JPH09316095A - 新規シグナルペプチド - Google Patents
新規シグナルペプチドInfo
- Publication number
- JPH09316095A JPH09316095A JP8131762A JP13176296A JPH09316095A JP H09316095 A JPH09316095 A JP H09316095A JP 8131762 A JP8131762 A JP 8131762A JP 13176296 A JP13176296 A JP 13176296A JP H09316095 A JPH09316095 A JP H09316095A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- fragment
- plasmid
- signal peptide
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- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネ型細菌におけるタンパク質の分泌を効
率よく行わせる。 【解決手段】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３菌株の染色体ＤＮＡから分泌タンパク質遺伝子のシ
グナルペプチドを得、該シグナルペプチドに変異を導入
して本発明の新規シグナルペプチドを得る。
率よく行わせる。 【解決手段】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３菌株の染色体ＤＮＡから分泌タンパク質遺伝子のシ
グナルペプチドを得、該シグナルペプチドに変異を導入
して本発明の新規シグナルペプチドを得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規シグナルペプチド
に関するものであり、具体的には、コリネ型細菌におい
て、所定の蛋白質の分泌を効率よく行わせるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列に関する。
に関するものであり、具体的には、コリネ型細菌におい
て、所定の蛋白質の分泌を効率よく行わせるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】コリネ型細菌による蛋白質の分泌につい
ては今日まであまり研究が進んでいない。Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＤＮ
ａｓｅの分泌（米国特許４，９６５，１９７号明細
書）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの細胞壁蛋白質であるＰＳ１・ＰＳ２の分泌
（ＷＯ９３／０３１５８号明細書）に関する研究が報告
されているにすぎず、系統的な研究は行われていない。
ては今日まであまり研究が進んでいない。Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによるＤＮ
ａｓｅの分泌（米国特許４，９６５，１９７号明細
書）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの細胞壁蛋白質であるＰＳ１・ＰＳ２の分泌
（ＷＯ９３／０３１５８号明細書）に関する研究が報告
されているにすぎず、系統的な研究は行われていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、工業的レベ
ルにおいて、所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させ
るために必要なアミノ酸をコードするコリネ型細菌由来
のＤＮＡ配列の提供を目的としてなされたものである。
ルにおいて、所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させ
るために必要なアミノ酸をコードするコリネ型細菌由来
のＤＮＡ配列の提供を目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内で
所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために必要
なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に関する情報を、コ
リネ型細菌から単離し、さらにこれを改変することによ
って見い出し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内で
所定の蛋白質を培地中へ効率よく分泌させるために必要
なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に関する情報を、コ
リネ型細菌から単離し、さらにこれを改変することによ
って見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明の要旨は、配列表の配列
番号１記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドに
存する。かくして、本発明のアミノ酸配列を所定の蛋白
質の直上流に同一フレーム内で連結することにより、工
業的レベルにおいて該蛋白質を効率よく培地中へ分泌生
産させることが可能である。以下、本発明についてさら
に詳細に説明する。
番号１記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドに
存する。かくして、本発明のアミノ酸配列を所定の蛋白
質の直上流に同一フレーム内で連結することにより、工
業的レベルにおいて該蛋白質を効率よく培地中へ分泌生
産させることが可能である。以下、本発明についてさら
に詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のシグナルペプチド（以
下、Ａ断片と略記することがある）は、分泌蛋白質の前
駆体のＮ末端側に存在し、培地中に分泌生産されたとき
に切断を受ける、いわゆるシグナル配列を意味するもの
であり、所定の蛋白質の直上流に同一フレーム内で連結
することによって使用するものである。
下、Ａ断片と略記することがある）は、分泌蛋白質の前
駆体のＮ末端側に存在し、培地中に分泌生産されたとき
に切断を受ける、いわゆるシグナル配列を意味するもの
であり、所定の蛋白質の直上流に同一フレーム内で連結
することによって使用するものである。
【０００７】Ａ断片をクローニングするに当たって、供
給源となるコリネ型細菌としては、例えば、ブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリ
ウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）、ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同Ａ
ＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
給源となるコリネ型細菌としては、例えば、ブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリ
ウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）、ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同Ａ
ＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
【０００８】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の具体的な一例としては次のとおりで
ある。Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に
存在し、この染色体の中から、分泌蛋白質遺伝子を単離
する通常の方法、すなわち、培養上清中の蛋白質を濃縮
・精製し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定し、決定した
アミノ酸配列をもとにデザインしたオリゴＤＮＡプロー
ブを用いたハイブリダイゼーションにより分離・取得す
ることができる。
るための基本操作の具体的な一例としては次のとおりで
ある。Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に
存在し、この染色体の中から、分泌蛋白質遺伝子を単離
する通常の方法、すなわち、培養上清中の蛋白質を濃縮
・精製し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定し、決定した
アミノ酸配列をもとにデザインしたオリゴＤＮＡプロー
ブを用いたハイブリダイゼーションにより分離・取得す
ることができる。
【０００９】目的遺伝子を含む断片を単離し、単離した
断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コドンを同定するこ
とにより、Ａ断片を同定できる。すなわち、その翻訳開
始コドンから、培養上清中に検出された蛋白質のＮ末端
アミノ酸の１アミノ酸上流側までの配列をコードするＤ
ＮＡ配列がＡ断片である。上記のＡ断片は、天然のコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたのち、分泌量の増
加を指標にして改良されたもののみならず、塩基配列が
決定された後であれば、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied B
iosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを
用いて合成されたものであってもよい。
断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コドンを同定するこ
とにより、Ａ断片を同定できる。すなわち、その翻訳開
始コドンから、培養上清中に検出された蛋白質のＮ末端
アミノ酸の１アミノ酸上流側までの配列をコードするＤ
ＮＡ配列がＡ断片である。上記のＡ断片は、天然のコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたのち、分泌量の増
加を指標にして改良されたもののみならず、塩基配列が
決定された後であれば、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied B
iosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを
用いて合成されたものであってもよい。
【００１０】また、本発明のＡ断片は、分泌量の増加を
指標に該配列の機能を実質的に損なわないよう改良する
ことは可能であり、その手法としては、ランダム変異導
入法、部位特異的変異導入法等が挙げられる。工業的レ
ベルにおいて培地中に所定の蛋白質を分泌生産可能なら
しめるものであれば、塩基配列の一部の塩基が他の塩基
と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或
いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配
列の一部が転位されているものであってもよく、これら
の誘導体のいずれもが、本発明のＡ断片に包含されるも
のである。
指標に該配列の機能を実質的に損なわないよう改良する
ことは可能であり、その手法としては、ランダム変異導
入法、部位特異的変異導入法等が挙げられる。工業的レ
ベルにおいて培地中に所定の蛋白質を分泌生産可能なら
しめるものであれば、塩基配列の一部の塩基が他の塩基
と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或
いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配
列の一部が転位されているものであってもよく、これら
の誘導体のいずれもが、本発明のＡ断片に包含されるも
のである。
【００１１】本発明のＡ断片の機能発現は、該配列によ
り発現される、下流に連結された蛋白質の活性等を測定
することにより確認することができる。下流に位置する
蛋白質としては、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、
セルラーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ等、通常菌体
外に分泌される酵素の構造遺伝子が挙げられ、該遺伝子
をＡ断片の直下流に連結することにより、その酵素活性
を指標にして、そのＡ断片の機能発現を測定することが
できる。以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例
によりさらに具体的に説明する。
り発現される、下流に連結された蛋白質の活性等を測定
することにより確認することができる。下流に位置する
蛋白質としては、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、
セルラーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ等、通常菌体
外に分泌される酵素の構造遺伝子が挙げられ、該遺伝子
をＡ断片の直下流に連結することにより、その酵素活性
を指標にして、そのＡ断片の機能発現を測定することが
できる。以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例
によりさらに具体的に説明する。
【００１２】
＜実施例１＞ 評価用プラスミドの作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミド
ｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラス
ミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。 （ａ−１）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA C
TG-3'（配列番号２） （ｂ−１）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号３） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
ｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラス
ミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。 （ａ−１）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA C
TG-3'（配列番号２） （ｂ−１）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号３） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００１３】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００１４】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００１５】上記で生成したＰＣＲ後の反応液１０μｌ
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液 １０μｌ、プ
ラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ １μｌを
各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に切断
し、７０℃で１０分間処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液 １０μｌ、プ
ラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ １μｌを
各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に切断
し、７０℃で１０分間処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００１６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００１７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ
断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認めら
れた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ
断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認めら
れた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００１８】米国特許５，１８５，２６２号明細書記載
のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌
内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成し
た。
のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌
内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成し
た。
【００１９】 （ａ−２）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-
3'（配列番号４） （ｂ−２）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号５） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
3'（配列番号４） （ｂ−２）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号５） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００２０】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００２１】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００２２】上記で生成したＰＣＲ後の反応液１０μｌ
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、プラ
スミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩお
よびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させる
ことにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ
4 ＤＮＡリガーゼ用１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で
１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、プラ
スミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩお
よびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させる
ことにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ
4 ＤＮＡリガーゼ用１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で
１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
【００２３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００２４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳ
ｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．
８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドを
ｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳ
ｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．
８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドを
ｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００２５】上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μ
ｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切
断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し、、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μ
ｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切
断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し、、滅菌蒸留水で１０μｌにし
て、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００２６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００２７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミ
ドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。 （Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミ
ドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。 （Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００２８】 （ａ−３）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC C
CC-3'（配列番号６） （ｂ−３）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC T
TT TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3'（配列番号７） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
CC-3'（配列番号６） （ｂ−３）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC T
TT TTA TCC GCT CACAAT TCC ACA CAT-3'（配列番号７） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００２９】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００３０】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３１】上記で生成したＰＣＲ後の反応液１０μｌ
を３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００
ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で増幅産
物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、上記（Ａ）
で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ
５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全
に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵
素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
を３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００
ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で増幅産
物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、上記（Ａ）
で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ
５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全
に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵
素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００３２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００３３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）作製の
プラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラス
ミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）作製の
プラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラス
ミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
【００３４】（Ｃ）アミラーゼ遺伝子の挿入 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｒｅｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓのアミラーゼ遺伝子の配列は決定されており［Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013(198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製のプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入
し、評価用プラスミドを作製した。下記の１対のプライ
マーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Bios
ystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー
（synthesizer ）」を用いて合成した。
ｓのアミラーゼ遺伝子の配列は決定されており［Journa
l of Biological Chemistry, 258, 1007-1013(198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製のプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入
し、評価用プラスミドを作製した。下記の１対のプライ
マーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Bios
ystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー
（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００３５】 （ａ−４）5'-TTT CAT ATG ATT CAA AAA CGA AAG-3'
（配列番号８） （ｂ−４）5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3'
（配列番号９） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
（配列番号８） （ｂ−４）5'-TTT GGA TCC TTA TTT CTG AAC ATA-3'
（配列番号９） 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レ
コンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・
タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）
（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００３６】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ２ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００３７】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３８】上記で生成したＰＣＲ後の反応液１０μｌ
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、上記
（Ｂ）で作製したプラスミド溶液５μｌを各々制限酵素
ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃１０
分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者
を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ用１０×緩衝液
１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添
加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反
応させ、結合させた。
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約
１．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気泳動で
増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μｌ、上記
（Ｂ）で作製したプラスミド溶液５μｌを各々制限酵素
ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃１０
分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者
を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ用１０×緩衝液
１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添
加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反
応させ、結合させた。
【００３９】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００４０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製の
プラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラス
ミドをｐＳｅｃ１と命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製の
プラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ
１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラス
ミドをｐＳｅｃ１と命名した。
【００４１】＜実施例２＞ Ａ断片の作成 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のシグナルペプチドの単離 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合
成培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4
７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ及びグルコース ２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌ
に前培養液を２％植菌し、３１℃で２０〜２４時間振と
うして定常期まで培養した。この培養液を遠心分離
（５，０００×ｇ、１０分間、１５〜２０℃）し培養上
清を集めた。
のシグナルペプチドの単離 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合
成培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4
７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ及びグルコース ２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌ
に前培養液を２％植菌し、３１℃で２０〜２４時間振と
うして定常期まで培養した。この培養液を遠心分離
（５，０００×ｇ、１０分間、１５〜２０℃）し培養上
清を集めた。
【００４２】得られた上清画分を、限外濾過装置（東洋
濾紙製”ＵＨＰ−４３Ｋ”、分画分子量２０，０００）
により濃縮後、緩衝液Ａ［組成：２００ｍＭ リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ ジチオレイ
トール(threo-1,4-dimercapto-2,3-butanediol)］で平
衡化された陰イオン交換カラム（ファルマシア社製Ｍｏ
ｎｏ-Ｑ、φ１×１０ｃｍ）にのせ、塩化カリウムの直
線濃度勾配（０〜１Ｍ）によって溶出し、精製画分とし
た。
濾紙製”ＵＨＰ−４３Ｋ”、分画分子量２０，０００）
により濃縮後、緩衝液Ａ［組成：２００ｍＭ リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ ジチオレイ
トール(threo-1,4-dimercapto-2,3-butanediol)］で平
衡化された陰イオン交換カラム（ファルマシア社製Ｍｏ
ｎｏ-Ｑ、φ１×１０ｃｍ）にのせ、塩化カリウムの直
線濃度勾配（０〜１Ｍ）によって溶出し、精製画分とし
た。
【００４３】この画分をポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、クマシーブルー色素液［組成：０．２％（ｗ
／ｖ）クマシーブリリアントブル−Ｒ２５０、４０％
（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸］により
染色したところ、ほぼ単一のバンドが検出された。その
Ｎ末端アミノ酸配列をアプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製「４７３Ａプロテインシー
ケンサー」を用いて決定した。決定したアミノ酸配列は
下記のとおりである。
動にかけ、クマシーブルー色素液［組成：０．２％（ｗ
／ｖ）クマシーブリリアントブル−Ｒ２５０、４０％
（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸］により
染色したところ、ほぼ単一のバンドが検出された。その
Ｎ末端アミノ酸配列をアプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製「４７３Ａプロテインシー
ケンサー」を用いて決定した。決定したアミノ酸配列は
下記のとおりである。
【００４４】Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Th
r Asn Gly Phe Asn Asp Ala AspGly Ser Thr （配列番
号１０） この決定された培養上清画分のＮ末端アミノ酸配列をも
とにオリゴＤＮＡプローブを、アプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザーを用いて合成した。
r Asn Gly Phe Asn Asp Ala AspGly Ser Thr （配列番
号１０） この決定された培養上清画分のＮ末端アミノ酸配列をも
とにオリゴＤＮＡプローブを、アプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）社製３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザーを用いて合成した。
【００４５】合成したＤＮＡプローブの配列は下記のと
おりである。 （ｃ−１）5'- CC(A/G) TCI GC(A/G) TC(A/G) TTI AAI
CC -3'（配列番号１１） このオリゴＤＮＡの５’末端をγ−ＡＴＰにより標識し
たもの（標識化は、宝酒造社製「メガラベルキット」を
使用）を用いて、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）染色体バンクをハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングし、遺伝子
を単離し、該プローブの上流領域の配列を決定した。
おりである。 （ｃ−１）5'- CC(A/G) TCI GC(A/G) TC(A/G) TTI AAI
CC -3'（配列番号１１） このオリゴＤＮＡの５’末端をγ−ＡＴＰにより標識し
たもの（標識化は、宝酒造社製「メガラベルキット」を
使用）を用いて、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）染色体バンクをハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングし、遺伝子
を単離し、該プローブの上流領域の配列を決定した。
【００４６】（Ｂ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の染色体バンクの作製 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を、半合成培地であるＡ培地［組
成：尿素２ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4
０．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミ
ノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μ
ｇおよびグルコース２０ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとす
る］１Ｌ中で対数増殖期後期まで培養した後に菌体を回
収した。
−２３３の染色体バンクの作製 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）を、半合成培地であるＡ培地［組
成：尿素２ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4
０．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミ
ノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μ
ｇおよびグルコース２０ｇを蒸留水に溶解して１Ｌとす
る］１Ｌ中で対数増殖期後期まで培養した後に菌体を回
収した。
【００４７】得られた菌体をリゾチームを１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテ
ナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、これ
を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得
られた溶菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加して室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量
を１０〜１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離
に供し、その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸
ナトリウムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、
次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取
り、これを７０％エタノールで洗浄して風乾した。得ら
れたＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを
加えて４℃で一晩静置した後、実験に供した。
ｌの濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテ
ナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、これ
を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得
られた溶菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加して室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量
を１０〜１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離
に供し、その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸
ナトリウムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、
次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取
り、これを７０％エタノールで洗浄して風乾した。得ら
れたＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを
加えて４℃で一晩静置した後、実験に供した。
【００４８】上記で抽出した染色体ＤＮＡ ＥｃｏＲＩ
完全分解物 １０μｇ、λＺＡＰＩＩファージＤＮＡ
ＥｃｏＲＩ分解物１μｇ（ＴＯＹＯＢＯ社製） を用い
て、添付のプロトコールに従い、遺伝子ライブラリーλ
ＺＡＰＩＩファージ溶液を作製した。０．２％ マルト
ース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を添加したＬＢ培養液に、
エシエリヒア・コリＰ２３２９株を植菌し、３７℃で培
養した。そして遺伝子ライブラリーλＺＡＰＩＩファー
ジ溶液４００μｌにＰ２３２９培養液を混合し、３７
℃，１５分間培養した。次に４ｍｌのλトップアガー
（５０℃保温）を加え、λプレートに均一になるように
撒いて、３７℃で一晩培養した。
完全分解物 １０μｇ、λＺＡＰＩＩファージＤＮＡ
ＥｃｏＲＩ分解物１μｇ（ＴＯＹＯＢＯ社製） を用い
て、添付のプロトコールに従い、遺伝子ライブラリーλ
ＺＡＰＩＩファージ溶液を作製した。０．２％ マルト
ース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を添加したＬＢ培養液に、
エシエリヒア・コリＰ２３２９株を植菌し、３７℃で培
養した。そして遺伝子ライブラリーλＺＡＰＩＩファー
ジ溶液４００μｌにＰ２３２９培養液を混合し、３７
℃，１５分間培養した。次に４ｍｌのλトップアガー
（５０℃保温）を加え、λプレートに均一になるように
撒いて、３７℃で一晩培養した。
【００４９】ニトロセルロースフィルターをλプレート
上に空気が入らないように静かに置いて、予めフィルタ
ーに書いた目印の点をプレートに写した。フィルターを
剥がし、吸着面を上にして、以下の混合溶液１〜３それ
ぞれに浸した濾紙上に置き、順次５分間処理した（溶液
１：［０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ］、溶
液２：［１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５），０．７５
Ｍ ＮａＣｌ］、溶液３：２×ＳＳＣ）。フィルターを
乾燥させた後、８０℃で３０分間加熱してフィルターへ
ＤＮＡを固定化した。
上に空気が入らないように静かに置いて、予めフィルタ
ーに書いた目印の点をプレートに写した。フィルターを
剥がし、吸着面を上にして、以下の混合溶液１〜３それ
ぞれに浸した濾紙上に置き、順次５分間処理した（溶液
１：［０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ］、溶
液２：［１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５），０．７５
Ｍ ＮａＣｌ］、溶液３：２×ＳＳＣ）。フィルターを
乾燥させた後、８０℃で３０分間加熱してフィルターへ
ＤＮＡを固定化した。
【００５０】フィルターを混合溶液［SALMON TESTES DN
A For Hybridization（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍｌを
５×ＳＳＰＥ，１×デンハルト溶液および５０％ホルム
アミドで希釈し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにしたも
の］にて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーション
を行った。２０×ＳＳＰＥの組成は、３．６Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4および０．０２Ｍ ＥＤＴＡ
である。上記で調製したプローブを加え、４２℃で一晩
ハイブリダイゼーションを行った。
A For Hybridization（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍｌを
５×ＳＳＰＥ，１×デンハルト溶液および５０％ホルム
アミドで希釈し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにしたも
の］にて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーション
を行った。２０×ＳＳＰＥの組成は、３．６Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4および０．０２Ｍ ＥＤＴＡ
である。上記で調製したプローブを加え、４２℃で一晩
ハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】フィルターを混合溶液［５×ＳＳＰＥ、１
×デンハルト溶液および５０％ホルムアミド］中、４２
℃で１５分間緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフ
ィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム混合溶液中、４２℃で１５分間緩やかに振盪させな
がら洗浄した。フィルターを風乾した後、オートラジオ
グラフィーを行った。読みとりは、富士写真フィルム社
製バイオイメージングアナライザーＢＡＳ−２０００を
用いた。
×デンハルト溶液および５０％ホルムアミド］中、４２
℃で１５分間緩やかに振盪させながら洗浄した。次にフ
ィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム混合溶液中、４２℃で１５分間緩やかに振盪させな
がら洗浄した。フィルターを風乾した後、オートラジオ
グラフィーを行った。読みとりは、富士写真フィルム社
製バイオイメージングアナライザーＢＡＳ−２０００を
用いた。
【００５２】目的プラークのソフトアガロースを砕い
て、２００μｌのＳＭ緩衝液に懸濁した。上記溶液１０
μｌを、３７℃で３〜４時間培養したエシエリヒア・コ
リＰ２３２９株３００μｌと混合し、トップアガロース
を加えてλプレートに撒いた。３７℃で一晩培養し、プ
ラークを形成させた。このλプレートに４ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、トップアガロースを掻き取って、４℃で１
時間穏やかに振盪した。トップアガロースを混入させな
いよう、上澄みを新しいチューブに移し、クロロホルム
を数滴加えた。そして５，０００ｒｐｍで５分間遠心
し、上澄みを得た。さらにＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ
（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間保
温した。等量の２０％ポリエチレングリコール（平均分
子量６，０００）−２Ｍ ＮａＣｌを加え、氷上で１時
間放置した後、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠
心後、上澄みを完全に除去した。２５０μｌのトリス−
ＥＤＴＡ緩衝液を加えて懸濁し、５μｌの１０％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを加え、６８℃で５分間加熱後、１０
μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、等量のフェノール・クロ
ロホルムを加え、よく懸濁した。１２，０００ｒｐｍで
１０分間遠心し、水層を新しいチューブに移した。イソ
プロパノール沈殿後、７０％エタノール洗浄・乾燥さ
せ、５０μｌのトリス−塩酸緩衝液に懸濁した。
て、２００μｌのＳＭ緩衝液に懸濁した。上記溶液１０
μｌを、３７℃で３〜４時間培養したエシエリヒア・コ
リＰ２３２９株３００μｌと混合し、トップアガロース
を加えてλプレートに撒いた。３７℃で一晩培養し、プ
ラークを形成させた。このλプレートに４ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、トップアガロースを掻き取って、４℃で１
時間穏やかに振盪した。トップアガロースを混入させな
いよう、上澄みを新しいチューブに移し、クロロホルム
を数滴加えた。そして５，０００ｒｐｍで５分間遠心
し、上澄みを得た。さらにＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ
（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間保
温した。等量の２０％ポリエチレングリコール（平均分
子量６，０００）−２Ｍ ＮａＣｌを加え、氷上で１時
間放置した後、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠
心後、上澄みを完全に除去した。２５０μｌのトリス−
ＥＤＴＡ緩衝液を加えて懸濁し、５μｌの１０％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを加え、６８℃で５分間加熱後、１０
μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、等量のフェノール・クロ
ロホルムを加え、よく懸濁した。１２，０００ｒｐｍで
１０分間遠心し、水層を新しいチューブに移した。イソ
プロパノール沈殿後、７０％エタノール洗浄・乾燥さ
せ、５０μｌのトリス−塩酸緩衝液に懸濁した。
【００５３】以上の操作で得られたλＺＡＰＩＩ ＤＮ
Ａに挿入された約３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を配列決
定用の鋳型として使用した。使用したオリゴプライマー
は上記に記載したｃ−１（配列番号１１）を使用した。
決定したＤＮＡ塩基配列のＯＲＦのアミノ酸配列と、培
養上清中に検出された蛋白質のＮ末端アミノ酸配列（配
列番号１０）とを比較することにより、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３由来のシグナルペプチドの
アミノ酸配列を見いだした。見いだしたシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
Ａに挿入された約３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を配列決
定用の鋳型として使用した。使用したオリゴプライマー
は上記に記載したｃ−１（配列番号１１）を使用した。
決定したＤＮＡ塩基配列のＯＲＦのアミノ酸配列と、培
養上清中に検出された蛋白質のＮ末端アミノ酸配列（配
列番号１０）とを比較することにより、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３由来のシグナルペプチドの
アミノ酸配列を見いだした。見いだしたシグナルペプチ
ドのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００５４】（Ｃ）Ａ断片の合成 決定した配列に基づき、Ａ断片をアプライド・バイオシ
ステムズ(Applied Biosystems)社製「３９４ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー」を用いて合成した。単離した遺伝
子上流の配列に基づいて合成した配列（配列番号１２に
記載の塩基配列） （ｄ−１） 5'- TTT CAT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GTT GCT ATC CCA GCA TTC GCT GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG -3' 次に、Ａ断片の疎水性を変化させるような変異を導入し
たＡ断片を合成した。変異を導入した配列（配列番号１
３に記載の塩基配列） （ｅ−１）5'- TTT CAT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GCC GCT ATC CCA GCA TTC GCT GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG -3'
ステムズ(Applied Biosystems)社製「３９４ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー」を用いて合成した。単離した遺伝
子上流の配列に基づいて合成した配列（配列番号１２に
記載の塩基配列） （ｄ−１） 5'- TTT CAT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GTT GCT ATC CCA GCA TTC GCT GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG -3' 次に、Ａ断片の疎水性を変化させるような変異を導入し
たＡ断片を合成した。変異を導入した配列（配列番号１
３に記載の塩基配列） （ｅ−１）5'- TTT CAT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GCC GCT ATC CCA GCA TTC GCT GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG -3'
【００５５】（Ｄ）Ａ断片の評価用プラスミドへの導入 上記、ｄ−１およびｅ−１プライマーを用いて、アミラ
ーゼ遺伝子本来のシグナルペプチドをＡ断片に置換した
アミラーゼ遺伝子断片をＰＣＲにより作製した。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のｄ−１もしくはｅ−１，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
ーゼ遺伝子本来のシグナルペプチドをＡ断片に置換した
アミラーゼ遺伝子断片をＰＣＲにより作製した。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のｄ−１もしくはｅ−１，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
【００５６】以上を混合し、この１００μｌの反応液を
ＰＣＲにかけた。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
ＰＣＲにかけた。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００５７】上記で生成したＰＣＲ後の反応液１０μｌ
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、各
々、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気
泳動で増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μ
ｌ、および実施例１（Ｂ）で作製したプラスミド（ｐＨ
ＳＧ２９８ｔａｃ） ５μｌを各々制限酵素ＮｄｅＩお
よびＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させ
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌
蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結
合させた。
を０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、各
々、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。上記電気
泳動で増幅産物を確認できたＰＣＲ反応終了液１０μ
ｌ、および実施例１（Ｂ）で作製したプラスミド（ｐＨ
ＳＧ２９８ｔａｃ） ５μｌを各々制限酵素ＮｄｅＩお
よびＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させ
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ用１０×緩衝液 １μｌ、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌
蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結
合させた。
【００５８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを
含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラク
ト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１
Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００５９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記実施例１
（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片
に加え、長さ１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。これらのプラスミドを各々、ｐＳｅｃ２、ｐＳｅｃ
３と命名した。 （Ｅ）Ａ断片の評価 実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドを米国特許５，１
８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９８）に導入した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）により切断
し、挿入断片を確認した。この結果、上記実施例１
（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片
に加え、長さ１．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。これらのプラスミドを各々、ｐＳｅｃ２、ｐＳｅｃ
３と命名した。 （Ｅ）Ａ断片の評価 実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドを米国特許５，１
８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９８）に導入した。
【００６０】形質転換されたブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ及びグルコース ２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌ
に前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうした後
に集菌し、アミラーゼ活性測定用培養液とした。
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２. ５
ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チ
アミン ２００μｇ及びグルコース ２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌ
に前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうした後
に集菌し、アミラーゼ活性測定用培養液とした。
【００６１】アミラーゼ活性の測定は市販のアミラーゼ
活性測定キット［アミラーゼ Ｂ−テストワコー（和光
純薬社製）］添付のプロトコールに従って行った。その
結果を以下に示す。
活性測定キット［アミラーゼ Ｂ−テストワコー（和光
純薬社製）］添付のプロトコールに従って行った。その
結果を以下に示す。
【００６２】
【表１】 ──────────────── プラスミド 酵素活性 ──────────────── ｐＳｅｃ１ ２ｕｎｉｔ ｐＳｅｃ２ ２９ｕｎｉｔ ｐＳｅｃ３ ３００ｕｎｉｔ ────────────────
【００６３】アミラーゼ活性測定の結果、ｐＳｅｃ１、
ｐＳｅｃ２を導入した菌体に比較して、ｐＳｅｃ３を導
入した菌体の培養上清中の活性は、各々約１００倍、約
１０倍に上昇しており、配列表１記載のＡ断片の活性が
著しく高いことを確認した。
ｐＳｅｃ２を導入した菌体に比較して、ｐＳｅｃ３を導
入した菌体の培養上清中の活性は、各々約１００倍、約
１０倍に上昇しており、配列表１記載のＡ断片の活性が
著しく高いことを確認した。
【００６４】
【発明の効果】コリネ型細菌由来の、所定の蛋白質を培
地中へ効率よく分泌させるために必要なアミノ酸をコー
ドするＤＮＡ配列が提供され、所定の蛋白質を培地中へ
効率よく分泌生産させる系の構築、製造法の確立が可能
となった。
地中へ効率よく分泌させるために必要なアミノ酸をコー
ドするＤＮＡ配列が提供され、所定の蛋白質を培地中へ
効率よく分泌生産させる系の構築、製造法の確立が可能
となった。
【００６５】
配列番号：１ 配列の長さ：９０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum ） 株名：ＭＪ−２３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA 48 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 5 10 15 ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GCC GCT ATC CCA GCA TTC GCT 90 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Ala Ala Ile Pro Ala Phe Ala 20 25 30
um flavum ） 株名：ＭＪ−２３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA 48 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 5 10 15 ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GCC GCT ATC CCA GCA TTC GCT 90 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Ala Ala Ile Pro Ala Phe Ala 20 25 30
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：２７ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：２７ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：５４ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：２４ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTCATATGA TTCAAAAACG AAAG 24
【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTGGATCCT TATTTCTGAA CATA 24
【００７４】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド トポロジー：直鎖状 配列 Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Thr Asn Gly Phe Asn Asp Ala 1 5 10 15 Asp Gly Ser Thr 20
【００７５】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 CCRTCNGCRT CRTTNAANCC 20 Nはイノシンを表す。
【００７６】配列番号：１２ 配列の長さ：９６ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTCAT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT GCT GGT GCA ATC GCA 54 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 5 10 15 ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GTT GCT ATC CCA GCA TTC GCT GTAAATGGCA 106 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala 20 25 30 CGCTGATGCA G 117
【００７７】配列番号：１３ 配列の長さ：９６ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 配列 TTTCATATGT TTAACAACCG TATCCGCACT GCAGCTCTTG CTGGTGCAAT CGCAATCTCC 60 ACCGCAGCTT CCGGCGCCGC TATCCCAGCA TTCGCTGTAA ATGGCACGCT GATGCAG 117
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
を有するシグナルペプチド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
する請求項１記載のシグナルペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8131762A JPH09316095A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 新規シグナルペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8131762A JPH09316095A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 新規シグナルペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09316095A true JPH09316095A (ja) | 1997-12-09 |
Family
ID=15065585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8131762A Pending JPH09316095A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 新規シグナルペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09316095A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023591A1 (fr) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé de production de transglutaminase |
| JP2006521802A (ja) | 2003-03-13 | 2006-09-28 | サートル ナショナル デ ラ レセルシュ シャティフィク（セアンアールエス） | 鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用 |
| WO2011105344A1 (ja) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | 東レ株式会社 | カダベリンの製造方法 |
-
1996
- 1996-05-27 JP JP8131762A patent/JPH09316095A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023591A1 (fr) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé de production de transglutaminase |
| US7723067B2 (en) | 1999-09-30 | 2010-05-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing transglutaminase |
| US7972829B2 (en) | 1999-09-30 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing transglutaminase |
| JP2006521802A (ja) | 2003-03-13 | 2006-09-28 | サートル ナショナル デ ラ レセルシュ シャティフィク（セアンアールエス） | 鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用 |
| WO2011105344A1 (ja) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | 東レ株式会社 | カダベリンの製造方法 |
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