JP2003514582A - テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド、およびその生成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有する酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子の相同および異種発現、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有する酵素の調製法、およびヒドロキシル化テトラヒドロピリミジンのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ生成でのこれら酵素の使用に関する。さらに、本発明は、本発明の方法の１つによって調製されたヒドロキシル化テトラヒドロピリミジンの生物工学的使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有する酵素、それ
をコードする遺伝子、その遺伝子の相同および異種発現、テトラヒドロピリミジ
ンジオキシゲナーゼ活性を有する酵素の調製法、およびヒドロキシル化テトラヒ
ドロピリミジンのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ生成でのこれら酵素の
使用に関する。さらに、本発明は、本発明の方法の１つによって調製されたヒド
ロキシル化テトラヒドロピリミジンの生物工学的使用に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】

浸透圧ストレス後、微生物は、浸透圧調節物質と呼ばれる低分子量の細胞内化
合物を生成し、これにはテトラヒドロピリミジンが含まれる。テトラヒドロピリ
ミジンであるＴＨＰ（Ｂ）（２−メチル−４−カルボキシ−３，４，５，６−テ
トラヒドロピリミジン）およびＴＨＰ（Ａ）（２−メチル−４−カルボキシ−５
−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン）は、原形質の細胞内
成分として種々の微生物によって生成される（Ｖｅｎｔｏｓａ， Ａ．ら、１９
９８、「中等度好塩性好気性菌」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ
． Ｒｅｖ．、６２、５０４〜５４４）（図１）。これらの微生物には、好塩性
真正細菌、放線菌、バチルス類、およびブレビバクテリウムが含まれる。ＴＨＰ
をこれらの生物から純粋な形態で単離し、生物工学的に種々の形態（例えば、そ
の溶液および凍結乾燥の両方におけるタンパク質の安定化（Ｌｉｐｐｅｒｔ，
Ｋ． ａｎｄ Ｇａｌｉｎｓｋｉ． Ｅ．Ａ．、１９９２、「エクトイン型適合
溶質：加熱、凍結、および乾燥からの保護」、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
． Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．、３７、６１〜６５）、タンパク質および核酸の相互
作用への影響（Ｌａｐｉｄｏｔ， Ａ．ら、１９９５、「テトラヒドロピリミジ
ン誘導体はＴａｔ様アルギニン含有ペプチドのＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡへのｉｎ
ｖｉｔｒｏ結合を阻害する」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３６７、３３〜３８；
Ｍａｌｉｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｌａｐｉｄｏｔ，Ａ．、１９９６、「Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ株におけるテトラヒドロピリミジン誘導体合成の融合および浸透圧お
よび熱ストレスへの反応についてのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対する
影響」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８、３８５〜３９５、Ｍａｌｉｎ，
Ｇ．ら、１９９９、「タンパク質−核酸相互作用に対するテトラヒドロピリミジ
ン誘導体の影響：モデル系としての１１型制限エンドヌクレアーゼ」、Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４、６９２０〜６９２９）、および変性タンパク質
の再折りたたみなど）で使用することができる。さらに、種々の原核生物（例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）の培養培地へのＴＨＰ（Ａ）またはＴＨＰ（Ｂ）の添加
により、塩および熱耐性の増加が認められた（Ｍａｌｉｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｌａｐ
ｉｄｏｔ， Ａ．、１９９６、「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株におけるテトラヒ
ドロピリミジン誘導体合成の誘導および浸透圧および熱ストレスに対する反応に
おけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対するその効果」、Ｊ． Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．、１７８、３８５〜３９５）。

【０００３】 図１で特徴付けられたＴＨＰ（Ａ）生合成経路は、Ｌ−アスパラギン酸βセミ
アルデヒドから開始される。その後のアミノ基転移反応では、Ｌ−２，４−ジア
ミノ−酪酸トランスアミナーゼがＬ−２，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢＡ）の形成
を触媒する。ＤＡＢＡのその後のＮアセチル化は、アセチル補酵素Ａを使用した
Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼによって行われる。Ｎ−
アセチル−γ−Ｌ，２，４−ジアミノ酪酸シクラーゼによる細胞内縮合反応によ
り、ＴＨＰ（Ｂ）が得られる（Ｐｅｔｅｒｓ， Ｐ．ら、１９９０、「エクトイ
ンの生合成」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．、７１、１５７〜
１６２；Ｏｎｏ， Ｈ．ら、１９９９、「中等度好塩性真正細菌Ｈａｌｏｍｏｎ
ａｓ ｅｌｏｎｇａｔａの適合性溶質としてのエクトインの生合成酵素の特徴付
け」、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、９１〜９９）。対照的に、ＴＨＰ
（Ｂ）の５−ヒドロキシ誘導体（ＴＨＰ（Ａ））の生合成工程は未だ説明されて
いない。

【０００４】 当該分野で公知の処理工程によるＴＨＰの調製は、細胞またはＴＨＰ（Ａ）お
よび／またはＴＨＰ（Ｂ）を生成する細菌由来の培養濾過物由来のこれらの化合
物の複雑な抽出に制限される。これらの処理工程は、培養培地の高塩濃度のため
に費用がかかる。

【０００５】 ＴＨＰの化学合成が可能であるにもかかわらず、この合成には、多数の合成工
程および複雑な保護基技術の使用が含まれるので、この複雑な処理工程を特に大
規模で工程経済的に行うことがきでない。各前駆物質を化学的経路によって得る
ことができず、その結果ＴＨＰ（Ａ）の化学合成を困難にしているので、これは
特にＴＨＰ（Ａ）の合成に関する。

【０００６】 したがって、本発明の目的は、ヒドロキシル化ＴＨＰ、特にＴＨＰ（Ａ）の改
良された調製処理工程を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】

テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを使用す
る処理工程を提供することにより本発明の目的を達成する。

【０００８】 したがって、本発明の一方の態様は、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に関する。これらの核酸配列
は、ＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列の両方を含み、 （ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸配列と、 （ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列から由来の遺伝コードの縮重の結果
として由来するＤＮＡ核酸配列と、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ核酸配列を有する少なくとも１つのＤ
ＮＡ核酸配列とハイブリッド形成するＤＮＡ核酸配列と、 （ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸配列のフラグメ
ント、対立遺伝子、または他の変異型であるＤＮＡ核酸配列と、 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載のＤＮＡ核酸配列由来のＲＮＡ核酸配列と、 （ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載の配列の１つと６０％を超える相同性を有する核酸
配列から選択される。

【０００９】 テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ核酸配列は、ゲノムＤＮＡ核酸配列およびｃＤＮＡ核酸配列の両方を
意味する。（ｆ）に記載の核酸配列と（ａ）〜（ｅ）に記載の配列の１つとの相
同性は少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％を超える。

【００１０】 本発明のさらなる態様は、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有
し、好ましくは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の
核酸配列の１つによってコードされるポリペプチドに関する。配列番号１に記載
のＤＮＡ核酸配列によってコードされるポリペプチド（配列番号６）が特に好ま
しい。

【００１１】 他方の態様において、本発明は、古細菌、原核生物、または真核生物から単離
されている（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載のＤＮ
ＡまたはＲＮＡ核酸配列に関する。好塩性真正細菌、放線菌、バチルス、または
ブレビバクテリウムから単離されている核酸配列が特に好ましい。

【００１２】 同様に、プロモーター配列および（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）ま
たは（ｆ）に記載の核酸配列からなる有効単位を含む核酸構築物が好ましい。

【００１３】 同様に、プロモーター配列および（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）ま
たは（ｆ）に記載の核酸配列からなり、１つまたは複数の分泌シグナルをコード
する核酸配列をさらに含む有効単位を含む核酸構築物が好ましい。

【００１４】 さらなる態様において、本発明は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
または（ｆ）に記載の核酸配列を含む複製組換えベクターに関する。

【００１５】 本発明はさらに、細胞で自律複製し、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）または（ｆ）に記載の核酸配列を含むベクターを含む細胞に関する。この細胞
が細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞であることが特に好ましい。

【００１６】 好ましい細胞は、非天然組換えによってゲノムに組み込まれた（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の核酸配列を有する。非天然組換
えが細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞のゲノム中で起こる細胞が特に好まし
い。

【００１７】 別の態様では、本発明は、遺伝子同定用の核酸プローブとしてのオリゴヌクレ
オチドの使用に関し、前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を、（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の核酸配列の配列に由来し
、オリゴヌクレオチドを、古細菌、原核生物、または真核生物に存在し、テトラ
ヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする染色
体遺伝子または染色体外遺伝子の同定に使用する。

【００１８】 本発明はまた、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え
ＤＮＡで形質転換された植物に関する。このような植物を、浸透圧耐性の増加に
よって識別する。

【００１９】 本発明はさらに、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリ
ペプチドの単離におけるテトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有する
ポリペプチドの調製法、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）
に記載の核酸配列または上記核酸構築物を有する核酸の一部を含む細胞の培養に
関する。

【００２０】 ポリペプチドの単離に使用した方法は、当業者に公知の様式で、調製で使用さ
れる細胞が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の核酸
配列、または上記型の核酸構築物を有する核酸の一部を含むかどうかに依存する
。第１の可能性として、細胞の破壊進行後のみに調製ポリペプチドを単離するこ
とができるか、第２の可能性として、細胞が分泌シグナルを含む核酸構築物を含
む場合、培養培地から調製ポリペプチドを直接単離することが可能である。

【００２１】 本発明の他方の態様は、ヒドロキシル化テトラヒドロピリミジン調製用のテト
ラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する
。

【００２２】 生細胞におけるテトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペ
プチドの補助によって調製を行うことが好ましく、生細胞は細菌細胞、酵母細胞
、または植物細胞である。テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有す
るポリペプチドを含む生細胞は、テトラヒドロピリミジンを含む培養培地に存在
し得る。この場合、生細胞は、好ましくはテトラヒドロピリミジンジオキシゲナ
ーゼ活性と有するポリペプチドとテトラヒドロピリミジンとの間の接触を支持す
るように調製前に浸透化処理されるべきである。

【００２３】

【発明の実施の形態】

本発明の好ましい実施形態を以下に記載するが、これは本発明者が所望する保
護の限定を推測することができないような方法で理解されることを意図しない。

【００２４】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓのＴＨＰ生合成遺伝子
を見出すために、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ由来のＴＨＰ生合成酵素）を
精製した。オリゴヌクレオチド配列は、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸アセチルトラ
ンスフェラーゼのトリプシンペプチド配列由来であり、コスミドバンクのスクリ
ーニングに使用した。Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ遺
伝子および隣接配列を配列決定した。特に、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメン
ト上に８．７ｋｂのサイズで４つの読取枠を見出した。ＴＨＰ生合成酵素をコー
ドするこれらの遺伝子を以後ｔｈｐＡ、ｔｈｐＢ、ｔｈｐＣおよびｔｈｐＤとい
う（図２）。読み取り枠を、ＴＨＰ（Ｂ）ジオキシゲナーゼ活性を有し、分子量
３２．１ｋＤａの酵素をコードするｔｈｐＤという。この酵素は、ＴＨＰ（Ｂ）
〜ＴＨＰ（Ａ）の不可逆性ヒドロキシル化を触媒するαケトグルタミン酸依存性
ジオキシゲナーゼである。ｔｈｐＤ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓで発現され、対応するタンパク質（ＴＨＰ（Ｄ））を当該分野で公知
の方法によって精製した。

【００２５】 相同性または異種発現ＴＨＰ（Ｄ）タンパク質の使用により、ＴＨＰ（Ａ）の
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生成が可能である。ＴＨＰ（Ｂ）、αケトグルタミン酸、アス
コルビン酸、硫酸鉄（ＩＩ）、およびカタラーゼの存在下でのＴＨＰ（Ｄ）のイ
ンキュベーションにより、ＴＨＰ（Ｂ）のＴＨＰ（Ａ）への完全なヒドロキシル
化が認められる。

【００２６】 テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼをコードする遺伝子には、８．７ｋ
ｂのサイズでＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに存在する。微生物中のこの
ＤＮＡフラグメント上に存在するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａ
ｌｌｕｓ遺伝子の発現により、ヒドロキシル化テトラヒドロピリミジンを合成可
能である。

【００２７】 ＴＨＰ（Ｂ）を生成する微生物中のｔｈｐＤ遺伝子の発現は、テトラヒドロピ
リミジン（ＴＨＰ（Ａ））の５−ヒドロキシ誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ生成を可能
にする。

【００２８】 この処理工程を、ＴＨＰジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する核酸配列を有する限り、多数の微生物（例えば、放線菌、バチルス、または
好塩性細菌など）に適用することができる。但し、任意の他の原核生物または真
核生物発現系でさらに発現することが可能である。

【００２９】

【実施例】

本発明を、以下の実施例によってより詳細に説明する。

【００３０】 実施例１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓからのＬ−
２，４−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの検出。

【００３１】 ヌクレオチド配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ
から先に精製したＬ−２，４−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの内部
ペプチド配列に由来していた（図３）。このヌクレオチド配列を放射性標識し、
コスミドバンクのスクリーニング用のプローブとして使用した。対応するコスミ
ドの一部をサブクローニングおよび配列決定した。特に、４つの読み取り枠（Ｌ
−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードするｔｈｐＡ、Ｌ−アスパ
ラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドトランスアミナーゼをコードするｔｈｐＢ、Ｎ−
アセチル−γ−Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸シクラーゼをコードするｔｈｐＣ、お
よびＴＨＰ（Ｂ）ジオキシゲナーゼをコードするｔｈｐＤ（図２））を見出した
。他の微生物における発現が可能であり、生物例としてＳｔｒｅｐｔｏｍｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓを使用する（実施例２参照）。

【００３２】 実施例２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのｔｈｐＤの発現。

【００３３】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのｔｈｐＤの発現のために、Ｓ
ｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして発現ベクターｐＳＰＩＪ００２にｔ
ｈｐＤ遺伝子をクローン化した（図５）。得られた発現プラスミドをｐＳＰＩＪ
ｔｈｐＤと呼んだ。ＰＣＲ変異誘発（３５サイクル：９５℃で１分、５５℃で９
０秒、７２℃で６５秒、プライマーについては表１参照）によってＳｐｈＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ制限切断部位を導入した。ＰＣＲのテンプレートとしてプラス
ミドｐＱＥ３０ｔｈｐＤを使用した。このプラスミドは、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ＰＣＲフラグメントとしてｔｈｐＤを含むｐＱＥ３０誘導体である（３
５サイクル：９５℃で１分、５５℃で９０秒、７２℃で６５秒、プライマーにつ
いては表１参照）。表１に記載の配列番号２〜５のプライマーを使用した。標準
的な方法によってライゲーションおよび形質転換を行った。

【００３４】 実施例３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｓからのヘキサ−Ｈｉｓ
−ＴＨＰ（Ｄ）の精製。

【００３５】 ＹＥＭＥ培地（３４０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／ｌグルコース、３ｇ／ｌ酵
母抽出物、３ｇ／ｌ麦芽抽出物、５ｇ／ｌバクトペプトン、および０．２％Ｍｇ
Ｃｌ₂）をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｓ株（ｐＳＰＩＪｔｈｐＤ
で形質転換、実施例２を参照のこと）の継代培養からＯＤ₆₀₀０．０５までイン
キュベートし、２８℃の震盪器でインキュベートした。７２時間後に細胞を回収
した。細胞を破壊緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０％グリ
セロール、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭイミダゾール、
および３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、フレンチプレス（１６０００ｐｓ
ｉ、１．１０５×１０⁸Ｐａに相当）に細胞を２回通過させて細胞を破壊した。
無細胞粗抽出物をＳＳ３４ローター中、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し
た。無細胞上清をＮｉ−ＮＴＡマトリクス上でクロマトグラフ分析を行った。ヘ
キサ−Ｈｉｓ−ＴＨＰ（Ｄ）タンパク質が３０〜１００ｍＭイミダゾールの範囲
で溶出される。

【００３６】 実施例４：２−メチル−４−カルボキシ−５−ヒドロキシ−３，４，５，６−
テトラヒドロピリミジン（ＴＨＰ（Ａ））のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成。

【００３７】 ＴＨＰ（Ｂ）ジオキシゲナーゼ活性を以下の反応混合物を使用して同定する。 リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＴＨＰ（Ｂ） ５ｍＭ αケトグルタル酸 ５ｍＭ アスコルビン酸 ５ｍＭ 硫酸鉄（ＩＩ） １ｍＭ ヘキサ−Ｈｉｓ−ＴＨＰ（Ｄ）（全体積１００μｌで変化する） ３０℃で１時間インキュベートする。生成物をＮＨ₂−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ
ＨＰＬＣカラムでのクロマトグラフィーによって分析する。７０％アセトニトリ
ル／Ｈ₂Ｏで溶出した。溶出プロフィールを図４に示す。カタラーゼ（ウシ肝臓
、Ｓｉｇｍａ）を使用してＴＨＰ（Ｂ）をＴＨＰ（Ａ）に完全にヒドロキシル化
することができる。 （表１） プラスミドｐＱＥ３０ｔｈｐＤおよびｐＳＰＩＪｔｈｐＤの構築に使用したＰ
ＣＲプライマー ＰＱＥ３０ｔｈｐＤ ＦＴＨＰＤ（３０量体） ５’−ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡＡ
ＧＴＡ ＣＧＣ−３’ （配列番号２） ＲＴＨＰＤ（２７量体） ５’−ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＴＣ
ＡＣＣ−３’ （配列番号３） ＰＳＰＩＪｔｈｐＤ ＦＳＰＩＪｔｈｐ（３０量体） ５’−ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＧＧＡ
ＴＣＧ ＣＡＴ−３’ （配列番号４） ＲＳＰＩＪｔｈｐ（２５量体） ５’−ＡＧＴ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＣＴ
Ｔ−３’ （配列番号５）

【００３８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌアスパラギン酸βセミアルデヒドから開始するＴＨＰ（Ｂ）の生合成を示す
図である。Ａ：Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸トランスフェラーゼ、Ｂ：Ｌ−２，４
−ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｃ：Ｎ−アセチル−ジアミノ酪酸
シクラーゼ。

【図２】 配列決定領域の制限地図および見出されたＴＨＰ生合成遺伝子の位置を示す図
である。対応する塩基の位置を、制限酵素の下に示す。

【図３】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ由来のＤＡＢＡアセチ
ルトランスフェラーゼの内部トリプシンペプチド配列およびこの配列由来のオリ
ゴヌクレオチド配列（１７０４９８Ａおよび１７０４９８Ｂ）を示す図である。

【図４】 ＮＨ₂−ＮｕｃｌｅｏｓｉｌカラムでのＴＨＰ（Ａ）およびＴＨＰ（Ｂ）のＨ
ＰＬＣを示す図である。５ｍＭのＴＨＰ（Ｂ）、５ｍＭのαケトグルタル酸、５
ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭのＦｅＳＯ₄、および２ｍｇ／ｍｌのＴＨＰ（Ｄ）
融合タンパク質（Ａ）または緩衝液Ｄ（Ｂ）を含む反応混合物の１／１０をロー
ドした。１ｍｌ／分の流速で７０％アセトニトリルを溶出した。

【図５】 ｐＳＰＩＪ００２（ｐＳＰ７２（ＢｇｌＩＩ）およびｐＩＪ７０２（ＢｇｌＩ
Ｉ）のライゲーションによって作製したシャトルベクター）。この発現ベクター
をＥ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの両方に使用することができる
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA08 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B063 QA01 QQ23 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AE48 CA04 CA19 CC24 DA16 4B065 AA50X AA50Y AB01 AC14 BA02 CA18 CA28

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸配列がテトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードし、以下の核酸配列群： （ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸配列と、 （ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列から、遺伝コードの縮重の結果とし
   て由来するＤＮＡ核酸配列と、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ核酸配列を有する少なくとも１つのＤ
   ＮＡ核酸配列とハイブリッド形成するＤＮＡ核酸配列と、 （ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸配列のフラグメ
   ント、対立遺伝子、または他の変異型であるＤＮＡ核酸配列と、 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載のＤＮＡ核酸配列から由来のＲＮＡ核酸配列と、 （ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載の配列の１つと６０％を超える相同性を有する核酸
   配列とから選択される核酸配列。
2. 【請求項２】 核酸配列が、ゲノムＤＮＡ核酸配列またはｃＤＮＡ核酸配列
   である、請求項１に記載の核酸配列。
3. 【請求項３】 核酸配列が、古細菌、原核生物、または真核生物から単離さ
   れている、請求項１または２のいずれかに記載の核酸配列。
4. 【請求項４】 核酸配列が、好塩性真正細菌、放線菌、バチルス、またはブ
   レビバクテリウムから単離されている、請求項３に記載の核酸配列。
5. 【請求項５】 プロモーター配列、および請求項１または２のいずれかに記
   載の核酸配列を有効単位で含む、核酸構築物。
6. 【請求項６】 核酸構築物が、１つまたは複数の分泌シグナルをコードする
   核酸配列をさらに含む請求項５に記載の核酸構築物。
7. 【請求項７】 請求項１または２のいずれかに記載の核酸配列によってコー
   ドされるか、またはそれに由来するポリペプチド。
8. 【請求項８】 ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する
   、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項１または２のいずれかに記載の核酸配列、または請求
   項５または６のいずれかに記載の核酸構築物を含む複製組換えベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターを含む細胞。
11. 【請求項１１】 非天然組換えによってゲノムに組み込まれた請求項１また
    は２のいずれかに記載の核酸配列を有する細胞。
12. 【請求項１２】 細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞である、請求項１０
    または１１に記載の細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む組
    換えＤＮＡで形質転換された植物。
14. 【請求項１４】 古細菌、原核生物、または真核生物に存在し、テトラヒド
    ロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする染色体遺
    伝子または染色体外遺伝子の同定用の核酸プローブとしての、請求項１または２
    のいずれかに記載の核酸配列から由来のオリゴヌクレオチドの使用。
15. 【請求項１５】 ヒドロキシル化テトラヒドロピリミジン調製用のテトラヒ
    ドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの使用。
16. 【請求項１６】 ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
    る、請求項１５に記載の使用。
17. 【請求項１７】 ヒドロキシル化テトラヒドロピリミジン調製用の、請求項
    １０〜１２のいずれか１項に記載の細胞の使用。
18. 【請求項１８】 テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポ
    リペプチドを発現する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞を培養培地
    中で培養し、 テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを実質的
    に単離する、テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチ
    ドの調製方法。
19. 【請求項１９】 生細胞が浸透し、テトラヒドロピリミジンが該培養培地に
    存在する、請求項１８に記載の方法。