JP2006504412A - 発酵による生物的生産のためのデンプン生成物の利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、精製度の低いデンプンを発酵工程で利用する方法に関する。一例は、(1,6)結合を含有する小型オリゴマー(イソマルトースおよびパノースをはじめとするがこれに限定されるものではない)を発酵で利用して有用な生成物を産生できる、外因性細胞外イソアミラーゼ活性を含有する組換え大腸菌(E.coli)である。本発明は基材炭水化物の経費を削減することにより、大規模工業的バイオ発酵で有用である。
Description
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、それはデンプン生成物を発酵生成物に効率的に転換する酵素を発現する遺伝子を含有する微生物宿主について記載する。
(関連出願の相互参照)
本願明細書は、2002年8月23日に出願された米国仮出願第60/405,896号の利益を主張する。
本願明細書は、2002年8月23日に出願された米国仮出願第60/405,896号の利益を主張する。
発酵は、再生可能な供給原料を所望の生成物に生体触媒転換するための重要な技術である。炭水化物は発酵産業における伝統的な供給原料である。基材として使用される炭水化物が、それ以外のあらゆる単一構成要素よりも製造原価に寄与することはよくある。特定のプロセス次第で、発酵の総費用の25〜70%は、炭水化物源によるかもしれない。((非特許文献1)、(非特許文献2))。このような経済的理由から、高度に精製されたグルコースまたはスクロースが、基材として使用できることは滅多にない。
炭水化物であるデンプンは、それぞれが連結された反復する単糖類(グルコース)鎖の単位からなる、2つの異なる多糖類の混合物である。混合物は、2つの独立した多糖類、アミロースおよびアミロペクチンからなる。アミロースはα(1,4)グリコシド結合のみを通じて結合したグルコース単位がある直鎖多糖類である。アミロペクチン中のグルコース単位は、α(1,4)グリコシド結合を通じても連結し、さらにグルコース残基30個毎に約1つのα(1,6)グリコシド結合を通じても連結する。デンプン中のアミロペクチンとアミロースとの比率は、植物種毎に変化するが、概して3〜4対1の範囲である(非特許文献3)。
市販のデンプンは、主に湿式粉砕処理を通じて生産される。しかし湿式ミルからの最終生成物は、非常にわずかな未処理のデンプンを含む。作られた生成物の大部分は、圧倒的に完全処理されたデンプン(グルコースを含む単糖類)またはデンプン由来のより小さな分解生成物の形態である。典型的にデンプンをより小さな鎖に切断するために、アミラーゼ酵素が使用される(非特許文献4)。様々な市販のα−アミラーゼ源が存在するが、酵素源に関わらず反応生成物は、大きさおよび連鎖タイプについて概して同じである。デンプンのアミラーゼ消化は、2〜10個のグルコース単位(オリゴ糖)を含有する小さなデンプン鎖を含む、限界デキストリンとして知られる生成物をもたらす。アミラーゼはアミロペクチン中のα(1,6)グリコシド結合を加水分解できないため、限界デキストリンは、α(1,4)−およびα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖の双方を含有する。代案としては、生デンプンを非酵素的手段(例えば酸加水分解による)で処理して、限界デキストリンに実質的に類似のデンプン生成物を生成しても良い。
湿式粉砕産業では、限界デキストリンを発酵の炭素源として使用して、様々な化学物質、市販の酵素、または抗生物質を製造するために、さらにグルコースに加工する。発酵プロセスにおいて普及している生体触媒である大腸菌(E.coli)を使用する場合、比較的純粋なグルコースが炭水化物源として好ましい。これは大腸菌(E.coli)が、一般に代案の廉価な発酵培地に含有される、限界デキストリンの構成要素(すなわちパノース、イソマルトース、そして約10個のα(1,4)−結合したグルコース単位よりも大きい鎖を有する高分子量オリゴ糖)を利用しないためである(非特許文献5)。細胞外に供給された場合、α(1,6)−結合を含有するグルコースオリゴマーは細胞内に移送されず、大腸菌(E.coli)はこの材料を分解する酵素を生産しない(非特許文献6)。
デンプンから大腸菌(E.coli)が使用するのに適した比較的純粋なグルコースを作ることは、多くのプロセス工程と追加的な酵素を必要とし、製品製造経費が極めて加算される。
したがって解決すべき問題は、大規模発酵製造プロセスにおいて、廉価なデンプン生成物を利用する工程の欠如である。廉価で部分的に分解されたデンプンをより完全に発酵する能力は、発酵を通じて製造される製品の製造原価を引き下げる。
出願人らは、(a)SEQID番号:2、4、および6よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する単離核酸分子、(b)以下のハイブリッド形成条件下で(a)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SES、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、および(c)(a)または(b)に相補的な核酸分子よりなる群から選択される、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する酵素をコード化する単離核酸分子を提供する。
出願人らは、シグナルペプチドおよびα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する酵素のためのコード領域を含むキメラタンパクが発現する核酸組成物を提供し、これは細胞質の外部にある(細胞外)加水分解活性を導く。単離核酸分子は、SEQID番号:24またはSEQID番号:25で示されるシグナルペプチドをコード化しても良い。シグナル配列の核酸配列は、SEQID番号:26またはSEQID番号:27である。単離核酸分子は、SEQID番号:2、4、6、17、または31で示されるα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドをコード化しても良い。
出願人らは、有用な生成物の発酵製造のために、外来性に添加されたα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖(例えばイソマルトースおよびパノース)の利用を可能にする、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する酵素を含む組み換え生物体を提供する。α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドは、SEQID番号:2、SEQID番号:6、SEQID番号:17、またはSEQID番号:31から選択されても良い。本発明はまた、SEQID番号:1、3、5、16、または30で示される核酸分子によってコード化される、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドを包含する。本発明はまた、SEQID番号:3、SEQID番号:28、SEQID番号:32、SEQID番号:34、SEQID番号:36、SEQID番号:38、SEQID番号:40、またはSEQID番号:42よりなる群から選択される単離核酸分子を含む。本発明はまた、ポリペプチドSEQID番号:4、SEQID番号:29、SEQID番号:33、SEQID番号:35、SEQID番号:37、SEQID番号:39、SEQID番号:41、およびSEQID番号:43を含む。
本発明はまた本明細書に記載される単離核酸分子を含み、適切な制御配列に作動可能に連結されたキメラ遺伝子も包含する。適切な制御配列は、CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、AOX1、lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac、trc、apr、npr、nos、およびGIを含む群から選択される。本発明は、キメラ遺伝子が染色体に組み込まれた、あるいはプラスミドにより運搬される、形質転換された宿主細胞を包含する。
出願人らは、
(a)適切な生育条件下で、
(i)SEQID番号2、6、17、および31よりなる群から選択される酵素をコード化する核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子
を含む形質転換された宿主細胞を、有効量の限界デキストリン基材と接触させる工程と、
(b)任意選択的に工程(a)の生成物を回収する工程と
を含む限界デキストリンを分解する方法もまた提供する。
(a)適切な生育条件下で、
(i)SEQID番号2、6、17、および31よりなる群から選択される酵素をコード化する核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子
を含む形質転換された宿主細胞を、有効量の限界デキストリン基材と接触させる工程と、
(b)任意選択的に工程(a)の生成物を回収する工程と
を含む限界デキストリンを分解する方法もまた提供する。
本発明は、適切な条件下で限界デキストリン存在下において、(i)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに連結されたシグナルペプチドから構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、および単糖類を標的分子に転換するためのキメラ遺伝子を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより標的分子を製造する工程と、任意選択的に製造された標的分子を回収する工程とを含む組換え宿主細胞中の標的分子を製造する方法も包含する。シグナルペプチドは、SEQID番号:24またはSEQID番号:25から選択されても良い。α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドは、SEQID番号:2、SEQID番号:6、SEQID番号:17、またはSEQID番号:31から選択されても良い。形質転換された宿主細胞は、細菌、酵母菌、または糸状菌から選択されても良い。本発明は、限界デキストリンから1,3プロパンジオール、グリセロール、および細胞塊を製造することを含む。
本発明は、SEQID番号:17で示される配列を有するポリペプチドと比較した場合に、アラインメントのBLASTP法に基づいて、少なくとも69%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、該ポリペプチドがα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する活性を有するポリペプチドも包含する。
(生物学的寄託および配列の簡単な説明)
出願人らは、10801ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、VA20110〜2209の米国微生物系統保存機関(ATCC)の「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
出願人らは、10801ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、VA20110〜2209の米国微生物系統保存機関(ATCC)の「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
列挙した寄託株(群)は、表示された国際受託機関に少なくとも30年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
出願人らは、43の配列を含有する配列一覧表を提供する。配列は、37C.F.R.1.821〜1.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」)に適合し、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)およびEPOおよびPCTの配列一覧表要件(規則5.2および49.5(aの2)、および実施細則第208号および附属書C)、そして37C.F.R.§1.822で示される対応する米国特許商標局規則に一致する。
SEQID番号:1〜6は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)ATCC15700から得られた3個の遺伝子/遺伝子産物の核酸およびアミノ酸配列である。
SEQID番号:7〜15および18〜23は、PCRのプライマーである。
SEQID番号:16〜17は、公共データベースで開示されたストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(ATCC25175D)の核酸およびアミノ酸配列である。
SEQID番号:24は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子、mbc2g.pk018.j20(SEQID番号:3内にも含有される)からの天然シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:25は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc1g.pk026.k1およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子によって、コード化された標的酵素のために使用される非天然シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:26は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:27は、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:28は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.h12遺伝子のコード配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:29は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.h12遺伝子のアミノ酸配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:30は、天然シグナルペプチド配列がない、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20の核酸配列である。
SEQID番号:31は、天然シグナルペプチド配列がない、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20のアミノ酸配列である。
SEQID番号:32は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.k1遺伝子のコード配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:33は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.k1遺伝子のアミノ酸配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:34は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子のコード配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:35は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子のアミノ酸配列に連結された、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子mbc2g.pk018.j20シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:36は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.h12遺伝子のコード配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:37は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.h12遺伝子のアミノ酸配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:38は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.j20遺伝子のコード配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:39は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.j20遺伝子のアミノ酸配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:40は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.k1遺伝子のコード配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:41は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)mbc2g.pk018.k1遺伝子のアミノ酸配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
SEQID番号:42は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子のコード配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドの核酸配列である。
SEQID番号:43は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子のアミノ酸配列に連結された、枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼ遺伝子シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
出願人らは、上述の問題を解決した。本発明は、産生宿主中で発現されると、宿主が廉価なデンプン生成物の構成要素であるα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を利用できるようにする、いくつかの酵素を提供する。本発明は、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する酵素を細胞外標的とするのを可能にするシグナル配列も提供する。
例えばα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を含有する生デンプンおよびその他の供給原料から限界デキストリンを生じる市販のアミラーゼ酵素の作用から、廉価なデンプン生成物が得られる。廉価なデンプン生成物の有効利用には、組み換え生物体がα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を分解する酵素を産生するように、宿主生物(例えば大腸菌(E.coli))を遺伝子操作することが必要である。α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を分解する酵素は既知である(非特許文献7)。さらにこれらの連鎖が分解する酵素は、それらの天然状態で細胞内(細胞質内)および細胞外(細胞質外)の双方に存在することが知られている。
宿主生物に輸送システムが欠如している場合、天然または非天然シグナルペプチドを追加することで、外部から供給される限界デキストリン(またはα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を含有するその他の供給原料)へのアクセスを有する細胞内酵素を設計することを達成しても良い。シグナルペプチドは、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を分解するタンパクが、細胞外部位(細胞質に対して外側)に導かれるようにして、細胞内に取り込まれない基材へのアクセスを与える(非特許文献8)。細胞膜を越えてタンパクを転位するシグナルペプチドの例としては、SEQID番号:24および25が挙げられるが、これに限定されるものではない。シグナルペプチドを含有するタンパクは、分泌経路に導かれ、次に細胞膜を越えて転位される。タンパク分泌の一般的機構は、全てのグラム陰性およびグラム陽性細菌の間で保存されている(非特許文献9)、(非特許文献10)。あらゆる細菌シグナルペプチドは、13〜20個の疎水性アミノ酸のストリングを含有する(非特許文献11)。
天然大腸菌(E.coli)はα(1,6)−グリコシド結合を加水分解しないので、(1,6)−結合を含有する化合物は、発酵で利用されない。(1,6)−結合は、「イソアミラーゼ」および」「グルコシダーゼ」酵素の双方によって加水分解される(イソマルトースおよびパノースは、(1,6)−結合したオリゴ糖のモデル化合物である)。非天然細胞外「イソアミラーゼ」または「グルコシダーゼ」を含有する組換え大腸菌(E.coli)は、発酵で(1,6)−結合を含有する化合物(例えばイソマルトースおよびパノース)を利用して有用な生成物を産生する。さらに非天然細胞外「イソアミラーゼ」または「グルコシダーゼ」を含有するあらゆる組み換え生物体は、(1,6)−結合を含有する化合物をより効率的に利用する。利用効率の増大は、組換え「イソアミラーゼ」または「グルコシダーゼ」遺伝子の構成的な発現、またはタイミングの変化を通じたものである。組換え遺伝子の発現はまた、存在するかもしれないあらゆる内在性「イソアミラーゼ」または「グルコシダーゼ」遺伝子の活性レベルを増大させることで、(1,6)−結合した基材の利用を増大させる。
本発明は、有機酸、抗生物質、アミノ酸、酵素、ビタミン、植物性エタノールなどのアルコール、および細胞塊をはじめとするが、これに限定されるものではないバイオ発酵の様々な生成物を製造するために使用しても良い。シグナルペプチドの使用を通じた、限界デキストリンを使用して、宿主微生物に対する炭素源として利用できるようにしたグリセロール、1,3−プロパンジオール、および細胞塊のバイオ生産が、発明を例証する役割を果たす。
多価アルコールである1,3プロパンジオールは、ポリエステル線維を製造するのに、そしてポリウレタンおよび環状化合物を製造するのに有用なモノマーである。グルコースまたはその他の糖などの炭素基材からの単一生物による1,3−プロパンジオールの生物学的生産のプロセスについては、その内容を本願明細書に引用した米国特許公報(特許文献1)で述べられている。
デンプンはグルコースのホモ多糖類である。それは2つの構成要素、アミロースおよびアミロペクチンを含有する顆粒として、高等植物中で合成される(非特許文献12)。本質的にα(1,4)−結合したグルコース残基によって形成される直鎖多糖類であるアミロースは、顆粒の15〜25%の割合を占める(植物種によって含有量は変動する)。対照的にアミロペクチンは高度に分岐しており、グルコシド結合の約4〜5%がα(1,6)−結合したグルコース残基である。デンプンを分解するデンプン分解酵素については、詳しく研究されている。高等植物種中における最初にポリマーを個々のグルコース残基に分解することによるデンプン代謝は、いくつかのデンプン分解酵素の相互作用を必要とする。
デンプン分解酵素は、単独で作用すると、デンプンを部分的にのみ、より小さい直鎖または分枝鎖に分解することが多い。デンプン分解酵素の組み合わせ、あるいは酸処理に加えた酵素の組み合わせを使用して、デンプンの脱重合を増大させても良い。
酵素および酵素の組み合わせは、デンプンを部分的に分解して、より小さな直鎖または分枝鎖をもたらし、あるいは完全にグルコースに分解するかもしれない。α−グルコシダーゼは、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、およびプルラナーゼなどのその他のデンプン分解酵素の作用、あるいは酸および熱処理によって形成される、オリゴ糖に見られる(1,4)−および(1,6)−結合の双方を加水分解する。
α−グルコシダーゼ(α−D−グルコシドグルコヒドロラーゼ、例えばEC3.2.1.20)は微生物間に広く分布する。それらは(1,4)−および(1,6)−結合を加水分解し、非還元末端からα−D−グルコース単位を遊離する。バチルス(Bacillus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)細菌種、ピロコッカス(Pyrococcus)、サーモコッカス(Thermococcus)、サーモトガ(Thermotoga)などの超好熱性古細菌、およびペニシリウム(Penicillium)、テトラヒメナ(Tetrahymena)、サッカロミセス(Saccharomyces)、およびアスペルギルス(Aspergillus)属などの真菌種で、異なる(そして幅広い)基材特異性を有するこれら酵素の様々なタイプが見つかっている。
クロカビ(Aspergillus niger)からの酵素は、多年にわたり詳しく研究されており、幅広い基材特異性を有する。それはマルトース、コウジビオース、ニゲロース、イソマルトース、フェニル−α−グルコシド、フェニル−α−マルトシド、オリゴ糖、マルトデキストリン、および可溶性デンプンなどの基材を加水分解する。類似の特性は、コウジカビ(A.oryzae)、枯草菌(Bacillus subtilis)、およびセレウス菌(B.cereus)および超好熱性古細菌からのα−グルコシダーゼによっても示される。
オリゴ−(1,6)−グルコシダーゼまたはイソマルターゼ(デキストリン6−α−D−グルカノヒドロラーゼ,EC3.2.1.10;dexB遺伝子によってコード化される)は、α−グルコシダーゼに類似した酵素である(非特許文献13)。それはα−アミラーゼ(非特許文献14)によってデンプンおよびグリコーゲンから生成されるイソマルトースおよびデキストリン中の(1,6)−α−D−グルコシド結合の加水分解を触媒する。この酵素は、α−グルコシダーゼ程には分布していないが、B.サーモグルコシジウス(B.thermoglucosidius)KP1006、セレウス菌(B.cereus)ATCC7064、およびおそらくはB.アミロリクエフェイシエンス(B.amyloliquefaciens)ATCC23844(非特許文献12)、並びにバチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)(非特許文献15)をはじめとするバチルス(Bacillus)種などの生物中に見いだされる。バチルス(Bacillus)酵素は、典型的に大きさが60〜63kDaである。サーモアナエロビウム(Thermoanaerobium)Tok6−B1からは、オリゴ−(1,6)−α−グルコシダーゼ(EC3.2.1.10)も単離されており、分子量は3033kDaと報告されている。
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)からのdexB酵素は、デキストラン中の(1,6)−α−D−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒する、デキストラナーゼ酵素(EC3.2.1.11)に類似した活性パターンを有する。dexB酵素とバチルス(Bacillus)種オリゴ−(1,6)−グルコシダーゼとの間には高い類似性がある(非特許文献16)。DexBはおよそ62kDaの大きさである(非特許文献17)。
α(1,6)加水分解酵素活性を有する酵素は、81を超えるグルコシル加水分解酵素の認識された系統群の非常に広範なカテゴリーに属する(非特許文献18)、(非特許文献19)。発酵可能基材としてα(1,6)結合したグルコース単位を利用できる酵素の広範な集団は、アミノ酸配列同一性わずか69%の酵素を使用して、本発明の有用性を実証することでさらに強調される。α(1,6)−結合したグルコース残基を含有するオリゴ糖を脱重合する能力を有する酵素は既知であり、配列中の次の連鎖が(1,4)−α−D−グルコシド結合である場合、(1,6)−α−D−グルコシド結合または連鎖を急速に加水分解するグルコアミラーゼ(EC3.2.1.3、アミログルコシダーゼとしても知られる)と、プルラン、アミロペクチン、グリコーゲン中の(1,6)−α−D−グルコシド結合、そしてアミロペクチンおよびグリコーゲンのα−およびα−アミラーゼ限界デキストリンを分解するα−デキストリンエンド−(1,6)−α−グルコシダーゼ(EC3.2.1.41、プルラナーゼとしても知られる)と、腸粘膜から単離されイソマルトースに対する活性を有するスクラーゼ(EC3.2.1.48)と、グリコーゲン、アミロペクチン、およびそれらのα−限界デキストリン中の(1,6)−α−D−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ(EC3.2.1.68)と、(1,6)−α−D−グルカンからの連続的グルコース残基および誘導されたオリゴ糖を加水分解するグルカン(1,6)−α−グルコシダーゼ(EC3.2.1.70)となどが挙げられる。
本開示の文脈においては、いくつかの用語を使用する。
「デンプン」と言う用語は、植物中で栄養貯蔵所を形成する、グリコシド結合によって連結されたD−グルコース単位からなるホモ多糖類を指す。デンプンは2つの形態、アミロースおよびアミロペクチンで生じる。アミロースでは、D−グルコース単位がα(1,4)グリコシド結合によってのみ連結する。複数のα(1,4)グリコシド結合からなる鎖は、直鎖または非分枝鎖とみなされる。アミロペクチンでは、優勢な結合はα(1,4)グリコシド結合を通じたものであるが、α(1,6)グリコシド結合の時々の存在が、さもなければ直鎖のセクションにおいて分岐点を形成する。アミロペクチン30個のα(1,4)連鎖あたり約1個のα(1,6)結合を含有する。
「単糖類」と言う用語は、経験式(CH2O)n(式中、n≧3であり、炭素主鎖は非分岐であり、1つを除く各炭素原子は水酸基を含有し、残る炭素原子は炭素原子2においてアルデヒドまたはケトンである。)の化合物を指す。「単糖類」と言う用語は、細胞内環状ヘミアセタールまたはヘミケタールの形態も指す。最もなじみ深い単糖類はD−グルコースである。D−グルコースの環状形態は、ヘミアセタールを形成する炭素原子5の水酸基と炭素原子1のアルデヒドとの反応に関与し、カルボニル炭素はアノマー炭素と称される。
「グリコシド結合」および「グリコシド連結」と言う用語は、アノマー炭素とアルコールの水酸基との反応によって形成するアセタールを指す。1つのD−グルコース分子のアノマー炭素と2つめのD−グルコース分子の炭素原子4の水酸基との反応は、(1,4)グリコシド結合または連鎖をもたらす。同様に、1つのD−グルコース分子と第2のD−グルコース分子の炭素原子6の水酸基とのアノマー炭素の反応は、(1,6)グリコシド結合または連鎖をもたらす。当業者は、グリコシド結合が、αまたはβ立体配置で生じても良いことを理解するであろう。グリコシド結合立体配置は、例えばα(1,4)およびα(1,6)と命名される。
「α」と言う用語は、連鎖が環平面よりも高い位置にある、高次構造を指す。対照的に「β」連鎖とは、連鎖が環平面よりも低い位置にあることを指す。
「オリゴ糖」と言う用語は、グリコシド結合によって連結された2〜10個の単糖類単位を含有する化合物を指す。「多糖類」と言う用語は、グリコシド結合によって連結された10個を超える単糖類単位を含有する化合物を指し、概してより大きな分子量の化学種の混合物を指す。単一モノマー単位からなる多糖類は、「ホモ多糖類」と言う用語で言及される。
「イソマルトサッカライド」と言う用語は、少なくとも1つのα(1,6)−結合を有するオリゴ糖を指す。
「(1,4)結合」と言う用語は、その中で1つのサッカライド単位からのC1が、第2のサッカライド単位のC4に結合する2つのサッカライドの関係を指す。
「(1,6)結合」と言う用語は、その中で1つのサッカライド単位からのC1が、第2のサッカライド単位のC6に結合する2つのサッカライドの関係を指す。
「アミラーゼ」および「α−アミラーゼ」と言う用語は、α(1,4)グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。α(1,4)グリコシド結合を加水分解する活性は、「アミラーゼ活性」または「デンプン分解活性」と言う用語で言及される。アミラーゼとしては、IUBMB分類EC3.2.1.1(アミラーゼ)、EC3.2.1.60((1,4)−α−マルトテトラオヒドロラーゼ)、およびEC3.2.1.98((1,4)−α−マルトヘキサオシダーゼ)を含む群が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「イソアミラーゼ」および「α−イソアミラーゼ」と言う用語は、α(1,6)グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。α(1,6)グリコシド結合を加水分解する活性は、「イソアミラーゼ活性」または「イソデンプン分解活性」と言う用語で言及される。イソアミラーゼとしては、IUBMB分類EC3.2.1.10(オリゴ−(1,6)−グルコシダーゼ)、EC3.2.1.11(デキストランase)、EC3.2.1.41(プルラナーゼ)、およびEC3.2.1.68(イソアミラーゼ)を含む群が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「グルコシダーゼ」および「α−グルコシダーゼ」と言う用語は、α(1,4)グリコシド結合およびα(1,6)グリコシド結合双方の加水分解を触媒して、オリゴ糖の非還元末端からα−D−グルコース単位を遊離する酵素を指す。グルコシダーゼは、デンプン分解活性およびイソデンプン分解活性の双方を有する。グルコシダーゼとしては、IUBMB分類EC32.1.3(アミログルコシダーゼ)およびEC3.2.1.20(α−グルコシダーゼ)を含む群が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する酵素」と言う用語は、α(1,6)グリコシド結合の加水分解を触媒する機能活性を有する酵素を指す。このような機能活性を有する酵素の具体例としては、イソアミラーゼ、α−イソアミラーゼ、グルコシダーゼ、およびα−グルコシダーゼが挙げられる。
「イソマルターゼ」または「オリゴ−(1,6)−グルコシダーゼ」または「デキストリン6−α−D−グルカノヒドロラーゼ」と言う用語は、オリゴ糖の非還元末端でα(1,6)−結合のみを加水分解する酵素(EC3.2.1.10)を指す。
「DexB」と言う用語は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)のdexB遺伝子(GenBank Accession番号M77351)によってコード化される(1,6)−α−グルコシダーゼを指し、これはα(1,6)−結合したイソマルトサッカライドおよびデキストランの非還元末端からグルコースを放出する。
「限界デキストリン」と言う用語は、単糖類およびオリゴ糖を含むデンプンの分解産物を指す。アミロペクチンに対するアミラーゼの作用からは、単糖類(Dグルコース)、二糖類(α(1,4)結合したマルトース、およびα(1,6)結合したイソマルトース)、および高級オリゴ糖の混合物が生じる。高級オリゴ糖は、直鎖((α(1,4)結合のみを含有する)または分枝鎖(α(1,4)結合およびα(1,6)結合を主に含有する)であっても良い。
「重合度」または「DP」と言う用語は、サッカライド混合物の個々の構成要素中に存在するモノマー単位の数を指す。例えばD−グルコースなどの単糖類のDPは1であり、マルトースなどの二糖のDPは2であり、パノースなどの三糖のDPは3である。多糖類混合物またはオリゴ糖混合物に適用される場合、DPは分子あたりのモノマーの平均数を指す。
「デキストロース当量」(「DE」)と言う用語は、レイン−エイノン滴定によって求められる、乾物上のデキストロース百分率として表される還元糖含量を指す(非特許文献20)。DEスケールはデンプンの加水分解の程度を示し、デンプンは名目上のDE値0を有し、究極的な加水分解生成物のDE値は100である。
アミラーゼおよびイソアミラーゼ活性は、細胞内または細胞外にあっても良い。本発明の目的では、「細胞内活性」と言う用語は、基材を提供した際に、破壊細胞または細胞抽出物について観察できるが、基材を細胞外に提供した場合、無傷の細胞では観察されない酵素活性を指すことを意図する。「細胞外活性」と言う用語は、基材を細胞外に提供した際に、無傷の細胞(成育中の細胞を含む)で観察される活性を指すことを意図する。酵素基材が細胞内に受動的拡散し、あるいは能動的輸送されることができないことは、「細胞内活性」および「細胞外活性」と言う用語で暗示される。
「標的分子」とは、生体触媒的に生成された生成物を指す。これは生体触媒によって自然に生成された化合物であるかもしれず、あるいは非天然遺伝子が、バイオ発酵におけるそれらの機能発現のために微生物中に遺伝子組み換えされているかもしれない。この文脈では「標的分子」とは、フィードバック阻害を排除するため、および/または生体触媒活性を最大化するために、バイオ発酵システムから選択的に除去することが望ましいバイオ発酵のあらゆる副産物も指す。
「容積生産性」とは、時間当たりの特定容積でバイオ発酵中で生成された標的分子の質量を指し、単位はグラム/(リットル時間)(g/(Lhr)と略される)である。この測定は、生体触媒の比活性および生体触媒の濃度によって求められる。それはバイオ発酵の力価、ランタイム、および仕事量から計算される。
「力価」とは、単位がグラム/(リットル)(g/Lと略される)である標的分子濃度を指す。
「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、および「核酸断片」または「単離核酸断片」と言う用語は、ここでは同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二重鎖で、任意選択的に合成、非天然または変性ヌクレオチド塩基を含有する、RNAまたはDNAのポリマーであっても良い。DNAポリマーの形態のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のcDNA、ゲノムDNA、合成DNAのセグメント、またはそれらの混合物を含んでも良い。
「単離」と言う用語は、自然発生的環境において、材料に常態で付随する、あるいはそれと相互作用する構成要素から、実質的に遊離し、さもなくば除去された、核酸分子および/またはタンパクなどの材料を指す。単離ポリヌクレオチドは、その中でそれらが自然に生じる宿主細胞から精製されても良い。当業者に既知の従来の核酸精製法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ても良い。この用語は、組換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。
ここでの用法では、任意選択的に合成非天然または変性ヌクレオチド塩基を含有する、「単離核酸分子」または「単離核酸断片」は、一本鎖または二重鎖のRNAまたはDNAのポリマーである。DNAポリマーの形態の単離核酸断片は、1つまたは複数のcDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAセグメントを含んでも良い。
「相補的」と言う用語は、お互いにハイブリッド形成できるヌクレオチド塩基間の関係を述べるのに使用される。例えばDNAに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は、添付の配列一覧で報告されるような完全な配列に相補的な単離核酸断片、並びに実質的に類似の核酸配列も含む。
本明細書での用法では「実質的に類似の」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基における変化が、1つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらすが、ヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドの機能特性には影響しない核酸断片を指す。したがって発明は、特定の例示的なヌクレオチドまたはアミノ酸配列を包含するに留まらず、その機能同等物を含むものと理解される。「実質的に類似の」および「実質的に相当する」と言う用語は、ここでは同義的に使用される。
さらに特定部位において化学的同等アミノ酸の産生をもたらすが、コード化されたポリペプチドの機能特性に影響しない核酸断片中の変更は、技術分野で周知である。したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンなどの別のより疎水性の低い残基をコード化するコドン、あるいはバリン、ロイシン、またはイソロイシンなどのより疎水性の高い残基によって置換されてもよい。同様にアスパラギン酸からグルタミン酸へのような1つの負に荷電した残基の別の残基への、あるいはリジンからアルギニンへのような1つの正に荷電した残基の別の残基への置換をもたらす変化からも、機能的相当品が生じることが期待できる。ポリペプチド分子のN末端およびC末端部分の変更をもたらすヌクレオチド変化も、ポリペプチドの活性を変更しないものと予期される。それぞれの提案された修正は、技術分野で常用の技能の範囲に十分収まり、コード化するされた生成物の生物活性の保持の判定についても同様である。
さらに実質的に類似の核酸断片は、それらのハイブリッド形成能によって特徴づけられても良い。当業者によって良く理解されるように、このような相同性の評価は、厳密的条件下でのDNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリッド形成のどちらかによって提供される(非特許文献21)。厳密的条件は、遠縁の生物からの相同的配列などの中程度に類似の断片をスクリーンするため、そして機能的酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの高度に類似の断片をスクリーンするために調整できる。ハイブリッド形成後の洗浄が、厳密条件を決定する。1つの好ましい条件の組は、室温において6×SSC、0.5%SDSで15分間に始まり、次に45℃において2×SSC、0.5%SDSで30分間を反復し、次に50℃において0.2×SSC、0.5%SDSを30分間を2回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましい厳密的条件の組はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の0.2×SSC、0.5%SDS中での2回の30分間の洗浄の温度を60℃に増大させたこと以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度に厳密的条件の組は、65℃において0.1×SSC、0.1%SDS中での2回の最終洗浄を使用する。
本発明の実質的に類似の核酸断片は、当業者によって一般に用いられるアルゴリズムで求められるように、それらがコード化するアミノ酸配列と、ここで開示されるアミノ酸配列との同一性百分率によって特徴づけられても良い。適切な核酸断片(本発明の単離ポリヌクレオチド)は、ここで報告するアミノ酸配列と、少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一のポリペプチドをコード化する。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも85%同一のアミノ酸配列をコード化する。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列をコード化する。より好ましいのは、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列をコード化する核酸断片である。適切な核酸断片は上の同一性を有するだけでなく、典型的に少なくとも50個のアミノ酸、好ましくは少なくとも100個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも150個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも200個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも250個のアミノ酸を有するポリペプチドをコード化する。
関連ポリペプチド配列の同定において、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によって良く理解される。同一性百分率の有用な例は、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%、または55%〜100%のあらゆる整数値の百分率である。「同一性百分率」と言う用語は、技術分野で既知のように、配列を比較することで判定される、2つ以上のポリペプチド配列、または2つ以上ポリヌクレオチド配列間の関係である。技術分野で「同一性」とは、場合によっては、このような配列のストリング間の合致によって判定されるように、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、(非特許文献22)、(非特許文献23)、(非特許文献24)、(非特許文献25)、(非特許文献26)で述べられるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の合致を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に公開されたコンピュータプログラムで体系化される。配列整合および同一性百分率の計算は、ウィスコンシンマディソンのDNASTAR(DNASTAR Inc.(Madison、WI))からのLASER遺伝子バイオインフォマティクス計算スイートのMegalignプログラムを使用して実施しても良い。Clustal整合法(非特許文献27)を使用して、デフォルトのパラメータ(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)で、配列の複数の整合を実施した。Clustal法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5であった。
適切な核酸断片(本発明の単離ポリヌクレオチド)は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約60%同一の、好ましくは少なくとも約80%同一のポリペプチドをコード化する。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と約85%同一のアミノ酸配列をコード化する。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列をコード化する。最も好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約95%同一のアミノ酸配列をコード化する。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が構成するタンパクまたは遺伝子の推定的同定を提供するのに十分な、アミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、当業者によって手動で、あるいはBLASTなどのアルゴリズムを用いるコンピュータベースの配列比較および同定ツールを使用して評価できる((非特許文献28)、国立衛生研究所の国立医学図書館全米バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトにあるBLASTアルゴリズムの説明も参照されたい)。概してポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパクまたは遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、10個以上の隣接アミノ酸または30個以上の隣接ヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、30以上の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプローブを遺伝子同定の配列依存的方法(例えばサザンハイブリダイゼーション)および分離(例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置(in situ)ハイブリッド形成)において使用しても良い。さらにプライマーを含む特定の核酸断片を得るために、PCRにおいて増幅プライマーとして、12個以上のヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドを使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含む核酸断片の特異性同定および/または分離を可能にする、ヌクレオチド配列を含む。本願明細書は、1つまたは複数の特定の植物タンパクを含むポリペプチドをコード化する、アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。ここで報告される配列の恩恵を受ける当業者は、当業者には既知である目的のために、開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用することができる。したがって本発明は、添付の配列一覧で報告される完全な配列、並びに上で定義されるこれらの配列のかなりの部分を含む。
「コドン縮重」とは、コード化されるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードにおける多様性を指す。したがって本発明は、ここで示されるアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコード化するヌクレオチド配列を含む、あらゆる核酸断片に関する。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために核酸断片を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように、核酸断片をデザインすることが望ましい。
「合成核酸断片」または「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして、より大きな核酸断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の核酸断片全体を構成しても良い。「化学的に合成された」とは、核酸断片に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体内で(in vitro)構築されたことを意味する。核酸断片の手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の1つを使用して、自動化学合成を実施できる。したがって核酸断片をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合における、遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのGCGパッケージソフト(Wisconsin Package Version 9.0、Genes Computer Group(GCG),Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(非特許文献29)、およびウィスコンシン州マディソンのDNASTAR(DNASTARInc.1228 S.Park St.Madison、WI 53715 USA)からのDNASTARおよびSmith−Watermanアルゴリズムを組み入れたFASTAプログラム(非特許文献30)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
「遺伝子」とは、コード配列に先行する(5’非コード配列)およびその後の(3’非コード配列)制御配列をはじめとする、特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列を有する自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでも良い。「キメラタンパク」は、キメラ遺伝子によってコード化されるタンパクである。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来遺伝子」とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、組換えDNA作成物、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
「コード配列」とは、特異性アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を指す。
「制御配列」および「適切な制御配列」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、その中、または下流(3’非コード配列)に位置し、関連コード配列の転写、RNAプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むかもしれない。
「プロモーター」とは、コード配列または機能RNAの発現を調節できるヌクレオチド配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して3’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ヌクレオチドセグメントを含んでさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが、当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に核酸断片の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に限定されていないので、異なる長さの核酸断片が、同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
所望の宿主細胞において本発明の遺伝子の発現を進行させるのに有用なプロモーターは、多数あり当業者にはなじみ深い。CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(サッカロミセス(Saccharomyces)での発現に有用);AOX1(ピチア(Pichia)での発現に有用);lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、およびtrc(大腸菌(E.coli)での発現に有用)、ストレプトマイセス・リビディンス(Streptomyces lividins)GI、並びにバチルス(Bacillus)での発現に有用なamy、apr、およびnprプロモーターおよび様々なファージプロモーターをはじめとするが、これに限定されるものではない遺伝子を駆動できる、実質的にあらゆるプロモーターが、本発明にとって適切である。
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流である完全にプロセスされたmRNA中に存在する。翻訳リーダー配列は、mRNAへの転写一次産物のプロセッシング、mRNA安定性または翻訳効率に影響するかもしれない。翻訳リーダー配列の例について述べられている(非特許文献31)。
「3’非コード配列」はコード配列の下流に位置するDNA配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えられる制御シグナルをコード化するその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。異なる3’非コード配列の利用が例証されている(非特許文献32)。
「RNA転写物」とは、DNA配列のRNAポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されたRNA配列であるかもしれず、成熟RNAと称される。「メッセンジャーRNA(mRNA)」とはイントロンがなく、細胞によってポリペプチドに翻訳されることができるRNAを指す。「cDNA」とは、mRNAテンプレートに対して相補的であり、それから誘導されるDNAを指す。cDNAは一本鎖であり、あるいは例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を使用して二重鎖形態に転換できる。「センスRNA」とは、mRNAを含み、細胞によってポリペプチドに翻訳されることができるRNA転写物を指す。「アンチセンスRNA」とは、標的一次転写物またはmRNAの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするRNA転写物を指す(参照によってここに編入する米国特許公報(特許文献2)を参照されたい)。アンチセンスRNAの相補性は、特異性ヌクレオチド配列のあらゆる部分、すなわち5’非コード配列、3’非コード配列、イントロン、またはコード配列にあっても良い。「機能RNA」とは、翻訳されないかもしれないが、それでもなお細胞過程に影響するセンスRNA、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、またはその他のRNAを指す。
「作動可能に連結された」と言う用語は、単一ポリヌクレオチド上に位置し、互いに連携して、1つの機能が他方の機能に影響する2つ以上の核酸断片を指す。例えばプロモーターはコード配列と作動可能に連結し、そのコード配列の発現に影響することができる(すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある)。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動可能に連結できる。
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されたセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積を指す。発現は、mRNAのポリペプチドへの翻訳も指す。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク発現を抑制できるアンチセンスRNA転写物の産生を指す。「過剰発現」とは、正常なまたは非形質転換生物中の産生レベルを超える、遺伝形質転換生物における遺伝子産物の産生を指す。「コサプレッション」とは、同一のまたは実質的に類似の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスRNA転写物の産生を指す(参照によってここに編入する米国特許公報(特許文献3))。
「タンパク」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド中のコード配列によって定まる特定の順序に配列されたアミノ酸の鎖である。各タンパクまたはポリペプチドは、独自の機能を有する。
「シグナル配列」とは、シグナルペプチドをコード化するヌクレオチド配列を指す。
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物または宿主生物ゲノムの中への核酸断片の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」、「遺伝形質転換」、または「形質転換」生物と称される。したがって本発明の単離ポリヌクレオチドは、典型的にDNAコンストラクトである組換えコンストラクト中に組み込むことができ、宿主細胞への導入およびその中での複製ができる。このようなコンストラクトは、特定の宿主細胞においてポリペプチド−コード化する配列の転写および翻訳ができる、複製システムおよび配列を含むベクターであることができる。典型的に発現ベクターは、例えば5’および3’制御配列の転写調節下の1つまたは複数のクローン化遺伝子、および選択可能マーカーを含む。このようなベクターは、プロモーター制御領域(例えば誘導性または構成的な、環境的または発達的に制御される、または部位特異的発現を調節する制御領域)、転写イニシエーション開始部位、リボゾーム結合部位、転写終結部位、および/またはポリアデニル化シグナルも含有することができる。
「宿主細胞」または「宿主生物」と言う用語は、外来性または異種性の遺伝子、または内在性遺伝子の複数のコピーを受容でき、これらの遺伝子を発現して活性遺伝子産物を産生できる微生物を指す。
「DNAコンストラクト」または「コンストラクト」と言う用語は、人為的に構築されたDNA断片を指す。このようなコンストラクトは、単独で使用されても良く、あるいはベクターと併せて使用されても良い。
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二重鎖DNA分子の形態である染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる源から誘導された一本鎖または二重鎖DNAまたはRNAの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な3’非翻訳配列と共に、プロモーター断片およびDNA配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特異性ベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特異性ベクターを指す。
「コード化(encoding)」および「コード化(coding)」と言う用語は、それによって遺伝子が、転写および翻訳機構を通じてアミノ酸配列を生じるプロセスを指す。特異性アミノ酸配列のコード化するプロセスは、DNA配列を含み、それはコード化されるアミノ酸に変化を引き起こさない塩基の変化伴うかもしれず、あるいはそれは1つまたは複数のアミノ酸を変化させるかもしれないが、DNA配列によってコード化されるタンパクの機能特性には影響しない塩基の変化を伴うかもしれない。したがって発明は、特定の代表的配列以上のものを包含するものと理解される。
「PCR」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、当業者には、特定のDNAセグメント増幅のために使用される技術として周知である(米国特許公報(特許文献4)および米国特許公報(特許文献5))。
「ORF」または「読み取り枠」とは、ペプチドまたはタンパクをコード化するDNA分子中のヌクレオチド配列である。この用語は、DNA断片の配列が決定された後、コード化されたタンパクの機能が未知である場合に、使用されることが多い。
「発酵可能炭素基材」と言う用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることができる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基材またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。
(相同体の分離)
本発明の核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物種からの相同的タンパクをコード化する遺伝子を分離しても良い。配列−依存性プロトコルを使用した相同的遺伝子の分離は、技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例としては、様々な核酸増幅技術の使用で例証されるように、核酸ハイブリッド形成法、およびDNAおよびRNA増幅法が挙げられるが、これに限定されるものではない(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Mullisらの米国特許公報(特許文献6)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(非特許文献33)、または連鎖置換増幅(SDA)(非特許文献34))。
本発明の核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物種からの相同的タンパクをコード化する遺伝子を分離しても良い。配列−依存性プロトコルを使用した相同的遺伝子の分離は、技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例としては、様々な核酸増幅技術の使用で例証されるように、核酸ハイブリッド形成法、およびDNAおよびRNA増幅法が挙げられるが、これに限定されるものではない(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Mullisらの米国特許公報(特許文献6)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(非特許文献33)、または連鎖置換増幅(SDA)(非特許文献34))。
典型的にPCRタイプ増幅技術ではプライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。PCRプライマーデザインの方法は一般的であり、技術分野で周知である。(非特許文献35)、(非特許文献36)。
ハイブリッド形成法は、良好に定義されている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリッド形成を可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件の下、無機または有機塩存在下でプローブとサンプルとを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸間のあらゆる可能なハイブリッド形成が起きるように、十分な時間接触していなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度が、ハイブリッド形成が起きる所要時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリッド形成時間は短くなる。
様々なハイブリッド形成溶液を用いることができる。典型的に、それらは約20〜60容量%、好ましくは30容量%の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリッド形成溶液は、約30〜50%v/vのホルムアミドと、約0.15〜1Mの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、トリス−HCl、PIPESまたはHEPES(pH範囲約6〜9)などの約0.05〜0.1Mの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムまたは0.5〜20mMEDTA、FICOLL(ファーマシア(Pharmacia)Inc.)(約300〜500kDa)、ポリビニルピロリドン(約250〜500kDal)、および血清アルブミンなどの約0.05〜0.2%の洗浄剤とを用いる。また典型的なハイブリッド形成溶液には、約0.1〜5mg/mLの非標識の担体核酸、例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子DNA、または酵母菌RNAなどの破片核酸DNA、および任意選択的に約0.5〜2%wt./vol.のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールや、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの陰イオンポリマーや、デキストラン硫酸などの陰イオン糖類ポリマーなどの様々な極性水溶性または水膨張性剤を含む容積排除剤などのその他の添加剤を含めても良い。
(組換え発現−微生物)
本配列の遺伝子および遺伝子産物を微生物宿主細胞に導入しても良い。本遺伝子および核酸分子の発現のために好ましい宿主細胞は、真菌または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、pH価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。大規模微生物生育および機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用しても良い。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育条件によって、阻止または抑圧され制御されても良い。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されても良い。生育速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であるかもしれない。適切な宿主系統の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)などの真菌または酵母菌種、またはプロテオバクテリアおよび放線菌類のメンバーなどの細菌種、ならびにロドコッカス(Rhodococcus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、アシドボラック(Acidovorax)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、およびコリネバクテリウム(Cornyebacterium)の特定の属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本配列の遺伝子および遺伝子産物を微生物宿主細胞に導入しても良い。本遺伝子および核酸分子の発現のために好ましい宿主細胞は、真菌または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、pH価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。大規模微生物生育および機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用しても良い。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育条件によって、阻止または抑圧され制御されても良い。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されても良い。生育速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であるかもしれない。適切な宿主系統の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)などの真菌または酵母菌種、またはプロテオバクテリアおよび放線菌類のメンバーなどの細菌種、ならびにロドコッカス(Rhodococcus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、アシドボラック(Acidovorax)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、およびコリネバクテリウム(Cornyebacterium)の特定の属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の発酵工程において、宿主微生物として使用するのに、大腸菌(E.coli)が特に良く適している。大腸菌(E.coli)は、α(1,6)連鎖を含有するオリゴ糖を代謝できず、またDP>7のあらゆるオリゴ糖を代謝することが困難である。
外来性タンパクの高レベル発現を導く制御配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者には周知である。これらのいずれかを使用してキメラ遺伝子を構築し、本配列の遺伝子産物を産生できる。次に形質転換技術を通じて、これらキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できる。
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の5’領域、および転写終結を制御するDNA断片の3’領域を含む。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。
イニシエーション制御領域またはプロモーターは、遺伝子産物の発現を進めるのに有用である。終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。任意選択的に終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
いくつかの用途では、本タンパクを異なる細胞区画に導くことが有用であろう。したがってコード配列を変化させて、輸送配列などの適切な細胞内標的配列を有する酵素をコード化することで、上述のキメラ遺伝子をさらに補足することが想定された。
(促進された活性を有する酵素)
本配列を使用して、促進されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造することが考察された。天然遺伝子配列を変異させて、改変されたまたは促進された活性を有する遺伝子産物を製造する、参照によってここに編入する、誤りがちなPCR(非特許文献37)、部位特異的突然変異生成(非特許文献38)および「遺伝子シャッフリング」(米国特許公報(特許文献7)、米国特許公報(特許文献8)、米国特許公報(特許文献9)、および米国特許公報(特許文献10))をはじめとするが、これに限定されるものではない様々な方法が知られている。
本配列を使用して、促進されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造することが考察された。天然遺伝子配列を変異させて、改変されたまたは促進された活性を有する遺伝子産物を製造する、参照によってここに編入する、誤りがちなPCR(非特許文献37)、部位特異的突然変異生成(非特許文献38)および「遺伝子シャッフリング」(米国特許公報(特許文献7)、米国特許公報(特許文献8)、米国特許公報(特許文献9)、および米国特許公報(特許文献10))をはじめとするが、これに限定されるものではない様々な方法が知られている。
(経路モジュレーション)
糖代謝経路を有するあらゆる生物において、このような経路を操作する上で、本遺伝子の配列知識は有用であろう。遺伝的経路を操作する方法は一般的であり、技術分野で周知である。特定経路中の選択された遺伝子は、様々な方法によってアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされても良い。さらに生物の競合経路は、遺伝子破壊および類似の技術によって排除または昇華されても良い。
糖代謝経路を有するあらゆる生物において、このような経路を操作する上で、本遺伝子の配列知識は有用であろう。遺伝的経路を操作する方法は一般的であり、技術分野で周知である。特定経路中の選択された遺伝子は、様々な方法によってアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされても良い。さらに生物の競合経路は、遺伝子破壊および類似の技術によって排除または昇華されても良い。
ひとたび重要な遺伝的経路が同定および配列決定されると、特定の遺伝子をアップレギュレーションして経路の産出量を増大できる。例えばpBR322などの多コピー型プラスミド上で、標的遺伝子の追加的コピーを宿主細胞に導入しても良い。代案としては、非天然プロモーターの調節の下におかれるように標的遺伝子を変性しても良い。経路が、細胞サイクル中または発酵生産中の特定点で作動することが所望される場合、制御されたまたは誘導性プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置き換えても良い。同様に場合によっては、天然または内在性プロモーターを変性させて、遺伝子発現を増大させても良い。例えば内在性プロモーターは、生体内で(in vivo)突然変異、欠失、および/または置換によって変性できる(Kmiecの米国特許公報(特許文献11)、Zarlingらの(特許文献12)を参照されたい)。
本発明の文脈内では、いくつかの周知の方法(例えばアンチ−センス、照射−または化学誘発突然変異、遺伝子−シャフリングなど)のいずれかの1つによって、糖代謝経路の発現を変調することが有用かもしれない。例えば本発明は、糖代謝経路において主要酵素をコード化するいくつかの遺伝子を提供し、単糖の産生をもたらす。単離遺伝子としてはα−グルコシダーゼおよびイソマルターゼ遺伝子が挙げられる。例えばグルコースまたはマルトースを蓄積することが所望される場合、上記方法のいずれかを用いて、本発明のα−グルコシダーゼおよびイソマルターゼ遺伝子を過剰発現しても良い。同様に上述の方法のいずれかの1つによって、解糖経路などの下流遺伝子の破壊をすることで、生合成遺伝子のグルコースまたはマルトース蓄積を達成しても良い。
(バイオ発酵)
本発明は、様々なバイオ発酵法、特に大規模工業的工程に適したものに適応できる。発明は、バッチ、流加バッチ、または連続法を使用して実施しても良いが、好ましくは流加バッチモードで実施される。これらのバイオ発酵法は、技術分野で一般的であり周知である((非特許文献39)または(非特許文献40))。
本発明は、様々なバイオ発酵法、特に大規模工業的工程に適したものに適応できる。発明は、バッチ、流加バッチ、または連続法を使用して実施しても良いが、好ましくは流加バッチモードで実施される。これらのバイオ発酵法は、技術分野で一般的であり周知である((非特許文献39)または(非特許文献40))。
「バイオ発酵システム」または「バイオ発酵」は、生体触媒を使用して、基材(群)と生成物(群)の間の反応を触媒するシステムを指す。
(生体触媒)
生体触媒は、基材(群)と生成物(群)の間の化学反応を開始し、あるいはその速度を変化させる。生体触媒は、微生物全体または単離酵素触媒の形態であっても良い。微生物全体は、透過化処理などの前処理なしに生体触媒として使用できる。代案としては、当業者になじみの深い方法(例えばトルエン、洗浄剤、または凍結融解による処理)によって、細胞全体を透過化処理して、細胞内外への材料の拡散速度を改善しても良い。
生体触媒は、基材(群)と生成物(群)の間の化学反応を開始し、あるいはその速度を変化させる。生体触媒は、微生物全体または単離酵素触媒の形態であっても良い。微生物全体は、透過化処理などの前処理なしに生体触媒として使用できる。代案としては、当業者になじみの深い方法(例えばトルエン、洗浄剤、または凍結融解による処理)によって、細胞全体を透過化処理して、細胞内外への材料の拡散速度を改善しても良い。
本発明で有用な微生物としては、細菌(例えば腸内細菌エシェリキア(Escherichia)およびサルモネラ(Salmonella)、ならびにバチルス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、メチロバクター(Methylobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)およびシュードモナス(Pseudomonas)など)、ラン藻類(紅色細菌(Rhodobacter)およびシネコシスティス(Synechocystis)など)、酵母菌(サッカロミセス(Saccharomyces)、チゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ケカビ(Mucor)、ピチア(Pichia)、およびトルロプシス(Torulopsis)など)、糸状菌(アスペルギルス(Aspergillus)およびアルソボトリス(Arthrobotrys)など)、および藻類が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の目的では、「微生物」は、昆虫、動物、または植物からの細胞も包含する。
(培養条件)
微生物培養物の維持と生育に適した材料および方法は、微生物学またはバイオ発酵科学技術の当業者に周知である(非特許文献41)。所望の機能遺伝子発現のための微生物の特定の要件次第で、適切な培地、pH、温度、および好気性、ミクロ好気性、または嫌気性条件のための要件を考慮しなくてはならない。
微生物培養物の維持と生育に適した材料および方法は、微生物学またはバイオ発酵科学技術の当業者に周知である(非特許文献41)。所望の機能遺伝子発現のための微生物の特定の要件次第で、適切な培地、pH、温度、および好気性、ミクロ好気性、または嫌気性条件のための要件を考慮しなくてはならない。
(炭素基材培地)
本発明で使用するためのバイオ発酵培地(液体ブロスまたは溶液)は、生体触媒の要求に照らして選択された、適切な炭素基材を含有しなくてはならない。適切な基材としては、単糖類(グルコースおよびフルクトースなど)、二糖類(乳糖またはショ糖など)、オリゴ糖および多糖類(デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物など)、または再生可能な供給原料からの未精製混合物(乳清パーミエート、コーンスティープリカー、甜菜糖みつ、および大麦モルトなど)が挙げられるが、これに限定されるものではない。炭素基材は、一炭素基材(二酸化炭素、メタノール、またはメタンなど)であっても良い。
本発明で使用するためのバイオ発酵培地(液体ブロスまたは溶液)は、生体触媒の要求に照らして選択された、適切な炭素基材を含有しなくてはならない。適切な基材としては、単糖類(グルコースおよびフルクトースなど)、二糖類(乳糖またはショ糖など)、オリゴ糖および多糖類(デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物など)、または再生可能な供給原料からの未精製混合物(乳清パーミエート、コーンスティープリカー、甜菜糖みつ、および大麦モルトなど)が挙げられるが、これに限定されるものではない。炭素基材は、一炭素基材(二酸化炭素、メタノール、またはメタンなど)であっても良い。
適切な炭素源に加えて、バイオ発酵培地は、当業者に既知の適切なミネラル、塩、ビタミン、補助因子、緩衝液、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない(非特許文献42)。これらのサプリメントは、生体触媒の生育に適切であって、バイオ発酵標的産物を生成するのに必要な酵素経路を促進しなくてはならない。
最後に、工業的に有用な生成物を発現する機能遺伝子は、特定の生育条件(例えば窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素あるいは小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量の微量栄養素の形態と量)によって制御、抑制され、または抑制解除されても良い。機能遺伝子の制御は、培養物に添加されて典型的に栄養またはエネルギー源とみなされない、特定の制御分子(無償性誘導物質など)の存在または不在によって達成されても良い。生育速度も遺伝子発現において、重要な制御因子であるかもしれない。
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱することなく、発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。
略語の意味は次のとおり。「h」は時間を意味し、「min」は分を意味する。「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「g」はグラムを意味し、「kg」はキログラムを意味し、「HPLC」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「RI」は屈折率を意味する。
(一般的方法)
細菌培養物の生育の維持に適した材料および方法は、技術分野で周知である。以下の例で使用するための適切な技術は、(非特許文献43)または(非特許文献39)で述べられている。
細菌培養物の生育の維持に適した材料および方法は、技術分野で周知である。以下の例で使用するための適切な技術は、(非特許文献43)または(非特許文献39)で述べられている。
グリセロールの1,3−プロパンジオールへの転換は、HPLCによってモニターされた。クロマトグラフィーの当業者が利用可能な標準技術および材料を使用して、分析を実施した。適切な一方法は、UV(210nm)およびRI検出を使用したウォーター・マキシマ(Waters Maxima)820HPLCシステムを利用する。サンプルをマサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ(Waters(Milford、MA))から購入された、ショデックス(Shodex)SH−1011Ppreカラム(6mm×50mm)を装着したショデックス(Shodex)SH−1011カラム(8mm×300mm)上に注入し、温度を50℃に調節して、0.01NH2SO4を移動相として流速0.5mL/minで使用した。定量分析が所望される場合、外部標準として、既知量のトリメチル酢酸でサンプルを調製した。典型的にグルコース(RI検出)、グリセロール、1,3プロパンジオール(RI検出)、およびトリメチル酢酸(UVおよびRI検出)の滞留時間は、それぞれ15.27分間、20.67分間、26.08分間、および35.03分間であった。
(実施例1)
(ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)ATCC15700のゲノム塩基配列決定法)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC15700)は、米国ヴァージニア州マナッサス私書箱1549号の米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection,(Manassas、VA 20108、U.S.A.))から購入した。細胞ペレットを得て、10mMのNa−EDTAおよび50mMトリス−HCl、pH7.5を含有する溶液中に懸濁した。標準プロトコルに従って、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC15700)からゲノムDNAを単離した。出版されたプロトコルに従って、ゲノムDNAおよびライブラリー構成を調製した(非特許文献44)。
(ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)ATCC15700のゲノム塩基配列決定法)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC15700)は、米国ヴァージニア州マナッサス私書箱1549号の米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection,(Manassas、VA 20108、U.S.A.))から購入した。細胞ペレットを得て、10mMのNa−EDTAおよび50mMトリス−HCl、pH7.5を含有する溶液中に懸濁した。標準プロトコルに従って、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC15700)からゲノムDNAを単離した。出版されたプロトコルに従って、ゲノムDNAおよびライブラリー構成を調製した(非特許文献44)。
ゲノムDNAの調製:懸濁後、0.2%サルコシン、20mMのβ−メルカプトエタノール、および150単位/mLのリティカーゼ中で細胞を穏やかに溶解させ、30分間37℃でインキュベートした。トリス平衡化フェノールで2回、クロロホルムで2回DNAを抽出物した。DNAを70%エタノール中で沈殿させ、1mMのNa−EDTAおよび10mMトリス−HCl、pH7.5を含有する溶液中で懸濁させた。DNA溶液をリボ核酸ヌクレチダーゼ混合で処理し、次にトリス平衡化フェノールで2回、クロロホルムで2回抽出した。エタノール中での沈殿、1mMのNa−EDTAおよび10mMトリス−HCl、pH7.5中での懸濁がこれに続いた。
ライブラリー構築:30%グリセロール、300mM酢酸ナトリウム、1mMのNa−EDTA、および10mMトリス−HCl、pH7.5を含有する溶液中に50〜100μgの染色体DNAを懸濁し、イリノイ州シカゴのIBI Medical Products(IBI Medical Products、(Chicago、IL))からのアエロミスト・ダウンドラフト・ネビュライザー(Aeromist Downdraft Nebulizer)チャンバー内で12psiで60秒間剪断した。DNAを沈殿させ、懸濁し、BAL−31ヌクレアーゼで処理した。低融点アガロースゲル上でのサイズ分画後、分画(2.0kbまたは5.0kb)を切除し清潔にして、マサチューセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラブ(New England Biolabs,Inc.(Beverly,MA))からのT4 DNAリガーゼを使用して、アマシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences)からのpUC18のフォスファターゼ処理されたSmaI部位にライゲートした。ライゲーションミックスをゲル上に流して、ベクターと1つの挿入ライゲーション産物に相当するDNAバンドを切り出し、ニュー・イングランド・バイオラブ(New England Biolabs)からのT4DNAポリメラーゼで処理して、次に再度ライゲートした。この二段階ライゲーション手順を適用して、単一挿入断片が99%を超える高力価ライブラリーを製造した。
塩基配列決定法:微生物ゲノム全体の塩基配列決定法のために、ショットガン塩基配列決定法戦略アプローチを採用した(非特許文献45)。ダイターミネーター技術(米国特許公報(特許文献13)、(特許文献14))を使用し、ベクターと挿入特異的プライマーとの組み合わせを使用して、配列をカリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City、CA))からのABI自動シークエンサー上で生成した。ウィスコンシン州マディソンのDNAスター(DNA Star Inc.(Madison、WI))からのDNAStar、あるいはウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group(GCG)(Madison、WI))からのウィスコンシンGCG(Wisconsin GCG)プログラム(ウィスコンシンパッケージ・バージョン9.0)とCONSEDパッケージ・バージョン7.0のどちらかの中で配列編集を実施した。全ての配列は、双方向における少なくとも2回のカバレッジを表す。Phred/Phrapソフトウェア・パッケージ(バージョン0.961028.m/0.990319)を使用して、配列アセンブリーを実施した。
(実施例2)
(炭水化物分解遺伝子の同定)
(あらゆる非冗長GenBank CDS翻訳、三次元構造ブルックヘブン・タンパク・データバンクから誘導される配列、SWISS−PROTタンパク配列データベース、EMBL、およびDDBJデータベースを含む)BLAST「nr」データベースに含まれる配列に対する類似性のためのBLAST((非特許文献29)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照されたい)検索を実施して、イソアミラーゼ活性をコード化する遺伝子を同定した。全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)によって提供されるBLASTNアルゴリズムを使用して、「nr」データベース中に含まれるあらゆる一般公開されたDNA配列に対する類似性について、得られた配列を分析した。全ての読み枠内でDNA配列を翻訳し、NCBIによって提供されるBLASTPアルゴリズム(非特許文献46)を使用して、「nr」データベースに含まれるあらゆる一般公開されたタンパク配列に対する類似性について比較した。
(炭水化物分解遺伝子の同定)
(あらゆる非冗長GenBank CDS翻訳、三次元構造ブルックヘブン・タンパク・データバンクから誘導される配列、SWISS−PROTタンパク配列データベース、EMBL、およびDDBJデータベースを含む)BLAST「nr」データベースに含まれる配列に対する類似性のためのBLAST((非特許文献29)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照されたい)検索を実施して、イソアミラーゼ活性をコード化する遺伝子を同定した。全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)によって提供されるBLASTNアルゴリズムを使用して、「nr」データベース中に含まれるあらゆる一般公開されたDNA配列に対する類似性について、得られた配列を分析した。全ての読み枠内でDNA配列を翻訳し、NCBIによって提供されるBLASTPアルゴリズム(非特許文献46)を使用して、「nr」データベースに含まれるあらゆる一般公開されたタンパク配列に対する類似性について比較した。
あらゆる比較は、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのどちらかを使用して実施された。最も高い類似性を有する配列を要約する表1に、BLAST比較の結果を示す。表1は、値を期待値で表した、BLASTPアルゴリズムに基づくデータを示す。期待値(E−値)は、偶然にデータベース検索中に起きることが期待される特定のスコアSに等しいまたはそれよりも良いスコアとの異なる整合の数である。E−値が低いほど、スコアの有意性は高い。
(実施例3)
(ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexBを遺伝子を含有する大腸菌(E.coli)中の細胞内イソアミラーゼ活性)
(非特許文献47)で述べられたプロトコルを使用して、dexB遺伝子のクローニングのために、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(ATCC25175D)からゲノムDNAを単離した。
(ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexBを遺伝子を含有する大腸菌(E.coli)中の細胞内イソアミラーゼ活性)
(非特許文献47)で述べられたプロトコルを使用して、dexB遺伝子のクローニングのために、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(ATCC25175D)からゲノムDNAを単離した。
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(dexB)DNA配列(非特許文献48)に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマー(SEQID番号:7およびSEQID番号:8)をデザインし、Bam HIおよびSalI制限部位も含めた。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン(Qiagen(Valencia、CA))からのHotStartTaq(商標)キットに含まれる標準PCRプロトコルを使用して、dexB遺伝子を増幅した。反応は1ngのゲノムDNAと、それぞれ1μMのプライマーを含有した。得られる1.6kbのDNA断片を酵素sBamHIおよびSalIで消化した。消化された断片を英国アマシャムのアマシャムファルマシア(Amersham−Pharmacia(Amersham、UK))からのプラスミドpTRC99a(ampR)中に直接クローン化し、LacZ遺伝子との翻訳融合が得られた。pTRC99−dexBと命名されたプラスミドは、LacZ遺伝子の最初の10個のアミノ酸のコード配列も含有し、それは発現すると天然DexBタンパクのN−末端に融合する。pTRC99−dexBプラスミドは、カリフォルニア州カールズバッドのインビトローゲン(Invitrogen(Carlsbad、CA))からの製造元のプロトコルを使用して、100μg/mLアンピシリンを含有するルリアブロス(LB)培地上に蒔いて、大腸菌(E.coli)DH5α細胞内に形質転換させる。
大腸菌(E.coli)中での発現に続いて、未精製タンパク抽出物からのイソアミラーゼ活性を評価した。大腸菌(E.coli)DH5α/pTRC99−dexBの単一コロニーをLB培地中で一晩培養し、次に新鮮なLB培地(3.0mL)中で1:100に希釈して37℃でさらに2時間培養した。この培養に続き、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を1mMの最終濃度で添加して、DexB遺伝子を誘導した。さらに2時間の培養後、誘導細胞から未精製タンパクを抽出した。未精製タンパク抽出物を分離するために、細胞を遠心分離(1×8000g)によって収集し、次に0.5mLのリン酸緩衝液(10mM、pH6.8)中に懸濁した。懸濁液を超音波処理して総細胞タンパクを放出し、遠心分離(1×14,000g)して細胞砕片を除去した。イソマルトースと共に、または別個にパノースと共に37℃において10mMリン酸緩衝液(pH6.8)中で2時間培養して、上清中に存在する総タンパクをイソアミラーゼ活性について分析した。反応生成物は、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)によって特性決定された。
HPAECのためには、以下のようにしてサンプルを調製し分析した。イソマルトースまたはパノースと共に2時間培養した後、ニューヨーク州コーニングのコスター(Costar(Corning、NY))からの0.22μM Spin−X(R)遠心管フィルターを通して総タンパク抽出物を濾過し、滅菌濾過水で希釈した。PA10カラム、溶出剤としての100mM水酸化ナトリウム、および0〜150mMの酢酸ナトリウム直線勾配を使用して、カリフォルニア州サニーヴェールのディオンネクス(Dionex(Sunnyvale、CA))からのHPAECによってサンプルを分析した。pTRC99−dexB細胞抽出物を使用したイソマルトースの分解を実証する結果を表2に列挙する。pTRC99−dexB細胞抽出物との培養により形成するパノースの分解および生成物を表3に列挙する。
(実施例4)
(大腸菌(E.coli)中でのビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)イソデンプン分解遺伝子の発現)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC 15700)ライブラリーからのいくつかの読み取り枠をα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖に対する活性を有する推定上の候補遺伝子として同定した(実施例2)。オリゴ糖を含有するα(1,6)−結合したグルコースを使用した、イソデンプン分解活性の詳細な性質決定のために、3個の推定上のクローン、mbc1g.pk007.h12(h12)、mbc1g.pk026.k1(k1)、およびmbc2g.pk018.j20(j20)を選択した。
(大腸菌(E.coli)中でのビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)イソデンプン分解遺伝子の発現)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC 15700)ライブラリーからのいくつかの読み取り枠をα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖に対する活性を有する推定上の候補遺伝子として同定した(実施例2)。オリゴ糖を含有するα(1,6)−結合したグルコースを使用した、イソデンプン分解活性の詳細な性質決定のために、3個の推定上のクローン、mbc1g.pk007.h12(h12)、mbc1g.pk026.k1(k1)、およびmbc2g.pk018.j20(j20)を選択した。
実施例1からのpUC18中に、推定上のイソデンプン分解ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)遺伝子のクローン化された完全長コード配列を含有する大腸菌(E.coli)DH5α系をLB培地に接種して、37℃で培養した。培養を20時間後に新鮮なLB培地中で希釈(1:100)し、37℃でさらに3〜4時間インキュベートした。実施例3で述べたようにして、総タンパク抽出物を細胞から調製した。イソマルトースと共に、または別個にパノースと共に、37℃において10mMリン酸緩衝液(pH6.8)中で2時間培養して、上清中に存在する総タンパクをイソデンプン分解活性について分析した。実施例3で述べたようにしてサンプルを調製し、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)によって反応生成物を特性決定した。結果は、クローンh12、k1、およびj20から生成された酵素が、イソマルトースをグルコースに分解したことを実証した(表4)。
総タンパク抽出物をパノース(250μg/mL)と共に2時間インキュベートし、次にニューヨーク州コーニングのコスター(Costar(Corning、NY))からの0.22μM Spin−X(R)遠心管フィルターを通して濾過した。実施例3で述べたようにして、サンプルをHPAECにより分析した。培養に続くパノースの不在は、クローンh12、k1、およびj20から生成された酵素が、パノースを分解できることを実証した。図1は、クローンh12がパノースをグルコースに完全に分解することを示す(ネガティブ対照、大腸菌(E.coli)DH5α中のプラスミドpUC18も示される)。図1はまた、k1およびj20クローンからの酵素が、パノースをグルコースおよびマルトースに分解することも示す。
(実施例5)
(大腸菌(E.coli)中での天然B.brevej20イソアミラーゼ遺伝子の発現)
天然ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子j20(実施例1で得られた)は、成熟コーディング配列のNH−末端にシグナルペプチドを有するようである(pソート予測ソフトウェアによって判定された(非特許文献49)。α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する活性をコード化する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)j20遺伝子の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれSEQID番号:30、SEQID番号:31である。
(大腸菌(E.coli)中での天然B.brevej20イソアミラーゼ遺伝子の発現)
天然ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)遺伝子j20(実施例1で得られた)は、成熟コーディング配列のNH−末端にシグナルペプチドを有するようである(pソート予測ソフトウェアによって判定された(非特許文献49)。α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する活性をコード化する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)j20遺伝子の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれSEQID番号:30、SEQID番号:31である。
そのため無傷の細胞全体使用して、イソマルトースの代謝を試みた。これは、イソマルトース(500μg/mL)を含有するLB培地中で、j20遺伝子を発現する大腸菌(E.coli)DH5α細胞の単一コロニーを37℃で24時間培養して達成された。培養に続いて細胞を培地から除去し、実施例3で述べたHPAEC法によって培地を調製し、分析した。B.brevej20遺伝子を発現する細胞における、細胞外イソアミラーゼ活性の存在は、ネガティブ対照(オリジナルpUC18プラスミドのみを含有する大腸菌(E.coli)DH5α細胞)と比較して、減少したイソマルトースのレベルによって実証された。表5の結果は、天然j20遺伝子を発現する大腸菌(E.coli)細胞が、細胞外に供給されるイソマルトースを分解したことを実証する。
(実施例6)
(S.mutans dexBおよびB.breveイソアミラーゼ酵素の細胞外ターゲティング)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)k1およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子は、天然シグナルペプチドを含有しないようなので(pソート予測ソフトウェアによって判定(非特許文献49))、PCR法により翻訳融合中でシグナルペプチドに成熟コーディング配列を連結し、細胞外発現を可能にした、
(S.mutans dexBおよびB.breveイソアミラーゼ酵素の細胞外ターゲティング)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)k1およびストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子は、天然シグナルペプチドを含有しないようなので(pソート予測ソフトウェアによって判定(非特許文献49))、PCR法により翻訳融合中でシグナルペプチドに成熟コーディング配列を連結し、細胞外発現を可能にした、
プラスミドpBE505(非特許文献50)およびpBE311(非特許文献51)に始まる一連の工程で、枯草菌(バチルス(Bacillus subtilis)アルカリ性および中性プロテアーゼ遺伝子を含有するモジュラー発現ベクターを構築した。プラスミドを制限酵素sKpnIおよびNruIで消化した。得られたpBE505からの969bpのKpnI−NruI断片を単離し、pBE311からのより大きな7.2kbのKpnI−NruI断片にライゲートし、pBE559を得た。
次にプラスミドpBE559およびpBE597(非特許文献52)を制限酵素KpnIおよびEcoRVで消化した。pBE559からの941bpのKpnI−EcoRV断片をpBE597からの8.9kbのKpnI−EcoRV断片にライゲートし、プラスミドpBE592を得た。
実施例3で述べられたPCR法を使用して、プラスミドpBE26(非特許文献53)をテンプレートとして使用して、B.アミロリクエフェイシエンス(B.amyloliquefaciens)のアルカリ性プロテアーゼ(apr)プロモーター領域を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーSEQID番号:9をデザインし合成して、NheI制限部位をアルカリ性プロテアーゼシグナル切断部位に、EcoRV制限部位を切断部位のすぐ下流に導入した。オリゴヌクレオチドプライマーSEQID番号:10をデザインし、pBE26のaprプロモーター領域の上流の5’ポリリンカー領域にアニールした。既述のプライマーおよびプラスミドpBE26テンプレートDNAを使用して、PCR反応を実施した。得られた1.2kbPCR生成物をKpnIおよびEcoRVaで消化して、pBE592からのより大きなKpnI−EcoRV断片にライゲートしてpBE92を得た。
実施例3で述べられたPCR法を使用して、プラスミドpBE80(非特許文献54)をテンプレートとして使用して、B.アミロリクエフェイシエンス(B.amyloliquefaciens)中性プロテアーゼ(npr)プロモーター領域を増幅した。下流プライマーSEQID番号:11をデザインし合成して、NheI制限部位を中性プロテアーゼシグナル切断部位に、EcoRV制限部位を切断部位のすぐ下流に導入した。プライマーSEQID番号:12をデザインし、pBE80中のNprプロモーターの5’領域にアニールした。既述のプライマーおよびDNAテンプレートを使用して、PCR反応を実施した。得られる350bpPCR生成物をKpnIおよびEcoRVで酵素的に消化し、pBE592からのより大きなKpnI−EcoRV断片にライゲートしてpBE93を得た。
ベクターpBE92およびpBE93中における、枯草菌(Bacillus subtilis)アルカリ性および中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドへのk1およびdexB遺伝子の翻訳融合は、表6で述べられたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して達成された。PCR増幅は、テンプレートとしてそれぞれ、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)(ATCC15700)からのゲノムDNA、あるいはpTRC99−dexBプラスミドを使用して、実施例3で述べられたプロトコルによって実施された。
NheIおよびBamHI部位と共に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーSEQID番号:14およびSEQID番号:15が、1.8kbk1遺伝子DNA断片を増幅するのに使用された。オリゴヌクレオチドプライマーSEQID番号:13およびSEQID番号:8は、NheIおよびSalI制限酵素部位を含有し、1.6kbのdexB遺伝子DNA断片の増幅をもたらす。断片を適切な酵素で消化し、モジュラーベクターpBE92およびpBE93にクローン化した。
得られるプラスミド(それぞれpBE92−dexB、pBE93−dexB、pBE92−k1、およびpBE93−k1と命名される)は、シグナルペプチド切断部位(Ala Ser Ala)が保存されるように、翻訳融合でシグナルペプチドに連結した天然酵素を含有した。ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)k1遺伝子に連結した枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼシグナルペプチドの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれSEQID番号:40および41である。ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)dexB遺伝子に連結した枯草菌(Bacillus subtilis)中性プロテアーゼシグナルペプチドの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれSEQID番号:42および43である。カリフォルニア州カールズバッドのインビトローゲン(Invitrogen(Carlsbad,CA))からの製造元のプロトコルを使用して、100μg/mLアンピシリンを含有するルリアブロス(LB)培地上に蒔いて、大腸菌(E.coli)DH5α細胞内にプラスミドを形質転換した。
アンピシリン(100μg/mL)およびイソマルトース(0.250mg/mL)を含有する3.0mLのLB培地に接種して、pBE93(ネガティブ対照)、pBE93−dexBまたはpBE93−k1プラスミドを含有する大腸菌(E.coli)DH5α細胞内の活性の性質決定を実施した。細胞を37℃で20時間培養した。培養に続いて細胞を培地から除去し、実施例3で述べられた方法によって調製し分析した。pBE93、pBE93−dexBまたはpBE93−k1プラスミドを含有する細胞中の細胞外イソアミラーゼ活性の存在は、ネガティブ対照(オリジナルのpBE92プラスミドのみを含有する大腸菌(E.coli)DH5α細胞)と比較した際のイソマルトースの減少したレベルによって実証された。表6の結果は、Npr−遺伝子融合タンパクが、細胞外に供給されたイソマルトースを分解したことを実証する。
pBE93−dexBまたはpBE93−k1プラスミドを含有する大腸菌(E.coli)DH5α細胞は、イソマルトースを分解した。しかし唯一の炭素源としてイソマルトースを含有する最少培地での細胞生育は、イソアミラーゼ活性のはるかにより厳密な測定である。そのためpBE93−dexBおよびpBE93−k1プラスミドを大腸菌(E.coli)系FM5内に形質転換した。FM5系はDH5αと違って、炭素源に加えて塩および微量金属のみを含有する最少培地で生育する能力を有する((非特許文献55)、(非特許文献56))。天然FM5細胞はDH5α系と同じく、炭素源としてイソマルトースを利用できない。これを確認するためにプラスミドpBE93で形質転換したFM5細胞をグルコース(1mg/mL)またはイソマルトース(1mg/mL)のどちらかを含有するM9培地(非特許文献57)に接種して、37℃で少なくとも20時間培養した。グルコースを含有するフラスコでは20時間後に細胞生育が観察されたが、イソマルトースを含有するフラスコでは、60時間の培養後でさえ細胞生育が観察されなかった。
ネガティブ対照とは対照的に、Npr−DexBおよびNpr−k1融合タンパク(それぞれpBE93−dexBおよびpBE93−k1)を含有するFM5細胞は、イソマルトースを含有するM9培地で20時間の培養期間後、良好に生育した。この実験では、唯一の炭素源としてグルコースまたはイソマルトース(1mg/mL)を補った2.0mLのM9培地に、FM5/pBE93、FM5/pBE93−dexBおよびFM5/pBE93−k1系を接種した。表7に示す結果は、dexBまたはk1遺伝子がNprシグナルペプチドに翻訳融合で連結して、FM5細胞内で発現されると、イソマルトースが代謝されて細胞生育を支持することを示す。
(実施例7)
(様々な発酵生成物の増大した合成をもたらす大腸菌(E.coli)中でのNpr−dexBおよびNpr−k1融合遺伝子の発現)
α(1,6)−結合したグルコース残基を含有するオリゴ糖を産生宿主が代謝する能力は、炭素源として糖混合物が供給された場合に発酵生成物の収率を増大させるかもしれない。最初に、グリセロールを生じるように設計された細胞系内に、プラスミドpBE93−dexBおよびpBE93−k1を形質転換して、Npr−dexBおよびNpr−k1融合タンパクがα(1,6)−結合を分解する能力を試験した。
(様々な発酵生成物の増大した合成をもたらす大腸菌(E.coli)中でのNpr−dexBおよびNpr−k1融合遺伝子の発現)
α(1,6)−結合したグルコース残基を含有するオリゴ糖を産生宿主が代謝する能力は、炭素源として糖混合物が供給された場合に発酵生成物の収率を増大させるかもしれない。最初に、グリセロールを生じるように設計された細胞系内に、プラスミドpBE93−dexBおよびpBE93−k1を形質転換して、Npr−dexBおよびNpr−k1融合タンパクがα(1,6)−結合を分解する能力を試験した。
1μgのプラスミドDNAを使用して、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiase)からのDAR1およびGPP2遺伝子、および肺炎桿菌(Klebsiella pnuemoniae)からのdhaBおよびorf)オペロンをコード化する、プラスミドpSYCO101(specR)(参照によってここに編入する米国特許公報(特許文献15)で述べられた)も含有する大腸菌(E.coli)系RJ8n(ATCCPTA−4216)を形質転換した。形質転換大腸菌(E.coli)系はグルコースからグリセロール、ならびにビタミンB12が添加される場合は1,3−プロパンジオールを産生する。グルコースからグリセロールおよび1,3−プロパンジオールを産生する方法については、参照によってここに編入する米国特許公報(特許文献16)および米国特許公報(特許文献17)で詳細に述べられている。50μg/mLのスペクチノマイシンおよび100μg/mLのアンピシリンを含有するLB培地上に、形質転換RJ8n細胞を蒔いて培養した。単一コロニーを使用し、2.0mLのTM2培地(リン酸カリウム7.5g/L、クエン酸2.0g/L、硫酸アンモニウム3.0g/L、硫酸マグネシウム2.0g/L、塩化カルシウム0.2g/L、クエン酸第二鉄アンモニウム0.33g/L、メリーランド州スパークスのディフコ(Difco−BD(Sparks、MD))からの酵母菌抽出物5.0g/L、微量元素(硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化コバルト、硫酸マンガン、硫酸第二鉄、塩化ナトリウム)、水酸化アンモニウム、pH6.5、グルコースまたはイソマルトース(1mg/mL)も含有する)に接種した。培養物を24時間37℃で生育させた。細胞を実施例で3述べられた方法で調製し分析した。
炭素源がグルコースであるTM2培地中で、プラスミドpSYCO101のみを含有する大腸菌(E.coli)RJ8n細胞を37℃で24時間培養すると、グリセロールの蓄積が見られた(表8)。しかし培地中でグルコースをイソマルトースに置き換えると、このネガティブ対照系はごく少量のレベルのグリセロールを産生し、α(1,6)−結合したグルコースが発酵生成物の蓄積を支持しないことを実証した。対照的にプラスミドpSYCO101およびpBE93−dexBまたはpBE93−k1を含有する大腸菌(E.coli)RJ8n内では、唯一の炭素源としてイソマルトースまたはグルコースのどちらかが提供されるとグリセロールが生成した(表8)。炭素源としてイソマルトースを使用すると、pSYCO101のみを含有するネガティブ対照系RJ8nと比較して、pBE93−dexBおよびpSYCO101プラスミドの双方を含有する大腸菌(E.coli)RJ8n内ではグリセロール産生が8〜9倍高くなることが示された。イソマルトースを使用したグリセロール蓄積は、ネガティブ対照と比較して、pSYCO101およびpBE93−k1を含有する系で6〜10倍高かった。表8のデータは、Npr−dexBまたはNpr−k1遺伝子の発現が、イソマルトースを供給された培養物中でのグリセロール産生をもたらすことを実証する。データは、炭素源がグルコースまたはイソマルトースであるかどうかに関わらず、蓄積された生成物のレベルが、融合タンパクを含有する培養物と同程度であることをさらに実証する。
プラスミドpSYCO101およびpBE93−k1を含有する大腸菌(E.coli)系RJ8nが、基材としてα(1,6)−結合したグルコースを使用して発酵生成物を産生する能力は、パノース(1mg/mL)を含有するTM2培地内で培養した結果を、基材としてグルコース(1mg/mL)を使用した同一系と比較することで、さらに特徴づけられる。
表9のデータは、プラスミドpSYCO101のみを含有する大腸菌(E.coli)系RJ8n(ネガティブ対照)が、TM2培地内で、唯一の炭水化物源としてパノースを供給した際に、グリセロールを合成しないことも示す。しかしこれと同じ系にプラスミドpBE93−k1が存在し、パノースと共にTM2培地中で培養した場合、グリセロールが生成する。プラスミドpSYCO101およびpBE93−k1を含有する大腸菌(E.coli)RJ8n内のグリセロール蓄積は、炭水化物源としてグルコースまたはパノースのいずれかが供給された場合と同程度である。
上記データは、イソマルトースまたはパノースが培地中の唯一の炭水化物源に相当する場合、大腸菌(E.coli)内でのNpr−dexBまたはNpr−k1融合タンパクの発現が、増大したグリセロールの産生をもたらすことを実証する。この結果がグリセロール産生のみに限定されないことの実証は、同一融合タンパク発現システムを使用した別の発酵生成物(1,3−プロパンジオール)の合成によって達成された。
プラスミドpSYCO101およびpBE93−dexBまたはpBE93−k1で形質転換されたRJ8n細胞をグルコース(1mg/mL)またはイソマルトース(1mg/mL)およびビタミンB12(100ng/L)も含有する2.0mLのTM2培地(上で述べた)に接種するのに使用した。培養物20時間37度で生育させた。実施例3で述べられた方法によって細胞を調製し分析した。
表10のデータは、炭水化物源としてイソマルトースのみを含有する培地内で生育させた場合、ネガティブ対照系(RJ8n/pSYCO101)によって1,3−プロパンジオールが合成されなかったことを実証する。しかしRJ8n細胞内で、Npr−dexBまたはNpr−k1融合タンパクのどちらかが発現される場合、イソマルトースが代謝されることが示された。これは発酵生成物1,3−プロパンジオールの蓄積をもたらした。データは、唯一の炭水化物としてグルコースまたはイソマルトースのいずれかが供給された場合、Npr−dexBまたはNpr−K1融合タンパクを発現するRJ8n細胞によって合成される1,3−プロパンジオールのレベルが、同程度であることをさらに実証する。
(実施例8)
(代案のプロモーターを使用した大腸菌(E.coli)内でのB.breve k1遺伝子の発現)
好ましい遺伝子の発現を導く代案のプロモーターの使用は、高度に望ましいことが多い。遺伝子発現のレベルまたはタイミングを変化させ、ひいては好ましい基材の利用を増大させるために、代案のプロモーターを使用しても良い。
(代案のプロモーターを使用した大腸菌(E.coli)内でのB.breve k1遺伝子の発現)
好ましい遺伝子の発現を導く代案のプロモーターの使用は、高度に望ましいことが多い。遺伝子発現のレベルまたはタイミングを変化させ、ひいては好ましい基材の利用を増大させるために、代案のプロモーターを使用しても良い。
代案のプロモーターを使用したB.breve k1イソアミラーゼ遺伝子の効果的発現は、プラスミドpBE93−k1(実施例6)中の中性プロテアーゼプロモーターをグルコースイソメラーゼ(GI)プロモーターおよびGI−プロモーターの変異体で置き換えることで実証された。ストレプトマイセス・リビディンス(Streptomyces lividins)GI−プロモーターの分離および変異体プロモーターの創造は、開示されている米国特許公報(特許文献15)。NPR−プロモーターを置き換えるのに先立って、中性プロテアーゼシグナルペプチドおよびK1遺伝子の非翻訳ヌクレオチド配列の修正を行った。配列修正は制限酵素部位をもたらし、それは引き続くクローン化で使用される。
プライマーSEQID番号:18およびSEQID番号:19を使用して、PCRによって、制限酵素部位SacIおよびPacIをそれぞれ中性プロテアーゼシグナルペプチドおよびK1遺伝子配列の5’および3’−末端に添加した。実施例3で述べられたプロトコルによって、PCR増幅を実施した。開示されるようにA1919bpPCR生成物を単離して、pSYCO109mcs野生型GIyqhDプラスミドにライゲートし米国特許公報(特許文献15)、それはまた酵素SacIおよびPacIで消化された。得られたプラスミドはk1遺伝子に翻訳融合で連結した、野生型GIプロモーターおよびNPR−シグナル配列を含有する。このコンストラクトをWTGI−ss−K1と命名した。また変異体GIプロモーターを使用して、NPR−シグナルペプチド/K1融合の発現を導いた。SacIおよびPacI制限酵素部位を使用して、プライマーSEQID番号:18およびSEQID番号:19を使用した反応から得られる1919bpのPCR生成物をpSYCO109mcs−short 1.6 GI yqhDプラスミド中に入れた。得られるプラスミドをLowGI−ss−K1と命名した。この変異体プロモーターはyqhD遺伝子に作動可能に連結すると、野生型GIプロモーター−yqhDコンストラクトとの比較で、より低レベルの遺伝子発現を導くことが以前示されている米国特許公報(特許文献15)。
野生型および変異体GIプロモーターを使用したK1遺伝子の効果的発現の実証は、活性アッセイによって達成された。カリフォルニア州カールズバッドのインビトローゲン(Invitrogen(Carlsbad、CA))からの大腸菌(E.coli)細胞(DH5α系)をプラスミドWTGI−ss−K1およびLowGI−ss−K1で形質転換し、LB培地で一晩培養した。遠心分離によって細胞ペレットを回収し、1/10容量のリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7.0)に懸濁した。フレンチプレスで懸濁液中の細胞を溶解させ、遠心分離によって細胞砕片を除去した。カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラドからのブラッドフォード・アッセイ(Bio−Rad(Hercules、CA)によって、総タンパク濃度を測定した。ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma(ST.Louis、MO)からの4−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシド(PNPG)を使用して、総タンパク分離物内のK1遺伝子産物の活性をアッセイした。プラスミドWTGI−ss−K1、LowGI−ss−K1、NPR−ss−K1(ポジティブ対照)、およびpSYCO109(ネガティブ対照)を含有する細胞からの総タンパク抽出物を10mMのPNPGを含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液溶液内で30分間30℃で培養した。PNPGからのグルコース残基の遊離はPNPの蓄積をもたらし、それは400nmの光を吸収する。k1酵素活性の直接の結果であるPNP蓄積を400nmの波長での吸光度によって経時的にモニターした。下の表11は、中性プロテアーゼプロモーター以外のプロモーターを使用して、活性K1遺伝子の発現を導いても良いことを実証する。結果はまた、代案のプロモーターを使用して、K1発現レベルを修正しても良く、K1活性が対プロモーター強度の相対レベルに応することを実証する。
(実施例9)
(大腸菌(E.coli)ゲノムへのB.breve k1遺伝子の組み込み)
細胞のゲノムへの所望DNAの組み込みは、長期にわたり、そして様々な発酵条件において、遺伝子発現の安定性を向上させるかもしれない。しかし組み込みの部位が、遺伝子発現レベル、究極的には所望の酵素活性の効果に影響するかもしれない。
(大腸菌(E.coli)ゲノムへのB.breve k1遺伝子の組み込み)
細胞のゲノムへの所望DNAの組み込みは、長期にわたり、そして様々な発酵条件において、遺伝子発現の安定性を向上させるかもしれない。しかし組み込みの部位が、遺伝子発現レベル、究極的には所望の酵素活性の効果に影響するかもしれない。
k1発現カセット(NPRプロモーター−シグナルペプチド−k1遺伝子)の
大腸菌(E.coli)(系FM5)ゲノムへの組み込み、およびα(1,6)−結合したグルコース基材使用の有用性の実証は、最初にプラスミドpKD3内にクローン化することで達成された(非特許文献58)。宿主aldA(アルデヒド脱水素酵素A)およびaldB(アルデヒド脱水素酵素B)ゲノム部位を組み込みについて選択した。プラスミドpKD3、aldAまたはaldBおよびk1遺伝子配列(SEQID番号:20〜23)に対する相同性を有するPCRプライマーをデザインした。
大腸菌(E.coli)(系FM5)ゲノムへの組み込み、およびα(1,6)−結合したグルコース基材使用の有用性の実証は、最初にプラスミドpKD3内にクローン化することで達成された(非特許文献58)。宿主aldA(アルデヒド脱水素酵素A)およびaldB(アルデヒド脱水素酵素B)ゲノム部位を組み込みについて選択した。プラスミドpKD3、aldAまたはaldBおよびk1遺伝子配列(SEQID番号:20〜23)に対する相同性を有するPCRプライマーをデザインした。
実施例3で述べられたプロトコルによってPCR増幅を実施した。プライマーSEQID番号:21〜23とk1発現カセットを含有するプラスミドpKD3との反応から得られるPCR生成物を単離し、ライゲートして、大腸菌(E.coli)(FM5)内に形質転換した。クロラムフェニコールを含有するLB培地上での培養によって、組み込まれたk1発現カセットを含有する細胞を選択した。プライマーSEQID番号:7およびSEQID番号:8を使用して、PCR反応によって、クロラムフェニコールポジティブコロニーをk1遺伝子の存在について試験した。
唯一の炭水化物源としてイソマルトースを含有する培地内での生育分析により、組み込まれたk1発現カセットを含有するFM5系を活性についてさらに試験した。0.5%イソマルトース(w/v)添加TM2培地(実施例7を参照されたい)にクロラムフェニコールおよびPCRポジティブコロニーを接種し、35℃で培養した。サンプルを様々な時点で取り出し、吸光度(A600nm)および(HPLCによる)イソマルトース消費(一般的方法を参照されたい)によって、細胞塊蓄積について特性決定した。
下の表12は、唯一の炭水化物源として提供された場合、FM5細胞が単独でイソマルトースを代謝しないことを実証する。これは0.5%イソマルトースを含むTM2培地での低レベルの細胞塊蓄積によって示される。FM5ネガティブ系の低レベルの生育は、観察されたが、これは単に、ミネソタ州セントルイスのシグマ(Sigma(St.Louis、MO))からのイソマルトース源材料に含有される少量の発酵可能糖、マルトースよるものであった。組み込まれたK1発現カセットを含有する細胞は、はるかに急速に生育し、25時間後により高い最終吸光度に達した。aldAsite部位に組み込まれたk1発現カセットを含有するAPCR−ポジティブコロニーはA2−3と命名した。PCRによりポジティブな、aldB部位に組み込まれたk1発現カセットを含有するコロニーは、B1−1およびB1−2と命名した。
組み込まれたK1発現カセットを含有する細胞によるイソマルトース消費は、FM5のネガティブ対照系とHPLC分析によっても比較された。表13のデータは、組み込みに続いてK1発現カセットが活性であり、細胞が、この炭水化物を利用しないネガティブ対照との比較で、α(1,6)−結合したグルコースを含有する利用可能な糖を完全に利用できるようにすることを実証する。データは、遺伝子がaldAに組み込まれた系で、aldB部位と比べてイソマルトースが同一速度で消費されないことも示す。
Claims (34)
- (a)アミノ酸配列のSEQID番号:2、4、または6をコード化する単離核酸分子、
(b)以下のハイブリッド形成条件で(a)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、および
(c)(a)または(b)に相補的である核酸分子
よりなる群から選択される、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドをコード化することを特徴とする単離核酸分子。 - SEQID番号:1、3、および5からなる核酸分子の群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の単離核酸分子。
- 請求項1に記載の単離核酸分子によってコード化されることを特徴とするポリペプチド。
- SEQID番号:2、4、および6よりなる群から選択されことを特徴とする請求項3に記載のポリペプチド
- (a)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドから構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、
(b)以下のハイブリッド形成条件下で(a)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃、および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、および
(c)(a)または(b)に相補的な核酸分子
よりなる群から選択される、α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドをコード化することを特徴とする単離核酸分子。 - 前記シグナルペプチドがSEQID番号:24またはSEQID番号:25であることを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- 前記α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドが、SEQID番号:2、4、6、17、または31であることを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- 前記シグナルペプチドがSEQID番号:24またはSEQID番号:25であり、前記α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドがSEQID番号:2、4、6、17、または31であることを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- 前記シグナルペプチドがSEQID番号:26またはSEQID番号:27で示されるシグナル配列によってコード化されることを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- 前記α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドをコード化し、単離核酸分子がSEQID番号:1、SEQID番号:5、SEQID番号:16、またはSEQID番号:30で示される配列を有することを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- SEQID番号:3、SEQID番号:28、SEQID番号:32、SEQID番号:34、SEQID番号:36、SEQID番号:38、SEQID番号:40、またはSEQID番号:42よりなる群から選択されることを特徴とする請求項5に記載の単離核酸分子。
- 請求項5に記載の核酸分子によってコード化されることを特徴とするポリペプチド。
- 請求項9、請求項10、または請求項11に記載の単離核酸分子によってコード化されることを特徴とするポリペプチド。
- SEQID番号:4、SEQID番号:29、SEQID番号:33、SEQID番号:35、SEQID番号:37、SEQID番号:39、SEQID番号:41、およびSEQID番号43よりなる群から選択されることを特徴とする請求項13に記載のポリペプチド。
- 適切な制御配列に作動可能に連結された、請求項1または請求項5に記載の単離核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
- 前記適切な制御配列が、CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、AOX1、lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac、trc、apr、npr、nos、およびGIを含む群から選択されることを特徴とする請求項15に記載のキメラ遺伝子。
- 請求項15に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項15に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換された宿主細胞。
- 前記キメラ遺伝子が染色体に組み込まれるか、またはプラスミドにより運搬されることを特徴とする請求項18に記載の形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が細菌、酵母菌、および糸状菌よりなる群から選択されることを特徴とする請求項18に記載の形質転換された宿主細胞。
- 前記形質転換された宿主細胞がアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、ロドコッカス(Rhodococcus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、アシドボラック(Acidovorax)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas)、またはコリネバクテリウム(Cornyebacterium)属から選択されることを特徴とする請求項20に記載の形質転換された宿主細胞。
- 前記形質転換された宿主細胞が大腸菌(E.coli)であることを特徴とする請求項20に記載の形質転換された宿主細胞。
- (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドから構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃、および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、および
(iv)単糖類を標的分子に転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより標的分子を製造する工程と、
(b)(a)で製造された標的分子を任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中における標的分子の製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドから構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃、および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)と相補的な核酸分子、および
(iv)単糖類をグリセロールに転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これによりグリセロールを製造する工程と、
(b)(a)で製造されたグリセロールを任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中におけるグリセロールの製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドから構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SES、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、
(iv)単糖類を1,3−プロパンジオールに転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより、1,3−プロパンジオールを製造する工程と、
(b)(a)で製造された1,3−プロパンジオールを任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中における1,3−プロパンジオールの製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)α(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解するポリペプチドに連結されたシグナルペプチドで構成されるキメラタンパクをコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、および
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させる工程と、
(b)(a)で製造された細胞塊を任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中の細胞塊の製造方法。 - 前記シグナルペプチドがSEQID番号:24またはSEQID番号:25を含むことを特徴とする請求項23、請求項24、請求項25、または請求項26に記載の方法。
- (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)SEQID番号:2、6、17、および31よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、および
(iv)単糖類を標的分子に転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより、前記標的分子を製造する工程と、
(b)(a)で製造された標的分子を任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中における標的分子の製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)SEQID番号2、6、17、および31よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、および
(iv)単糖類を1,3−プロパンジオールに転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより、1,3−プロパンジオールを製造する工程と、
(b)任意選択的に(a)で製造された1,3−プロパンジオールを回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中における1,3−プロパンジオールの製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)SEQNO:2、6、17、および31よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で、(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子、および
(iv)単糖類をグリセロールに転換するための少なくとも1つのキメラ遺伝子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させる、これにより、グリセロールを製造する工程と、
(b)(a)で製造されたグリセロールを任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中におけるグリセロールの製造方法。 - (a)適切な条件下で限界デキストリン存在下において、
(i)SEQID番号:2、6、17、および31よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する単離核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC,0.1%SDS、65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子
を含む形質転換された宿主細胞を接触させ、これにより、細胞塊を製造する工程と、
(b)(a)で製造された細胞塊を任意選択的に回収する工程と
を含むことを特徴とする組換え宿主細胞中における細胞塊の製造方法。 - 前記シグナルペプチドがSEQID番号:24またはSEQID番号:25であることを特徴とする請求項28、請求項29、請求項30、または請求項31に記載の方法。
- (a)適切な生育条件下で、
(i)SEQID番号:2、6、17、および31よりなる群から選択される酵素をコード化する核酸分子、
(ii)以下のハイブリッド形成条件下で(i)とハイブリッド形成する核酸分子:0.1×SSC、0.1%SDS,65℃および2×SSC、0.1%SDSとそれに続く0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄、または
(iii)(i)または(ii)に相補的な核酸分子
を含む形質転換された宿主細胞を、有効量の限界デキストリン基材と接触させる工程と、
(b)任意選択的に工程(a)の生成物を回収する工程と
を含むことを特徴とする限界デキストリンを分解する方法。 - SEQID番号:17で示される配列を有するポリペプチドと比較した場合に、アライメントのBLASTP法に基づいて少なくとも69%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、該ポリペブチドがα(1,6)−結合したグルコースオリゴ糖を加水分解する活性を有することを特徴とするポリペプチド。
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