JP5853695B2 - カダベリンの製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、カダベリンの製造方法に関する。特に、本発明は、リジン脱炭酸酵素を微生物で分泌生産させることによりカダベリンを効率的に製造する方法に関する。
ポリアミド(PA)は、自動車産業、スポーツ産業、ライフスタイル産業で使用する一連の特殊プラスチックの原料となる重要なポリマー群であり、ジアミンは、このポリアミドの重要な原料モノマー成分である。ジアミンはジカルボン酸と縮合して種々のポリマーを形成するが、この際、ジアミンとジカルボン酸の鎖長によりポリマーの特性が定まる。
従来、ジアミンは化学的にはジカルボン酸の中間段階を径由して石油由来の素材から製造されるか、またはアミノ酸の化学的脱カルボキシ反応によって製造される(非特許文献1)。石油価格の高騰を考慮すると、酵素反応や微生物培養などのバイオテクノロジー法による再生可能資源からのジアミンの合成に速やかに切り替えることが望まれる。
そこで、バイオテクノロジー法により製造が可能なジアミンとして、カダベリンが注目されている。カダベリンとは、別名では1,5−ペンタンジアミンであり、ポリアミドの原料モノマーとなりえる化合物である。また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであって、その生合成系が解明されつつあるが(非特許文献2参照)、その生合成経路の一部として、リジンからカダベリンの脱炭酸反応を触媒するリジン脱炭酸酵素(LDC)が知られている。そして、LDC遺伝子として大腸菌(Escherichia coli)由来のLDC遺伝子が知られている(非特許文献3参照)。
従来のバイオテクノロジー法によるカダベリンの製造方法では、微生物にLDC遺伝子を導入することを基本として、リジンを基質とする酵素反応による製造方法や、微生物培養によるカダベリンの製造方法に大別される。さらに、微生物培養によるカダベリンの製造方法としては、組換え大腸菌の培養による製造方法(特許文献1参照)や、リジン生産微生物のコリネ型細菌において更にリジン生産能力を上げる方法(特許文献2参照)、カダベリン分解系を遮断する方法(特許文献3参照)、リジン輸送体の遮断する方法(特許文献4)が知られている。しかしながら、特に微生物培養によるカダベリンの製造方法には解決するべき課題は多く、例えば、リジン生産微生物のコリネ型細菌にLDC遺伝子を導入した微生物を培養する場合、リジンを副生産してしまうという課題もあった(非特許文献4参照)。リジンが副生産すると、前駆体までが製造されているにも関わらず、カダベリンの収率が向上せず、また、カダベリンをポリアミド原料として利用するためにはカダベリンの高純度化が重要であるが、リジンが副生産するとカダベリンの精製に対しても負荷が増加することとなるため、経済的に問題となっていた。
特開2002−223770号公報 特開2004−222569号公報 特表2009−531042号公報 WO2008/092720号
須山、金尾、「薬学雑誌」,1965年,第85巻,p.513−533 セリアホワイトテーバー(Celia white tabor)、他1名,「マイクロバイオロジカルレビューズ(Microbiological Reviews)」,1985年,第49巻,p.81−99 シユアンメング(Shi−yuanmeng)、他1名,「ジャーナルオブバクテリオロジー(Journal of Bacteriology)」,1992年,第174巻,p.2659−2669 耳塚孝、他4名、「バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー(Bioscience,Biotechnology,and,Biochemistry)」,2007年,第71巻,p.2130−2135
本発明は、微生物培養によるカダベリンの製造方法において、微生物培養終了時にカダベリン前駆体であるリジンを微生物培養液中に残存させない方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、微生物培養終了時にリジンが培養液中に残存しないようにするべく鋭意研究した結果、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することで、微生物培養終了時においてリジンが培養液中に残存しなくなることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の(1)〜()で構成される。
(1) リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法であって、前記微生物が、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現することによりリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌し、前記分泌シグナルペプチドが配列番号13から43のいずれかのアミノ酸配列または配列番号13から43のいずれかのアミノ酸配列に対する配列同一性が85%以上のアミノ酸配列で表されるペプチドである、カダベリンの製造方法
(2)前記微生物の培養のための培地にリジンを添加することを特徴とする、(1)に記載のカダベリンの製造方法。
(3)前記微生物が、核酸配列の5’から3’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を有することにより、細胞内でリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を発現することを特徴とする、(1)または(2)に記載のカダベリンの製造方法。
(4)リジン脱炭酸酵素が大腸菌由来であることを特徴とする、(1)から(3)のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
(5)前記微生物がコリネ型細菌または大腸菌であることを特徴とする、(1)から()のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
本発明によれば、微生物培養によるカダベリンの製造方法において、微生物培養終了時においてリジンが培養液中に残存しなくなるため、従来の製造方法よりもカダベリン対糖収率が向上し、さらにはポリアミド原料としてカダベリンを精製する際の精製工程での負荷低減も可能となる。
本発明の方法は、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することによるカダベリンの製造方法である。なお、本明細書において、リジン脱炭酸酵素が細胞外に「分泌」されるとは、リジン脱炭酸酵素が微生物外(細胞外)に移送されることをいい、最終的にリジン脱炭酸酵素が培地または培養液中に完全に遊離状態におかれる場合のことである。リジン脱炭酸酵素の一部のみが細胞外に存在している場合や、微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合して存在している場合は、ここでいう分泌には含まれない。
リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物はこれまで知られていないが、遺伝子組換え技術により望みの微生物にリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌させることが可能である。具体的には、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現させる方法によって、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌させることができる。
本発明において使用されるリジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、L−リジン脱炭酸酵素であることが好ましい。また、リジン脱炭酸酵素の由来についても特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス(Bacillus halodurans)、バシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)、エシェリシア・コリ(Escherichia coli;大腸菌)、セレノモナス・ルミナンチウム(Selenomonas ruminamtium)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、ストレプトマイセス・コエリカーラ(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・ピロサス(Streptomyces pilosus)、エイケネラ・コロデンス(Eikenella corrodens)、イユバクテリウム・アシダミノフィルム(Eubacterium acidaminophilum)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)、ナイセリア・メニンギチデス(Neisseria meningitidis)、テルモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)、またはピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)由来のものが好ましく用いられ、より好ましくは安全性の認められている大腸菌由来のものである。これらのリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、データベース(GenBank)に登録されている。
分泌シグナルペプチドとは、元々、分泌型タンパク質を細胞外に分泌させるために機能するシグナルペプチド配列として見出されたものである。分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、その後、成熟型タンパク質になるが、その際、プレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳された後、細胞外への分泌に伴ってプロテアーゼ(一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる)によって分泌シグナルペプチド(「プレ部分」)が切断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになり、その後、細胞外に分泌されることが知られている。そして、分泌シグナルペプチドは、分泌型タンパク質を細胞外に分泌させるだけにとどまらず、分泌型でないタンパク質と分泌シグナルペプチドを融合させることにより、分泌型でないタンパク質を細胞外に分泌させる機能を有することが知られており、本発明では、分泌シグナルペプチドとリジン脱炭酸酵素を融合させることで、リジン脱炭酸酵素を効率よく細胞外に分泌させることができる。
本発明で使用される分泌シグナルペプチドは、異なる微生物に由来する場合であっても、使用する微生物の分泌シグナルペプチドであってもよいが、使用する微生物の分泌型タンパク質に由来することが好ましい。さらに本発明の目的に使用し得る分泌シグナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質のN末端アミノ酸配列を一部含んでいてもよい。分泌シグナルペプチドの具体例としては、大腸菌由来のTorA(トリメチルアミンN−オキシドレダクターゼ)、SufI(Suppressor of ftsI;ftsIサプレッサー)、バチルス・ズブチリス(Bacillus Subtilis)由来のPhoD(ホスホエステラーゼ)、LipA(リパーゼ)、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来のイソマルトデキストラナーゼ(IMD)等の分泌シグナルペプチド(それぞれ、配列番号13〜17参照)、特許3711658号公報にある分泌シグナルペプチド(配列番号18参照)、Microbiology (2009),155,p.741−750にあるコリネバクテリウム・グルタミカム R 由来の分泌シグナルペプチドであるCgR0079、CgR0120、CgR0124、CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、CgR2677、CgR2926、CgR0040、CgR0789、CgR0865、CgR1522、CgR1819、CgR2213、CgR2386およびCgR2535(それぞれ、配列番号19〜36参照)、特開平9−316095号公報にある分泌シグナルペプチド(配列番号37参照)、Applied and Enviromental Microbiology,(1995),61(4),p.1610−1613にあるサチライシンの分泌シグナルであるarpEのシグナルペプチド(配列番号38参照)、Applied and Enviromental Microbiology,(2003),69(1),p.358−366にある分泌シグナルペプチド(配列番号39参照)、ならびにTrends in Microbiology,(2005),13(4),p.175−180にある分泌シグナルペプチド(配列番号40〜43参照)が挙げられる。
なお、前記リジン脱炭酸酵素および分泌シグナルペプチドとしては、その機能を有する限りにおいては、それぞれ各アミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加されたタンパク質も含まれる。ここで、「数個」とは、通常1〜7個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個程度である。また、前記リジン脱炭酸酵素および分泌シグナルペプチドとしては、その機能を有する限りにおいては、アミノ酸配列に対する配列同一性が、通常85%以上、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のようなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、保存的置換であることが好ましい。元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、およびValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。
遺伝子組換えにより微生物にリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現させる方法としては、核酸配列の5’から3’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を微生物に導入する方法が挙げられる。
本発明で使用されるプロモーター配列は特に限定されず、使用する微生物内で機能し得るプロモーター配列であれば一般に使用でき、更に異種由来のプロモーターであってもよいが、好ましいプロモーターの例として、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2−イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル−ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸(DAHP)合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系、例えばホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子の各プロモーター、ならびにtacプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。これらのプロモーター配列は、データベース(GenBank)に登録されている。
本発明で使用される分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列は、前記分泌シグナルペプチドを翻訳しうるような核酸配列であれば特に限定されず、分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列のコドン(標準遺伝暗号)を参考に決定することができ(ホートン 生化学 第3版 東京化学同人、p.526参照)、その際、本発明に使用する微生物にとって良く利用されているコドンで核酸配列を再設計してもよい。具体的には、大腸菌由来のTorA(トリメチルアミンN−オキシドレダクターゼ)、SufI(Suppressor of ftsI;ftsIサプレッサー)、バチルス・ズブチリス(Bacillus Subtilis)由来のPhoD(ホスホエステラーゼ)、LipA(リパーゼ)、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来のイソマルトデキストラナーゼ(IMD)等の分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(それぞれ、配列番号44〜48参照)、特許3711658号公報にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(配列番号49参照)、Microbiology (2009),155,p.741−750にあるコリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム R 由来の分泌シグナルペプチドであるCgR0079、CgR0120、CgR0124、CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、CgR2677、CgR2926、CgR0040、CgR0789、CgR0865、CgR1522、CgR1819、CgR2213、CgR2386およびCgR2535をコードする核酸配列(それぞれ、配列番号50〜67参照)、特開平9−316095号公報にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(配列番号68参照)、Applied and Enviromental Microbiology,(1995),61(4),p.1610−1613にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(配列番号69参照)、Applied and Enviromental Microbiology,(2003),69(1),p.358−366にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(配列番号70参照)、ならびにおよびTrends in Microbiology,(2005),13(4),p.175−180にある分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列(配列番号71〜74参照)が挙げられる。
本発明で使用されるリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列が具体例として挙げられ、その際、使用する微生物のコドン使用頻度に応じて核酸配列を再設計してもよい。なお、前述の生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、データベース(GenBank)に登録されている。
前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、それぞれ各核酸配列において、1又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加された核酸配列も含まれる。ここで、「数個」とは、通常1〜40個、好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜20個、特に好ましくは1〜10個、最適に好ましくは1〜5個程度である。また、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、該核酸配列もしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列が挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも20個、好ましくは25個、より好ましくは少なくとも30個の連続した配列を1つあるいは複数個選択した核酸配列をプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al.,(1987) Publish.John Wily & Sons Section 6.3−6.4)などを用いて、ハイブリダイズする核酸配列である。ここでストリンジェントな条件としては、例えば50%ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が37℃、より厳しい条件としては42℃、さらに厳しい条件としては65℃で、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)を用いて洗浄することにより達成することができる。また、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列としては、その機能を有する限りにおいては、配列同一性が、通常85%以上、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の配列同一性を有する核酸配列であってもよい。このようなプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、本来の宿主以外からも取得され得るし、本来の宿主から得られた核酸配列を、当業者に周知のインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。
本発明で使用される遺伝子構築物は、前記プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含むほか、微生物の細胞内でリジン脱炭酸酵素遺伝子を発現させるために必要な制御配列(オペレーターやターミネーター等)を、それらが機能し得るように適切な位置に有してもよい。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、微生物中で機能し得るものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってよい。また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。なお、遺伝子構築物の構築や、その確認方法については当業者に周知の分子生物学的手法になされるものであり、例えば、Sambrook et al.,Molecular Clonig:A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York、DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I andII (D.N.Glovered.1985)、F.M.Ausubel et al. (eds),Current Protocols in Molecular Biology (1994) John Wiley & Sons,Inc.、PCR Technology:Principles and Application for DNA Amplication,H.Erlich,ed.,Stockton Press等を参照することができる。
前記遺伝子構築物の微生物への導入方法は特に限定されず、例えば、プロトプラスト法(Gene,(1985),39,p.281−286)、エレクトロポレーション法(Bio/Technology,(1989),7,1067−1070)等により導入することができる。
本発明におけるリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物としては、前記遺伝子構築物を遺伝子組換えにより導入できる微生物が好ましく、具体例として、大腸菌(エシェリシア・コリ)、枯草菌、カビ、酵母、コリネ型細菌などが挙げられるが、カダベリンの前駆体であるリジンを効率よく生産することが知られている微生物である大腸菌またはコリネ型細菌がより好ましい。
大腸菌の具体例としては、MC1061株、HB101株、JM105株、JM109株、DH5α株及びJE5505株などを用いることができる。
また、コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在、コリネバクテリウム属に統合された細菌も含まれる(Int.J.Syst.,Bacteriol.,(1981)41,p.225)。また、コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophylum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)、コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium mellassecola)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エッフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)、ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevivacterium divaricatum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevivacterium flavum)、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム(Brevivacterium immariophilum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevivacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevivacterium roseum)、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevivacterium saccharolyticum)、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevivacterium thiogenitalis)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・アルバム(Brevivacterium album)、ブレビバクテリウム・セリヌム(Brevivacterium cerinum)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)が挙げられる。
また、各コリネ型細菌の具体的な菌株として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806、コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511、コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020,ATCC13020,ATCC13060、コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990、コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965、コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(寄託番号:FERM BP−1539)、コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868、ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020、ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(寄託番号:FERM BP−2205)、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871,ATCC6872、ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111、ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354が挙げられる。
前述のコリネ型細菌は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載され、この番号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
本発明においては、前述のコリネ型細菌の中でもコリネバクテリウム・グルタミカムが好ましく用いられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13869のストレプトマイシン耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカム AJ12036(寄託番号:FERM BP−734)(昭和59年3月26日原寄託、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター)はその親株(野生株)に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ2〜3倍と極めて高いため、リジン脱炭酸酵素を分泌させるコリネ型細菌として好適である(WO02/081694参照)。
リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物がリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することの確認方法としては、微生物を培養し遠心分離することで培養上清と微生物に分離して得られた培養上清中のリジン脱炭酸酵素活性を測定し、有無を確認すればよい。また、細胞外へのリジン脱炭酸酵素量は、ウエスタンブロッティング法やELISA法などの抗原−抗体反応を利用した定量法によって定量することができる。
リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、培養液中にカダベリンを生成・蓄積させることができる。
培養方法としては、回分培養、流加培養または連続培養を用いることができる。連続培養の場合、例えば特開2008−104453号公報に記載のような連続培養を行うことが好ましい。
培養培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンB6等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
なお、本発明では培養培地にリジンを予め添加しておくことも好ましい態様の1つである。培養培地にリジンを予め添加しておけば、培養液中にて細胞外に分泌されたリジン脱炭酸酵素が予め添加されていたリジンを基質にしてカダベリンに変換をするため、カダベリンの製造効率を高めることができる。培養培地に予めリジンを添加する場合の培養培地中のリジン濃度としては特に制限はないが、微生物の増殖へ悪影響がおこらずかつリジン脱炭酸酵素への阻害がおこらない濃度が好ましく、具体的には、0.01から2Mであることが好ましい。
添加するリジンはL−リジンであることが好ましい。また、添加するリジンはフリー体であってもリジン塩であってもよいが、リジン塩としてはリジン塩酸塩または後述のジカルボン酸由来のリジン・ジカルボン酸塩が好ましい。なお、リジン・ジカルボン酸塩の好ましい具体例としては、リジン・アジピン酸塩、リジン・セバシン酸塩、リジン・1,12−ドデカンジカルボン酸塩、リジン・コハク酸塩、リジン・イソフタル酸塩、リジン・テレフタル酸塩が挙げられるが、より好ましい具体例としてはリジン・アジピン酸塩が挙げられる。
培養条件には特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に25℃〜42℃に、好ましくは28℃〜38℃である。培養時間は、通常1日から6日間である。
培養pH調整にはアンモニア、塩酸またはジカルボン酸を使用することが好ましく、ジカルボン酸を使用することがより好ましい。これら中和剤を用いて培養pHを5〜8に、好ましくはpH6.5〜7.5に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
中和剤として好ましく使用されるジカルボン酸には特に制限はないが、好ましくは、前記2つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないジカルボン酸である。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応(反応条件としては、例えば、反応温度250〜270℃、圧力10〜20kg/cm2で反応時間1から5時間)の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下(結晶化度80%以下)させるような反応基であり、例えば、アミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基(スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等)や塩基性基(ヒドラジノ基等)やプロトニックな極性基(水酸基等)や開裂性を有する基(エポシキ基、過酸化基等)やその他反応性の高い基(イソシアナート基等)が該当する。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基、エーテル基、エステル基、アミド基等は反応性が低く、ここでいう官能基には該当しない。
ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式(1)、(2)または(3)で示されるジカルボン酸である。
HOOC−(CH−COOH (1)
(但し、一般式(1)において、m=0〜16)。
Figure 0005853695
(但し、一般式(2)において、n,o=0〜16)。
Figure 0005853695
(但し、一般式(2)において、p,q=0〜16)。
また、ジカルボン酸として、更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、1,12−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
培養液中のカダベリンはカダベリンのフリー体またはカダベリン塩として存在する。培養液中のカダベリンを採取する方法として、まず、培養液中から微生物を除去する。分離方法としては、微生物を沈殿除去・遠心分離・膜ろ過分離など従来から知られている方法を用いることが好ましい。
微生物が除去されたカダベリンを含む培養液からカダベリンを採取する方法としては、特開2009−207495号公報に記載のようにカダベリン・ジカルボン酸塩として晶析して採取することもできる。また、特開2009−29872号公報に記載のようにNF膜を利用してカダベリンのフリー体を精製し採取することもできる。また、特開2009−28045号公報に記載のように極性有機溶媒で抽出し、蒸留することによりカダベリンのフリー体を採取することもできる。
以下、本発明について、実施例、比較例を挙げて詳細に説明する。また、特に断らない限り実施例・比較例で使用した全ての培地、寒天培地および培養培地は通常の滅菌操作(例えば121℃、30分間のオートクレイブ滅菌や0.45μmフィルター滅菌)を行い滅菌された状態で利用している。
(カダベリンおよびリジン濃度のHPLCによる分析方法)
使用カラム:CAPCELL PAK C18(資生堂)
移動相:0.1%(w/w)リン酸水溶液:アセトニトリル=4.5:5.5
検出:UV360nm
サンプル前処理:分析サンプル25μlに内標として1,4−ジアミノブタン(0.03M)を25μl、炭酸水素ナトリウム(0.075M)を150μlおよび2,4−ジニトロフルオロベンゼン(0.2M)のエタノール溶液を添加混合し37℃で1時間保温する。上記反応溶液50μlを1mlアセトニトリルに溶解後、10,000rpmで5分間遠心した後の上清10μlをHPLC分析した。
参考例1(リジンを生産できるコリネバクテリウム・グルタミカムの作製)
カダベリンの前駆体であるリジンを合成できるコリネバクテリウム・グルタミカムを作製するため、アスパルトキナーゼへの有効変異導入によるリジン生産菌を作製した。Apppl.Microbiol.Biotechnol.,(2002),58,p.217−223に記載の方法により、コリネバクテリウム・グルタミカム AK−1(以下AK-1株と略す)株を作製した。本菌株のアスパルトキナーゼは、リジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。そのためリジンを培養により合成できるようになっている。
次に、AK−1株を更に遺伝子組換えにより、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネ型細菌(実施例1,2)、リジン脱炭酸酵素を細胞外には分泌しないコリネ型細菌(比較例1)を作製した。
実施例1(リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製)(その1:Tat経路利用)
(1)HOM遺伝子のクローニング
リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入する遺伝子座としてホモセリンデヒドロゲナーゼを選択した。HOM遺伝子の、N末端から300アミノ酸領域に該当する遺伝子のクローニングを行った。データベース(GenBank)に登録されているHOM遺伝子(Accession No.BA000036)の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号1および配列番号2)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から常法に従い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型として0.2mlのミクロ遠心チューブに0.2μlづつ取り、各プライマーを20pmol、トリス塩酸緩衝液pH8.0(20mM)、塩化カリウム(2.5mM)、ゼラチン(100μg/ml)、各dNTP(50μM)、LATaqDNAポリメラーゼ(2単位)(宝酒造製)となるように各試薬を加え、全量を50μlとした。DNAの変性条件を94℃、30秒、プライマーのアニーリング条件を55℃、30秒、DNAプライマーの伸長反応条件を72℃、3分の各条件でBioRad社のサーマルサイクラーを用い、30サイクルポリメラーゼ連鎖反応させた(以下PCR法と略す)。尚、本実施例におけるPCR法は特に断らない限り、本条件にて行った。このPCR法により得られた産物を1%アガロースにて電気泳動し、HOM遺伝子を含む約0.9kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キット(BIO101社製)により精製した。この断片を、制限酵素のEcoRIおよびBamHIで消化し、得られた0.9kbのEcoRI−BamHI断片を、予めEcoRIおよびBamHIで消化しておいたpHSG298(宝酒造製)のEcoRI/BamHI間隙にライゲーションキットver.1(宝酒造社製)を用いて挿入し、得られたプラスミドをpHOM1と命名した。
(2)LDC分泌発現カセットの作成
LDCをコリネバクテリウム・グルタミカムで構成的に発現させるためのプロモーターとして、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを選択し、分泌シグナルとしてTat経路による分泌をする大腸菌のSufIを選択し、LDC遺伝子として大腸菌のcadAを選択した。
まず、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターのクローニングを行った。データベース(GenBank)に登録されているpHSG299(Accession No.M19415)の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号3および配列番号4)を合成した。プラスミドpHSG299を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号:3)、(配列番号:4)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む0.3kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターpT7blue(Novagen社製)のEcoRV切断部位の3’末端にT塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットver.1を用いて挿入し、得られたプラスミドのうち制限酵素のHindIIIおよびSacIIで消化した際に3.2kbの単一断片になるプラスミドをpKMP1と命名した。
次に、LDC遺伝子のクローニングを行った。データベース(GenBank)に登録されているLDC遺伝子(Accession No.M76411)の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号5配列番号6)を合成した。大腸菌(エシェリシア・コリ ATCC10798)から常法に従い調整したゲノムDNAの溶液を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド(配列番号5、6)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC遺伝子を含む2.1kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、プラスミドベクターpT7blueのEcoRV切断部位の3’末端にT塩基が付加された間隙に、ライゲーションキットver.1を用いて挿入し、得られたプラスミドのうちHindIIIおよびNcoIで消化した際に4.0kbの単一断片になるプラスミドをpCADAと命名した。
最後に、分泌シグナルとして大腸菌のSufIのアミノ酸配列に対応する塩基配列とLCD遺伝子の融合した、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号7)を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー3’側はLDC遺伝子の5’側と重複する領域を設計している。pCADAを増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド(配列番号7、6)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC遺伝子を含む2.2kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した(LDC遺伝子断片1)。同時に、分泌シグナルとして大腸菌のSufIのアミノ酸配列に対応する塩基配列とカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの融合した、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号8)を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー5’側はカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの3’側と重複する領域を設計している。pKMP1を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド(配列番号3、配列番号8)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC遺伝子を含む0.4kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した(カナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片1)。
こうして得られたLDC遺伝子断片1とカナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片1を増幅鋳型として制限酵素のBamHI配列を設計しているオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号9)および制限酵素のSphI配列を設計しているオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号10)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC分泌発現カセットを含む2.6kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、制限酵素のBamHIおよびSphIで消化し、得られた2.6kbのBamHI-SphI断片を、予めBamHIおよびSphIで消化しておいたpHOM1のBamHI/SphI間隙にライゲーションキットver.1(宝酒造社製)を用いて挿入し、得られたプラスミドをpTM65と命名した。
(4)pTM65の染色体への組み込み
AK-1株にプラスミドpTM65を、電気穿孔法[FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)]により導入し、カナマイシン(25μg/ml)を含むLB(トリプトン(10g/l)(Bacto社製)、酵母エキス(5g/l)(Bacto社製)、塩化ナトリウム(10g/l))寒天培地上で選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムDNA溶液を調整した。このゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチド(配列番号:1)(配列番号:6)をプライマーセットとして用いたPCR法を行い、得られた産物を1.0%アガロースゲルにて電気泳動したところ、3.5kbの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、HOM遺伝子座に、LDC遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムAK-1/pTM65(AK−1/pTM65株と略す)と命名した。
実施例2(リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製)(その1:Sec経路利用)
(1)LDC分泌発現カセットの作成
次に、LDCをコリネバクテリウム・グルタミカムで構成的に発現させるためのプロモーターとして、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを選択し、分泌シグナルとしてSec経路による分泌をするサチライシンのシグナルであるarpEを選択し、LDC遺伝子として大腸菌のcadAを選択した。実施例1と同じく分泌シグナルとしてarpEのアミノ酸配列に対応する塩基配列とLCD遺伝子の融合した、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号11)を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー3’側はLDC遺伝子の5’側と重複する領域を設計している。pCADAを増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド(配列番号11、配列番号6)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC遺伝子を含む2.2kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した(LDC遺伝子断片2)。
同時に、分泌シグナルとしてarpEのアミノ酸配列に対応する塩基配列とカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの融合した、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号12)を合成した。このオリゴヌクレオチドプライマー5’側はカナマイシン耐性遺伝子プロモーターの3’側と重複する領域を設計している。pKMP1を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチド(配列番号3、配列番号12)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC遺伝子を含む0.4kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した(カナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片2)。
こうして得られたLDC遺伝子断片2とカナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片2を増幅鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号:9)および(配列番号:10)をプライマーセットとしたPCR法により得られた産物を1%アガロースゲル電気泳動し、LDC分泌発現カセットを含む2.6kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。この断片を、制限酵素のBamHIおよびSphIで消化し、得られた2.6kbのBamHI-SphI断片を、予めBamHIおよびSphIで消化しておいたpHOM1のBamHI/SphI間隙にライゲーションキットver.1(宝酒造社製)を用いて挿入し、得られたプラスミドをpTM66と命名した。
(2)pTM66の染色体への組み込み
AK-1株にプラスミドpTM66を、電気穿孔法[FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)]により導入し、カナマイシン(25μg/ml)を含むLB(トリプトン(10g/l)(Bacto社製)、酵母エキス(5g/l)(Bacto社製)、塩化ナトリウム(10g/l))寒天培地上で選択した。こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムDNA溶液を調整した。このゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチド(配列番号1、配列番号6)をプライマーセットとして用いたPCR法を行い、得られた産物を1.0%アガロースゲルにて電気泳動したところ、3.5kbの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、HOM遺伝子座に、LDC遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムAK-1/pTM66(AK−1/pTM66株と略す)と命名した。
比較例1(リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌しないコリネバクテリウム・グルタミカムの作製)
pKMP1をHindIIIおよびNcoIで消化し、この産物を1.2%アガロースゲル電気泳動し、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を含む0.3kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたHindIII−NcoI断片を、予めHindIIIおよびNcoIで消化しておいたpCADAのHindIII/NcoI間隙にライゲーションキットver.1を用い挿入し、得られたプラスミドをpTM100と命名した。
次に、pTM100をSacIIで消化し、この産物を1.0%アガロースゲル電気泳
動し、LDC発現カセットを含む2.4kbのDNA断片をゲルから切り出しジーン・クリーン・キットにより精製した。こうして得られたSacII断片を、予めSacIIで消化しておいたpHOM1のSacII間隙にライゲーションキットver.1を用い挿入し、得られたプラスミドをpTM101と命名した。
AK−1株にプラスミドpTM101を、電気穿孔法[FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)]により導入し、カナマイシン(25μg/ml)を含むLB(トリプトン(10g/l)(Bacto社製)、酵母エキス(5g/l)(Bacto社製)、塩化ナトリウム(10g/l))寒天培地上で選択した。
こうして選択された形質転換体から常法に従いゲノムDNA溶液を調整した。このゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチド(配列番号:5)(配列番号:6)をプライマーセットとして用いたPCR法を行い、得られた産物を1.0%アガロースゲルにて電気泳動したところ、2.1kbの単一のバンドが観察された。このことから、選択された形質転換体が、HOM遺伝子座に、LDC遺伝子が挿入されていることが確認できた。この形質転換体を、コリネバクテリウム・グルタミカムAK−1/pTM101(以下AK−1/pTM101株と略す)と命名した。
実施例3(リジン脱炭酸酵素活性を細胞外に分泌することの確認)
AK-1/pTM65株、AK-1/pTM66株およびAK-1/pTM101株をBY培地(J.Bacteriol.,159,p.306−311(1984)参照)にて培養した後に、遠心分離により微生物と培養上清に分けた。微生物については常法にしたがい破砕し、微生物破砕液を調整した。こうして得られた培養上清および微生物破砕液中のリジン脱炭酸酵素活性を測定した(Biosci.Biotechnol.Biochem.,71,p.2130−2135,(2007)参照)。酵素活性を、L−リジンをカダベリンに1分間に1nmolの変換するとき1Uとし、結果をタンパク質重量当たりの比活性で表1に示す。
Figure 0005853695
AK−1/pTM65株およびAK−1/pTM66株は、細胞外である培養上清にリジン脱炭酸酵素活性を有しており、リジン脱炭酸酵素が細胞外に分泌されていることが確認できた。また、微生物破砕液中にはすべての株がリジン脱炭酸酵素活性を有していることが確認できた。
実施例4,5、比較例2,3(微生物培養:微生物がコリネ型細菌である場合)
AK−1/pTM65株(実施例4)、AK−1/pTM66株(実施例5)、AK−1/pTM101株(比較例2)およびAK−1/pTM101株+20mg精製リジン脱炭酸酵素(特開2004−000114号公報に記載の方法で調整)(比較例3)をそれぞれ培養し、カダベリンの生産性を比較した。
滅菌したBY培地5mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で24時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地50mlに全量植菌し、30℃、振幅30cmで、120rpmの条件下で24時間培養して前培養を行った。次に、表2に示すMMP培地(培養培地)950mlに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を0.07vvmで通気しながら、30℃、攪拌翼回転数800rpm、pHを6.7に調整しながら50時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液(3M)およびアンモニア水(3M)で行った。比較例3については20mgの精製リジン脱炭酸酵素を培養開始時に添加した。
Figure 0005853695
培養終了後、4℃、8,000rpmで10分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをHPLCにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。カダベリン対糖収率(生産されたカダベリン重量/消費したグルコース重量)×100(%))を計算し、それら結果を表3に示す。
Figure 0005853695
その結果、比較例2および3では細胞外にリジン脱炭酸酵素を添加することでリジンの副生産を低減可能であるという予想可能な効果が現れている。一方で、比較例2と実施例4、5を比較すると、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することでリジンの副生産を顕著に低減可能であることが明らかになった。また、リジンの副生産低減によるカダベリンの蓄積濃度向上と対糖収率向上は、比較例3と実施例4、5では差はないものと考えられていたが、驚くべきことに、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、リジン脱炭酸酵素を培養液に添加する場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
参考例2(リジン脱炭酸酵素活性欠損大腸菌の作製)
(1)大腸菌のリジン脱炭酸酵素(LDC)遺伝子の削除
大腸菌にはLDC遺伝子としてcadA遺伝子とldcC遺伝子が存在することが知られている。DatsenkoとWannerにより開発された「Red−driven integration」と呼ばれる方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640−6645)に従い、以下の通り大腸菌W3110株のcadAおよびldcC遺伝子を削除した。「Red−driven integration」法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらに酵母由来のFLPレコンビナーゼにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することができる。
(1−1)cadA遺伝子の削除
PCRの鋳型として、プラスミドpKD3(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640−6645)を使用した。pKD3は、pMW118(タカラバイオ社製)にFLP−レコンビナーゼの認識配列であるFRT(FLP recombinase Recognition Target)と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、FRT−cat−FRTの順で挿入されている。FRTを配列番号75に示す。
このFRTの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、削除する遺伝子であるcadA遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)に隣接する50塩基をプライマーの5’末端に有する配列番号76、77に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行った。
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含む大腸菌W3110株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640−6645)は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRedレコンビナーゼをコードする遺伝子(γ、β、e x o遺伝子)を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント(GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459,第31088番目〜33241番目)を含む。
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、アンピシリンを含むLB培地中で30℃、一晩培養した大腸菌W3110株を、アンピシリンとL−アラビノースを含んだSOB培地で100倍希釈した。得られた希釈物を30℃で通気しながらOD600が約0.6になるまで生育させた後、10%グリセロールで3回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。
エレクトロポレーション後のセルは1mLのSOC培地を加えて37℃で2.5時間培養した後、37℃でクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をW3110 cadA::FRT−cat−FRT株と名づけた。
次に、cadA遺伝子内に導入されたFRT−cat−FRT遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpCP20を使用した。pCP20(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640−6645)は、酵母のFLPレコンビナーゼを搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pCP20導入により、染色体上に存在する2箇所のFRTを認識して組換えを起こしFRT間の遺伝子を切り出し、染色体上にはFRTのみが残る構造になる。
上記で得られたW3110 cadA::FRT−cat−FRT株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpCP20にて形質転換し、30℃で50mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pCP20を除去するために、LB寒天培地上、42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、cat遺伝子、およびpCP20が脱落しているクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をW3110ΔcadAと命名した。
(1−2)ldcC遺伝子の削除
大腸菌W3110ΔcadA株におけるldcC遺伝子の削除は、上記(1−1)の手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号78、79のプライマーを使用して行った。これによって、cadAおよびldcC遺伝子が削除された株を得た。構築した菌株をW3110ΔLDCと命名した。
実施例6,7、比較例4(リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する大腸菌(Sec経路利用およびTat経路利用)の作製および細胞外に分泌しない大腸菌の作製)
W3110ΔLDC株を常法により、プラスミドpTM101、pTM65およびpTM66で形質転換を行った。それらの遺伝子組換え大腸菌をそれぞれ、W3110ΔLDC/pTM101株(細胞外に分泌しない株)(比較例4)、W3110ΔLDC/pTM65株(細胞外分泌株:Tat経路利用)(実施例6)およびW3110ΔLDC/pTM66株(細胞外分泌株:Sec経路利用)(実施例7)と命名した。
実施例8(リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌することの確認)
W3110ΔLDC/pTM101株、W3110ΔLDC/pTM65株およびW3110ΔLDC/pTM66を、カナマイシンを含むLB培地にて培養した後に、遠心分離により微生物と培養上清に分けた。微生物については常法にしたがい破砕し、微生物破砕液を調整した。こうして得られた培養上清および微生物破砕液中のリジン脱炭酸酵素活性を測定した。酵素活性を、L−リジンをカダベリンに1分間に1nmolの変換するとき1Uとし、結果をタンパク質重量当たりの比活性で表4に示す。
Figure 0005853695
W3110ΔLDC/pTM101株、W3110ΔLDC/pTM65株、細胞外である培養上清にリジン脱炭酸酵素活性を有しており、リジン脱炭酸酵素が細胞外に分泌されていることが確認できた。また、微生物破砕液中にはすべての株がリジン脱炭酸酵素活性を有していることが確認できた。
実施例9,10、比較例5(微生物培養:微生物が大腸菌である場合)
W3110ΔLDC/pTM65株(実施例9)、W3110ΔLDC/pTM66株(実施例10)、およびW3110ΔLDC/pTM101株+20m精製リジン脱炭酸酵素(特開2004−000114号公報に記載の方法で調整)(比較例5)をそれぞれ培養し、カダベリンの生産性を比較した。
カナマイシンを含むLB培地5mlに各株を1白金耳植菌し、30℃で24時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地50mlに全量植菌し、30℃、振幅30cmで、120rpmの条件下で24時間培養して前培養を行った。次に、表5に示すMS培地(培養培地)950mlに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を0.20vvmで通気しながら、37℃、攪拌翼回転数800rpm、pHを7.0に調整しながら50時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液(3M)およびアンモニア水(3M)で行った。比較例6については20mgの精製リジン脱炭酸酵素を培養開始時に添加した。
Figure 0005853695
培養終了後、4℃、8,000rpmで10分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをHPLCにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。カダベリン対糖収率(生産されたカダベリン重量/消費したグルコース重量)×100(%))を計算し、それら結果を表6に示す。
Figure 0005853695
比較例5と実施例9、10を比較すると、驚くべきことにリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養すると、リジン脱炭酸酵素を培養液に添加する場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
実施例11,12、比較例6、7(微生物培養:リジン添加の効果比較)
W3110ΔLDC/pTM65株(実施例11)、W3110ΔLDC/pTM66株(実施例12)、W3110ΔLDC/pTM101株(比較例6)およびW3110ΔLDC/pTM101株+20mg精製リジン脱炭酸酵素(特開2004−000114号公報に記載の方法で調整)(比較例7)によるリジンのカダベリンへの変換能力について比較した。実施例9,10と同様の試験で各微生物を培養し、MS培地(培養培地)にL−リジン塩酸塩を62.5g/L添加する点だけを変更した。50時間後、4℃、8,000rpmで10分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをHPLCにより分析した。本結果を表7に示す。
Figure 0005853695
比較例6、7と実施例11、12を比較すると、カダベリンの生産効率(生産速度)が、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物のほうが顕著に優れていることを確認できた。このことより、リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養する際に、リジンを添加することで、カダベリンの生産効率が向上することが明らかになった。
実施例13,14、比較例8(微生物培養:微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合している微生物との比較)
リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物(以下、LDC分泌微生物という。)と、微生物表層にリジン脱炭酸酵素が結合して存在している微生物(以下、LDC細胞表層提示微生物という。)として特開2004−298033号公報に記載のJM109/pTM16株をそれぞれ培養した場合のカダベリンの生産性を比較した。
W3110ΔLDC/pTM65株(実施例13)、W3110ΔLDC/pTM66株(実施例14)、およびJCM109/pTM16株(比較例8)について、カナマイシンを含むLB培地5ml(JCM109/pTM16株はアンピシリンを含むLB培地)に各株を1白金耳植菌し、30℃で24時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地50mlに全量植菌し、30℃、振幅30cmで、120rpmの条件下で24時間培養して前培養を行った。次に、終濃度1mM イソプロピル−チオ−β−D−ガラクトシドを添加したMS培地(培養培地)に950mlに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を0.20vvmで通気しながら、37℃、攪拌翼回転数800rpm、pHを7.0に調整しながら50時間培養を行った。中和剤として硫酸水溶液(3M)およびアンモニア水(3M)で行った。
培養終了後、4℃、8,000rpmで10分間遠心分離することで微生物を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のカダベリンおよびリジンをHPLCにより分析した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。カダベリン対糖収率(生産されたカダベリン重量/消費したグルコース重量)×100(%))を計算し、それら結果を表8に示す。
Figure 0005853695
比較例8と実施例13、14を比較すると、驚くべきことにLDC分泌微生物を培養した場合、LDC細胞表層提示微生物を培養した場合よりもカダベリンの蓄積濃度および対糖収率が向上することが確認できた。
本発明は、カダベリンの製造に好適に適用することが可能である。

Claims (5)

  1. リジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌する微生物を培養することを特徴とする、カダベリンの製造方法であって、前記微生物が、リジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を細胞内で発現することによりリジン脱炭酸酵素を細胞外に分泌し、前記分泌シグナルペプチドが配列番号13から43のいずれかのアミノ酸配列または配列番号13から43のいずれかのアミノ酸配列に対する配列同一性が85%以上のアミノ酸配列で表されるペプチドである、カダベリンの製造方法
  2. 前記微生物の培養のための培地にリジンを添加することを特徴とする、請求項1に記載のカダベリンの製造方法。
  3. 前記微生物が、核酸配列の5’から3’方向に、該微生物中で機能するプロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列およびリジン脱炭酸酵素をコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を有することにより、細胞内でリジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列のN末端側に分泌シグナルペプチドが付加されたタンパク質を発現することを特徴とする、請求項1または2に記載のカダベリンの製造方法。
  4. リジン脱炭酸酵素が大腸菌由来であることを特徴とする、請求項1からのいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
  5. 前記微生物がコリネ型細菌または大腸菌であることを特徴とする、請求項1からのいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
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