ES2425291B1 - Método para la producción de hidroxiectoína - Google Patents

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Abstract

Método para la producción de hidroxiectoína.#La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende los genes de producción de ectoína e hidroxiectoína, preferiblemente con al menos dos copias del gen que codifica para la enzima ectoína hidroxilasa, y cuya expresión está dirigida por al menos un promotor activo en condiciones de baja salinidad y temperatura. Además, la presente invención se refiere al vector y la célula que comprende dicho polinucleótido, y a un método de producción de ectoína e hidroxiectoína basado en dicha célula. Preferiblemente, dicha célula es de la especie Chromohalobacter salexigens y es incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativos.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCiÓN DE HIDROXIECTOíNA
la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende los
genes de producción de ectoina e hidroxiectoina, preferiblemente con al menos
dos copias del gen que codifica para la enzima ectoína hidroxilasa, y cuya expresión está dirigida por al menos un promotor activo en condiciones de baja salinidad y temperatura. Además, la presente invención se refiere al vector y la célula que comprende dicho polinucleótido, y a un método de producción de ectoína e hidroxiectoína basado en dicha célula. Por tanto, la invención se podría
encuadrar en el campo de la Biotecnologia.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los microorganismos halófilos y halotolerantes se adaptan a las altas concentraciones salinas mediante cambios en la composición lipídica de sus membranas y la acumulación en su citoplasma de solutos con bajo peso
molecular. Asi, las arqueas aerobias halófilas extremas de la familia Halobacteriaceae, la bacteria halófila extrema Salinibacter ruber, asi como serie de bacterias halófilas moderadas Gram positivas, acetogénicas y sulfato
reductoras, del orden Ha/anaerobia/es acumulan concentraciones muy elevadas de iones inorgánicos, principalmente K+ y cr,hasta niveles que se asemejan a los de la concentración salina del medio externo. Sin embargo, el resto de microorganismos halófilos, en especial aquellos con mayor adaptación a las concentraciones salinas elevadas, acumulan en su citoplasma grandes cantidades de compuestos orgánicos específicos, solubles, que actúan como osmolitos para equilibrar la presión osmótica externa. Se trata de moléculas
orgánicas de bajo peso molecular, muy solubles y generalmente de carga neutra.
Se han denominado "solutos compatibles" porque no interfieren con el metabolismo celular, y pueden acumularse hasta alcanzar concentraciones muy
elevadas, del orden de 1 mollkg de agua. Además de su función como
osmoprotectores, los solutos compatibles pueden ejercer otras funciones de
protección, por lo que poseen un gran potencial desde el punto de vista aplicado. Es de gran interés la aplicación industrial de estos compuestos en la tecnologia
de enzimas (biosensores, peR, entre otros), en la fabricación y diseño de nuevos fármacos útiles en cosmética y dermofarmacia, en agricultura, en medicina Y, en general, como agentes que favorecen la conservación de biomoléculas, células
completas y tejidos.
Entre los solutos compatibles que se han investigado, las ectoínas son las que han mostrado las mayores propiedades estabilizantes. Las aplicaciones de las ectoínas han sido ampliamente revisadas por (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801), entre otras, se ha demostrado que pueden proteger enzimas, ADN y la estructura de las proteínas frente a distintos tipos de estrés. Así mismo, se han postulado como potenciales moléculas protectoras frente a diferentes enfermedades por su capacidad estabilizadora de las proteínas. Por último, son ampliamente empleadas en preparaciones dermatológicas pos su capacidad protectora de la piel.
El término ectoínas engloba a dos compuestos tetrahidropirimidínicos cíclicos: la
ectoína (ácido 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinocarboxilico) y su derivado hidroxilado, la hidroxiectoína (ácido 1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4pirimidinocarboxílico). Ambas, ectoína e hidroxiectoína, son junto con la betaína,
los salutos compatibles mayoritariamente sintetizados por bacterias halófilas
Gram negativas heterótrofas y también por un amplio número de bacterias Gram
positivas halófilas moderadas y halotolerantes. La ruta biosintética de la ectoína se elucidó a nivel bioquímico por primera vez en Ha/amanas e/ongafa y consta de
tres etapas enzimáticas que se originan a partir del aspartato semialdehido, intermediario en el metabolismo de aminoácidos, siendo el diaminobutirato (DA) y el Ny-acetildiaminobutirato (NADA) compuestos intermediarios de la ruta. El
aspartato semialdehído proviene de la fosforilación del L-aspartato y su posterior
reducción a aspartato semialdehído. El aspartato semialdehido es convertido en ácido diaminobutirico (DA) mediante la enzima diaminobutirato transaminasa. A continuación, este compuesto es acetilado hasta Ny-acetildiaminobutirato (NADA),
interviniendo la enzima diaminobutirato acetiltransferasa. Finalmente, mediante la condensación del NADA por acción de la ectoína sintasa, se obtiene la ectoína.
La región genética implicada en la síntesis de ectoína comprende tres genes, ectA , ectB y ectC, que codifican las enzimas ácido diaminobutírico acetiltransferasa, ácido diaminobutírico transaminasa y ectoína sintasa,
respectivamente. Estos tres genes se encuentran habitualmente en un mismo
operón, aunque existen excepciones donde encontramos clústeres incompletos o incluso microorganismos que sólo poseen el gen eclC. La principal ruta biosintética para la hidroxiectoína implica la hidroxilación directa de la ectoína, mediante una reacción catalizada por la enzima edoína hidroxilasa (EctD o
ThpD), que fue caracterizada en Chromohafobacter safexigens (García-Estepa y col. , 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84) y Streptomyces chrysomalfus. Además, se ha
sugerido una ruta secundaria para la síntesis de hidroxiectoína en C. salexigens que partiría del precursor NADA. Este soluto compatible es más común en
bacterias halófilas Gram positivas como Brevibacterium linens o Marinococcus
halophilus, aunque frecuentemente es sintetizado en cantidades menores junto a la ectoína en microorganismos productores de la misma. A pesar de que su estructura química es muy parecida a la de la ectoína, la hidroxiectoína confiere
mayor protección frente a los choques térmicos (García-Estepa y col., 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84) y la desecación. Estas propiedades adicionales han propiciado la aparición de estudios sobre procesos industriales orientados a la producción especifica del derivado hidroxilado de la ectoína (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801).
En el caso concreto de la producción de ectoínas por C. safexigens, las concentraciones de ectoína e hidroxiectoína alcanzan su máximo en la fase estacionaria de crecimiento y la acumulación de ectoína se produce
principalmente en respuesta a una elevada salinidad (14,5% (p/v) NaCl, 37 ·C),
mientras que la de hidroxiectoína se produce frente a una elevada salinidad y
temperatura (14,5% (p/v) NaCl, 45 ·C) (Garcia-Estepa y col., 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84). La transcripción de los genes responsables de la síntesis de ectoína (ectABC) implica a múltiples promotores (PectA1-4, PectB) que permiten
que el sistema sea regulado por diversos factores ambientales como la salinidad , la temperatura, la presencia de osmoprotectores o el hierro. La expresión de
fusiones transcripcionales PectA-lacZ y PectB-lacZ es máxima en fase
estacionaria a elevada salinidad , aunque mantiene unos niveles mínimos a baja
salinidad (0,75 M NaCI), especialmente la fusión PeclA-lacZ, lo que sugiere que el
sistema ectABC es semiconstitutivo.
El creciente interés comercial de las ectoinas ha posibilitado el desarrollo de
muchas estrategias para su producción biotecnológica. la principal ventaja de los procesos de producción biológica de ectoinas frente a su síntesis química reside en su mayor especificidad y su menor complicación al ser un proceso con menos etapas de separación de los productos y con menor generación de productos
secundarios. Entre las posibles desventajas que ofrecen los procesos
biotecnológicos se encuentran la gran cantidad de nutrientes necesarios y el control exhaustivo a que deben someterse las condiciones de fennentación (pH ,
aireación, etc). Además, la elevada concentración salina del medio de cultivo es
un problema importante en estos procesos, al ser la causante de la corrosión de los equipos, ademas de limitar la tasa de crecimiento, provocando una disminución en la producción de ectoínas. Aun así, los procesos de fermentación
son actualmente el método de elección para la producción de ectoínas (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801). El proceso más utilizado actualmente para la producción de ectoina es conocido como "bacterial milking", e implica el cultivo aerobio de H. elongata a 25°C en un medio salino con 15 % (p/v) de NaCI (2,57 M NaCI) hasta conseguir una gran densidad celular. Cuando el cultivo alcanza la densidad óptica adecuada se induce el shock hipoosmótico
reemplazando el 80% del medio con agua destilada. Transcurrida una hora se
retira el 80% del volumen (que contiene las ectoinas excretadas) y se añade
medio salino nuevo, empezando así un nuevo ciclo de síntesis de ectoínas. También se han usado para la producción de ectoína microorganismos del género Brevibacterium. El proceso es similar al seguido para H. e/ongata, aunque los
shocks hipoosmóticos se realizan mediante la centrifugación de las células y posterior suspensión de las mismas en agua destilada. Sin embargo, este proceso obtuvo una productividad inferior a otros donde no se realizan shocks
hipoosmóticos continuos, sino una extracción final usando agua destilada y etanol a una concentración 1 M de NaCI. Otro modo de evitar el uso de medios con elevadas concentraciones salinas es el empleo de microorganismos que
sintetizan estos salutos en condiciones de menor salinidad. Así, algunos estudios
postulan la utilización de una cepa de H. elongata secretora de ectoína cuando se
cultiva con 0 ,5 M de NaCI y glutamato monosódico.
Los problemas para la síntesis química de la hidroxiectoína son aún mayores que
en el caso de la ectoína, dado que el grupo hidroxilo añade otro centro quiral a la
molécula, haciendo más interesante su producción biotecnológica. El proceso
utilizado actualmente para la producción industrial de hidroxiectoína con H. elongata es el anteriormente mencionado "bacterial mifking" o mejoras de dicho
procedimiento que emplean fermentaciones continuas de dicho microorganismo
en las que se eleva la concentración salina y la temperatura para aumentar la producción de hidroxiectoína (Seip y col. , 2011 Appl Environ Microbiol. 77(4):1368-74). Otros estudios con microorganismos muy relacionados con H.
e/ongata como H. boliviensis (Van-Thuoc y coL, 2010 Journal of Biotechnology
147:46-51) o C. salexigens (Vargas y col. , 2008 Saline Systems 4:14; Fallet y col. , 2010 Biotechnol Bioeng. 107:124-33) parecen contirmar que en la lamilia Halomonadaceae siempre se produce una combinación de ectoína e hidroxiectoína, aumentando la proporción de la segunda con la temperatura. Así, Van Thuoc y col. (2010 Journal 01 Biotechnology 147:46-51), utilizando fermentaciones en dos etapas con la bacteria H. bolivíensís, consiguieron aumentar la producción de hidroxiectoína, combinada con la producción de ectoína y PHB (polihidroxibutirato). Otro microorganismo utilizado para la síntesis de este soluto compatible es Marinococcus M52, consiguiéndose grandes cantidades de hidroxiectoína a partir de ectoína durante la lase estacionaria del cultivo en un medio con 10% (p/v) de NaCI, con el inconveniente de que este microorganismo no puede ser sometido a procesos de "bacteriaJ mílkíng" basados en una simple dilución del medio de cultivo (Frings y col., 1995 Journal 01 Biotechnology 43:53-61). En el método descrito por Schiraldi y col. (2006 Research in Microbiology 157:693-699) se optimiza la concentración de oxígeno disuelto y la composición del medio, con un 10 % (p/v) de NaCI. Además, emplearon un nuevo método de extracción que combina el shock hipoosmótico con una permeabilización térmica para recuperar el producto de la biomasa, mejorando la extracción del producto y, por tanto, la productividad del proceso,
aunque impide la reutilización de las células en nuevos ciclos de producción/extracción. Una desventaja de Marinococcus spp. es su producción de compuestos inhibidores del crecimiento como el acetato, que le hacen ser menos
adecuado para la producción en fermentadores. Esta desventaja puede evitarse
utilizando sistemas de reactores con diálisis o técnicas de microfiltración (Schiraldi
y col., 2006 Research in Microbiology 157:693-699). Estas técnicas de
fermentación requieren una avanzada tecnología y por ello no han sido aplicadas a la producción industrial de hidroxiectoína. Uno de los últimos estudios publicados sobre producción de hidroxiectoina emplea el microorganismo
Pseudomonas stutzeri (Seip y col., 2011 Appl Environ Microbiol. 77(4):1368-74),
presentando la ventaja de una producción casi exclusiva de hidroxiectoína (con
pequeñas cantidades de trehalosa y NAGGN (N-y-acetilglutaminil glutamina lamida), en medio de crecimiento con un 5% (p/v) de NaCI y a una temperatura de
37 oC, obteniendo una producción de hidroxiectoína similar a la de otros estudios.
Este mismo estudio de Seip y col., 2011 Appl Enviran Microbiol. 77(4):1368-74)
ensaya la producción heteróloga de hidroxiectoína con una cepa de Escherichia
coli DH5a portadora de un plásmido con el operón ectABCD-ask de P. stutzeri,
consiguiendo una producción de hidroxiectoína sin contaminación de otros salutos
con una producción y una productividad superiores a otros estudios y empleando un medio de cultivo con 2% (p/v) de NaCI. La producción heteróloga de hidroxiectoína es útil para evitar los problemas que se derivan de la elevada
salinidad de los medios empleados en la producción industrial de ectoinas. La
mayoría de estudios anteriores sobre producción heteróloga de ectoína y/o hidroxiectoína se centran en la obtención de la primera, no alcanzando ninguno
una producción y excreción de ectoina superior a la obtenida con los
microorganismos que la producen de forma natural (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801). Una excepción es el trabajo realizado por Prabhu y col. (2004) para conseguir una mejora del proceso de "bacterial milking" aplicado a la producción biológica de ectoínas, donde se clonó y expresó el gen que codifica para la ectoína hidroxilasa de S. crysomalllls, thpD, en C. saJexigens,
consiguiendo la transformación de toda la ectoina que se sintetiza de manera
natural en hidroxiectoína (Prabhu y col. , 2004 Appl. Environ. Microbiol. 70:31303132), lo que permite la sintesis de hidroxiectoina a una salinidad menor (1 ,7 M de NaCI).
En el único estudio publicado hasta el momento sobre producción de ectoina e hidroxiectoína utilizando C. salexigens como microorganismo productor se empleó
un sistema de dos reactores continuos acoplados: el primero se utiliza para obtener una masa celular muy elevada y el segundo, para inducir un shock
hipoosmótico en esa masa celular (Fallet y col., 2010 Biotechnol Bioeng. 107:124
33). Este método alcanzó una producción de ectoína e hidroxiectoina, 540 mg y 400 mg por gramo de peso seco, en un mismo proceso, Jo que supone una mayor producción que la obtenida en otros procesos que emplean otros microorganismos (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801).
En W002077254 se expone la producción de ectoína ylo hidroxiectoína en organismos que dispongan de la información genética para dicha producción, centrándose sobre todo en evitar la limitación impuesta por los llamados cuellos
de botella metabólicos y la regulación que producen los sistemas de transporte. En W00138500 y en W02009059783 se describe el uso del gen de la tetrahidropirimidina dioxigenasa de S. chrysomallus para la obtención de
hidroxiectoína.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende:
(a) la secuencia codificante del gen ectA, donde dicho gen codifica para el enzima
diaminobutirato acetiltransferasa;
(b) la secuencia codificante del gen ecta, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobulirato transaminasa:
(e) la secuencia codificante del gen ectC, donde dicho gen codifica para el enzima ectoína sintasa; y
(d) la secuencia codificante del gen ectO, donde dicho gen codifica para el enzima
ectoína hidroxilasa.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una construcción
génica que comprende el poJinucleótido del primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención o la construcción génica del segundo aspecto de la invención.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de ectoína e hidroxiectoína que comprende las siguientes etapas:
(a) cultivar la célula del tercer aspecto de la invención, y
(b) purificar la ectoina y la hidroxiectoina a partir del cultivo de (a).
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
La presente invención permite conseguir una mayor producción de hidroxiectoína
a una temperatura y salinidad menores que lo conseguido hasta la fecha, lo que
supone una gran ventaja, dado que tanto la elevada temperatura como la salinidad aumentan los costes de cualquier proceso industrial de producción en fermentadores.
Los autores de la presente invención han encontrado que el uso de una construcción génica que comprende los genes de síntesis de ectoína e hidroxiectoína, dirigidos por un promotor activo a baja salinidad y temperatura, para la producción de dichas sustancias, es sorprendentemente ventajoso cuando
dicha construcción se introduce en una bacteria halófila donde los genes nativos de sintesis de ectoina e hidroxiectoina han sido inactivados.
Más aún, los autores de la presente invención han encontrado que cuando la construcción génica comprende una segunda copia del gen de síntesis de
hidroxiectoina (ectD) , la cantidad de hidroxiectoína y la tasa de producción
específicas se ven muy incrementadas, sin afectar a la tasa de crecimiento.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un
polinucleótido aislado que comprende:
(a) la secuencia codificante del gen ectA, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobutirato acetiltransferasa;
(b) la secuencia codificante del gen ectB, donde dicho gen codifica para el enzima
diaminobutirato transaminasa;
(c) la secuencia codificante del gen ectC, donde dicho gen codifica para el enzima
ectoina sintasa; y
(d) la secuencia codificante del gen ectD, donde dicho gen codifica para el enzima
ectoína hidroxilasa.
Preferiblemente, dichas secuencias codificantes están ordenadas de manera consecutiva.
El enzima diaminobutirato acetiltransferasa convierte el diaminobutirato en Ny
acetildiaminobutirato (NADA). El enzima diaminobutirato transaminasa convierte
el aspartato semialdehído en diaminobutirato, y viceversa. El enzima ectoína sintasa convierte el NADA en ectoína. El enzima ectoína hidroxilasa convierte la ectoína en hidroxiectoína.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el polinucleótido comprende al menos dos copias de la secuencia codificante del gen eclD que '
codifica para el enzima ectoína hidroxilasa.
Preferiblemente, el polinucleótido además comprende al menos un promotor. Más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 2 y 6% peso/volumen, aún más preferiblemente el promotor
permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 3 y 5%
peso/volumen. Preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de temperatura entre 32 y 40 oC, aún más preferiblemente el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de temperatura entre
34 y 38 oC. Más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones
ambientales de salinidad entre 2 y 6% peso/volumen y temperatura entre 32 y 40
oC. Aún más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones
ambientales de salinidad entre 3 y 5% pesolvolumen y temperatura entre 34 y 38
oC.
El término "promotor", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere
a una secuencia de ADN que regula la expresión del (o de los) gen (es) que se localiza(n) "corriente abajo". Dicha secuencia permite la unión de factores de transcripción, proteinas que van a modular la transcripción del (o de los) gen(es) que regula(n) dicho promotor, asi como de la ARN polimerasa.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, al menos uno de
los promotores es la secuencia nucleotídica promotora del gen ectA.
Preferiblemente, la secuencia nucleotídica promotora del gen ectA es SEO ID NO:
5.
La regulación de la transcripción de los genes ectABe fusionados con el gen ectO, por el promotor del gen ectA (pectA o ectAp, es decir, SEO ID NO: 5) es
importante para el efecto técnico de la presente invención. Aunque en otros microorganismos existen los genes de síntesis de ectoína e hidroxiectoína, en
cada uno la regulación de dichos genes es distinta. Los promotores originales de
C. salexigens tienen una expresión semiconstitutiva, siendo la expresión basal bastante elevada. La región localizada en 5' de ectA está compuesta por 4 promotores, y en su conjunto se denomina pectA. La región localizada delante de ectB contiene solo un promotor, que además de la secuencia entre ectA y ectB, comprende parte del final de la secuencia codificante del gen ectA.
La ventaja de emplear el promotor pectA es que dicho promotor no se activa únicamente a elevada salinidad y temperatura. El uso de promotores más fuertes
o activos a salinidades aún menores presentaría algunas desventajas: en el caso
de un promotor muy fuerte hay que tener en cuenta que la síntesis de ectoínas es un proceso con un elevado coste energético. Esto hace que métodos descritos y que consiguen obtener elevadas cantidades de ectoína lo hagan a costa de una tasa de crecimiento del microorganismo muy baja, lo que es un inconveniente
importante para su aplicación industrial. Se necesita llegar a un compromiso entra
las cantidades de hidroxiectoína obtenidas y una tasa de crecimiento razonable, dado que las ectoínas están asociadas a biomasa. En el caso de promotores activos a salinidades aún más bajas, supone un inconveniente para su aplicación en bacterias halófilas, que a salinidades muy bajas presentan un crecimiento deficiente con producción y excreción de metabolitos inhibidores del crecimiento. La ventaja de emplear bacterias halófilas es que presentan mecanismos de
transporte y excreción exclusivos que penmiten aplicar técnicas del tipo del "bacterial milking", que aumentan tanto la producción como la productividad de
solutos. Es importante tener en cuenta que la producción heteróloga en bacterias no halófilas no se aplica en la producción industrial de ectoínas, por no resultar ventajosa. Además, actualmente existen fermentadores fabricados de materiales no corrosibles por la sal, aunque es preferible usar el menor porcentaje de sal
posible para simplificar y abaratar el proceso.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia
codificante del gen ectA para la enzima diaminobutirato acetiltransferasa es SEO
ID NO: 1. La enzima diaminobutirato acetiltransferasa es la enzima E.C.
2.3.1.178. El gen ectA de C. salexigens tiene la secuencia SEO ID NO: 1 y codifica la proteina con SEO ID NO: 7.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia codificante del gen eetB para la enzima diaminobutirato transaminasa es SEO ID
NO: 2. La enzima diaminobutirato transaminasa es la enzima E.C. 2.6.1.76. El gen ectB de C. salexigens tiene la secuencia SEO ID NO: 2 y codifica la proteína con SEO ID NO: 8.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, donde la secuencia codificante del gen ectC para la enzima ectoína sintasa es SEO ID NO: 3. La enzima ectoina sintasa es la enzima E.C. 4.2.1 .108. El gen ectC de C. salexigens tiene la secuencia SEO ID NO: 3 y codifica para la proteina con SEO ID NO: 9.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia
codificante del gen ectD para la enzima ectoína hidroxilasa es SEO ID NO: 4. El gen ectD de C. salexigens tiene la secuencia SEO ID NO: 4 y codifica la proteína con SEO ID NO: 10.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una construcción
génica que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención.
Preferiblemente, la construcción génica es un vector de expresión. Más
preferiblemente, el vector de expresión comprende un origen de replicación de la familia HaJomonadaceae y un origen de replicación de entero bacterias.
El término "vector de expresión", tal y como se emplea en la presente descripción. se refiere a una molécula de ácido nucleico usada para transferir material
genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de
la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente una vez que son introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano o los vectores episomales de mamíferos. Otros vectores pueden integrarse en el genoma de la célula huésped y replicarse así junto con el genoma celular. Un vector de expresión es aquel capaz de dirigir la expresión de
genes a los que se ha ligado de manera operativa. Un vector de expresión se usa para la transcripción y la traducción de un gen de interés, normalmente controlado por un promotor. El promotor está operativamente unido al gen de interés. "Operativamente unido" se refiere a la relación funcional y a la localización de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés, por ejemplo, un promotor
o potenciador está operativa mente unido a un secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. En general, un promotor operativamente unido está contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión. El término "origen de replicación", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una secuencia de nucleótidos donde se forma una horquilla de replicación y donde se
inicia la replicación del ADN.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención o la construcción génica del segundo aspecto de la invención. Preferiblemente, dicha célula es de la especie es Chromoha/obacter salex;gens. Dicha especie es una bacteria halófila de la familia Halomonadaceae, orden Oceanospiri"ales, clase Gamma Proteobacteria, filum Proteobacteria, reino Bacteria. C. salexigens no crece bien en medios donde la salinidad es inferior a 0,6 M de NaCI y su crecimiento empieza a ser óptimo a partir de 0,75 M (4.35%).
En la célula de la invención, los genes de síntesis de ectoina e hidroxiectoína están en trans, es decir, en una construcción independiente del genoma de la célula, en un vector hibrido entre un plásmido nativo de bacterias halófilas y un replicón de E. coN, por lo que al menos es capaz de replicar en enterobacterias y bacterias de la familia Halomonadaceae.
Los inventores de la presente invención han probado las construcciones de la
presente invención en E. coN para intentar producir el soluto a menor salinidad (13%) y, aunque se obtienen cantidades apreciables de hidroxiectoína, no son lo suficientemente grandes como para considerarlo ventajoso (ver ejemplo 7). En cultivos de E. coN con la construcción génica de la invención, se produce ectoína
e hidroxiectoina pero no en cantidad suficiente. En E. col; la producción de ectoina se ve limitada por cuellos de botella metabólicos como el de la aspartato quinasa. En otras palabras, no es sólo que las bacterias halófilas del tipo C.
salexigens poseen una ruta específica para la producción de ectoínas, es que
todo su metabolismo está consagrado y altamente especializado en la producción de ectoinas, y ha evolucionado de forma que los flujos metabólicos están
derivados hacia la producción de estos compuestos, que pueden constituir hasta el 70-80 % de la fracción soluble en los procesos de extracción.
En la presente memoria, el término "saluto" se refiere a la ectoína o hidroxiectoína.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la célula es
incapaz de expresar los genes ec/A, ec/B, ec/C y ec/D nativos. Preferiblemente, dicha célula es de la estirpe CHR137 de C. sa/exigens.
La expresión "incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ecle y ectO nativos", tal
y como se emplea en la presente descripción, se refiere a que dichos genes en el
genoma de la bacteria están alterados, bien están ausentes porque han sido delecionados, o bien han sido interrumpidos por la inserción de una secuencia que impide la correcta expresión de los mismos, o bien han sido mutados de cualquier forma conocida por un experto en la materia para impedir que se expresen las enzimas para las que codifican. Cuando una célula es incapaz de
expresar dichos genes, se entiende que dichos genes han sido inactivados. La estirpe CHR137 ha sido descrita en Garcia-Estepa, et al. 2006. J. Bacteriol.
188:3774-84. Las características esenciales de dicha célula son que pertenece a
la especia C. sa/exigens y que es incapaz de expresar los genes ec/A, ec/B, ec/C y ectD nativos. La forma en que se altera el genoma de la célula para que esta sea incapaz de expresar los genes ec/A, ec/B, ec/C y ectD nativos es irrelevante, ya que el experto en la materia conoce multitud de técnicas para lograr la
inactivación de dichos genes.
La célula de la presente invención es más eficaz en la producción de ectoínas, especialmente hidroxiectoína, que otros microorganismos salvajes descritos hasta
la fecha y que la estirpe mutante (donde los genes de sintesis de ectoina/hidroxiectoina han sido inactivados) sin la construcción. El hecho de
combinar los cuatro genes ec/ABCD en una misma construcción, controlados por
el promotor pec/A, sumado al hecho de emplear la bacteria halófila C. salexigens
ya hace muy eficiente la producción de ectoina e hidroxiectoína, pero cuando realmente se favorece sorprendentemente la producción, especialmente de hidroxiectoína, es cuando se emplea además una copia adicional del gen ectD y,
sobre todo, una estirpe donde se han inactivado los genes nativos de sintesis de ec!oina/hidroxiectoina.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para la producción de ectoína e hidroxiectoína que comprende las siguientes etapas:
(a)
cultivar la célula del tercer aspecto de la invención, y
(b)
purificar la ectoína y la hidroxiectoína a partir del cultivo de (a).
En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se
lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre 2 y 7% peso/volumen.
Preferiblemente, la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre el 3 y 5% peso/volumen.
En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 y 50· C. Preferiblemente, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 34 y 40· C.
Preferiblemente, el cultivo de la etapa (a) se lleva a cabo en un medio mínimo. Dicho medio es preferido para la posterior purificación de los salutos y su
composición es conocida en el estado de la técnica. Un ejemplo no limitante de dicho medio mínimo podría ser el medio M63 descrito en Csonka, 1982 J Bacteriol. 151:1433-43.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus
variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y
características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se
proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Muestra un esquema de las construcciones pHS15ABCD y pHS15DD. Las secuencias promotoras son ectAp (1-4) y eclBp, y las secuencias codificantes son ectA, ectB, ecle y ectO. A ambos lados de la construcción génica hay dianas del enzima de restricción EcoR l. la secuencia de la construcción génica de arriba es SEO ID NO: 11 y la de la de abajo es SEO ID NO: 12.
FIG. 2. Representa el vector pHS15. Se muestran los puntos de corte de diversas enzimas de restricción, así como los genes de resistencia a ampicilina (amp) o a estreptomicina y espectinomicina (Sm/Spc). el origen de replicación en
E. coli, CoIE1 ori y el origen de replicación oriT.
FIG. 3. Representa la construcción del vector pHS15ABCD. Se muestran las distintas etapas de la construcción descritas en los ejemplos. A. Construcción del vector pME2.2. B. Construcción del vector pHS15ABCD.
FIG. 4. Representa la construcción del vector pHS15DD. Se muestran las distintas etapas de la construcción descritas en los ejemplos.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la eficacia del método para la producción de ectoína e hidroxiectoína de la presente invención.
Ejemplo 1: construcciones génicas. Se planteó la fusión de los genes responsables de la sintesis de ectoina (ectABC) e hidroxiectoina (ectO) de C. salexigens de manera que el gen ecto quede bajo el control de las zonas promotoras existentes en el operón ectABC. Posteriormente
esa fusión se clonó en el plásmido pHS15 (ver figura 2 y Vargas y col., 1995 Mol Gen Gene!. 246:411-8), vector de clonación y expresión en bacterias halófilas
moderadas con múltiples sitios de restricción únicos útiles para la clonación de
ADN. El plásmido pHS15 contiene el plásmido pHE1, autóctono de H. e/ongata, el gen de resistencia a la estreptomicina y la espectinomicina, el plásmido pBluescript KS (incluyendo el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de replicación de E. col/) y una región de 3,1 kb de la región oriT.
Se plantearon dos construcciones diferentes: una primera con una sola copia del gen ectO y una segunda con dos copias de este gen con el fin de comprobar el efecto de aumentar la dosis génica sobre la producción de hidroxiectoína.
Como muestra la figura 3, en primer lugar, a partir del plásmido pME2 (plásmido pSK Bluescript que contenia el operón BetABC completo, es decir, SEO ID NO: 6), se introdujo, mediante mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte BamHI
entre el gen ecle y el terminador transcripcional existente detrás de éste,
resultando el plásmido pME2.1. A continuación, sobre el plásmido pME2.1 se eliminó, mediante mutagénesis dirigida por PCR, el punto de corte BamHI presente en el sitio de multiclonación del pSK Bluescript, dando como resultado el plásmido pME2.2. Posteriormente a partir del plásmido pEcIO (plásmido pSK Bluescript que contenía el gen ecto (SEO ID NO: 4)) se introdujo, mediante mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte Bcn en la zona intergénica posterior al gen ecto, obteniéndose el plásmido pEctD.1. Se digirió el plásmido pME2.2 con BamH 1 y el plásmido pEctD.1 con Bcll (que extrae el gen ectO). Se
procedió a la ligación de ambas construcciones digeridas obteniéndose el
plásmido pEctABCD (que contiene la construcción ectABCO, es decir, SEO ID NO: 11). Esta construcción pEctABCD se digirió con EcoRI para extraer la fusión ectABCO (SEO ID NO: 11), así como el plásmido pHS 15 con el mismo enzima, para a continuación proceder a la ligación de la fusión con pHS15, obteniéndose el plásmido pHS15ABCD (Figuras 1 y 3).
Por otro lado, como muestra la figura 3A, partiendo del plásmido pEctABCD, se introdujo, mediante mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte BamHI entre
el gen ectC (SEO ID NO: 3) y el gen ectO (SEO ID NO: 4), obteniéndose el plásmido pEctABCD.l. Esta construcción resultante se utilizó para eliminar un
punto de corte BamHI interno del gen ectD, mediante mutagénesis dirigida por
PCR e introduciendo una mutación silenciosa, obteniéndose el plásmido
5 pEctABCD.2. Se digirió el plásmido pEctD.l con Bc/I (que extrae el gen ecto) y pEctABCD.2 con la enzima BamHI. Se procedió a la ligación de ambas construcciones digeridas obteniéndose el plásmido pEctDD. Esta construcción pEctDD se digirió con EcoRI para extraer la fusión ectABCOO (SEO ID NO: 12),
así como el plásmido pHS15 con la mismo enzima, para a continuación proceder
lOa la ligación de la fusión con pHS15 (Figura 2), obteniéndose el plásmido pHS15DD (Figuras 1, 3 y4).
Ejemplo 2: estirpes receptoras y cultivos.
Todos los porcentajes de NaCI se refieren a % (p/v).
Como estirpes receptoras de las construcciones se escogieron la estirpe silvestre de C. salexigens, un mutante de C. safexigens incapaz de producir ectoína ni
hidroxiectoína (CHRI37) y E. coli DH5a.
20 Ambas construcciones, pHS15ABCD y pHSI5DD, se introdujeron en E. coli DH5a, la estirpe silvestre de C. safexigens y en el mutante CHRI37.
La estirpe CHR61 , un mutante espontáneo de C. safexigens DSM3043 resistente a la rifampicina, fue empleado como estirpe silvestre. CHR61 reproduce el 25 fenotipo de la estirpe silvestre a todas las condiciones ensayadas. Las estirpes de
C. safexígens se cultivaron de forma rutinaria en medio complejo SW-2 que
contenia un 2% de sales totales (Vargas y col., 1997). E. coli fue cultivada aeróbicamente en medio complejo Luria-Bertani (LB) (Miller, 1992). Como medio mínimo para todas las estirpes se empleó el medio M63 (Csonka , 1982 J 30 Bacteriol. 151 :1433-43) a diferentes salinidades: 4,35%, 8,7% Y 14,5% de NaCI en el caso de las estirpes de C. safexigens y 1 %, 2% y 3% de NaCI para E. coli. La fuente de carbono utilizada fue glucosa a una concentración 20 mM. El pH de todos los medios se ajustó a 7,2 mediante la adición de KOH. Los cultivos fueron
incubados a 37 oC en un agitador orbital a 200 rprn. En caso de ser necesarios, se añadieron antibióticos previamente esterilizados por filtración a las siguientes
concentraciones (~g mr'): ampicilina (Ap), 150 para E coli; kanamicina (Km), 50 para E coli y 75 para C. sa/exigens; rifampicina (Rf), 25 para E coli y C. sa/exigens; estreptomicina (Sm), 20 para E coli y 50 para C. sa/exigens. El
crecimiento se monitorizó mediante la medición de la densidad óptica de los
cultivos a 600 nm con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 25 UVNis.
Ejemplo 3: transferencia de las construcciones.
Los plásmidos fueron transferidos de E. coli a C. salexígens mediante conjugación
triparental en medio SW-2, utilizando pRK600 como plásmido ayudante ("he/per'), tal y como está descrito en Vargas y col., 1997 System Appl MicrobioI20:173-181.
Ejemplo 4: determinación de la concentración de ectoínas. Para la determinación de la concentración de ectoína e hidroxiectoína , las células se obtuvieron por centrifugación de los cultivos en fase estacionaria temprana y fueron congeladas. Estas células fueron sometidas a un extracción mediante una
modificación del método de Bligh y Dyer, tal y como describen Kraegeloh y Kunte (2002 Extremophiles 6:453-462). La concentración de ectoina e hidroxiectoina se midió por cromatografia liquida y espectrometria de masas (HPLC-MS). Esta
concentración siempre corresponde a una producción a punto final en cultivos en matraz (no corresponde a procesos de ubacferiaJ milking" ni a cultivos en
fermentadores y/o de elevada densidad celular).
Ejemplo 5: la estirpe CHR137 con la construcción pHS15DD produce
mayores cantidades de hidroxiectoína con menor salinidad y temperatura. Todas las estirpes fueron cultivadas en medio mínimo M63 a las salinidades expuestas anteriormente. Una vez alcanzada la fase estacionaria, las células
fueron centrifugadas, sometidas a un proceso de extracción y se midió por HPLCMS su contenido en ectoina e hidroxiectoina. En la tabla 1 se muestran las
producciones de ectoínas de las diferentes estirpes así como su tasa de crecimiento específica y las tasas específicas de producción resultantes. Como la producción de ectoínas está directamente relacionada con la biomasa cuando la
salinidad es constante, la tasa específica de producción [~mol/(g peso seco hora}] (~mol/(g PS h) es una función simple del contenido en hidroxiectoina y la tasa de crecimiento (Seip y col., 2011Appl Environ Microbiol. 77: 1368-74).
5 Tablal . Producción de ectoina e hidroxiectoina en la estirpe silvestre de C.
salexigens y en las estirpes silvestre y CHR137 portando las construcciones
pHS15ABCD y pHS15DD a 37 oC y diferentes salinidades.
Estirpe
Salinidad ("lo pIV) Ta", crecimiento (IJ) (h" ) Ecloína Hidroxiecloina
Cantidad (IJmol/g PS)
Ta", producción especifica (IJmol/g PS·h) Cantidad (I-lmoJlg OBM) Tasa producción específica (I-Imol/g DBM'h)
C. salexigens wt
4,35 0,24 393 94.3 59 14,1
8,7
0,33 654 21 5,8 202 66,6
14,5
0,2 1 725 152,2 324 68
14,S.A
0 ,15 381 57,2 1 942 141
C. salexigens wt pHS15ABCD
4,35 0,14 220 30,8 483 67,62
8,7
0,25 156 39 424 106
C. salexigens wt pHS15DD
4,35 0, 18 68 12,2 384 69,12
8,7
0,29 108 31,3 36 1 104,6
C. salexigens CHR137 pHS15ABC O
4,35 0,14 81 11 ,3 598 83,72
8,7
0,1 170 17 632 63,2
C. safexigens CHR137 pHS15DD
4,35 0 ,14 93 13 883 123,62
8,7
0,1 286 28,6 987 96,7
•A Indica a 45 oC. 10
Como ya fue comentado anteriormente, la estirpe silvestre de C. salexigens
alcanza un contenido máximo de ectoina a una salinidad de 14,5% NaCI y 37 oC, con 725 ~mol/g peso seco de ectoina y observándose una tasa de crecimiento de 0,21, lo que arroja una tasa de producción de 152,2 ~mol/(g PS hora}. En cambio,
15 el máximo contenido intracelular de hidroxiectoína se alcanza a una salinidad de
14,5% NaCI y 45 oC., con 942 ~mol/g peso seco de hidroxiectoina, una tasa de crecimiento de 0,15 Y una tasa de producción de 141 ~mol/(g PS hora). Cuando
se analizan los datos de producción de ectoínas para las estirpes portadoras de
las fusiones transcripcionales lo primero que se observa es una mayor producción
de hidroxiectoína en todas ellas que en la estirpe silvestre cuando se cultivaron a
las mismas salinidades (4,35% y 8,7% NaCI) (ver tabla 1).
No se pudo analizar el contenido intracelular de edoínas de estas estirpes cultivadas a una salinidad de 14,5% porque mostraron un crecimiento muy retrasado o fueron incapaces de crecer.
Es destacable como esta mayor producción de hidroxiectoína se produce a costa de una disminución en el contenido de ectoina, aunque esta última no llega a
desaparecer en ninguno de los casos. Este mayor contenido en hidroxiectoína está acompañado por una disminución de las tasas de crecimiento en comparación con las observadas para la estirpe silvestre. Esta disminución en la tasa de crecimiento puede ser explicada por la mayor concentración de hidroxiectoína en detrimento de la ectoína , como ya se ha expuesto anteriormente la ectoína posee una función eminentemente osmoprotectora mientras su derivado hidroxilado posee funciones termoprotectoras adicionales y no es tan eficaz como agente osmoprotector.
También es destacable la diferencia de producción de ectoínas entre la estirpe
silvestre y la estirpe mutante cuando ambas portan las construcciones con las
fusiones transcripcionales. Aunque en ambas, sea cual sea la construcción, el equilibrio ectoína/hidroxiectoína se encuentra desplazado hacia la segunda, este
desplazamiento es mucho mayor cuando la estirpe portadora es CHR137.
Otra diferencia es el funcionamiento de las dos construcciones en ambas estirpes, mientras en la estirpe silvestre se alcanza una mayor producción y productividad de hidroxiectoína cuando porta el plásmido pHS15ABCD, sorprendentemente en la estirpe CHR137 se obtienen mejores resultados con la construcción pHS15DD.
Las mayores producciones de hidroxiectoína se obtuvieron con la estirpe CHR137 que portaba el plásmido pHS15DD. Esta estirpe tuvo una producción de 883 ~mol
hidroxiectoína/g peso seco y una productividad de 123,6 Ilmol hidroxiectoína/(g
PS h) a una salinidad de 4,35% NaCI y 37 oC, es decir, una producción y una
productividad del mismo orden que las de la estirpe silvestre a una salinidad de
14,5% y 45 oC.
Cuando se cultiva CHR137 portando la construcción pHS15DD a una salinidad de 8,7% Y 37 oC se obtiene una cantidad de hidroxiectoína (967 ~mol hidroxiectoínalg PS) similar a la de la estirpe silvestre a 14,5% y 45 oC. Sin embargo, esta producción de hidroxiec!oina lleva asociada una drástica caída de la tasa de crecimiento (0,1) que hace que la productividad de esta estirpe sea menor (96, 7 ~mol hidroxiectoina/g PS).
Ejemplo 6: la estirpe CHR137 con la construcción pHS15DD produce mayores cantidades de hidroxiectoína que otros ensayos anteriores.
En la tabla 2 encontramos las producciones de hidroxiectoína obtenidas en
diferentes estudios anteriores y en la presente invención, así como las salinidades
a las que se obtuvieron y las tasas específicas de producción resultantes.
Podemos destacar que con la estrategia de la presente invención se obtienen cantidades de hidroxiectoína superiores a otros sistemas propuestos, manteniendo una productividad del mismo orden que muchos de los estudios
comparados. Todo ello a una de las salinidades inferiores ensayadas para la producción de hidroxiectoína (4,35%). Aunque Seip y col. (2011 Appl Environ Microbiol. 77:1368-74) prueban un 2% de salinidad en producción heteróloga en
E. coli, la producción de hidroxiectoína es sustancialmente menor.
Como se comentó anteriormente, el proceso que actualmente se emplea para la producción industrial de hidroxiectoína emplea el método conocido como "baclerial milking" con la bacteria H. e/ongala (filogenéticamente muy cercana a C. salexigens) a temperaturas y salinidades superiores a las empleadas para la producción de ectoína (por encima del 14% de NaCI).
Una ventaja adicional de la presente invención frente al estado de la técnica es que a diferencia de Marinococcus spp., C. salexigens puede ser sometido a choques hipoosmóticos por dilución simple del medio de cultivo liberando la mayor parte de sus solutos internos y sin perder viabilidad de las células (Fallet y col. , 2010 Biotechnol Bioeng. 107:124-33).
Tabla2. Comparación de distintos estudios sobre producción de hidroxiectoína
Estirpe
Salinidad Tasa crecimiento (") (h-1) Contenido (~moJlg PS) Tasa producción especifica (I-Imol/g PS-h)" Referencia
Marinococcus sp. M52
10% 0,258 860 215 Frings el aL, 1995c
Marinococcus sp. M52
10% 0,20 670 134 Schiraldi el aL, 20060
Marinococcus sp. M52
10% 0,03 603 18 Schiraldi el al. , 2006"
H. bofiviensis
18,5% proceso en múltiples etapas 950 169 Van Thuocel al. , 2010E
P. stulzeri DSM190T
5% 0,16 480 76,8 Seip el ar. , 2011
E. coli DH5a1pSB01
2% 0,35 500 175 Seip el al., 20 11
C. safexigens DSM3043 salvaje
10,75% 0,3 2.528 76 Falle! el aL. 2010F
C. salexigens CHR137JDD
4,35% 0,14 883 123,62 l. presente invención
A. Tasas de producción específica calculadas en función del contenido, la tasa de crecimiento y la biomasa.
B. Máxima.
C. El microorganismo no crece exponencialmente, y la máxima tasa de
15 crecimiento es únicamente observada al inicio de la fermentación , la hidroxiectoína es retenida en las células tras el shock hipoosmótico.
D. Las células fueron cultivadas en un fermentador con una tasa de crecimiento de 0,2 para posteriormente ser sometidas a diálisis continua para retirar compuestos inhibidores del crecimiento (tasa de crecimiento de 0,03).
E. En una primera etapa las células fueron cultivadas a salinidad óptima para la
5 producción de biomasa, y posteriormente se transfirieron a un medio con mayor
salinidad para la producción de solutos. El tiempo necesario para la etapa 1 (24 horas), así como un periodo de adaptación de 3 horas al principio de la etapa 2 no han sido tenidos en cuenta para el cálculo de la tasa específica de producción.
F. Cálculos para una biomasa máxima de 61 giL. La fermentación está optimizada 10 para la producción simultánea de ectoína e hidroxiectoína, Cantidad de ectoina:
3797 ~mol/g.
La estrategia de la presente invención puede ser aplicada en la producción
industrial de hidroxiectoína a menores salinidades y temperaturas de las que se 15 emplean actualmente y supone una gran ventaja para dicho proceso.
Ejemplo 7: producción de hidroxiectoína en E. col; con las construcciones pHS15ABCD o pHS15DD.
Las construcciones pHS15ABCD y pHS15DD se probaron en E. coli para intentar 20 producir el soluto a menor salinidad (1-3%). Sin embargo, aunque se obtienen
cantidades apreciables de hidroxiectoína, estas no son lo suficientemente grandes
como para considerar ventajoso un método que emplee esta bacteria (tabla 3).
Tabla 3. Producción de ectoína e hidroxiectoína E. coli DH5a portando las 25 construcciones pHS15ABCD o pHS15DD a 37 oC y diferentes salinidades.
Tasa
Estirpe
Salinidad crecimiento Ectoina Hidroxiectoina
(,) (h-1 )
Cantidad (~moVg DBM)
Tasa producción específica (IJmoVg DBM'h) Cantidad (IJmol/g DBM) Tasa producción específica (~molfg D8Mh)
E. col;
1% 0,35 0,48 0, 168 80, 1 28
ES 2 425291 Al
DH5alpHS15ABCD
2% 0,32 0,84 0,268 124,1 39,7
3%
0,2 0,82 0,164 30 6
E. coli
1% 0,_ 0,045 0,018 6,56 2,6
OH5a/pHS15DD
2% 0,35 0,15 0,255 0,19 0,089 10,4 3,64
3%
0,028
3,04 0,45

Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un polinucleótido aislado que comprende:
    (a)
    la secuencia codificante del gen ec/A, donde dicho gen codifica la enzima diaminobutirato acetiltransferasa;
    (b)
    la secuencia codificante del gen ec/B, donde dicho gen codifica la
    enzima diaminobutirato transaminasa;
    (c) la secuencia codificante del gen ec/C, donde dicho gen codifica la
    enzima ectoína sintasa; y
    (d) la secuencia codificante del gen eclO, donde dicho gen codifica la
    enzima ectoína hidroxilasa.
  2. 2.-El polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos dos copias de la secuencia codificante del gen eclO, donde dicho gen codifica la enzima ectoína hidroxilasa.
  3. 3.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque además comprende al menos un promotor.
  4. 4.-El polinucleótido según la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor permite la expresión en condiciones ambient~les de salinidad entre 2 y 6% peso/volumen.
  5. 5.-El polinucleótido según la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor
    permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 3 y 5%
    pesolvolumen.
  6. 6.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de temperatura entre 32 y 40 oC.
  7. 7.-El polinucleótido según la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de temperatura entre 34 y 38 oC.
  8. 8.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado
    porque el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 2 y 6% pesolvolumen y temperatura entre 32 y 40 oC.
  9. 9. El polinucleótido según la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor
    permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 3 y 5% peso/volumen y temperatura entre 34 y 38 oC.
  10. 10.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, caracterizado porque al menos uno de los promotores es la secuencia nucleotidica promotora del gen ectA.
  11. 11 .-El polinucleótido según la reivindicación 10, donde la secuencia nucleotidica promotora del gen ectA es SEO ID NO: 5.
  12. 12.-El pOlinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde la secuencia codificante del gen ectA para el enzima diaminobutirato acetiltransferasa es SEO ID NO: 1.
  13. 13.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. donde la secuencia codificante del gen ectB para el enzima diaminobutirato transaminasa es SEO ID NO: 2.
  14. 14.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la
    secuencia codificante del gen ectC para el enzima ectoina sintasa es SEO ID NO:
  15. 3.
  16. 15.-El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la
    secuencia codificante del gen ectO para el enzima ectoína hidroxilasa es SEO ID
    NO:4.
  17. 16.-Una construcción génica que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  18. 17.-La construcción génica según la reivindicación 14, caracterizada porque es un vector de expresión.
  19. 18.-La construcción génica según la reivindicación 17, donde el vector de
    expresión comprende un origen de replicación de la familia Hafomonadaceae y un
    origen de replicación de enterobacterias.
  20. 19.-Una célula que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la construcción génica según cualquiera de las
    reivindicaciones 16 a 18.
  21. 20.-La célula según la reivindicación 19 donde la especie es Chromohafobacter
    salexígens.
  22. 21.-La célula según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, donde dicha célula es incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC yectD nativos.
  23. 22.-La célula según la reivindicación 21 , donde dicha célula es de la estirpe CHR137 de Chromohafobacter safexigens.
  24. 23.-Un método para la producción de ectoína e hidroxiectoína que comprende las siguientes etapas:
    (a)
    cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, y
    (b)
    purificar la ectoina y la hidroxiectoina a partir del cultivo de (a).
  25. 24.-El método según la reivindicación 23 donde la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre 2 y 6% pesolvolumen.
  26. 25.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24 donde la etapa
    (a) se lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre el 3 y 5% peso/volumen.
  27. 26.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 donde la etapa
    (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 y 50' C.
  28. 27.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 donde la etapa
    (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 32 y 40' C.
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