor International, Palo Alto CA). Orecipiente de reação foi aquecido em seguida até 95 0C e a a-amilase restantefoi adicionada vinte minutos mais tarde. Após permanecer a 95 0C pelo tempoespecificado, o recipiente foi resfriado a 70 0C e o pH da mistura foi ajustadoem 4,5 com 1 M HCI. Adicionou-se glucoamilase (Gzyme 480, Genencor) e atemperatura foi adicionalmente rebaixada para 50 0C e mantida por uma noite.Nesse momento, o reator foi resfriado a menos de 40 0C e o conteúdo foifiltrado através de pano de filtro Dacron com tamanho de poros de 10 |im. Oaglomerado de filtragem foi lavado com água e o aglomerado de filtragem final,ou grãos esgotados, foi seco a 105 0C por uma noite e armazenado àtemperatura ambiente até o uso em experimentos de tratamento prévio.Condições específicas de reação para cada material de partida sãorelacionadas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Processamento de Amostras de Grãos Esgotados

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Espigas de milho inteiras foram processadas com moedor demordente (motor de 2,2 kW) com espaçamento de mordente de cerca de 0,95cm, seguido por fragmentador (motor de 1,5 kW, Franklin Miller Inc., Livingston,NJ), seguido por peneiramento com peneira Sweco equipada com peneirapadrão norte-americana de 1,9 cm. Espigas fraturadas foram carregadas comum tipo de grão esgotado, conforme relacionado na Tabela 3, em reator PEHR.

Os grãos esgotados foram cerca de 10% do peso seco total de biomassa noreator. A carga de biomassa seca total foi de cerca de 473 g. Cada reatorcarregado foi aquecido previamente no incubador de rolo a 95 °C, sem rotação,antes do início do experimento. Aplicou-se vácuo (pressão medida de cerca de85 kPa) ao recipiente de reação e o recipiente foi vedado. Quando atemperatura em cada recipiente de reação reestabilizou-se em 95 0C1 iniciou-sea rotação a 19 rpm. Adicionou-se solução diluída de hidróxido de amônio paragerar concentração de amônia de 4 g de amônia/100 g de peso seco debiomassa e concentração de sólidos de 30 g de peso seco de biomassa/100 gde peso total de mistura de biomassa e amônia. Após a injeção, o vácuo sobreo recipiente foi liberado até pressão atmosférica. O reator foi mantido a 95 0Cpor trinta minutos e, em seguida, a temperatura foi rebaixada para 85 0C1 naqual foi mantida por quatro horas com rotação. Ao final daquele período,aplicou-se vácuo (pressão medida de cerca de 85 kPa) ao recipiente do reatorpor trinta minutos para remover amônia e rebaixar a temperatura do conteúdode cada reator para cerca de 50 0C. Dióxido de carbono foi injetado em seguidaem cada reator para liberar o vácuo e os reatores foram pressurizados atépressão medida de 138 kPa com CO2 e mantido sob pressão por trinta minutosa 50 0C.

Em seguida, o reator foi despressurizado, aberto e o pH doconteúdo foi ajustado em cerca de 5,5 por meio de injeção de 75 ml de 1 Mtampão ácido cítrico, pH 4,8, no qual adicionou-se e dissolveu-se monoidratode ácido cítrico. O tampão de ácido cítrico foi injetado em cada reator apósaquecimento a 50 0C e, em seguida, mantido em equilíbrio por meio deincubação dos reatores a 50 0C e 19 rpm por uma hora. Os reatores foramremovidos do incubador, abertos e o pH de amostra foi determinado. Caso opH fosse de mais de 5,5, agregava-se monoidrato de ácido cítrico sólidoadicional e os reatores foram incubados com rotação a 50 0C por uma horaadicional. Este processo foi repetido com a freqüência necessária até obter pHpara cada reator de cerca de 5,5. Ao atingir-se o pH desejado, 28,4 mg/g decelulase Spezyme CP de celulose (Genencor) e 10,1 mg de proteína ativa porgrama de celulose de coquetel Diversa D2 que contém beta-glucosidase,xilanase, beta-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. Osreatores permaneceram no incubador a 50 0C e 19 rpm por 72 horas. Apósesse tratamento prévio e sacarificação, os rendimentos de açúcar foramtestados conforme descrito nos Métodos Gerais. Os rendimentos de glicose exilose, com base em glucano e xilano total chegando com as duasalimentações, são exibidos na Tabela 4. Os rendimentos de amostras debiomassa de combinação de grãos esgotados mais espigas foram similaresaos rendimentos da amostra de espiga isolada.

Tabela 4

Rendimentos de Açúcar Após o Tratamento Prévio e Sacarificação deAlimentos de Biomassa Combinados

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Exemplo 8

Tratamento Prévio e Sacarificação de Biomassa Combinada ContendoEspigas de Milho. Grãos Esgotados e Componentes Adicionais no ReatorPEHR

Espigas fraturadas e grãos esgotados em uísque, preparadosconforme descrito no Exemplo 7, foram combinados no reator PEHR conformedescrito no Exemplo 7. Além disso, foram adicionados outros componentes degrãos. Em uma amostra, amido (Sigma S4126, lote n° 093K0033) foiadicionado a 5 g/100 g de peso seco total de biomassa. Em outra amostra, óleode milho (óleo de milho Sysco Classic, lote n° 4119095) foi adicionado em nívelde cerca de 2 g/100 g de peso total de biomassa. As amostras foram tratadaspreviamente e sacarificadas conforme descrito no Exemplo 7. Os resultadossão exibidos na Tabela 4. Estes resultados também apresentam comparaçãofavorável com os dados de controle somente de espigas da Tabela 3.

Tabela 4

Rendimentos de Açúcar Resultantes de Tratamento Prévio eSacarificação de Espigas. Grãos Esgotados e Componentes de Grãos

Adicionais

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Exemplo 9

Tratamento Prévio e Sacarificação de Biomassa Combinada que ContémEspigas de Milho e Fibra de Milho no Reator PEHR

Espigas de milho fraturadas e fibra de milho Farelo Cargill 80(Cargill, Minnetonka, MN) foram combinadas de tal forma que a fibra fossecerca de 10% da biomassa seca total. A biomassa combinada foi previamentetratada e sacarificada conforme descrito no Exemplo 7. Os rendimentos deaçúcar resultantes são exibidos na Tabela 5. Os rendimentos da biomassa decombinação de espiga mais fibra de milho foram similares aos rendimentos daamostra de espiga isolada.

Tabela 5

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Claims

1. SISTEMA DE PROCESSAMENTO DE BIOMASSA EMBATELADAS, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) um aparelho que compreende:(i) um recipiente de reação cilíndrico com abertura em pelomenos uma extremidade;(ii) uma ou mais pás fixadas ao lado interno do mencionadorecipiente;(iii) meios de atrito que compreendem pelotas em livreflutuação no interior do recipiente de reação;(iv) uma tampa para a extremidade aberta do mencionadorecipiente, que compreende uma ou mais portas; e(v) uma lança de injeção que compreende meio defornecimento de um reagente de processamento, em que o mencionado meio éuma lança de injeção que se estende pelo comprimento do recipiente dereação e conectam-se a primeira porta na tampa de (iv); e(b) meios de rotação das pás do recipiente.

2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os meios de atrito do aparelho ocupam menos de cerca de-10% do volume do recipiente de reação.

3. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o aparelho compreende adicionalmente uma junção giratóriaconectada à porta na tampa do recipiente de reação.

4. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a segunda porta do aparelho é uma porta de adição dereagentes ao recipiente de reação, para amostragem do conteúdo do recipientede reação, ou ambos.

5. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado recipiente do aparelho é composto de ummaterial não corrosivo capaz de suportar temperaturas que variam de cerca de-10°C a cerca de 220°C.

6. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o recipiente do sistema é capaz de suportar temperaturas quevariam de cerca de 4°C a cerca de 170°C.

7. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o mencionado material é aço inoxidável.

8. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado recipiente do aparelho é composto de ummaterial não corrosivo capaz de suportar pressões de até cerca de 1200 kPa.

9. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o recipiente do aparelho é capaz de suportar pressões de atécerca de 310 kPa.

10. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as mencionadas pás do aparelho são fixadas em ângulosperpendiculares à superfície interna do recipiente de reação.

11. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado reagente de processamento do aparelho é umasolução aquosa que compreende amônia.

12. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado reagente de processamento do aparelho é umamistura de enzimas de sacarificação.

13. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente meios de controle detemperatura.

14. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que os mencionados meios de controle da temperatura são umrevestimento de controle da temperatura ou um incubador externo.

15. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de vácuo conectada àporta.

16. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado sistema fornece tratamento de biomassa emaltas concentrações de biomassa seca que variam de cerca de 15% em peso acerca de 80% em peso de uma mistura de biomassa e reagente.

17. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o mencionado sistema fornece tratamento de biomassa emaltas concentrações de biomassa seca que variam de cerca de 15% em peso acerca de 60% em peso de uma mistura de biomassa e reagente.

18. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os mencionados meios de rotação são rolos, eixo e manivela,cintas, rodas ou mancais de pino.

19. PROCESSO DE TRATAMENTO DE BIOMASSA,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introdução de biomassa no recipiente de reação doaparelho conforme descrito no sistema da reivindicação 1;(b) introdução de um reagente de processamento no recipientede reação; e(c) assimilação do mencionado reagente de processamento namencionada biomassa por meio de rotação das pás do recipiente de rotação,por meio do quê as pás erguem e deixam cair os meios de atrito.

20. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o mencionado processo é um processo detratamento prévio de biomassa.

21. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o mencionado reagente de processamento éuma solução aquosa que compreende amônia.

22. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o mencionado processo é um processo desacarificação.

23. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o mencionado reagente de processamento éuma mistura de enzimas de sacarificação.

24. PROCESSO DE TRATAMENTO DE BIOMASSA,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) tratamento prévio de biomassa no recipiente de reação doaparelho conforme descrito no sistema da reivindicação 1, produzindobiomassa previamente tratada;(b) ajuste da temperatura e do pH da biomassa previamentetratada de (a) no recipiente de reação; e(c) sacarificação da biomassa previamente tratada ajustada de(b) no recipiente de reação.

25. PROCESSO DE TRATAMENTO PRÉVIO DE BIOMASSA,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introdução de biomassa no recipiente de reação doaparelho conforme descrito no sistema da reivindicação 1;(b) contato da mencionada biomassa com uma soluçãoaquosa que compreende amônia para formar uma mistura de biomassa eamônia aquosa no recipiente de reação, em que a amônia está presente emuma concentração pelo menos suficiente para manter o pH alcalino da misturade biomassa e amônia aquosa, mas em que a mencionada amônia encontra-sepresente em menos de cerca de 12% em peso com relação ao peso seco debiomassa e, adicionalmente, em que o peso seco de biomassa encontra-se emalta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso comrelação ao peso da mistura de biomassa e amônia aquosa.

26. PROCESSO DE SACARIFICAÇÃO DE BIOMASSA,previamente tratada em alta concentração de biomassa seca, caracterizadopelo fato de que compreende:(a) fornecimento de biomassa, em que a mencionadabiomassa tenha sido opcionalmente tratada previamente para fornecer umacomposição facilmente sacarificável;(b) fornecimento de uma associação de enzimas capaz dehidrolisar a biomassa de (a);(c) assimilação das enzimas de (b) na biomassa de (a) noaparelho conforme descrito no sistema da reivindicação 1.

27. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que são produzidos açúcares fermentáveis.

28. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o peso seco de biomassa encontra-se em altaconcentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso com relação aopeso da mistura de biomassa e reagente.

29. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 25 ou-26, caracterizado pelo fato de que a mencionada biomassa é selecionada apartir do grupo que consiste de brotos de grama, resíduos de papel, lodo defabricação de papel, grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho,forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha decevada, palha de arroz, bagaço de cana de açúcar, sorgo, soja, componentesobtidos por meio do processamento de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas,lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores eesterco animal.

30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste de espigas de milho, forragem de milho, cascas de milho, bagaço decana de açúcar, serragem, brotos de grama, palha de trigo, feno, palha dearroz e gramas.

31. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a biomassa é selecionada a partir do grupo queconsiste de espigas de milho, forragem de milho, serragem e bagaço de canade açúcar.

32. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a mencionada biomassa é derivada dediversos estoques de alimentação.

33. MÉTODO DE OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DETRATAMENTO, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introdução de biomassa no recipiente de reação doaparelho conforme descrito no sistema da reivindicação 1;(b) variação das condições de tratamento no recipiente dereação;(c) amostragem da biomassa tratada por meio da mencionadauma ou mais portas, sob as mencionadas condições de tratamento variáveis; e(d) teste das mencionadas amostras para determinarcondições de tratamento ideais para o processamento de biomassa.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que as mencionadas condições variáveis incluem pH, temperatura,reagentes de processamento e concentrações de reagentes deprocessamento, percentual inicial de peso seco de biomassa na mistura debiomassa e reagente, tipo e forma de biomassa, tipo de atmosfera inerte,pressão, estratégias de alimentação para reagentes de processamento etempo de processamento.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o mencionado processo de tratamento é um processo desacarificação.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o mencionado processo de tratamento é um processo detratamento prévio.