BR112019013694A2 - sistema de expressão isento de células tendo nova regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico - Google Patents

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Abstract

a invenção refere-se a um sistema de expressão isento de células in vitro incorporando um novo sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico. em certas modalidades, a invenção inclui um sistema de expressão isento de células onde a fonte de energia celular, atp, é regenerada de polifosfato inorgânico usando um sistema de enzima dupla. nesta modalidade, este sistema de enzima dupla pode incluir as enzimas adenosil cinase e/ou polifosfato cinase termoestáveis.

Description

“SISTEMA DE EXPRESSÃO ISENTO DE CÉLULAS TENDO NOVA REGENERAÇÃO DE ENERGIA COM BASE EM POLIFOSFATO INORGÂNICO “ [001]Este pedido reivindica o benefício de e prioridade ao Pedido Provisório dos EUA N2 62/440.975, depositado em 30 de dezembro de 2016. O relatório descritivo inteiro, figuras e listagens de sequências do pedido referenciado acima são por meio deste incorporados em sua totalidade por referência.
CAMPO TÉCNICO [002]A invenção refere-se a um sistema de expressão isento de células, à mistura de reação contendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para o mecanismo de transcrição/tradução in vitro, aminoácidos, nucleotídeos, componentes metabólicos que fornecem energia e que são necessários para a síntese proteica. A invenção refere-se ainda a um sistema de expressão isento de células in vitro incorporando um novo sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico que pode resultar em rendimentos mais altos de produtos de expressão objetos, tais como proteínas. A invenção refere-se ainda a um dispositivo para a expressão de gene isenta de células in vitro. Adicionalmente, a invenção refere-se a um novo sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico que pode ser incorporado em aplicações e/ou ensaios de diagnóstico.
FUNDAMENTOS [003]Sistemas de expressão isentos de células (também conhecidos como transcrição/tradução in vitro, expressão proteica isenta de células, tradução isenta de células, ou síntese proteica isenta de células) representam uma técnica de biologia molecular que permite aos pesquisadores expressar proteínas funcionais ou outras moléculas alvos in vitro. Comparado a técnicas in vivo com base em células de cultura bacteriana ou tecidual, a expressão proteica in vitro é consideravelmente mais rápida porque ela não requer transfecção de gene, cultura celular ou purificação proteica
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2/68 extensa. Uma outra vantagem de tais sistemas é que frequentemente a proteína alvo a ser expressada pode ser tóxica a uma célula hospedeira, ou geralmente incompatível com a expressão celular, tornando os sistemas in vivo impráticos se não veículos completamente ineficazes para a expressão proteica.
[004]Mais especificamente, sistemas de expressão isentos de células geram moléculas alvos e complexos tais como espécies de RNA e proteínas sem usar células vivas. Um sistema de expressão isento de células típico pode utilizar os componentes/mecanismo biológicos encontrados em lisatos celulares para gerar moléculas alvos a partir do DNA contendo um ou mais genes alvos. Os componentes comuns de uma reação de sistema de expressão isento de células típico podem incluir um extrato celular geralmente derivado de um lisato de cultura celular, uma fonte de energia tal como ATP, um fornecimento de aminoácidos, cofatores tais como magnésio, e o padrão de síntese de ácido nucleico com os genes desejados, tipicamente na forma de um padrão de síntese de plasmídeo, ou padrão de expressão linear (ou síntese) (LET ou LST). Um extrato celular pode ser obtido lisando-se a célula de interesse e removendo-se as paredes celulares, DNA genômico, e outros fragmentos através de centrifugação ou outros métodos de precipitação. As porções remanescentes do lisato, ou extrato celular podem conter o mecanismo celular necessário, necessário para expressar a molécula alvo.
[005]Um sistema de expressão isento de células comum envolve a síntese proteica isenta de células (CFPS). Para produzir uma ou mais proteínas de interesse, sistemas de CFPS típicos utilizam um conjunto de componentes catalíticos necessário para geração de energia e síntese proteica a partir de lisatos brutos de células microbianas, vegetais, ou animais. Lisatos brutos contêm os elementos necessários para transcrição de DNA a RNA, tradução de RNA à proteína, enovelamento de proteínas, e metabolismo energético (por exemplo, ribossomos, aminoacil-tRNA sintetases, fatores de iniciação e prolongamento da tradução, fatores de liberação de
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3/68 ribossomo, enzimas de reciclagem de nucleotídeo, enzimas metabólicas, chaperonas, foldases, etc.). Extratos celulares comuns em uso atualmente são fabricados de Escherichia coli (ECE), reticulócitos de coelho (RRL), gérmen de trigo (WGE), e células de inseto (ICE), e ainda células mamíferas (MC).
[006]Apesar de muitos aspectos vantajosos de sistemas de expressão isentos de células, vários obstáculos previamente limitaram seu uso como uma tecnologia de produção de proteína. Estes obstáculos incluíram durações de reação curtas de síntese proteica ativa, taxas baixas de produção de proteína, escalas de reação pequenas, uma capacidade limitada de enovelar corretamente proteínas contendo múltiplas ligações dissulfeto, e seu desenvolvimento inicial como uma ciência de “caixa preta”. Uma limitação significativa encontrada em sistemas de expressão isentos de células tradicionais é a dificuldade em fornecer as necessidades intensas de energia e substrato de síntese proteica necessária para a transcrição/tradução sem mudanças concomitantes deletérias no ambiente químico. Além disso, custos de reagente caros, particularmente produtos químicos de fosfato de alta energia na forma de nucleotídeos e fontes de energia secundárias, limitam os usos práticos de tais sistemas de expressão isentos de células tradicionais.
[007]Um dos principais fatores limitantes para sistemas de expressão isentos de células in vitro é a regeneração de energia. Por exemplo, depois da iniciação da síntese proteica isenta de células, a produção tipicamente continua até que um dos substratos (por exemplo, ATP, cisteína, etc.) seja suprimido, ou o acúmulo de subproduto (por exemplo, fosfato inorgânico) atinja uma concentração inibitória. Como tal, a incapacidade de qualquer sistema de expressão isento de células de regenerar eficientemente uma fonte de energia apropriada pode agir como um fator limitante, reduzindo o tempo de execução global e os rendimentos finais do sistema. Além disso, é impraticável, além de ser proibitivamente caro, simplesmente adicionar ATP adicional em um sistema de expressão isento de células visto que níveis altos de ATP
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4/68 podem realmente inibir a expressão proteica.
[008]Para tratar estes problemas, sistemas de expressão isentos de células tradicionais contam com a adição de fontes de energia suplementares, principalmente na forma de Fosfoenolpiruvato (PEP) e Piruvatocinase (PK) ou Creatinofosfato (CP) e Creatinocinase (CK) ou outros compostos similares. Entretanto, tal suplementação de energia tem limitações significativas. Primeiro, tais substratos PEP e CP têm apenas uma duração limitada funcional sob condições in vitro, e seu subproduto de reação piruvato é inibitório à tradução in vitro. Segundo, como observado acima, estes substratos aumentam significativamente os custos para aplicações in vitro. Terceiro, ambas as enzimas PK e CK demonstraram ter apenas um número de rotatividade total limitado de 3 a 4 vezes antes da degradação/inatividade limitando ainda sua utilidade como uma regeneração de fonte de energia. Uma “rotatividade” ou número de rotatividade (também denominado feat) de proteína podem ser definidos como o número máximo de conversões químicas de moléculas de substrato por segundo que um único sítio catalítico executará para uma concentração de enzima dada. Como um resultado, por causa de seu número de rotatividade deficiente, ambas as enzimas PK e CK devem ser adicionadas em quantidades significativas que limitam o tempo de execução de aplicações in vitro enquanto também aumentando os custos.
[009]Em um exemplo mais específico, sistemas isentos de células com base em E. coli correntes principalmente contam com fosfato de creatina/creatina cinase ou com fosfoenolpiruvato (PEP) e Piruvato Cinase (PK) como o principal sistema de regeneração de energia, ainda que seja estabelecido que PK tem um número de rotatividade total nos dígitos únicos baixos e o produto secundário, piruvato é um inibidor da reação de tradução. Desta maneira, não apenas o sistema de regeneração de energia celular da invenção corrente mostra sistemas de expressão isentos de células tradicionais, mas, de fato, representa uma melhoria demonstrável sobre sistemas de expressão isentos de células tradicionais conhecidos na técnica.
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5/68 [010]Como um resultado, existe uma necessidade de um sistema de expressão isento de células mais energeticamente eficiente e robusto que pode, por exemplo, ter duração de reação mais longa e taxas de síntese proteica aumentadas, finalmente produzindo rendimentos proteicos mais altos. De fato, os problemas precedentes com respeito aos sistemas de expressão isentos de células, e em particular, regeneração de energia dentro destes sistemas, representam uma necessidade há muito sentida de uma solução eficaz -- e econômica - para os mesmos. Embora a implementação dos elementos possa estar disponível, tentativas reais de satisfazer esta necessidade podem ter falhado em algum grau. Isto pode ter sido devido a uma falha daquele tendo habilidade comum na técnica para avaliar ou compreender completamente a natureza dos problemas e desafios envolvidos. Como um resultado desta falta de compreensão, tentativas para satisfazer estas necessidades há muito sentida podem ter falhado para resolver eficazmente um ou mais dos problemas ou desafios aqui identificados. Estas tentativas podem ter levado ainda para longe das direções técnicas tomadas pela presenta tecnologia inventiva e podem resultar ainda nas obtenções da presente tecnologia inventiva sendo considerada a algum grau um resultado inesperado do método tomado por alguns no campo.
[011]Como será debatido em mais detalhe abaixo, a tecnologia inventiva corrente supera as limitações de sistemas de expressão isentos de células tradicionais, em particular suas limitações de uso de energia, enquanto satisfazendo os objetivos de um sistema de expressão isento de células in vitro verdadeiramente energeticamente eficiente e robusto que resulta em durações de reação mais longas e rendimentos de produto mais altos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [012]Geralmente, a tecnologia inventiva refere-se a sistemas de expressão isentos de células. Um objetivo da invenção pode ser fornecer métodos de expressão
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6/68 isenta de células que incluem novas composições, aparelho e procedimentos que resultam em tempos de reação mais longos, eficiência de reação mais alta, e estabilidade de reação melhorada que finalmente produzem rendimentos mais altos de um produto de expressão desejado.
[013]Um outro objetivo da invenção pode ser fornecer um sistema de expressão isento de células melhorado, que em uma modalidade pode incluir novos sistemas e métodos de regeneração de energia. Por exemplo, em uma modalidade preferida, a tecnologia inventiva pode incluir um sistema de expressão isento de células in vitro incorporando um novo sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico. Nesta modalidade preferida, a regeneração de energia pode ser obtida através da adição de polifosfato inorgânico e proteínas cinase de eficiência alta sinérgicas isoladas e purificadas de cepas bacterianas selecionadas. Estas proteínas cinase podem conduzir a regeneração química de eficiência alta da fonte de energia celular, trifosfato de adenosina (ATP) dentro do sistema de expressão isento de células. Esta regeneração de energia melhorada leva em consideração a atividade contínua do sistema de expressão isento de células resultando em rendimentos mais altos de produtos de expressão objetos, tais como proteínas.
[014]Em certas modalidades, este sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico pode ser aplicado a uma variedade de sistemas de expressão isentos de células. Por exemplo, em uma modalidade preferida o novo sistema de regeneração de energia pode levar em consideração tempo de execução mais longo do sistema antes da supressão de energia química e rendimentos mais altos de produtos de expressão, tais como proteínas, de sistemas de tradução isentos de células.
[015]Um outro objetivo da tecnologia inventiva pode referir-se a processos dependentes de energia e/ou ensaios diagnósticos. Especificamente, a tecnologia inventiva pode incluir processos e/ou ensaios dependentes de ATP in vitro melhorados
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7/68 tendo um sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico. Em uma modalidade preferida, o sistema de regeneração de energia inventivo pode incluir um ensaio de atividade proteica dependente de ATP in vitro tendo um sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico. Nesta modalidade, a regeneração de energia dentro do ensaio pode ser obtida através da adição de proteínas cinase sinérgicas de eficiência alta isoladas e purificadas de cepas bacterianas selecionadas. Estas proteínas cinase podem conduzir a regeneração química de eficiência alta de ATP em um ensaio dependente de ATP. Esta modalidade pode levar em consideração tempo de execução de ensaio mais longo antes da supressão de energia química, que por sua vez, pode levar em consideração desempenho e sensibilidade de ensaio melhorado.
[016]O objetivo adicional da tecnologia inventiva pode incluir a identificação, isolamento, purificação e/ou modificação de proteínas RNA polimerase (RNAP) de certas cepas bacterianas que exibem estabilidade, termoestabilidade e atividade e/ou rotatividade enzimáticas aumentadas em sistemas in vitro isentos de células tais como aqueles descritos aqui. Em uma modalidade, uma RNA polimerase bacteriana termoestável pode permitir a biossíntese de RNA mensageiro (mRNA) de construções de DNA em uma estabilidade mais alta e em temperaturas mais altas do que tradicionais que podem auxiliar no desenovelamento de DNA genômico ou Cosmídeo sob, ou sem o controle de, um promotor específico. Em uma modalidade preferida, esta RNAP altamente estável pode ser usada para gerar produtos de expressão em um sistema de expressão isento de células, tal como transcrição in vitro, produção de cDNA in vitro, e sistemas de expressão de transcrição/tradução in vitro. Esta RNAP altamente estável pode ser usada em sistemas de expressão isentos de células tendo enzimas específicas para regenerar fontes de energia/substratos tais como Trifosfato de uridina (UTP), Trifosfato de guanosina (GTP), e/ou Trifosfato de citidina CTP, assim como um sistema de regeneração de energia de polifosfato inorgânico como
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8/68 geralmente descrito aqui. Nesta modalidade, a estabilidade aumentada das proteínas RNA polimerase pode levar em consideração tempo de execução aumentado e rendimentos mais altos em sistemas de expressão isentos de células como geralmente descrito aqui.
[017]Ainda um outro objetivo da invenção pode ser fornecer uma ou mais cepas geneticamente modificadas de bactérias que podem ser otimizadas para o uso em sistemas de expressão isentos de células. Exemplos de tais modificações podem incluir a eliminação de certos genes que podem, por exemplo, ter atividade proteolítica, de ribonuclease, e/ou esporulação para citar alguns. Modalidades adicionais podem incluir bactérias geneticamente engendradas que superexpressam certos fatores sigma que podem facilitar o reconhecimento de promotor in vitro de produtos de PCR lineares, assim como resultar na supra-regulação de RNAP.
[018]Um outro objetivo da invenção corrente pode levar em consideração um novo meio de crescimento de sistema de expressão isento de células. Em certas modalidades, a invenção refere-se a um meio de crescimento modificado que pode ser usado em um sistema de expressão isento de células. Este novo meio pode permitir o crescimento bacteriano ideal sem a presença de sais metálicos tóxicos e ou queladores de íon metálico.
[019]Os objetivos adicionais da tecnologia inventiva podem tornar-se evidentes a partir da divulgação detalhada, figuras e reivindicações apresentadas abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [020]As figuras anexas, que são incorporadas e formam uma parte do relatório descritivo, ilustram uma ou mais modalidades da presente invenção e, junto com a descrição, servem para explicar certos aspectos da tecnologia inventiva. Os desenhos são apenas para o propósito de ilustrar uma ou mais modalidades preferidas da invenção e não devem ser interpretados como limitando a invenção.
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9/68 [021 ]Fiqura 1a: mostra um diagrama geral de um fermentador de sistema de expressão isento de células termotolerante em uma modalidade deste;
[022]Fiqura 1b: mostra um diagrama geral de um fermentador de sistema de expressão isento de células em uma modalidade deste;
[023]Fiqura 2a: mostra um vetor de expressão Gst AdK em uma modalidade deste;
[024]Fiqura 2b: mostra um vetor de expressão TaqPPK em uma modalidade deste;
[025]Fiqura 3: listagem de aminoácidos adicionais adicionados a subunidades de proteína RNAP nativa e RpoD.
[026]Fiqura 4: ensaio de ATPase Luciferase demonstrando a regeneração de ATP utilizando sistema de regeneração de energia acoplado de Gst AdK/PPK. Os dados especificamente mostrando: fileira A: 10 uM de ATP em 200 ul de ensaio de ATPase Luciferase padrão em cada poço; fileira B: 10 uM de ATP, condições de PEP/PK padrão (200 uM de PEP, 0,02 U/ml de PK), fileira C: 10 uM de ATP, razão de PPK/Gst AdK (4:1) total de 1 ug/ml; fileira D: 10 uM de ATP, razão de PPK/Gst AdK (1:1) total de 1 ug/ml; fileira E: 10 uM de ATP, razão de PPK/Gst AdK (1:4) total de 1 ug/ml; colunas 1 a 3: 1 ul (10 mg/ml de poliFosfato); colunas 4 a 6: 3 ul (10 mg/ml de poliFosfato); colunas 7 a 9: 6 ul (10 mg/ml de poliFosfato); colunas 10 a 12: 10 ul (10 mg/ml de poliFosfato). Todas as reações foram registradas continuamente por 137 minutos em placas de 96 poços em um leitor de placa Tecan (eixo X para cada poço). A luminescência relativa total foi registrada e é mostrada para cada poço (eixo Y).
[027]Fiqura 5: Sob as mesmas condições como para a figura 4, reações de ensaio de ATPase Luciferase são apresentadas em representação linear de todos os pontos de dados registrados de luminescência relativa de ensaios de ATPase com base em Luciferase/D-Luciferina de ATP, PEP/PK e do sistema de Gst AdK/PPK PPi para os 392 minutos continuamente registrados (eixo X). A luminescência relativa
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10/68 (mesmo escalonamento, mesma leitura, mesma placa) é reapresentada pelo eixo Y. Uma separação de todos os três sistemas torna-se muito distinta com o passar do tempo.
[028]Fiqura 6: Representação logarítmica da luminescência relativa em ensaios de ATPase com base em Luciferase/D-Luciferina como uma média de todos os pontos de dados registrados (5 experimentos independentes) das 3 repetições de: 10 uM de ATP em 200 ul de ensaio, 10 uM de ATP com condições de PEP/PK (200 uM de PEP, 0,02 U/ml de PK), 10 uM de ATP, razão de PPK/AdK (4:1) total de 1 ug/ml de proteína e 3 ul (10 mg/ml de poliFosfato). Os experimentos foram registrados para um ponto de dados adicional depois de 1008 minutos. Todas as placas permaneceram no leitor de placa para impedir o fotobranqueamento.
[029]Fiqura 7: demonstração do isolamento e purificação de proteínas recombinantes Gst AdK e TaqPPK.
[030]Fiqura 8: demonstração do sistema de regeneração de energia de ATP em concentrações de polifosfato variadas.
[031 IFiqura 9: ensaio de luciferase mostrando produtos de reação de geração de energia de ATP desacoplados.
[032]Fiqura 10: esquema de reação geral do sistema de regeneração de energia de ATP de Gst AdK/TaqPPK como utilizado em um ensaio de luciferase.
[033]Fiqura 11: enzimas sinérgicas Gst AdK e TaqPPK gerando energia de ATP além de polifosfato inorgânico e AMP como uma fonte de substrato.
[034]Fiqura 12: é uma comparação de uma literatura e sequências de proteína PPK recombinantes;
[035]Fiqura 13a-b: é um biorreator de expressão isento de células para um sistema de expressão isento de células em uma modalidade deste.
[036]Fiqura 14: é um aparelho de cultura celular para gerar culturas celulares em uma modalidade deste.
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MODO(S) PARA REALIZAR A(S) INVENÇÃO(ÕES) [037]A presente invenção inclui uma variedade de aspectos, que podem ser combinados em diferentes modos. As seguintes descrições são fornecidas para listar elementos e descrevem algumas das modalidades da presente invenção. Estes elementos são listados com modalidades iniciais, entretanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados em qualquer maneira e em qualquer número para gerar modalidades adicionais. Os exemplos variavelmente descritos e as modalidades preferidas não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas aos sistemas, técnicas, e aplicações explicitamente descritos. Além disso, esta descrição deve ser entendida como sustentando e abrangendo descrições e reivindicações de todas as modalidades, sistemas, técnicas, métodos, dispositivos, e aplicações variados com qualquer número dos elementos divulgados, com cada elemento sozinho, e também com quaisquer e todas as permutações e combinações variadas de todos os elementos neste pedido ou qualquer pedido subsequente.
[038]A tecnologia corrente inclui uma nova regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico tendo aplicações para sistemas de expressão isentos de células incluindo mas não limitados a: sistemas de transcrição in vitro tendo, por exemplo, extratos celulares e/ou substratos e enzimas suplementados levando em consideração a regulação de UTP, GTP, CTP; sistemas de tradução in vitro; sistemas de ensaio de atividade proteica in vitro (dependente de ATP); e sistemas de transcrição/tradução in vitro combinados.
[039]Em certas modalidades, tais produtos genéticos energeticamente sinérgicos utilizados em um sistema de expressão isento de células podem incluir, mas não são limitados a, Adenosil Cinase (AdK), e/ou Polifosfato Cinase (PPK).
[040]Geralmente, PPK catalisa a formação reversível de ATP e polifosfato inorgânico:
ADP + ΡΡίθ ATP + PPi-i
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12/68 [041]Geralmente, Adk catalisa a interconversão de nucleotideos de adenina, isto é, 2 ADP podem ser convertidos em um ATP e um AMP.
ADP θ 1 ATP + 1 AMP [042]Em alguns exemplos, tais produtos genéticos energeticamente sinérgicos podem ser geralmente termoestáveis, e em alguns exemplos, geneticamente modificados para seu uso em um sistema de expressão isento de células. Este sistema de regulação de energia acoplado a AdK/PPK pode ser utilizado em um sistema de expressão isento de células, assim como outras reações dependentes de ATP, aplicação e/ou ensaios diagnósticos.
[043]Como será detalhado abaixo, o sistema de regulação de energia de AdK/PPK pode incluir proteínas AdK e/ou PPK derivadas de uma variedade de fontes, tais como várias espécies bacterianas assim como expressões recombinantes. Como tal, embora em algumas modalidades, certos genes ou proteínas AdK e/ou PPK podem ser especificamente identificados, entretanto, deve ser observado que a identificação de AdK e/ou PPK pode geralmente abranger todos os genes ou proteínas AdK e/ou PPK e seus homólogos, parálogos e ortólogos assim como todas as versões geneticamente modificadas. Tal modificação genética pode incluir mutações, tais como uma ou mais mutações de pontos, que podem realçar a atividade da proteína.
[044]Em uma modalidade, a tecnologia inventiva pode incluir a identificação e isolamento de um ou mais produtos genéticos energeticamente sinérgicos de espécies bacterianas selecionadas. Geralmente referindo-se à figura 4, em uma modalidade preferida AdK pode ser clonada a partir do gDNA de Geobacillus stearothermophilus utilizando técnicas geralmente descritas acima. Além disso, PPK pode ser clonada a partir de gDNA de E. coli (ecPPK) (SEQ ID NO. 9), ou como será debatido abaixo, em uma modalidade preferida, PPK pode ser clonada e/ou modificada de uma bactéria termofílica e/ou termotolerante, tal como Thermus aquaticus (TaqPPK).
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13/68 [045]Por exemplo, em uma modalidade preferida o gDNA de G. stearothermophilus foi isolado de uma cultura noturna de aproximadamente 20 ml. A cultura de G. stearothermophilus pode ser peletizada e o gDNA isolado usando, por exemplo um kit comercialmente disponível, tal como o Kit Macherey-Nagel NuceloSpin Microbial DNA. O gDNA depois pode ser concentrado usando precipitação com etanol. Isto pode ser geralmente realizado adicionando-se um sal e etanol a uma solução contendo o gDNA que pode precipitar o gDNA que pode novamente ser peletizado por exemplo, com uma centrífuga e depois recolocado em suspensão em água isenta de DNase/RNase. O isolamento de gNDA contendo um gene de PPK em T. aquaticus pode ser isolado e concentrado por meios similares como descrito acima.
[046]Similar à descrição referenciada acima, em uma modalidade preferida, tanto Gst AdK quanto TaqPPK podem ser clonadas usando iniciadores específicos que podem ser designados com base nas sequências de nucleotídeo de cada gene. Nesta modalidade, tanto iniciadores dianteiros quanto reversos podem ser gerados que contêm sítios de restrição específicos para a introdução dos genes objetos em um vetor de expressão selecionado. Em uma modalidade preferida, iniciadores dianteiros e reversos podem ser gerados que contêm sítios de restrição para introduzir especificamente os genes Gst AdK e/ou Vetores de Expressão TaqPPK em IBA StarGate. Os iniciadores objetos e gDNA de Gst e E. coll podem estar sujeitos a reações em cadeia de polimerase individuais (PCR) para amplificar os genes Gst AdK e/ou TaqPPK respectivamente. Em uma modalidade, PCR’s individuais para ambos os genes Gst AdK e/ou ecPPK podem ser realizadas usando reações MasterMix padrão e 50 ng de gDNA de entrada isolado de G. stearothermophilus e E. coll (Tabela 1) respectivamente.
[047]Em uma modalidade preferida, uma enzima PPK termoestável pode ser derivada da T. aquaticus termofílica (TaqPPK), e pode ser ainda acoplada no sistema de expressão isento de células inventivo com o Gst AdK (SEQ ID NO. 8) geralmente
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14/68 identificado acima. Nesta modalidade, a sequência de proteína de literatura PPK (SEQ ID NO. 10; figura 12) foi usada para retro-traduzir em DNA. A sequência depois foi otimizada de códon para E. coli e o gene foi subclonado em pET151/D-TOPO para expressão (Figura 2b). Nesta modalidade, o gene PPK subclonado, geralmente identificado como TaqPPK, de Thermus aquaticusto\ geneticamente modificado para conter aminoácidos que não ocorrem naturalmente adicionais no término N. Estes aminoácidos que não ocorrem naturalmente adicionais incluem: 1) um rótulo de 6xHis; 2) um rótulo de epítopo V5 e 3) um sítio de divagem de TEV (SEQ ID NO. 11). Como observado na tabela 2, estas três modificações genéticas são parte da cadeia principal de pET151 e podem facilitar a expressão e purificação. TaqPPK foi expressado em BL21 (DE3) e purificado usando os métodos geralmente descritos aqui.
[048]Em uma modalidade, as sequências de DNA de gene Gst AdK e TaqPPK que foram amplificadas através do processo de PCR podem ser isoladas. Em uma modalidade preferida, reações PCR podem ser analisadas em géis de agarose de brometo de etídio a 1 % e os genes Gst AdK e/ou PPK podem ser isolados por extração de gel de agarose e/ou métodos de purificação de PCR conhecidos dentro da indústria tais como Macherey-Nagel NucleoSpin Gel e/ou PCR Clean-up. Estes genes isolados depois podem ser inseridos em um vetor de liberação apropriado. Por exemplo, em uma modalidade, os fragmentos de genes previamente gerados e um vetor selecionado, nesta modalidade, um vetor apropriado (ver, por exemplo, fig. 2ab respectivamente), pode ser digerido com enzima(s) de restrição selecionada(s) e ligado através de, por exemplo, uma reação de T4 DNA ligase a 3:1 que pode estar disponível comercialmente como um Kit Thermo Fisher Scientific Rapid DNA Ligation. Deve ser observado que para isto, e todas as outras modalidades, cada fragmento de gene pode ser separadamente ligado em um vetor de liberação individual e transformado em uma cepa bacteriana selecionada ou outra célula apropriada. Outras modalidades podem incluir ligação de múltiplos fragmentos de gene em um vetor de
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15/68 liberação e transformados em uma cepa bacteriana selecionada para ser coexpressada.
[049]Nesta modalidade os genes Gst AdK e TaqPPK ligados e o vetor plasmídico podem ser individualmente ou coletivamente transformados em uma cepa bacteriana selecionada. Em uma modalidade preferida, o(s) vetor(es) ligado(s) individual(is) podem ser transformados em E. coli competente Top10 que pode ser configurada para ter uma taxa alta de eficiência de transformação. Nesta modalidade, E. coli competente Top10 pode incluir mutações no gene recA que podem reduzir a recombinação de DNA promovendo estabilidade de vetor plasmídico, e podem incluir ainda um gene knockout endA que pode reduzir a atividade de endonuclease não específica melhorando o rendimento e qualidade do vetor plasmídico.
[050]Bactérias transformadas com êxito podem ser identificadas, por exemplo, através de PCR de detecção de gene positiva, ou outros métodos conhecidos, e depois podem ser subsequentemente cultivadas para gerar múltiplas cópias do vetor plasmídico dentro da colônia bacteriana de crescimento. Em uma modalidade preferida, o DNA do vetor plasmídico pode ser isolado e sub-transformado em uma outra cepa bacteriana selecionada. Em uma modalidade preferida, o DNA do vetor plasmídico preparado pode ser sub-transformado em uma cepa de expressão alta de E. coli, tal como BL21 (DE3) para expressão proteica ideal.
[051 ]Em uma modalidade, a tecnologia inventiva pode incluir expressão individual de ambas as proteínas Gst AdK e TaqPPK cada uma tendo um rótulo molecular selecionada. Nesta modalidade, proteínas Gst AdK e/ou PPK podem todas ser configuradas para conter um rótulo poli-His ou His-6, que pode ser usada mais tarde para a purificação de proteína. Nesta modalidade, as proteínas Gst AdK e/ou PPK expressadas podem ser detectadas e purificadas porque a sequência de resíduos de histidina se liga a vários tipos de íons metálicos imobilizados, incluindo níquel, cobalto e cobre, sob condições tampão apropriadas.
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16/68 [052]Em uma modalidade, uma proteína Gst AdK (SEQ ID NO. 8) e/ou TaqPPK (SEQ ID NO. 11) pode ser individualmente expressada e purificada. Nesta modalidade preferida, as proteínas Gst AdK e/ou PPK individualmente rotuladas com His-6 podem ser expressadas em uma cepa BL21 (DE3) de E. coli. Nesta modalidade, a cepa BL21 (DE3) de E. coli pode ser cultivada em meio NYZ, que entre outras coisas, podem carecer de lactose que pode induzir certas proteases que podem degradar potencialmente quaisquer proteínas expressadas, reduzindo os rendimentos globais. A expressão proteica pode ser induzida em uma certa densidade óptica (OD) de crescimento bacteriano. Em uma modalidade preferida, em aproximadamente OD 0,7, a expressão proteica pode ser induzida pela adição de 0,25 mM de isopropil β-D-ltiogalactopiranosídeo (IPTG) por 6 a 8 horas a 30 a 32 °C. IPTG é um reagente molecular que imita alolactose, um metabolite de lactose que desencadeia a transcrição de um operon lac no DNA do vetor plasmídico, induzindo desse modo a expressão proteica onde o gene objeto, neste caso os genes Gst AdK e/ou TaqPPK respectivamente, que podem estar sob o controle de um operador lac.
[053]Nesta modalidade preferida, as culturas de BL21 (DE3) individuais podem ser lisadas e um lisato pode ser preparado e passado através de uma resina carregada com íon metálico. Os lisatos individuais podem passar através de uma resina IMAC carregada com Ni, onde os rótulos His-6 nas proteínas Gst AdK e/ou TaqPPK podem se ligar ao íon níquel imobilizado na resina. Proteínas que não de ligação e de ligação não específica podem ser ainda removidas, nesta modalidade através da adição de 5 mM de Imidazol, as proteínas que não de ligação e de ligação não específica podem ser removidas enquanto as proteínas Gst AdK e TaqPPK permanecem ligadas à resina. Novamente, como observado acima, as etapas de purificações de proteína anteriormente mencionadas podem ser realizadas individualmente para ambas as proteínas Gst AdK e TaqPPK.
[054]As proteínas Gst AdK e/ou TaqPPK depois podem ser individualmente
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17/68 eluídas pela adição de 300 mM de Imidazol ou outros métodos conhecidos. A presença das proteínas pode ser demonstrada através de SDS-PAGE e a pureza de proteína pode ser adicionalmente mostrada por perfis de FPLC UV. Em uma modalidade preferida, as proteínas individualmente purificadas podem ser armazenadas em condições tampão compatíveis à transcrição/tradução in vitro em uma concentração de 13 mg/ml para Gst AdK e 10 mg/ml para PPK a -20 °C para uso mais tarde.
[055]Além disso, ensaios de determinação de ATP podem ser realizados para verificar a funcionalidade das proteínas Gst AdK e/ou PPK na presença de um polifosfato. Um tal ensaio pode quantificar os níveis de trifosfato de adenosina (ATP) assim como produção de ATP. ATP (ver figura 6) é um nucleotídeo de adenina compreendido de três grupos fosfato esterificados à porção açúcar, encontrada em todas as células vivas. Trifosfato de adenosina está envolvido na produção de energia para processos metabólicos assim como síntese de RNA e proteína.
[056]Em uma modalidade preferida, polifosfato inorgânico, neste caso polifosfato de sódio, pode ser fornecido como uma fonte de energia para o sistema em um sistema dependente de ATP in vitro. Gst AdK e/ou TaqPPK isoladas e purificadas podem ser adicionadas ao sistema de expressão isento de células. Em uma modalidade preferida Gst AdK para TaqPPK podem ser adicionadas a um sistema de expressão isento de células, ou outro ensaio, diagtnóstico ou sistema, em que a razão de Gst AdK para TaqPPK pode incluir quantidades mais altas de Gst AdK quando comparado a TaqPPK. Em em uma modalidade, Gst AdK para TaqPPK pode ser adicionada a este sistema em uma razão molar aproximada entre aproximadamente 3:1 a 4:1. Deve ser entendido que tais razões são meramente exemplares e outras razões estão dentro do escopo desta invenção. Por exemplo, em outras modalidades, Gst AdK para TaqPPK pode ser adicionada a este sistema em uma razão molar aproximada incluindo, mas não limitada a [Ver e-mail de
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18/68 concentração] 1:1,2:1,3:1,5:1,5:1,7:1,8:1,9:1, 10:1 e semelhantes.
[057]Como geralmente mostrado na figura 8, em uma outra modalidade preferida, Gst AdK e/ou TaqPPK isoladas e purificadas podem ser adicionadas a este sistema de expressão isento de células com uma quantidade de polifosfato inorgânico. Em uma modalidade, esta quantidade de polifosfato inorgânico pode incluir uma faixa de concentração de polifosfato ideal. Nesta modalidade preferida, tal faixa de concentração de polifosfato ideal sendo geralmente definida como a concentração de polifosfato inorgânico (PPi) que mantém o equilíbrio da reação estável. Nesta modalidade preferida, a faixa de concentração de polifosfato ideal pode ser aproximadamente 0,2 a 2 mg/ml PPi.
[058]Como observado acima, PPK pode sintetizar ADP a partir de polifosfato e AMP. Nesta modalidade preferida a ação acoplada de Gst AdK e PPK, pode remover difosfato de adenosina (ADP) do sistema convertendo-se dois ADP a um ATP e um monofosfato de adenosina (AMP):
Gst AdK ▼
ADP 1 ATP + 1 AMP [059]Esta reação pode ser suficientemente rápida o bastante para conduzir uma reação em equilíbrio de PPK para a produção de ADP:
TaqPPK ▼
AMP + (fosfato)n —► ADP + (fosfato)n-i [060]Neste sistema, a presença de concentrações mais altas de AMP pode conduzir ainda a reação de TaqPPK para ADP.
[061]Novamente, como demonstrado nas figuras 4 a 6, em ensaios de determinação de ATP, a taxa de regeneração de ATP do sitema de regeneração de energia (ATP) de PPK/AdK é significativamente mais alta comparado aos sistemas de
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19/68 produção de energia de PEP/PK tradicionais. Em algumas modalidades, a taxa de conversão de ATP inicial pode ser aproximadamente 10 vezes mais alta comparado a sistemas de PEP/PK tradicionais sob condições comparáveis. Adicionalmente, o Gst AdK e PPK demonstrados ainda nas figuras 4 a 6, podem ter um número de rotatividade total mais alto que resulta em uma regeneração de ATP detectável por um período prolongado, que nesta modalidade foi até 12 horas.
[062]A incorporação de TaqPPK pode resultar ainda em uma regeneração de ATP detectável em excesso de 12 horas. Tal rotatividade de regeneração de ATP sendo significativamente mais alta do que sistemas de regeneração de ATP in vitro tradicionais descrito acima. Em outras modalidades, Gst AdK e/ou TaqPPK podem incluir tolerância salina melhorada permitindo atividade e/ou rotatividade enzimáticas contínuas em concentrações salinas que seriam inibitórias para outras proteínas AdK. Como tal, pode ser observado como Gst AdK e TaqPPK, (assim como AdK e/ou PPK e seus homólogos derivados de várias outras bactérias, incluindo mas não limitados a, cepas microbianas termofílicas e/ou termotolerantes) na presença de um polifosfato podem funcionar sinergicamente dentro de um sistema de expressão isento de células para regenerar a fonte de energia celular ATP:
Gst AdK ▼
ADP 1 ATP + 1 AMP ▲
TaqPPK ▼
▼
AMP + (fosfato)n —► ADP + (fosfato)n-i [063]Certas modalidades da tecnologia inventiva podem incluir sistemas de expressão isentos de células tendo um sistema de regeneração de energia
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20/68 melhorado. Em uma modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células, tal como um sistema de transcrição e/ou tradução in vitro pode ser configurado para incluir uma capacidade de regeneração de energia de polifosfato inorgânico que pode incluir ainda RNA polimerase termoestável (RNAP) de cepas bacterianas selecionadas.
[064]Em uma modalidade preferida, as subunidades de RNAP alfa (SEQ ID NO. 1), beta (SEQ ID NO. 2), beta’ e ou beta’ (opt) (SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4 respectivamente), delta (SEQ ID NO. 5) e ômega (SEQ ID NO. 6) das espécies bacterianas Geobacillus stearothermophilus foram identificadas, clonadas, purificadas e preparadas para o uso em um sistema de expressão de proteína isento de células. Deve ser observado que G. stearothermophilus é uma bactéria termofílica grampositiva caracterizada por uma membrana celular interna e uma parede celular espessa. G. stearothermophilus é um anaeróbio em forma de bastão encontrado em habitats termofílicos como fontes hidrotermais ou fontes termais.
[065]Uma RNAP de G. stearothermophilus (Gst RNAP) pode ser identificada, clonada, expressada e depois purificada como geralmente descrito aqui. Nesta modalidade, a Gst RNAP pode ser mais estável do que, por exemplo, RNAP padrão de bactérias não extremófilas tais como E. coli. A Gst RNAP pode ter termoestabilidade melhorada, assim como estabilidade cinética melhorada, tal que pode permanecer viável catalisar a produção de mRNA em um sistema in vitro por um período de tempo mais longo do que outras variantes de RNAP usadas em sistemas de expressão isentos de células tradicionais.
[066]Em uma modalidade preferida, uma Gst RNAP termoestável pode ser clonada e transformada em uma cepa de E. coli expressão alta. Esta Gst RNAP termoestável pode ser clonada, isolada e purificada depois introduzida em um sistema de expressão isento de células na presença de um meterial genético alvo, tal como plasmídeo e/ou DNA linear contendo um ou mais genes selecionados, e deixada
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21/68 produzir transcritos de mRNA dos genes selecionados. Em uma modalidade, estes transcritos de mRNA podem ser introduzidos a, ou combinados com um extrato bacteriano ou outro extrato celular. O extrato pode conter os elementos necessários para a transcrição de DNA a RNA, tradução de RNA à proteína, enovelamento de proteínas, e metabolismo energético. Como observado acima, nesta modalidade, TaqPPK e Gst AdK isoladas e purificadas podem ser adicionadas a, por exemplo, um extrato celular de um sistema de expressão isento de células, assim como uma quantidade de um ou mais polifosfatos durante a tradução de proteína para fornecer um mecanismo de regeneração de ATP melhorada.
[067]Nesta modalidade preferida, a tradução dos transcritos de mRNA alvos podem gerar uma ou mais proteínas selecionadas enquanto a atividade sinérgica da TaqPPK, Gst AdK e polifosfato fornece regeneração de ATP realçada, permitindo tempos de execução mais longos do sistema de expressão isento de células, em temperaturas possivelmente mais altas se desejado, e tendo um número de rotatividade mais alto resultando em rendimentos proteicos globais mais altos. Nesta modalidade, a presença de uma Gst RNAP altamente estável leva em consideração tempos de execução mais longos para a produção de transcritos de mRNA, em temperaturas possivelmente mais altas sem ser desnaturada e tendo um número de rotatividade mais alto resultando em transcritos de mRNA mais altos e finalmente rendimentos proteicos dentro do sistema de expressão isento de células.
[068]A invenção refere-se ainda a um sistema de transcrição/tradução in vitro melhorado, geralmente referido como um sistema de expressão isento de células. Em uma modalidade, este sistema de expressão isento de células pode incluir uma ou mais cepas geneticamente modificadas de bactérias termofílicas ou termotolerantes que podem ser desenvolvidas para o uso em preparação de extrato isento de células. Em uma modalidade preferida, uma cepa geneticamente modificada de uma bactéria termofílica, tal como uma cepa de Geobacillus, pode ser desenvolvida e usada para
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22/68 preparação de extrato isento de células (CF) e para transcrição/tradução in vitro. Cepas de Geobacillus geralmente exibem uma temperatura de crescimento alta (52 a 55 QC) comparado a E. coli (35 a 37 QC). Este diferencial térmico pode levar em consideração estabilidade proteica mais alta e toleração de densidades proteicas mais altas em preparações de extrato CF. Além disso, atributos termofílicos de cepas de Geobacillus podem levar em consideração a estabilidade aumentada para outras funções de enzima, e funções enzimáticas, tais como, mas não limitadas a: aminoácido-sintases; ribossomos; RNA polimerase dependente de DNA; fator(es) sigma; e enzimas de regeneração de ATP glicolíticas.
[069]Bactérias do gênero Geobacillae também são vantajosas para preparações de extrato CF. Sendo firmicutes, elas são tolerantes a O2 ou estritamente aeróbicas, sob condições específicas. Preparações de manejo, fermentação e extrato de termófilos anaeróbicos podem ser significativamente mais complexas, mais caras, e têm incertezas adicionais relacionadas à estabilidade da enzima devido a condições oxidantes da atmosfera. Além disso, Geobacilli são conhecidos como não tendo nenhuma implicação à saúde conhecida a seres humanos, e como tal, são adequados para produzir material clínico a partir de um sistema CF.
[070]Com respeito à cepa de Geobacillus geneticamente modificada da invenção, foi determinado que 0 sítio de ligação a ribossomo (RBS) foi prognosticado e demonstrado por análise genética para ser idêntico, ou comparável, ao RBS padrão de construções de expressão para cepas de expressão proteica de E. coli, permitindo que a tecnologia inventiva em uma modalidade preferida preserve e utilize construções genéticas existentes.
[071 ]Em uma outra modalidade preferida, a cepa de Geobacillus geneticamente modificada da invenção demonstrou cobertura favorável de uso de códon de tRNA. Em uma modalidade, análise bioinformática foi realizada usando uma ferramenta de software proprietária com distribuição de população de tRNA para
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23/68 identificar cepas que abrangem todos ou a maioria de códons potenciais para impedir o retardo da reação de tradução in vitro devido a códons de tRNA raros ou não abrangidos. Extratos desta cepa de Geobacillus também podem utilizar tRNAs de E. coli purificados, que são reconhecidos pelas aminoácido sintases da cepa. Isto pode permitir cobertura de códon completa e quase igualmente distribuída. Esta modalidade toma a distribuição desigual natural de uso de códon de tRNA de cepas variadas, tais como Geobacillus stearothermophilus, e Thermophilus aquaticus em consideração a favor de uma distribuição termodinamicamente balanceada.
[072]Como geralmente debatido acima, em uma modalidade preferida, uma cepa bacteriana geneticamente modificada foi desenvolvida para o uso em um sistema de expressão isento de células. Em uma modalidade preferida, uma cepa de Geobacillus foi geneticamente modificada para remover e/ou reduzir a expressão de certas enzimas, e para superproduzir constitutivamente enzimas durante o processo de fermentação para facilitar o uso de preparações de extrato CF. (Esta cepa geneticamente modificada algumas vezes pode ser geralmente referida como “CF de Geobacillus”). Nesta modalidade, um Geobacilli foi geneticamente modificado para inativar o OmpT-homólogo de protease forte, RNasel, e a DNase dependente de metilação de DNA. Nesta modalidade, as modificações de inativação gênica foram realizadas através da remoção seletiva do controle de transcrição destes genes a partir do genoma bacteriano. Outros métodos de inativação também podem ser utilizados, visto que eles são geralmente conhecidos e entendidos na técnica. Nesta modalidade, a atividade do operon de esporulação dependente de densidade de cultura foi reduzida por modificação genética (inativada) para reduzir o processo de esporulação e para aumentar a densidade bacteriana em cultura considerando eficiência mais alto e rendimento de extrato CF melhorado.
[073]Novamente, como geralmente debatido acima, em certas modalidades uma cepa bacteriana geneticamente modificada foi desenvolvida para superexpressar
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24/68 o fator sigma, RpoD, para reconhecer um promotor específico para transcrição favorecida in vitro a partir de produtos de PCR lineares. Em uma modalidade preferida, um CF de Geobacillus foi geneticamente modificado para superexpressar o fator sigma, RpoD durante a fermentação da cepa. Esta superexpressão geneticamente modificada de RpoD elevou a expressão deste fator sigma acima da concentração celular natural de sigma 70, que por sua vez, resultou em uma concentração aumentada da RNAP bacteriana na cepa de Geobacillus geneticamente modificada. Finalmente, a cepa de Geobacillus bacteriana geneticamente modificada exibe taxas de crescimento comparáveis às cepas de E. colide expressão proteica conhecidas na técnica. Vantagens adicionais de usar a cepa de Geobacilli geneticamente modificada para preparação de extrato CF incluem: 1) uma temperatura de crescimento alta (aproximadamente 52 a 55 QC) que significativamente reduz a contaminação potencial da cultura; e 2) meios de fermentação “gastos” são simples e não perigosos, reduzindo a necessidade de tratamento de resíduos, como seria necessário para termófilos anaeróbicos.
[074]Em modalidade adicional, um extrato celular pode ser gerado a partir de vários microrganismos diferentes. Por exemplo, extratos celulares podem ser gerados a partir de Escherichia coli (ECE), reticulócitos de coelho (RRL), gérmen de trigo (WGE), e células de inseto (ICE), e ainda células mamíferas (MC). Em modalidade adicional, extratos celulares de microalgas podem ser gerados. Uma tal modalidade pode ser vantajosa, visto que bactérias não fornecem qualquer mecanismo para reconhecer e remover os introns. Por outro lado, microalgas, como Nannochloropsis, têm introns e o mecanismo cleular as remove - o que naturalmente seria um constituinte de um extrato celular de microalgas tornando a invenção corrente aplicável para a produção de proteínas vegetais e outros produtos de expressão.
[075]Expressão isenta de células in vitro, como usado aqui, refere-se à síntese isenta de células de polipeptídeos em uma mistura ou solução de reação
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25/68 compreendendo extratos biológicos e/ou componentes de reação isentos de células definidos. A mistura de reação pode compreender um padrão, ou padrão genético, para a produção da macromolécula, por exemplo, DNA, mRNA, etc.; monômeros para a macromolécula a ser sintetizada, por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, etc., e tais cofatores, enzimas e outros reagentes que são necessários para a síntese, por exemplo, ribossomos, tRNA, polimerases, fatores transcricionais, etc. A reação de síntese isenta de células, e/ou componentes de sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular podem ser realizados/adicionados como lote, fluxo contínuo, ou fluxo semi-contínuo.
[076]Como observado acima, a invenção corrente pode ser aplicável a vários ensaios, e outras aplicações de diagtnóstico. Por exemplo, em uma modalidade, a adição das enzimas duplas Adk/PPK, junto com PPi e AMP pode levar em consideração a regeneração de ATP dentro de qualquer ensaio dependente de energia de ATP ou aplicação de diagtnóstico, tal como um ensaio de luciferase. Em uma modalidade preferida, uma primeira quantidade de Gst AdK, e uma primeira quantidade de TaqPPK, pode ser adicionada a um ensaio dependente de ATP ou diagtnóstico, junto com uma primeira quantidade de PPi e uma primeira quantidade de AMP. Nesta modalidade preferida, a regeneração de energia de ATP celular pode ser obtida considerando melhorar o tempo de execução, produtividade, sensibilidade de ensaio e/ou diagtnóstico, assim como perder custo devido à natureza barata dos componentes comparado a técnicas de suplementação de energia tradicionais. Cada um dos componentes referenciados acima pode ser ainda suplementado durante um curso de tempo específico.
[077]Exemplos de tal aplicação dependente de ATP podem incluir, mas não ser limitados a reações ópticas ou reações enzimáticas dependentes de energia podem de benefício; Epimerases, Desidratases, NADPH-Hidrato-Desidratases, Celulases, enzimas remodeladoras de Cromatina, peptídeo ligases dependentes de
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ATP, ligação de DNA, e sistemas de expressão isentos de células tradicionais. Ο sistema inventivo pode ser aplicado na geração de: Sintetases; Processos de fosforilação; enzimas dependentes de CoA (detergentes, indústria de flavor); Desaminoácido amidas (Desala-Desala-Ligases) [078]Como observado acima, em uma modalidade da presente invenção um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de Adk/PPK acoplado pode incluir a adição de polifosfato inorgânico (PPi). Em uma outra modalidade, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de Adk/PPK acoplado pode incluir a adição de uma primeira quantidade de PPi, enquanto ainda outras modalidades podem incluir a adição de uma pluralidade de quantidades de PPi. Nesta modalidade, uma pluralidade de quantidades de PPi pode ser adicionada emn um intervalo de tempo predeterminado.
[079]Em uma modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de AdK/PPK acoplado pode incluir uma faixa de concentração suficiente para manter a reação de regulação de energia no estado aproximado de equilíbrio, e/ou produzir o nível máximo, ou desejado de ATP. Ainda em uma outra modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de AdK/PPK acoplado pode incluir concentração aproximadamente entre ,1 e 50 mg/m de IPPi ou mais alta. Ainda em uma outra modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de AdK/PPK acoplado pode incluir uma faixa de concentração suficiente para manter a reação de regulação de energia em um estado aproximado de equilíbrio, tal faixa estando aproximadamente entre ,3 e 4 mg/mIPPi.
[080]Ainda em uma outra modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de AdK/PPK acoplado pode incluir uma faixa de concentração suficiente para manter a reação de regulação
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27/68 de energia em um estado aproximado de equilíbrio, tal faixa estando aproximadamente entre ,2 e 2 mg/ml de PPi. Ainda em uma outra modalidade preferida, um sistema de expressão isento de células tendo um sistema de regeneração de energia de AdK/PPK acoplado pode incluir uma faixa de concentração suficiente para manter a reação de regulação de energia no estado aproximado de equilíbrio, tal faixa estando aproximadamente entre ,5 e ,6 mg/ml de PPi. Naturalmente, todas as tais razões podem ser ampliadas ou diminuídas como pode ser necessário com base nos requisitos de tamanho, duração e energia de uma reação de expressão isenta de células. Em algumas outras modalidades, uma faixa funcional também pode incluir nenhum PPi adicional, ou 0 mg/ml.
[081]Geralmente referindo-se às figuras 13a-b, em uma modalidade a invenção refere-se a um biorreator de expressão isento de células (22) (ver elementos 10 a 20). Deve ser observado que um tal biorreator é exemplar apenas visto que múltiplos sistemas isentos de células podem ser implementados com esta invenção. O biorreator inventivo pode permitir a expressão isenta de células em temperaturas mais altas do que tradicionais e pode ser configurado para conduzir como um lote, contínuo ou semi-contínuo, a partir de, por exemplo uma solução de reação alimentadora.
[082]Novamente referindo-se à figura 14, nesta modalidade a invenção pode incluir ainda um aparelho de cultura isenta de células (21) (ver elementos 1 a 9). Este aparelho de cultura celular pode ser configurado para cultivar, em certa modalidade preferida, bactérias termofílicas. Um vaso de fermentação pode ser removível e separadamente autoclavável em uma modalidade preferida. Adicionalmente, este aparelho de cultura isenta de células (21) pode ser configurado para acomodar o crescimento de aeróbico assim como anaeróbico com organismos. Além disso, tanto o biorreator de expressão isento de células (22) quanto o aparelho de cultura isenta de células (21) podem acomodar uma variedade de culturas celulares, uma tal
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28/68 microalga, células vegetais e semelhantes.
[083]Deve ser observado que o sistema de expressão de proteína isento de células seguintes é exemplar em natureza e diferentes configurações e sistemas podem ser incorporados com o sistema de regeneração de energia de polifosfato inorgânico anteriormente mencionado. Além disso, o novo sistema de regeneração de energia de polifosfato inorgânico pode ser adaptado a uma variedade de sistemas de expressão isentos de células conhecidos, e pode ser ainda configurado em um kit adaptável.
[084]Porque esta invenção envolve a produção de organismos geneticamente alterados e envolve técnicas de DNA recombinantes, as seguintes definições são fornecidas para auxiliar em descrever esta invenção. Os termos “isolado”, “purificado”, ou “biologicamente puro” como usado aqui, referem-se ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material em seu estado nativo ou quando o material é produzido. Em uma modalidade exemplar, pureza e homogeneidade são determinadas usando técnicas da química analítica tais como eletroforese de poliacrilamida em cromatografia em gel ou líquida de alto desempenho. Um ácido nucleico ou bactérias particulares que são as espécies predominantes presentes em uma preparação são substancialmente purificados. Em uma modalidade exemplar, o termo “purificado” denota que um ácido nucleico ou proteína que dá origem a essencialmente uma faixa em um gel eletroforético. Tipicamente, ácidos nucleicos ou proteínas isolados têm um nível de pureza expressado como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza para o componente é cerca de 60 %, cerca de 70 % ou cerca de 80 % e a extremidade superior da faixa de pureza é cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 % ou mais do que cerca de 90 %.
[085]O termo “ácido nucleico” como usado aqui refere-se a um polímero de ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Tipicamente, polímeros de “ácido
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29/68 nucleico” ocorrem em forma de filamento único ou duplo, mas também são conhecidos como formando estruturas compreendendo três ou mais filamentos. O termo “ácido nucleico” inclui polímeros de ácido nucleico que ocorrem naturalmente assim como ácidos nucleicos compreendendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificada, que são sintéticos, que ocorrem naturalmente, e que não ocorrem naturalmente, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência, e que são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Análogos exemplares incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonates, quiral-metil fosfonatos, 2-0metil ribonucleotídeos, e peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs). “DNA”, “RNA”, “polinucleotídeos”, “sequência de polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo”, “nucleotídeo”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico”, “fragmento de ácido nucleico”, e “fragmento de ácido nucleico isolado” são usados permutavelmente aqui. Para ácidos nucleicos, tamanhos são fornecidos em quilobases (kb) ou pares de base (pb). Estimativas são tipicamente derivadas de eletroforese em gel de agarose ou acrilamida, a partir de ácidos nucleicos sequenciados, ou a partir de sequências de DNA publicadas. Para proteínas, tamanhos são fornecidos em quilodaltons (kDa) ou números de resíduos de aminoácido. Tamanhos de proteínas são estimados a partir de eletroforese em gel, a partir de proteínas sequenciadas, a partir de sequências de aminoácido derivadas, ou a partir de sequências de proteína publicadas.
[086]A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas destes (por exemplo, substituições de códon degeneradas), a sequência complementar (ou de complemento), e a sequência de complemento reversa, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degeneradas podem ser obtidas gerando-se sequências em que a terceira posição de
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30/68 um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxiinosina (ver, por exemplo, Batzer etal., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka etal., J. Biol. Chem. 260:2605 - 2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 - 98 (1994)). Além da natureza degenerada dos códons de nucleotideo que codificam aminoácidos, alterações em um polinucleotídeo que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um sítio dado, mas não afetam as propridades funcionais do polipeptídeo codificado, são bem conhecidas na técnica. “Substituições de aminoácido conservatives” são aquelas substituições que são prognosticadas para interferir menos com as propriedades do polipeptídeo de referência. Em outras palavras, substituições de aminoácido conservatives substancialmente conservam a estrutura e a função da proteína de referência. Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica um outro resíduo menos hidrofóbico, tal como glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, tal como valina, leucina, ou isoleucina. Similarmente, mudanças que resultam na substituição de um resíduo negativamente carregado no lugar de um outro, tal como ácido aspártico no lugar de ácido glutâmico, ou um resíduo positivamente carregado no lugar de um outro, tal como lisina no lugar de arginina ou histidina, também podem ser esperadas para produzir uma proteína ou polipeptídeo funcionalmente equivalentes. Substituições de aminoácido conservatives exemplares são conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. Substituições de aminoácido conservatives geralmente mantêm (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha beta ou conformação helicoidal alfa, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio da substituição, e/ou (c) a massa da cadeia lateral.
[087]Homologia (por exemplo, homologia percentual, identidade de sequência + similaridade de sequência) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia computando um alinhamento de sequência aos pares.
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Como usado aqui, “identidade de sequência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo inclui referência aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada em referência a proteínas, é reconhecido que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácido conservativas, onde resíduos de aminoácido são substituídos no lugar de outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e portanto, não mudam as propridades funcionais da molécula. Onde sequências diferem em substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir quanto à natureza conservativa da substituição. Sequências que diferem em tais substituições conservativas são para ter “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica. Tipicamente isto envolve a classificação de uma substituição conservativa como uma má combinação parcial ao invés de uma completa, aumentando desse modo a porcentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico é fornecido uma classificação de 1 e uma substituição não conservativa é fornecida uma classificação de zero, uma substituição conservativa é fornecida uma classificação entre zero e 1. A classificação de substituições conservativas é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Henikoff S e Henikoff JG. [Amino acid substituition matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915 -9], [088]De acordo com uma modalidade específica, as sequências homólogas são pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou ainda idênticas às sequências (sequências de ácido nucleico ou aminoácido) fornecidas aqui. Sequências homólogas das SEQ ID Nos 1 a 22 entre 50 % e 99 % podem ser incluídas em certas modalidades da presente invenção.
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32/68 [089]O termo “iniciador”, como usado aqui, refere-se a um oligonucleotídeo capaz de agir como um ponto de iniciação da síntese de DNA sob condições adequadas. Tais condições incluem aquelas em que a síntese de um produto de extensão de iniciador complementar a um filamento de ácido nucleico é induzido na presença de quatro diferentes trifosfatos de nucleosídeo e um agente para a extensão (por exemplo, uma DNA polimerase ou transcriptase reversa) em um tampão apropriado e em uma temperatura adequada.
[090]Um iniciador é preferivelmente um DNA de filamento único. O comprimento apropriado de um iniciador depende do uso intencionado do iniciador mas tipicamente varia de cerca de 6 a cerca de 225 nucleotídeos, incluindo faixas intermediárias, tais como de 15 a 35 nucleotídeos, de 18 a 75 nucleotídeos e de 25 a 150 nucleotídeos. Moléculas iniciadoras curtas geralmente requerem temperaturas mais frias para formar complexos híbridos suficientemente estáveis com o padrão. Um iniciador não precisa refletir a sequência exata do ácido nucleico padrão, mas deve ser suficientemente complementar para hibridizar com o padrão. O projeto de iniciadores adequados para a amplificação de uma sequência alvo dada é bem conhecido na técnica e descrito na literatura citada aqui.
[091 ]Como usado aqui, uma “polimerase” refere-se a uma enzima que catalisa a polimerização de nucleotídeos. “DNA polimerase” catalisa a polimerização de desoxirribonucleotídeos. DNA polimerases conhecidas incluem, por exemplo, DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA polimerase I de E. coli, DNA polimerase de T7 e DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq), entre outras. “RNA polimerase” catalisa a polimerização de ribonucleotídeos. Os exemplos precedentes de DNA polimerases também são conhecidos como DNA polimerases dependentes de DNA. DNA polimerases dependentes de RNA também caem dentro do escopo de DNA polimerases. Transcriptase reversa, que inclui polimerases virais codificadas por retrovirus, é um exemplo de uma DNA polimerase dependente de RNA. Exemplos
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33/68 conhecidos de RNA polimerase (“RNAP”) incluem, por exemplo, RNA polimerase de T3, RNA polimerase de T7, RNA polimerase de SP6 e RNA polimerase de E. coli, entre outras. Os exemplos precedentes de RNA polimerases também são conhecidos como RNA polimerase dependente de DNA. A atividade de polimerase de qualquer uma das enzimas acima pode ser determinada por meios bem conhecidos na técnica.
[092]O termo “mistura de reação”, ou “mistura de reação isenta de células” como usado aqui, refere-se a uma solução contendo reagentes necessários para realizar uma reação dada. Uma “mistura de reação” ou “solução de reação” de sistema de expressão isento de células tipicamente contém um extrato bruto ou parcialmente purificado, padrão de tradução de nucleotídeo (tal como de uma bactéria, célula vegetal, microalgas, fungos, ou célula mamífera), e um tampão de reação adequado para promover a síntese proteica isenta de células a partir do padrão de tradução. Em alguns aspectos, a mistura de reação CF pode incluir um padrão de tradução de RNA exógeno. Em outros aspectos, a mistura de reação CF pode incluir um padrão de expressão de DNA que codifica um quadro aberto de leitura operavelmente ligado a um elemento promotor para uma RNA polimerase dependente de DNA. Nestes outros aspectos, a mistura de reação CF também pode incluir uma RNA polimerase dependente de DNA para direcionar a transcrição de um padrão de tradução de RNA que codifica o quadro aberto de leitura. Nestes outros aspectos, NTPs adicionais e cofator de cátion bivalente podem ser incluídos na mistura de reação CF. Uma mistura de reação é referida como completa se ela contém todos os reagentes necessários para permitir a reação, e incompleta se ela contém apenas um subconjunto dos reagentes necessários. Será entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que componentes de reação são rotineiramente armazenados como soluções separadas, cada uma contendo um subconjunto dos componentes totais, por razões de conveniência, estabilidade em armazenamento, ou para levar em consideração o ajuste dependente de aplicação das concentrações de componente, e que
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34/68 componentes de reação são combinados antes da reação para criar uma mistura de reação completa. Além disso, será entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que componentes de reação são empacotados separadamente para comercialização e que kits comerciais úteis podem conter qualquer subconjunto dos componentes de reação da invenção. Além disso, aqueles de habilidade comum compreenderão que alguns componentes em uma mistura de reação, enquanto utilizados em certas modalidades, não são necessários para gerar produtos de expressão isentos de células.
[093]O termo “produtos de expressão isentos de células” pode ser qualquer produto biológico produzido através de um sistema de expressão isento de células.
[094]O termo “cerca de” ou “aproximadamente” significa, dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor ou valores tal como uma concentração estabelecida, comprimento, peso molecular, pH, prazo, temperatura, pressão ou volume. Um tal valor ou faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, tipicamente dentro de 20 %, mais tipicamente dentro de 10 %, e ainda mais tipicamente dentro de 5 % de um valor ou faixa dados. A variação permissível abrangida por “cerca de” ou “aproximadamente” dependerá do sistema particular em estudo. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo”, e “contendo” devem ser interpretados como termos ilimitados (isto é, significando “incluindo, mas não limitado a”,) a menos que de outro modo observado.
[095]A enumeração de faixas de valores aqui é meramente intencionada a servir como um método abreviado de referir-se individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, e inclui os limites finais que definem a faixa, a menos que de outro modo indicado aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele tiver sido individualmente enumerado aqui.
[096]O termo “recombinante” ou “geneticamente modificado” quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína, ou vetor,
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35/68 indica que a célula, organismo, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heterólogos, ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteína nativos, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, células recombinantes podem expressar genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante ou do tipo selvagem) da célula ou expressar genes nativos que são de outro modo anormalmente expressados, super-expressados, sub-expressados ou não expressados completamente.
[097]Como usado aqui, o termo “transformação” ou “geneticamente modificada” refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico em uma célula. Um microrganismo é “transformado” ou “geneticamente modificado” por uma molécula de ácido nucleico transduzida nas bactérias ou célula ou organismo quando a molécula de ácido nucleico torna-se estavelmente replicada. Como usado aqui, o termo “transformação” ou “geneticamente modificada” abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma célula ou organismo, tal como uma bactéria.
[098]Como usado aqui, o termo “promotor” refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser operavelmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula, ou um promotor pode ser operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser operavelmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula.
[099]O termo, “operavelmente ligado”, quando usado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, signifia que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligado. “Sequências
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36/68 reguladoras”, ou “elementos de controle”, referem-se a sequências de nucleotídeo que influenciam o momento e o nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de tradução; introns; realçadores; estruturas de haste e ansa; sequências repressoras ou de ligação; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem ser localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operavelmente ligada a estas. Também, sequências reguladoras particulares operavelmente ligadas a uma sequência de codificação podem ser localizadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.
[0100]Como usado aqui, o termo “genoma” refere-se ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também refere-se ao DNA de organelas encontrado dentro de componentes subcelulares da célula. O termo “genoma” conforme ele aplica-se a bactérias refere-se a tanto ao cromossomo quanto aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria tal que a molécula de DNA é integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmídeo estável.
[0101 ]O termo “gene” ou “sequência” refere-se a uma região de codificação operavelmente unida a sequências reguladoras apropriadas capazes de regular a expressão do produto genético (por exemplo, um polipeptídeo ou um RNA funcional) em alguma maneira. Um gene inclui regiões reguladoras não traduzidas de DNA (por exemplo, promotores, realçadores, repressores, etc.) precedendo (a montante) e seguindo (a jusante) a região de codificação (quadro aberto de leitura, ORF) assim como, onde aplicável, sequências de intervenção (isto é, introns) entre regiões de
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37/68 codificação individuais (isto é, exons). O termo “gene estrutural” como usado aqui é intencionado a significar uma sequência de DNA que é transcrita em mRNA que depois é traduzida em uma sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.
[0102]O termo “expressão”, como usado aqui, ou “expressão de uma sequência de codificação” (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. Expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer lugar na via de DNA a RNA à proteína. A regulação da expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles agindo sobre a transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através de ativação, inativação, compartmentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas depois que elas foram fabricadas, ou por combinações destas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio(s) de atividade proteica in vitro, in situ, ou in vivo.
[0103]O termo “vetor” refere-se a alguns meios pelos quais DNA, RNA, uma proteína, ou polipeptídeo podem ser introduzidos em um hospedeiro. Os polinucleotídeos, proteína, e polipeptídeo que devem ser introduzidos em um hospedeiro podem ser terapêuticos ou profiláticos em natureza; podem codificar ou ser um antígeno; podem ser reguladores em natureza, etc. Existem vários tipos de vetores incluindo vírus, plasmídeo, bacteriófagos, cosmídeos, e bactérias.
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38/68 [0104]Um “vetor de expressão” é o ácido nucleico capaz de replicar em uma célula hospedeira ou organismo selecionados. Um vetor de expressão pode replicar como uma estrutura autônoma, ou alternativamente pode integrar, ao todo ou em parte, nos cromossomos da célula hospedeira ou nos ácidos nucleicos de uma organela, ou ele é usado como um circuito para liberar o DNA estranho às células, e assim replicar junto com o genoma da célula hospedeira. Assim, um vetor de expressão são polinucleotídeos capazes de replicar em uma célula hospedeira, organela, ou organismo selecionados, por exemplo, um plasmídeo, vírus, cromossomo artificial, fragmento de ácido nucleico, e para os quais certos genes no vetor de expressão (incluindo genes de interesse) são transcritos e traduzidos em um polipeptídeo ou proteína dentro da célula, organela ou organismo; ou qualquer construção adequada conhecida na técnica, que compreende um “cassete de expressão”. Ao contrário, como descrito nos exemplos aqui, um “cassete” é um polinucleotídeo contendo uma seção de um vetor de expressão desta invenção. O uao dos cassetes auxilia na montagem dos vetores de expressão. Um vetor de expressão é um replicon, tal como plasmídeo, fago, vírus, vírus quimérico, ou cosmídeo, e que contém a sequência de polinucleotídeo desejada operavelmente ligada à(s) sequência(s) de controle de expressão.
[0105]Os termos “produto de expressão” visto que ele refere-se a uma proteína expressada em um sistema de expressão isento de células como geralmente descrito aqui, são usados permutavelmente e referem-se geralmente a qualquer peptídeo ou proteína tendo mais do que cerca de 5 aminoácidos. Os polipeptideos podem ser homólogos a, ou podem ser exógenos, significando que eles são heterólogos, isto é, estranhos, ao organismo do qual o extrato isento de células é derivado, tal como uma proteína humana, proteína vegetal, proteína viral, proteína de levedura, etc., produzida no extrato isento de células.
[0106]Um “extrato isento de células” ou “lisato” pode ser derivado de uma
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39/68 variedade de organismos e/ou células, incluindo bactérias, bactérias termofílicas, bactérias termotolerantes, Archaea, firmicutes, fungos, algas, microalgas, culturas de célula vegetal, e culturas de suspensão vegetal.
[0107]Como usado aqui as formas no singular “um/uma”, “e”, e “o/a” incluem referentes no plural a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma pluralidade de tais células e referência “à cultura” inclui referência a uma ou mais culturas e equivalentes destas conhecidos àqueles habilitados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido a uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence a menos que claramente indicado de outro modo.
[0108]A invenção agora sendo geralmente descrita será mais facilmente entendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos meramente para os propósitos de ilustração de certos aspectos das modalidades da presente invenção. Os exemplos não são intencionados a limitar a invenção, visto que uma pessoa de habilidade na técnica reconhecerá a partir dos ensinamentos acima e dos exemplos seguintes que outras técnicas e métodos podem satisfazer as reivindicações e podem ser utilizados sem divergir do escopo da invenção reivindicada. De fato, embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às modalidades preferidas desta, será entendido por aqueles habilitados na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas nesta sem divergir do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Geração de Gst RNAP termoestável a partir de G. stearothermophilus.
[0109]Nesta modalidade preferida, os presentes inventores demonstraram que a RNA polimerase de G. stearothermophilus (Gst RNAP) pode ser clonada a partir
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40/68 de DNA genômico (gDNA) isolado de uma cultura de G. stearothermophilus. Nesta modalidade, aproximadamente 20 ml de G. stearothermophilus podem ser cultivados em uma cultura noturna e depois peletizados, por exemplo com uma centrífuga. O gDNA depois pode ser isolado, neste exemplo usando-se kits de purificação de gDNA comercialmente disponíveis, tal como um Kit Macherey-Nagel NuceloSpin Microbial DNA. O gDNA depois pode ser concentrado usando precipitação com etanol. Isto pode ser geralmente realizado adicionando-se um sal e etanol a uma solução contendo o gDNA que pode precipitar o gDNA que pode novamente ser peletizado por exemplo com uma centrífuga e depois recolocado em suspensão em água isenta de DNase-/RNase.
[0110]Nesta modalidade preferida, as subunidades da Gst RNAP podem ser clonadas usando iniciadores específicos que podem ser designados com base nas sequências de nucleotídeo de cada gene. Iniciadores dianteiros e reversos que contêm sítios de restrição específicos para introduzir os genes de subunidade em um vetor de expressão podem ser utilizados. Em uma modalidade preferida, iniciadores dianteiros e reversos que contêm sítios de restrição para introduzir especificamente os genes de subunidade em um Vetor de Expressão IBA StarGate podem ser gerados. Em seguida, os iniciadores objetos e gDNA podem estar sujeitos a uma reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar os genes de subunidade de Gst RNAP. Em uma modalidade preferida PCRs podem ser realizadas usando reações MasterMix padrão e 50 ng de gDNA de entrada isolado de G. stearothermophilus.
[0111]Como observado acima, pode ser preferido selecionar uma subunidade de Gst RNAP para agir como uma sequência genética otimizada, talvez devido à presença de sítio de restrição interno. Geralmente referindo-se à Tabela 1, subunidade beta’ de Gst RNAP (opt) (SEQ ID NO. 4) pode ser identificada e clonada em uma maneira similar àquela descrita acima. Também referindo-se à Tabela 1, um fator de transcrição, neste caso RpoD (SEQ ID NO. 7), pode ser usado a partir de uma
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41/68 síntese de gene otimizada de códon comercialmente disponível (Invitrogen) e clonado diretamente em um vetor de expressão.
[0112]Em uma modalidade, as sequências de DNA de subunidade de Gst RNAP que foram amplificadas através do processo de PCR podem ser isoladas. Em uma modalidade preferida, reações PCR podem ser analisadas em géis de agarose de brometo de etídio a 1 % e os fragmentos de subunidade podem ser isolados por métodos de extração de gel de agarose e/ou purificação de PCR conhecidos dentro da indústria tais como Macherey-Nagel NucleoSpin Gel e PCR Clean-up. Estes fragmentos de gene depois podem ser inseridos em um vetor de liberação apropriado. Por exemplo, em uma modalidade, os fragmentos de gene previamente gerados e um vetor selecionado, nesta modalidade um vetor StarGate comercialmente disponível (ver por exemplo, fig. 2), podem ser digeridos com enzima(s) de restrição selecionada(s) e ligados através de, por exemplo, uma reação de T4 DNA ligase a 3:1 que pode estar disponível comercialmente como um kit Thermo Fisher Scientific Rapid DNA Ligation.
[0113]Em seguida, nesta modalidade os fragmentos de gene e o vetor plasmídico ligados podem ser transformados em uma cepa bacteriana selecionada. Em uma modalidade preferida, o(s) vetor(es) ligado(s) podem ser transformados nas bactérias Escherichia coli, em particular E. coli competente Top10 que pode ser configurada para ter uma taxa alta de eficiência de transformação. Nesta modalidade, E. coli competente Top10 pode incluir mutações no gene recA que pode reduzir a recombinação de DNA promovendo estabilidade de vetor plasmídico, e pode incluir ainda um gene knockout endA que pode reduzir a atividade de endonuclease não específica melhorando o rendimento e a qualidade do vetor plasmídico.
[0114]Bactérias transformadas com êxito podem ser identificadas, por exemplo, através de PCR de detecção de gene positiva, ou outros métodos conhecidos, e depois podem ser subsequentemente cultivadas para gerar múltiplas
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42/68 cópias do vetor plasmídico dentro da colônia bacteriana de crescimento. Em uma modalidade preferida, o DNA do vetor plasmídico pode ser isolado e sub-transformado em uma outra cepa bacteriana selecionada. Em uma modalidade preferida, o DNA do vetor plasmídico preparado pode ser sub-transformado em uma cepa de expressão alta de E. coli, tal como BL21 (DE3) para expressão proteica ideal.
[0115]Em uma modalidade, ums ou mais proteínas de subunidade de RNAP expressadas podem ser configuradas com um rótulo molecular. Referindo-se agora à figura 3, a subunidade de RNAP beta’ (opt) pode ser configurada para conter um rótulo poli-His ou His-6, que pode ser usado mais tarde para purificação de proteína. Nesta modalidade, a subunidade de RNAP beta’ (opt) rotulada com His expressada pode ser purificada e detectada facilmente porque a sequência de resíduos de histidina se liga a vários tipos de íons metálicos imobilizados, incluindo níquel, cobalto e cobre, sob condições tampão apropriadas.
[0116]Em uma modalidade, uma Gst RNAP rotulada pode ser expressada e purificada. Nesta modalidade preferida, a subunidade rotulada com His-6 beta’ (opt) pode ser expressada em uma cepa BL21 (DE3) de E. coli. Nesta modalidade, a cepa BL21 (DE3) de E. coli pode ser cultivada em meio NYZ, que entre outras coisas, pode carecer de lactose que pode induzir certas proteases que podem degradar potencialmente quaisquer proteínas expressadas, reduzindo os rendimentos globais. A expressão proteica pode ser induzida em uma certa densidade óptica (OD) de crescimento bacteriano. Em uma modalidade preferida, em OD 0,7, a expressão proteica pode ser induzida pela adição de 0,25 mM de isopropil β-D-ltiogalactopiranosídeo (IPTG) por 6 a 8 horas a 30 a 32 °C. IPTG é um reagente molecular que imita alolactose, um metabolite de lactose que desencadeia a transcrição de um operon lac no DNA do vetor plasmídico, induzindo desse modo a expressão proteica do gene de subunidade de Gst RNAP sob o controle de um operador lac (ver figura 2a).
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43/68 [0117]Nesta modalidade preferida as culturas de BL21(DE3) podem ser lisadas e um lisato preparado e passado através de uma resina carregada com íon metálico. Este lisato pode passar através de uma resina IMAC carregada com Ni, onde o rótulo de His-6 na subunidade beta’ (opt) pode se ligar ao íon níquel imobilizado na resina. Proteínas que não de ligação e de ligação não específica podem ser ainda removidas nesta modalidade através da adição de 5 mM de Imidazol, enquanto a subunidade beta’ (opt) permanece ligada à resina.
[0118]Em seguida, a expressão e o isolamento das subunidades de Gst RNAP remanescentes podem ocorrer. Em uma modalidade preferida, um lisato combinado de cepas de expressão proteica para as subunidades de Gst RNAP remanescentes pode ser preparado e incubado com resina beta’(opt)-carregada por aproximadamente 2 a 3 horas. Proteínas que não de ligação e de ligação não específica podem ser novamente removidas através da adição de 5 mM de4 Imidazol. As subunidades expressadas podem montar para formar um complexo de RNAP ligado à resina através da subunidade beta’ (opt), e a Gst RNAP montada depois pode ser eluída pela adição de 300 mM de Imidazol ou outros métodos conhecidos. A montagem da Gst RNAP pode ser demonstrada por SDS-PAGE e armazenada ainda em condições tampão compatíveis de transcrição/tradução in vitro em uma concentração de 10 mg/ml a -20 °C para uso mais tarde. Além disso, ensaios de atividade proteica podem ser realizados para verificar a montagem e a funcionalidade do complexo de GSt RNAP. A presença de transcritos de mRNA sendo indicativa de isolamento e montagem de Gst RNAP bem-sucedidos. Em uma modalidade, um ensaio de 25 μΙ pode ser realizado compreendendo:
- 4 mM de cada tri-fosfato de ribonuclease (rNTP);
- 250 ng de DNA;
- 2 μΙ de Gst RNAP;
- 20 U de inibidor de RNase; e
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- 5 μΙ de tampão de reação 5x
Exemplo 2: Isolamento e purificação de Gst AdK/TaqPPK.
[0119]Os presentes inventores demonstraram o isolamento e purificação de Gst AdK e TaqPPK, de modo que proteínas purificadas fossem utilizadas nos ensaios subsequentes como descrito abaixo. Especificamente, Gst AdK e TaqPPK foram expressadas e isoladas utilizando os métodos como geralmente descrito aqui. Referindo-se à figura 7, as proteínas recombinantes, purificadas foram analisadas em um SDS PAGE a 4 a 20 %. O gel sendo tingido com corante coomassie.
[0120]Especificamente, alíquotas das proteínas purificadas foram analisadas em SDS PAGE quanto à pureza e tamanho correto. Uma proteína PPK previamente purificada por teste (PPK) foi usada como um marcador de tamanho adicional para a purificação em lote da TaqPPK recombinante (frações de PPK 1 a 3). Todas as frações eluídas da coluna de purificação são demonstradas como puras e mostram o tamanho correto em torno de 74 kDa. A Gst AdK purificada não mostra nenhuma proteína contaminante e tem o tamanho correto em torno de 25 kDa.
Exemplo 3: Regeneração de energia de ATP de AdK/PPK acoplada.
[0121]Os presentes inventores demonstraram a capacidade de regeneração de ATP de AdK/PPK acoplada da invenção através de um ensaio de determinação de ATP comercialmente disponível. Aqui, os presentes inventores utilizaram Life technologies, D-Luciferina, A22066 para verificar a funcionalidade das proteínas Gst AdK e/ou PPK, (nesta modalidade, derivadas de E. coli), na regeneração de ATP.
[0122]Nesta modalidade, além dos componentes de ensaio de 200 μΙ padrão, os materiais seguintes podem ser adicionados ao ensaio, com os resultados sendo fornecidos nas figuras 4 a 6.
i) 10 μΜ de ATP ii) 5 μΙ de Gst AdK iii) 5 μΙ de PPK derivado de E. coli (exemplar apenas)
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45/68 iv)50 μΙ de polifosfato (1 mg/ml de solução de estoque) [0123]Como demonstrado nas figuras 4 a 6, estes dados geralmente demonstram as capacidades de regeneração de ATP realçada do sistema de regeneração de energia de ATP de AdK/PPK-PPi da invenção, e sua melhoria sobre ATP sozinho, assim como suplementação de energia de PEP/PK tradicional. Especificamente, os dados claramente separam: superior: ATP, intermediário: PEP/PK, e superior: AdK/PPK-PPi
Exemplo 4: Regeneração de energia de AdK/PPK em concentrações de polifosfato variáveis [0124]Os presentes inventores demonstraram que a regeneração de energia de Gst AdK/TaqPPK acoplada pode ser obtida em concentrações de polifosfato variáveis através de um ensaio de determinação de ATP comercialmente disponível. Especificamente, uma configuração de reação padrão foi variada na quantidade de PPi adicionado. O sinal de luciferase (RLU) foi medido com o passar do tempo (min).
[0125]Como demonstrado na figura 8, uma faixa de concentração que manteve o equilíbrio da reação foi determinada como estando entre aproximadamente 0,2 e 2 mg/ml de PPi. Outras faixas de concentração foram determinadas para manter o equilíbrio da reação. Especificamente, tais faixas foram determinadas para estar entre 0,1 e 4 mg/ml PPi, e/ou ,5 e ,6 mg/ml, e/ou ,1 a 7 mg/ml. Como demonstrado na figura 8, alguma regeneração de ATP foi encontrada dentro das faixas funcionais, incluindo, mas não limitadas a aproximadamente 0 a 48 mg/ml e mais altas.
[0126]Em uma modalidade, uma configuração de reação padrão para 100 μΙ de ensaio de luciferase pode incluir:
padrão conc. final
20x tampão 5 1x lOOmMdeDTT 1 1 mM de DTT mg/mL de D-luciferina 5 150 pg/ml de luciferina
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46/68 mg/mL de luciferase mM de AMP
0,34 mg/ml de TaqPPK mg/ml de Gst AdK
100 mg/ml de Polifosfato de sódio dH2O
TOTAL
0,2 10 mg/ml de luciferase
2,5 mM de AMP
228 pg/ml de PPK
0,2 ,226 mg/ml de AdK
0,5 0,5 mg/ml
111
100 [0127]Novamente, como demonstrado na Figura 8, a regeneração de ATP foi sustentada por mais do que cinco horas, ponto este em que as medições foram interrompidas. Como mostrado, os presentes inventores demonstraram que entradas mais altas ou mais baixas de PPi podem interromper um ciclo de reação estável de Gst AdK/TaqPPK e, embora funcionais, não resultam nos níveis mais altos de regeneração de energia contínua. Naturalmente, tais faixas são aproximações e não são intencionadas a serem limitantes.
Exemplo 5: Desreqeneração de energia de ATP de AdK/PPK acoplada além de AMP/PPi [0128]Os presentes inventores demonstraram que o sistema de Gst AdK/TaqPPK pode gerar energia (ATP) além de materiais baratos, tais como PPi e AMP como uma fonte. Para confirmar ainda este novo sistema de regeneração de ATP, os presentes inventores desacoplaram a reação de Gst AdK/TaqPPK do ensaio de luciferase. Especificamente, os presentes inventores primeiro geraram ATP de AMP/PPi usando as proteínas Gst AdK e TaqPPK ATP purificadas, purificaram as reações e usaram amostras para conduzir um ensaio de luciferase - que como observado acima, requer ATP para emitir luz.
[0129]Como mostrado na figura 9, os presentes inventores mostram que apenas uma configuração padrão com todos os componentes de reação forneceu ATP suficiente para uma reação de emissão de luz de luciferase. Os controles que tiveram
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47/68 compostos/enzimas individuais ou combinações destes ausentes, não forneceram ATP para uma reação de luciferase bem-sucedida. Visto que a energia de ATP não foi regenerada neste ensaio, o sinal de luciferase cai com o passar do tempo e chega quase ao fundo depois de cerca de sete minutos, ponto este em que todo o ATP previamente gerado foi usado.
Exemplo 6: Geração de energia de ATP além de AMP/PPi e sua regeneração porGst AdK/TaqPPK [0130]Os presentes inventores demonstraram a geração de energia de ATP além de AMP e PPI e que a regeneração de ATP, através de pelo menos uma modalidade do sistema de regeneração de energia de Gst AdK/TaqPPK. Especificamente, os presentes inventores realizaram um ensaio de luciferase, substituindo o ATP usualmente necessário por AMP e adicionaram os componentes do sistema de regeneração de energia, isto é, Gst AdK, TaqPPK, e PPi). Em experimentos de controle, os presentes inventores omitiram cada componente e combinações deste.
[0131]O esquema de reação do sistema de regeneração de energia de ATP de Gst AdK/TaqPPK, no contexto de uma reação de luciferase usando ATP para emitir luz, é geralmente demonstrado na figura 10. Em uma primeira etapa, ADP é gerado em uma reação irreversível por PPK usando AMP e PPi como uma fonte. ADP pode ser convertido em ATP por PPK e AdK, ambos em reações reversíveis mantendo as quantidades de AMP, ADP e ATP equilibradas. ATP depois é usado por luciferase para converter luciferina e emitir luz.
[0132]Como mostrado na figura 11, os componentes do sistema de regeneração de energia padrão mostraram um sinal de luciferase (RLU) crescente depois que bastante ATP é fabricado para sustentar a reação de emissão de luz. O sinal aumenta com o passar do tempo até que ele atinge um máximo depois de cerca de 7 horas. Reações de controle com o sistema de regeneração de energia ausente
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48/68 não mostram qualquer RLU. Como tal, os presentes inventores demonstram que isto é a energia de geração de enzimas Gst AdK e TaqPPK acopladas, ou sinérgicas (ATP) além de polifosfato e AMP baratos como uma fonte de substrato. Os presentes inventores foram capazes de medir uma reação de emissão de luz por aproximadamente 20 horas (não mostrado), demonstrando ainda a regeneração de energia robusta possível a partir de seu novo sistema.
Exemplo 7: Preparação de extrato isento de células.
[0133]Um meio definido, não tóxico, não perigoso com base em peptona de soja isenta de organismo geneticamente modificado (GMO-free), purificada e triptona de caseína isenta de materiais de origem animal (ASM-free) foi desenvolvido pelos presentes inventores para a fermentação das cepas de Geobacillus geneticamente modificadas. Este meio não requer a adição de sais metálicos potencialmente tóxicos ou queladores de íon metálico, (por exemplo, ácido trinitriloacético, etc.), para uma fermentação produtiva das cepas de Geobacillus geneticamente modificadas. A faixa de temperatura de fermentação pode ser ajustada e mantida estável em aproximadamente 52 a 55 QC, embora faixas de temperatura maiores também são consideradas e permissíveis. A cultura pode ser mantida em um pH aproximado de 7,2 a 7,6, embora faixas de pH maiores também sejam consideradas e permissíveis. A adição de 10 mM de tampão de HEPES, pode ser adicionada conforme necessário. Agentes antiespumantes não tóxicos, com base em silicona podem ser adicionados, conforme necessário, para um processo de fermentação controlado.
[0134]RNA ribossômico (rRNA) foi isolado de culturas crescentes em diferentes estágios do processo de fermentação e sua concentração determinada como uma medida da concentração de ribossomo por unidade de cultura. Uma concentração máxima de rRNA foi observada depois de 6 a 7 horas de crescimento em meio fresco. Em algumas modalidades, culturas podem ser cultivadas em múltiplas fases com volumes crescentes, e os 7,5 L finais de cultura são inoculados a
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ODeoo 0,5 e cultivados por 6 a 8 horas a um ODeoo final de 2,5 a 2,8 a 52 a 55 QC e pH 7,2 a 7,6.
[0135]O lisato é preparado depois de um único ciclo de congelamento/descongelamento durante a noite a -80 QC das células coletadas lavadas (3x). Depois do ciclo de congelamento/descongelamento, as células são recolocadas em suspensão em uma solução salina tampão de HEPES contendo inibidores de RNase e protease (razão a 1,25:1 de células para tampão) e são rompidas por ultra-som a 2 a 4 QC usando um protocolo estabelecido por menos do que 5 min (ciclo de 10 s “ligado”, 30 s “desligado”). O tampão de lise usado, CF-L1, é não tóxico, não perigoso. Particulados são removidos do lisato por centrifugação (12.000 g, 4 QC, 10 min), e dialisados contra um tampão de armazenamento não tóxico, CF-St, que é similar em composição ao tampão de reação CF-1, mas não contém 20 % v/v de glicerol e nenhum inibidor de protease. Uma reação de liquidação de 30 minutos (agitando em um tubo fechado em 250 rpm e a 30Q C) e centrifugação adicional (mesmas condições) para purificar ainda mais o extrato, não é usualmente necessária. Bactérias sobreviventes potenciais e/ou contaminações bacterianas e fúngicas são determinadas riscando-se amostras do lisato e dos fragmentos peletizados em placas de ágar de meio mLB/CS, NB, ISP2, ágar sangue-cérebro e são incubadas a 30Q C e 55Q C por dois dias. A taxa de rompimento celular é consistentemente acima de 99,95 % (<1 sobrevivente por 200 μΙ_ de fragmentos recolocados em suspensão e <1 unidade de formação de colônia (CFU) por mL de lisato). Em uma modalidade, o processamento de um fermentador de 7,5 L pode produzir aproximadamente 30 ml de extrato. Naturalmente, com base no desejo e/ou necessidade do operador, estas quantidades/volumes podem ser ampliados e/ou diminuídos consequentemente.
[0136]Extrações de RNA totais de lisatos depurados podem ser usadas para determinar a concentração de ribossomo. A concentração de proteína total do lisato é
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50/68 determinada por espectroscopia UV/Vis e está consistentemente na faixa de 150 a 160 mg/mL. Alíquotas do lisato são armazenadas a -80 QC e podem ser estáveis por 6 meses ou mais, como demonstrado determinando-se a estabilidade do extrato (nenhuma precipitação) e taxas de transcrição/tradução in vitro compatíveis de uma construção de Cas9-sfGFP (determinada por medições de absorção UV/Vis e fluorescência). O lisato e as reações de transcrição/tradução in vitro podem ser mantidos em uma faixa aproximada de pH 7,8 a 8,0. As concentrações salinas para as condições de reação CF podem ser variáveis. Cada lote de lisato pode ser avaliado pela atividade de transcrição/tradução in vitro de uma construção linear de Cas9sfGFP (produção de uma proteína maior com enovelamento compatível) e de uma construção de luciferase (atividade enzimática).
Exemplo 8: Extratos isentos de células gerados utilizando cepas de Geobacillus geneticamente modificadas.
[0137]Como observado acima, os presentes inventores observaram que a super-expressão do fator sigma RpoD (de Geobacillus) supra-regulou a polimerase bacteriana de RNA (RNAP) em culturas bacterianas de E. coll e Geobacillus. Construções genéticas recombinantes foram geradas para expressar constitutivamente RpoDx, uma versão engendrada, em Geobacilli. A segurança funcional da construção genética e os níveis de expressão proteica foram determinados e são monitorados usando uma construção de sfGFP transformada na mesma cepa de Geobacillus e são monitorados por leituras de fluorescência de 510 nm dos lisatos preparados.
[0138]Os presentes inventores utilizaram ainda o promotor de Rhlll para transcrição in vitro junto com a RNAP bacteriana. Um promotor de Rhlll recombinante modificado para compactar o reconhecimento de RpoD/promotor pode ser utilizado em algumas modalidades. Alternativamente, um promotor de T7 pode ser usado, se, por exemplo, uma RNAP polimerase de T7 for adicionada à reação CF. Em algumas
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51/68 modalidades, uma T7 RNAP geneticamente modificada proprietária (T7x) tendo uma ou mais mutações de pontos únicas comparado à RNAP nativa do bacteriófago T7 podem ser utilizadas. Tais mutações de pontos podem permitir uma fusão mais rápida do DNA de filamento duplo e aumentar a estabilidade do complexo da RNAP com o DNA padrão de filamento único. Nesta modalidade, um T7x pode causar transcritos significativamente menos incompletos e produzir concentrações de mRNA consistentemente mais altas comparado ao T7-RNAP comercial. Os presentes inventores demonstraram que ambas as RNAPs desempenham com segurança, com resultados reproduzíveis e prognosticáveis, para construções até 45.000 bases em comprimento.
Exemplo 9: Sistema de expressão isento de células in vitro tendo novo sistema de regeneração de energia de ATP.
[0139]Como detalhado acima, a invenção refere-se, em certas modalidades a um sistema de expressão isento de células onde a fonte de energia celular, ATP, é regenerada de polifosfato inorgânico usando um sistema de enzima dupla. Uma enzima para o sistema foi desenvolvida utilizando uma polifosfato cinase termoestável (PPK) a partir de Thermophilus aquaticus (TaqPPK), depois de demonstrar que uma atividade hidrolisante de polifosfato foi observada para uma enzima homóloga clonada e produzida a partir de E. coli (ecPPK ou PPK). Exceto a atividade de PPK relatada, isolada de Vibrio cholerae, TaqPPK e ecPPK preferivelmente geram ADP de AMP e os polifosfatos inorgânicos hidrolisados (iPPi). Para a segunda etapa enzimática, duas moléculas de ADP são depois rearranjadas por uma Adenosina Cinase (AdK) termoestável para formar uma unidade de ATP e AMP.
[0140]Este sistema provou operar eficazmente por pelo menos 32 horas, como determinado por medições de luminescência de luciferina depois de adicionar luciferase a uma solução de 10 nM de AMP, 150 pg/ml de luciferina, 1 mg/ml de iPPi e quantidades catalíticas das enzimas. Um número de rotatividade de enzima total foi
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52/68 determinado para o par Gst AdK/TaqPPK de pelo menos 300. Este ciclo enzimático pode permanecer ativo por pelo menos 72 horas e até pelo menos 1 semana ou mais. Em uma modalidade, a concentração de ATP na solução de alimentação pode ser mantida em um ATP estável a 1,5 mM. Os presentes inventores demonstraram ainda que TaqPPK pode ter um número de rotatividade total máximo de aproximadamente 3.000, consequentemente, permitindo a redução adicional da concentração de proteína de TaqPPK no sistema de expressão isento de células inventivo. Isto pode impedir ou minimizar a hidrólise ao acaso de polifosfato, que causa uma inibição de retroalimentação acumulando-se pirofosfato às reações isentas de células, enquanto produzindo/mantendo os níveis de ATP desejados.
[0141 ]Tais novas características de regeneração de energia são importantes, visto que sistemas isentos de células com base em E. coli correntes principalmente contam com fosfato de creatina/creatina cinase ou com fosfoenolpiruvato (PEP) e Piruvato Cinase (PK) como o principal sistema de regeneração de energia, ainda que seja estabelecido que PK tem um número de rotatividade total nos dígitos únicos baixos e o produto secundário piruvato é um inibidor da reação de tradução. Desta maneira, não apenas a invenção corrente mostra tais sistemas de expressão isentos de células tradicionais, mas de fato, representa uma melhoria demonstrável destes sistemas de expressão isentos de células tradicionais conhecidos na técnica.
[0142]O potencial redox do sistema de expressão isento de células do presente inventor pode ser estabilizado por uma Sorbitol-desidrogenase (SDH). Em uma modalidade, esta SDH pode ser termoestável (tSDH) (tal designação t sendo aplicável geralmente a outras moléculas referenciadas aqui). Ensaios enzimáticos usando a absorção de 340 nm para NADH com amostras de proteína purificada demonstraram que a conversão dianteira de sorbitol e NAD/NAD(P) a frutose e NADH/NAD(P)H é 8 vezes mais rápida comparado à reação traseira. Os presentes inventores clonaram e produziram esta enzima termoestável geneticamente
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53/68 modificada a partir de Geobacillus stearothermophilus, que foi também otimizada quanto à expressão em E. coli como previamente descrito aqui (Gst SDH), que pode ser adicionada à solução de alimentação junto com 200 mM de sorbitol. O produto de reação também fornece uma fonte de energia adicional por intermédio de glicólise e não acumula na mistura de reação.
[0143]Em certas modalidades, o sistema de expressão isento de células pode incluir um volume inicial de 5 ml para o volume de reação isento de células, e 80 ml para a solução de alimentação para garantir uma troca contínua e condições de reação homogênea nos vasos. Sistemas de expressão isentos de células entre 0,5 ml e 2 litros de volumes de reação e mais altos podem ser ainda considerados.
Exemplo 10: Configuração da reação do sistema de expressão isento de células.
[0144]Em uma modalidade, o sistema CF pode ser ajustado e estabilizado na faixa de pH 7,9 a 8,0 com um tampão de TRIS-acetato (CF-1) nos compartimentos de alimentação e reação. A concentração final do lisato no vaso de reação pode estar entre 100 e 110 mg/ml de proteína total, enquanto o DNA padrão (alternativamente também junto como uma reação de RNA/RNAP pré-conduzida) é adicionado junto com cofatores, aminoácidos e nucleotídeos ao lisato. A solução de alimentação contém concentrações iguais dos nucleotídeos e todos os aminoácidos naturais. Cofatores, sorbitol e as enzimas anteriormente mencionadas são adicionados igualmente. Uma lista detalhada dos materiais é fornecida abaixo e pode ser geralmente referida como componentes de reação isentos de células. Adicionalmente, os componentes gerais do sistema de regeneração de ATP de enzima dupla podem ser incluídos. Tais componentes em uma modalidade preferida podem incluir mas não são limitados a, uma quantidade de Gst AdK, uma quantidade de TaqPPK, e/ou uma quantidade de PPi, e/ou uma quantidade de AMP. Modalidades adicionais podem incluir uma quantidade de Gst SDH e sorbitol.
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54/68 [0145]Esta reação isenta de células exemplar pode ser conduzida em uma incubadora em aproximadamente 35 a 37Q C, enquanto o reator é agitado em aproximadamente -300 rpm por 16 horas. Em certas modalidades, esta configuração de reação ou mistura de reação das reações de transcrição/tradução in vitro combinadas pode ser adequada para produzir a proteína alvo por mais do que 3 dias. Em uma modalidade exemplar, o sistema de expressão isento de células inventivo pode fornecer a estabilidade para produzir proteínas por mais do que 36 horas.
[0146]Em uma modalidade específica, componentes de reação isentos de células podem incluir, mas não são limitados a:
-aminoácidos
-polifosfato
-Tris-Acetato
-Mg(OAc)2
-K+-glutamato
-amino-acetato
-NaCI
-KCI
-MgCI2
-DTT
-octil-b-glicosídeo
-NAD (convertido a NADH no sistema)
-NADP (convertido a NADPH no sistema)
-sorbitol
-FADH (regenerado por processos celulares de NADH/FADH)
-ATP
-GTP, UTP, CTP cada
-CoA
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55/68
-PLP
-SAM [0147]Em uma modalidade específica, componentes de reação isentos de células podem incluir, mas não são limitados a:
-2 mM de cada aminoácido natural
-1 mg/ml de polifosfato
-5 mM de Tris-Acetato
-4 mM de Mg(OAc)2
-12 mM de K+-glutamato
-1 mM de amino-acetato
-100 mM de NaCI
-10 mM de KCI
-5 mM de MgCE
-0,1 mM de DTT
-0,2 % de octil-b-glicosídeo
-0,8 mM de NAD (convertido a NADH no sistema)
-0,4 mM de NADP (convertido a NADPH no sistema)
-200 mM de sorbitol
-0,5 mM de FADH (regenerado por processos celulares de NADH/FADH)
-1,5 mM de ATP
-1 mM de GTP, UTP, CTP cada
-1 mM de CoA
-2 mM de PLP
-0,2 mM de SAM [0148]Todas as quantidades, concentrações, volumes e razões de qualquer componente de reação isenta de células são exemplares apenas, visto que eles podem ser variáveis com base no volume de reação, duração, ou produto de
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56/68 expressão a ser produzido, e outras variáveis. Componentes de reação isentos de células podem incluir ainda, mas não são limitados a, todos os outros componentes necessários para o mecanismo de transcrição/tradução, aminoácidos, nucleotídeos, componentes metabólicos que fornecem energia e que são necessários para a síntese, se fornecidos pelo extrato celular, e ou adicionados ao extrato celular. Componentes de reação isentos de células podem incluir ainda uma quantidade de tRNA específico para a cepa de bactérias, algas, microalgas Archaea, fungos e/ou firmicute que podem ser utilizados. Por exemplo, nesta modalidade descrita acima, tRNAs de Geobacillus naturais podem ser adicionados. Adicionalmente, componentes de reação isentos de células podem incluir ainda uma qualidade de tRNA que pode superar o retardo da tradução devido a códons raros. Por exemplo, em algumas modalidades, tRNAs de E.coli mre600 podem ser incluídos na reação isenta de células para superar o retardo da tradução devido a códons raros.
Exemplo 11: Geração de eficiência alta de Clostridium tetaniE88 Tentoxilisina por expressão isenta de células in vitro.
[0149]Os presentes inventores demonstraram, como uma modalidade exemplar, a expressão in vitro de Tentoxilisina (neurotoxina do tétano) utilizando pelo menos uma modalidade do sistema de expressão isento de células inventivo que utiliza uma regeneração de energia de ATP de Gst AdK/TaqPPK acopladas como geralmente descrito aqui.
[0150]Tentoxilisina (TetNT) é naturalmente produzida como um protoproteína de cadeia única de 150 kDa. TetNT coordena com um cátion Zn2+ no motivo de endopeptidase, M232HELIHVL239, que permite a divagem proteolítica do polipeptídeo de tamanho natural entre A457 e S458. A oxidação seletiva de dois resíduos de Cisteína (C439 e C467) forma uma ponte dissulfeto entre ambas as cadeias e permite a formação do complexo proteico de proteína toxina do tétano ativa compatível de uma cadeia curta, M1-A457, e uma cadeia longa, S458-A1319. Esta proteína depois é seletivamente
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57/68 exportada pelas cepas de produção natural da família de Cl. tetani.
[0151]TetNT é uma endopeptidase dependente de Zn2+ internalizante, que hidrolisa Synaptobrevin-2 entre Gln?6 e Phe?7 por intermédio de uma formação de complexo de receptor de toxina/gangliosídeo. A hidrólise dos receptores de Sinaptobrevin-2 em vesículas sinápticas impede a liberação do neurotransmissor inibitório ácido gamaminobutírico (GABA) na fenda sináptica. Isto finalmente causa espasmos musculares rígidos, além de outros sintomas, do paciente descritos como Tétano. O gene tetX foi localizado no genoma de Cl. tetani E88 e foi previamente codificado ainda no plasmídeo de expressão proteica de E. coli CTC_p60. O produto genético foi previamente clonado e expressado, como uma proteína heteróloga para confirmar a atividade proteica e para conduzir estudos de proteína estrutural de alta resolução. Uma atividade modificadora de ácido N-acetil-b-neuramínico potencial de TetNT foi previamente descrita e conhecida na técnica igualmente.
[0152]De acordo com regulações do FDA, correntemente o toxoide tetX, adequado para vacinação humana, é derivado de cultura de Cl. tetani ativa. A toxina completamente enovelada e exportada é removida da cultura ativa por floculação resultante da adição de sulfato de alumínio e sulfato de amônio. A toxina extraída é subsequentemente inativada pela adição de formaldeído para ganhar toxoide adequado para vacinações. FDA sugere medidas de controle de qualidade na forma de perfis de SDS-PAGE, FPLC ou HPLC e purificações, que não são correntemente necessários.
[0153]O protocolo de isolamento e preparação estabelecido correntemente conhecido na técnica carrega riscos. Estes riscos foram reconhecidos pelo FDA, conforme a agência recomenda vacinações contra o tétano para crianças de 7 anos de idade e mais velhas, e adultos apenas. A vacinação carrega um risco de 5 % de infecções com Cl. tetani. Os maiores desafios para a produção com base em fermentação de toxoide Tet são o controle de concentrações de formaldeído para
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58/68 garantir a desativação completa da toxina e o controle da concentração de toxoide no produto final resultando em 40 % de todas as vacinações sendo ineficazes.
[0154]Como uma modalidade exemplar, estes desafios e as limitações da produção podem ser dirigidos substituindo-se o processo de fermentação com o método de produção com base em transcrição/tradução in vitro inventivo. O transporte de esporos e quaisquer outros formadores de colônia não é existente e garante esterilidade total do Ingrediente Farmacêutico Ativo (API). A concentração de proteína total é monitorada durante o processo integral e o produto final pode ser controlado por métodos de laboratório padrão.
[0155]Os presentes inventores geraram uma construção genética para expressão de TetNT. Nesta modalidade, a construção genética foi designada para a síntese de gene e, especificamente, para ser alimentada na transcrição/tradução in vitro, ou reação de expressão isenta de células como um padrão de PCR linear. O uso de DNA linear no presente sistema de expressão isento de células pode ser preferível em algumas modalidades visto que ele não pode ser transferido, visto que ele é incapaz de recombinar, replicar ou ser transfectado. A construção genética linear pode incluir a configuração básica seguinte: ((promotor) - (RBS) - (início)(sítio de divagem de produto de expressão - rótulo de detecção + rótulo de purificação)(parada). Em uma modalidade específica, esta configuração pode incluir: (promotor) - (RBS) (início)(TetNT TEV mCherry H6)(parada).
[0156]Nesta modalidade, o promotor pode incluir: uma sequência de promotor de Rhlll (SEQ ID NO. 18), ou alternativamente uma sequência de promotor de T7 (SEQ ID NO. 19). Um RBS (sítio de ligação ribossômica) pode ser derivado de um fago de gene T7 compatível com sequências de Geobacillus (SEQ ID NO. 20) (naturalmente vários promotores podem ser utilizados além destes exemplos exemplares). Um gene TetNT recombinante pode incluir SEQ ID NO. 21. Neste gene TetNT recombinante, a sequência de parada é removida. Finalmente, um TEVsite,
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59/68 mCherry, His6 podem incluir SEQ ID NO. 22, novamente, com a parada removida do mCherry. Como deve ser observado, embora fornecida como sequências separadas, a construção genética pode ser apresentada como um único fragmento de PCR linear de DNA geralmente descrito.
[0157]Neste exemplo, devido a preocupações quanto à segurança, o DNA que codifica a toxina do tétano de tamanho natural, em uma modalidade preferida, a síntese genética pode proceder como duas construções circulares separadas, que serão recombinadas no laboratório a um único plasmídeo para propósitos de amplificação. Por exemplo, uma primeira construção que codifica a cadeia leve de TetNT (SEQ ID NO. 12) com o sítio de protease autocatalítico (SEQ ID NO. 13) e ponte de dissulfeto formando cisteínas. Uma segunda construção codificará a cadeia pesada de TetNT (SEQ ID NO. 14), contendo o sítio de TEV parcialmente integrado (SEQ ID NO. 15) e mCherry-His6 (SEQ ID NO. 16). Embora a proteína recombinante seja apresentada como construções genéticas individuais e sequências de aminoácidos, tais sequências podem ser parte de uma única construção que finalmente produz um único polipeptídeo linear (SEQ ID NO. 17), que pode corresponder a uma sequência de polinucleotídeo, como uma construção de DNA linear de amplificada por PCR. Modalidades adicionais podem incluir construções muito diferentes que podem formar um único polipeptídeo linear.
[0158]Qs presentes inventores demonstraram a expressão de uma pró-toxina de 150 kDa de tamanho natural por síntese proteica isenta de células utilizando ainda o sistema de regeneração de ATP de enzima dupla previamente descrito. Nesta modalidade específica, a expressão de uma pró-toxina de 150 kDa de tamanho natural por síntese proteica isenta de células pode ocorrer no reator de 5 ml de acordo com as condições descritas. O progresso da reação pode ser monitorado por fluorescência da luz do dia de mCherry rotulado com um comprimento de onda de excitação de 587 nm e fluorescência alterada por vermelho. Depois que nenhum aumento adicional na
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60/68 concentração de proteína é observado, o conteúdo do vaso de reação será transferido em um tubo de reação de 50 ml. Os tempos de reação e concentrações de proteína obtidos podem ser determinados continuamente.
[0159]Um tampão de HEPES a 10 mM no pH 8,0, contendo lactose, 200 mM de NaCI, 1 mM de DTT, pode ser adicionado para diluir a mistura de reação 10 vezes. 1 a 2 mL de uma resina de Ni-IDA serão adicionados a esta solução e incubados em aproximadamente 20 a 25 QC por 1 hora com agitação limitada. A capacidade de ligação desta resina pode ser suficiente para até 60 mg de proteína rotulada com His6. Depois que a pró-toxina rotulada com His6 é ligada à resina, a resina será coletada, e o sobrenadante removido por tampão de lavagem. A fluorescência imediatamente confirmará que nenhuma pró-toxina de TetNT está presente no sobrenadante.
[0160]A resina carregada de proteína coletada pode ser lavada com 50 ml de tampão de HEPES no pH 8,0, contendo lactose, 200 mM de NaCI, e incubada na temperatura ambiente, sem nenhum agente redutor presente. Sob exposição a O2 em várias concentrações (de 2 % até a atmosférica) e por vários tempos e na ausência de agentes redutores, 0 enovelamento/re-enovelamento expontâneo, formação oxidativa das pontes de dissulfato nativas, será iniciado dentro da cadeia longa de TetNT e em entre a cadeia longa e curta de TetNT.
[0161]Subsequente ao enovelamento/re-enovelamento, ZnCL pode ser adicionado a uma concentração final de 2 mM à solução de proteína. Isto ativa a atividade autoproteolítica interna para clivar a ligação peptídica entre a cadeia longa e cadeia curta da TetNT adsorvido na resina. Um tempo de incubação de aproximadamente 2 horas a 20 a 25 QC pode ser usado inicialmente. Até este ponto a toxina é inerte, visto que as modificações engendradas com mCherry e um rótulo de His6 impedirão sua atividade devido ao impedimento estérico dos sítios de reconhecimento e ligação de seu alvo natural. Além disso, 0 tamanho de pérola fda resina aumenta 0 tamanho de partícula total significativamente e reduz 0 risco da
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61/68 proteína ser aerossolizada ou absorvida. A facilidade de detectar a fluorescência de mCherry ajuda a manter o rastro da proteína e a impedir a exposição indesejada ou descarte não intencionado de material potencialmente tóxico neste estágio. O tampão pode ser trocado para remover todos os fragmentos de toxina incompletamente enovelados que não formaram pontes de dissulfeto e removerá o acesso de ZnCb da solução.
[0162]Uma TEV protease rotulada com His6 purificada pode ser adicionada à mistura de reação e a amostra é incubada por várias horas em aproximadamente 20 a 25 QC. A TEV protease pode ser adsorvida à resina igualmente e permanecerá ligada, enquanto a toxina do tétano ativada é liberada da resina clivando-se o sítio de TEV protease. Este processo pode ser monitorado, pela extinção da fluorescência de mCherry, devido à divagem do sítio de TEV sobrepondo com o término N ausente de mCherry e o desenovelamento parcial resultante da proteína fluorescente. Depois que nenhuma fluorescência puder ser detectada, a resina, que ainda é carregada com mCherry-His6 e TEV-His6 protease não enovelada, é coletada e o sobrenadante deveria conter apenas TetNT pura em um tampão estéril e desejado.
[0163]O sobrenadante pode ser testado pelos presentes inventores com um Fab anti-Tet proprietário, para confirmar o enovelamento correto de proteínas em ensaios ELISA e western blot, enquanto o perfil de SDS-PAGE e FPLC confirmam a pureza da amostra. Depois que a concentração de proteína é determinada a quantidade necessária de formaldeido pode ser adicionada para ganhar o toxoide inativado. Ensaios em animais para determinar doses eficazes para confirmar o grau de proteína corretamente enovelada e ativa na amostra final podem ser ainda conduzidos. Naturalmente, como descrito acima, este protocolo é exemplar em natureza. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que tais protocolos podem ser similarmente utilizados, sem experimentação indevida para produzir proteínas similares a partir de outra Clostridia assim como outras proteínas de
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62/68 interesse.
REFERÊNCIAS:
[0164]As referências seguintes são por meio deste incorporadas em sua totalidade por referência:
[1] Carlson, Erik D. et al. “Cell-Free Protein Synthesis: Applications Come of
Age”. Biotechnology advances 30,5 (2012): 1185-1194. PMC. Web. 1 de jan. de 2018.
LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS [0165]O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. Em alguns casos, as designações de letra única para aminoácidos são fornecidas neste relatório descritivo, enquanto designações de três letras foram fornecidas no formato apresentado eletronicamente. Todos os dados de sequência anteriores divulgados no Pedido Provisório dos EUA N2 62/440.975 são por meio deste incorporados por referência.
TABELA 1: Listagens de sequências
SEQ IP NO. 1
SGSSMIEIEKPKIETVELSEDAKYGKFVVEPLERGYGTTLGNSLRRILLSSLPGAAVTSVQI DGVLHEFSTIDGVVEDVTAIILNIKKLALKIYSDEEKTLEIDVQGEGVVTAADITHDSDVEI LNPDLHIATLAEGGRLRMRMTAKRGRGYVPAEANKREDQPIGVIPIDSIYTPVSRVSYQVEN TRVGQVTDYDKLTIDVWTDGSIGPKEAISLGAKILTEHLNIFVGLTDEAQNAEIMVEKEDDQ KEKVLEMTIEELDLSVRSYNCLKRAGINTVQELTQKTEEDMMKVRNLGRKSLEEVKAKLAEL GLSLRKDDGRRAA
SEQ IP NO. 2
SGSSMTGRLVQYGRHRQRRSYARISEVLELPNLIEIQTSSYQWFLDEGLREMFREISPIEDF SGNLSLEFIDYSLGEPKYTVEEAKERDVTYAAPLRVKVRLINKETGEVKEQDVFMGDFPLMT ETGTFIINGAERVIVSRLVRSPSVYYSDKVDKNGKRGYSATVIPNRGAWLEYETDAKDVVYV RIDRTRKLPVTVLLRALGFSSDQEIIDLLGDNEYLRNTLEKDNTDSTEKALIEIYERLRPGE PPTLENAKNLLASRFFDPKRYDLASVGRYKINKKLHIKNRLFNQRLAETIIDPETKEVIAEA GAMIDRRTLNRLLPYLEKGVGLQTYRPAEGVVDGDISVQTIKIYAPNDPDGEKVINVIGNGF IAEDVKHITPADIIASISYFFNLLHGVGDTDDIDHLGNRRLRSVGELLQNQFRIGLSRMERV VRERMSIQDTNTITPQQLINIRPVIAAIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPG GLTRERAGFEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSTYAKVNKFGFIETPYRRVDPET GRVTDQIDYLTADEEDNYVVAQANVPLAEDGTFLEENVVARFRGENIVVKRDRVDYMDVSPK QVVSAATACIPFLENDDSNRALMGANMQRQAVPLLEPEAPIVGTGMEYVSAKDSGAAVICKH RGIVERVEAKEIWVRRLIEVDGKEVKGDLDKYRLLKFVRSNQGTCYNQRPIVKKGDIVERGE ILADGPSMDKGELALGRNVLVAFMTWDGYNYEDAIIMSERLVKEDVYTSIHIEEYEAESRDT

Claims (145)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema de expressão de proteína isento de células termoestável CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular derivado de uma cultura de microrganismo termofílico tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para síntese de macromolécula in vitro em que o dito microrganismo termofílico é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação desta
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - uma quantidade de RNAP termoestável purificada;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) purificada;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
    - em que as ditas enzimas AdK e PPK trabalham sinergicamente para regenerar energia de ATP celular de PPi e AMP.
  2. 2. Sistema de expressão de proteína isento de células CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
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    - uma mistura de reação contendo um extrato celular tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para síntese de macromolécula in vitro;
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (Gst AdK) termoestável; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (TaqPPK) termoestável;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
    - em que as ditas enzimas AdK e PPK trabalham sinergicamente para regenerar a energia de ATP celular de PPi e AMP.
  3. 3. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima Gst Adk termoestável compreende a SEQ ID NO. 8.
  4. 4. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima TaqPPK termoestável compreende a SEQ ID NO. 11.
  5. 5. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de RNAP derivada de G. stearothermophilus (Gst RNAP).
  6. 6. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Gst RNAP derivada de G. stearothermophilus compreende subunidades de RNAP:
    - subunidade alfa tendo a SEQ ID NO. 1;
    - subunidade beta tendo a SEQ ID NO. 2;
    - subunidade beta’ tendo a SEQ ID NO. 3 e/ou subunidade beta’ (opt) tendo a
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    SEQ ID NO. 4;
    - subunidade delta tendo a SEQ ID NO. 5; e
    - subunidade ômega tendo a SEQ ID NO. 6.
  7. 7. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende extrato celular de Geobacillus.
  8. 8. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  9. 9. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de Sorbitol-desidrogenase (SDH).
  10. 10. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita SDH compreende uma Sorbitol-desidrogenase recombinante derivada de Geobacillus stearothermophilus (Gst SDH).
  11. 11. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de sorbitol.
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  12. 12. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs isolada do mesmo tipo de microrganismo usado para gerar o dito extrato celular.
  13. 13. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs do mesmo organismo como o extrato celular compreende a quantidade de tRNAs de Geobacillus onde o dito extrato celular foi derivado de Geobacillus.
  14. 14. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros.
  15. 15. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros compreende uma quantidade de tRNAs isolados de E. coli.
  16. 16. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico compreende um padrão de DNA linear.
  17. 17. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de DNA linear compreende um padrão de DNA linear tendo:
    - pelo menos um gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor;
    - pelo menos um sítio de ligação a ribossomo (RBS);
    - pelo menos um sítio de divagem de produto de expressão; e
    - pelo menos um rótulo.
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  18. 18. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor compreende um gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor.
  19. 19. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende uma primeira construção recombinante que codifica a cadeia leve de TetNT (SEQ ID NO. 12) com um sítio de protease autocatalítica (SEQ ID NO. 13) e ponte de dissulfeto formando cisteínas, e a segunda construção que codificará a cadeia pesada de TetNT (SEQ ID NO. 14), contendo o sítio de TEV parcialmente integrado (SEQ ID NO. 15) e mCherry-His6 (SEQ ID NO. 16).
  20. 20. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende um gene de TetNT recombinante identificado na SEQ ID NO. 21.
  21. 21. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor compreende um gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor de Rhlll identificado na SEQ ID NO. 18, ou promotor de T7 identificado na SEQ ID NO. 19.
  22. 22. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito RBS compreende um RBS identificado na SEQ ID NO. 20.
  23. 23. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sítio de divagem de produto de expressão compreende um sítio de TEV identificado na SEQ ID NO. 17.
  24. 24. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um rótulo
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    6/33 compreende um rótulo de mCherry-His6 identificado na SEQ ID NO. 16.
  25. 25. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um rótulo compreende um rótulo de His6.
  26. 26. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK.
  27. 27. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK e compreende um sistema de expressão de proteína isento de células em que a dita razão molar de enzima Gst Adk:TaqPPK é aproximadamente 3:1.
  28. 28. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 2 e 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP.
  29. 29. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP e compreende uma faixa de concentração de aproximadamente 0,2 a 2 mg/ml de PPi na reação de regeneração de ATP de volume de 100 μΙ.
  30. 30. Sistema de expressão de proteína isento de células, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
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    7/33
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) purificada;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
    - em que as ditas enzimas AdK e PPK trabalham sinergicamente para regenerar a energia de ATP celular de PPi e AMP.
  31. 31. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende um extrato celular selecionado do grupo consistindo em: um extrato celular bacteriano; um extrato celular bacteriano anaeróbico; um extrato celular bacteriano aaeróbico; um extrato celular bacteriano anaeróbico facultativo; um extrato celular vegetal; um extrato celular de microalgas; um extrato celular de Archaea; um extrato celular fúngico; um extrato celular de firmicutes; reticulócitos de coelho (RRL); um extrato celular de gérmen de trigo (WGE); um extrato celular de inseto (ICE); e um extrato celular mamífero (MC).
  32. 32. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende um extrato celular bacteriano termofílico e/ou um extrato celular bacteriano termoestável.
  33. 33. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular bacteriano termofílico e/ou um extrato celular bacteriano termoestável compreende um extrato celular de Geobacillus.
  34. 34. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 83/125
    8/33 reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  35. 35. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus geneticamente modificado compreende uma cepa geneticamente modificada de Geobacillus stearothermophilus.
  36. 36. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes de reação isentos de células compreendem componentes de reação isentos de células selecionados do grupo consistindo em:
    - aminoácidos;
    - polifosfato;
    - Tris-Acetato;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-glutamato;
    - amino-acetato;
    - NaCI;
    - KCI;
    - MgCI2;
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    9/33
    - DTT;
    - octil-b-glicosídeo;
    - NAD (que pode ser convertido a NADH no sistema);
    - NADP (que pode ser convertido a NADPH no sistema);
    - sorbitol;
    - FADH (que pode ser regenerado por processos celulares de NADH/FADH); -ATP;
    - GTP, UTP, e/ou CTP;
    -CoA;
    - PLP; e
    - SAM, ou qualquer combinação destes.
  37. 37. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes de reação isentos de células compreendem componentes de reação isentos de células selecionados do grupo consistindo em:
    - 2 mM de cada aminoácido natural;
    -1 mg/ml de polifosfato;
    - 5 mM de Tris-Acetato;
    - 4 mM de Mg(OAc)2;
    -12 mM de K+-glutamato;
    -1 mM de amino-acetato;
    -100 mM de NaCI;
    -10 mM de KCI;
    - 5 mM de MgCb;
    - 0,1 mM de DTT;
    - 0,2 % de octil-b-glicosídeo;
    - 0,8 mM de NAD (que pode ser convertido a NADH no sistema);
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    10/33
    - 0,4 mM de NADP (que pode ser convertido a NADPH no sistema);
    - 200 mM de sorbitol;
    - 0,5 mM de FADH (que pode ser regenerado por processos celulares de NADH/FADH);
    - 1,5 mM de ATP;
    -1 mM de GTP, UTP, CTP cada;
    -1 mM de CoA;
    - 2 mM de PLP; e
    - 0,2 mM de SAM, ou qualquer combinação destes.
  38. 38. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de RNA polimerase termoestável (RNAP).
  39. 39. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita RNAP termoestável compreende uma quantidade de RNAP derivada de G. stearothermophilus (Gst RNAP).
  40. 40. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Gst RNAP derivada de G. stearothermophilus compreende subunidades de RNAP:
    - subunidade alfa tendo a SEQ ID NO. 1;
    - subunidade beta tendo a SEQ ID NO. 2;
    - subunidade beta’ tendo a SEQ ID NO. 3 e/ou subunidade beta’ (opt) tendo a SEQ ID NO. 4;
    - subunidade delta tendo a SEQ ID NO. 5; e
    - subunidade ômega tendo a SEQ ID NO. 6.
  41. 41. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 86/125
    11/33 quantidade de tRNAs isolados do mesmo tipo de organismo usado para gerar o dito extrato celular.
  42. 42. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda em que a dita quantidade de tRNAs do mesmo microrganismo como o extrato celular compreende quantidade de tRNAs de Geobacillus onde o dito extrato celular foi derivado de Geobacillus.
  43. 43. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros.
  44. 44. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros compreende uma quantidade de tRNAs isolados de E. coli.
  45. 45. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de Sorbitol-desidrogenase (SDH).
  46. 46. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita SDH compreende uma Sorbitol-desidrogenase recombinante derivada de Geobacillus stearothermophilus (Gst SDH).
  47. 47. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de sorbitol.
  48. 48. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita macromolécula
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 87/125
    12/33 compreende um polipeptídeo.
  49. 49. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de síntese de ácido nucleico compreende um padrão de DNA linear.
  50. 50. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de DNA linear compreende um padrão de DNA linear otimizado de códon.
  51. 51. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de DNA linear compreende um padrão de DNA linear tendo:
    - pelo menos um gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor;
    - pelo menos um sítio de ligação a ribossomo (RBS);
    - pelo menos um sítio de divagem de produto de expressão; e
    - pelo menos um rótulo.
  52. 52. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito promotor compreende um promotor de Rhlll identificado na SEQ ID NO. 18, ou promotor de T7 identificado na SEQ ID NO. 19.
  53. 53. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor compreende um gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor.
  54. 54. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende uma primeira construção recombinante que codifica a cadeia leve de TetNT (SEQ ID NO. 12) com um sítio de protease autocatalítica (SEQ ID NO. 13) e
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    13/33 ponte de dissulfeto formando cisteínas, e a segunda construção que codificará a cadeia pesada de TetNT (SEQ ID NO. 14), contendo o sítio de TEV parcialmente integrado (SEQ ID NO. 15) e mCherry-His6 (SEQ ID NO. 16).
  55. 55. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende um gene de TetNT recombinante identificado na SEQ ID NO. 21.
  56. 56. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito RBS compreende um RBS identificado na SEQ ID NO. 20.
  57. 57. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sítio de divagem de produto de expressão compreende um sítio de TEV identificado na SEQ ID NO. 15.
  58. 58. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito um produto de expressão alvo é identificado como a SEQ ID NO. 17.
  59. 59. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK purificada compreende uma quantidade de enzima AdK termoestável purificada.
  60. 60. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK termoestável purificada compreende uma quantidade de enzima AdK termoestável purificada derivada de G. stearothermophilus (Gst Adk).
  61. 61. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima Gst Adk compreende a SEQ ID NO. 8.
  62. 62. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 89/125
    14/33
    PPK purificada compreende a quantidade de enzima PPK termoestável purificada.
  63. 63. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima PPK termoestável purificada compreende uma quantidade de termoestável purificada derivada de Thermus aquaticus (TaqPPK).
  64. 64. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima TaqPPK compreende a SEQ ID NO. 11.
  65. 65. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK purificada e a dita em que a dita quantidade de enzima PPK purificada compreende uma quantidade de enzima Gst AdK purificada identificada como a SEQ ID NO. 8, e uma quantidade de enzima de rótulo PPK purificada identificada como SEQ ID NO. 11.
  66. 66. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK.
  67. 67. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito um sistema de expressão de proteína isento de células tendo uma quantidade de enzima Gst Adk maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK compreende um sistema de expressão de proteína isento de células em que a dita razão molar de Gst Adk:TaqPPK é aproximadamente 3:1.
  68. 68. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito nas reivindicações 30 e 67, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP.
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 90/125
    15/33
  69. 69. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP e compreende uma faixa de concentração de aproximadamente 0,2 a 2 mg/ml de PPi na reação de regeneração de ATP de volume de 100 μΙ.
  70. 70. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes do sistema de regeneração de energia de ATP celular podem ser adicionados ao dito biorreator de expressão isento de células como lote, fluxo contínuo, ou fluxo semicontínuo.
  71. 71. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes de reação isentos de células podem ser adicionados ao dito biorreator de expressão isento de células como lote, fluxo contínuo, ou fluxo semi-contínuo.
  72. 72. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular derivado de uma cultura bacteriana tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK); e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK);
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 91/125
    16/33
    - em que as ditas AdK e PPK trabalham sinergicamente para regenerar a energia de ATP celular de PPi e AMP.
  73. 73. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK compreende uma quantidade de enzima AdK derivada de G. stearothermophilus (Gst Adk).
  74. 74. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima PPK compreende uma quantidade de termoestável purificada derivada de Thermus aquaticus (TaqPPK).
  75. 75. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima Gst Adk compreende a SEQ ID NO. 8.
  76. 76. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 74, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita TaqPPK compreende a SEQ ID NO. 11.
  77. 77. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de RNAP e compreende uma quantidade de RNAP derivada de G. stearothermophilus (Gst RNAP).
  78. 78. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Gst RNAP derivada de G. stearothermophilus compreende subunidades de RNAP:
    - subunidade alfa tendo a SEQ ID NO. 1;
    - subunidade beta tendo a SEQ ID NO. 2;
    - subunidade beta’ tendo a SEQ ID NO. 3 e/ou subunidade beta’ (opt) tendo a SEQ ID NO. 4;
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 92/125
    17/33
    - subunidade delta tendo a SEQ ID NO. 5; e
    - subunidade ômega tendo a SEQ ID NO. 6.
  79. 79. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 78, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende um extrato celular de Geobacillus.
  80. 80. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 79, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  81. 81. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de Sorbitol-desidrogenase (SDH).
  82. 82. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 81, CARACTERIZADO pelo fato de que o dita SDH compreende uma Sorbitol-desidrogenase recombinante derivada de Geobacillus stearothermophilus (Gst SDH).
    XX190 Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de sorbitol.
  83. 83. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 93/125
    18/33 descrito na reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs isolados do mesmo tipo de bactérias usadas para gerar o dito extrato celular.
  84. 84. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs das mesmas bactérias usadas para gerar o dito extrato celular compreende a quantidade de tRNAs de Geobacillus onde o dito extrato celular foi derivado de Geobacillus.
  85. 85. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros.
  86. 86. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros compreende uma quantidade de tRNAs isolados de E. coli.
  87. 87. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico compreende um padrão de DNA linear.
  88. 88. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 87, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de DNA linear compreende um padrão de DNA linear tendo:
    - pelo menos um gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor;
    - pelo menos um sítio de ligação a ribossomo (RBS);
    - pelo menos um sítio de divagem de produto de expressão; e
    - pelo menos um rótulo.
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 94/125
    19/33
  89. 89. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor compreende um gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor.
  90. 90. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 89, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende um gene de TetNT recombinante identificado na SEQ ID NO. 21.
  91. 91. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 75 e XX120, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK.
  92. 92. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 91, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK e compreende um sistema de expressão de proteína isento de células em que a dita razão molar de enzima Gst Adk:TaqPPK é aproximadamente 3:1.
  93. 93. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 72 e 92, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP.
  94. 94. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 93, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP e compreende uma faixa de concentração de aproximadamente 0,2 a 2 mg/ml de PPi na reação de regeneração de ATP de volume de 100 μΙ.
  95. 95. Sistema de expressão de proteína isento de células, como descrito na reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes de reação isentos de células compreendem componentes de reação isentos de células
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 95/125
    20/33 selecionados do grupo consistindo em:
    - aminoácidos;
    - polifosfato;
    - Tris-Acetato;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-glutamato;
    - amino-acetato;
    - NaCI;
    - KCI;
    - MgCI2;
    - DTT;
    - octil-b-glicosídeo;
    - NAD (que pode ser convertido a NADH no sistema);
    - NADP (que pode ser convertido a NADPH no sistema);
    - sorbitol;
    - FADH (que pode ser regenerado por processos celulares de NADH/FADH);
    -ATP
    - GTP, UTP, e/ou CTP;
    -CoA;
    - PLP; e
    - SAM, ou qualquer combinação destes.
  96. 96. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular derivado de uma cultura tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 96/125
    21/33
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) purificada;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
    - em que as ditas AdK e PPK trabalham sinergicamente para regenerar energia de ATP celular de PPi e AMP.
  97. 97. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 96, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK compreende uma quantidade de enzima AdK derivada de G. stearothermophilus (Gst Adk).
  98. 98. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima PPK compreende uma quantidade de termoestável purificada derivada de Thermus aquaticus (TaqPPK).
  99. 99. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima Gst Adk compreende a SEQ ID NO. 8.
  100. 100. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 98, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita TaqPPK compreende a SEQ ID NO. 11.
  101. 101. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 99, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de RNAP compreende uma quantidade de RNAP derivada de G. stearothermophilus (Gst RNAP).
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 97/125
    22/33
  102. 102. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Gst RNAP derivada de G. stearothermophilus compreende subunidades de RNAP:
    - subunidade alfa tendo a SEQ ID NO. 1;
    - subunidade beta tendo a SEQ ID NO. 2;
    - subunidade beta’ tendo a SEQ ID NO. 3 e/ou subunidade beta’ (opt) tendo a SEQ ID NO. 4;
    - subunidade delta tendo a SEQ ID NO. 5; e
    - subunidade ômega tendo a SEQ ID NO. 6.
  103. 103. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende um extrato celular de Geobacillus.
  104. 104. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 103, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  105. 105. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de Sorbitol-desidrogenase (SDH).
  106. 106. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 98/125
    23/33 descrito na reivindicação 105, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita SDH compreende uma Sorbitol-desidrogenase recombinante derivada de Geobacillus stearothermophilus (Gst SDH).
  107. 107. Sistema de expressão de proteína isento de células bactriano, como descrito na reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de sorbitol.
  108. 108. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs isolados do mesmo tipo de bactérias usadas para gerar o dito extrato celular.
  109. 109. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 108, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs das mesmas bactérias usadas para gerar o dito extrato celular compreende a quantidade de tRNAs de Geobacillus onde o dito extrato celular foi derivado de Geobacillus.
  110. 110. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 109, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros.
  111. 111. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de tRNAs configurados para impedir o retardo traducional devido a códons raros compreende uma quantidade de tRNAs isolados de E. coli.
  112. 112. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 111, CARACTERIZADO pelo fato de que no dito pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico compreende um padrão de DNA linear.
  113. 113. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 99/125
    24/33 descrito na reivindicação 112, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito padrão de DNA linear compreende um padrão de DNA linear tendo:
    - pelo menos um gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor;
    - pelo menos um sítio de ligação a ribossomo (RBS);
    - pelo menos um sítio de divagem de produto de expressão; e
    - pelo menos um rótulo.
  114. 114. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de produto de expressão alvo operavelmente ligado a um promotor compreende um gene de tentoxilisina (TetNT) operavelmente ligado a um promotor.
  115. 115. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 114, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito gene de TetNT compreende um gene de TetNT recombinante identificado na SEQ ID NO. 21.
  116. 116. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 99 e XX120, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK.
  117. 117. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 116, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK e compreende um sistema de expressão de proteína isento de células em que a dita razão molar de enzima Gst Adk:TaqPPK é aproximadamente 3:1.
  118. 118. Sistema de expressão de proteína isento de células in vitro, como descrito na reivindicação 97 e 117, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP.
  119. 119. Sistema de expressão de proteína in vitro, como descrito na reivindicação
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 100/125
    25/33
    118, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de PPi compreende uma faixa de concentração que mantém o equilíbrio da reação de regeneração de ATP e compreende uma faixa de concentração de aproximadamente 0,2 a 2 mg/ml de PPi na reação de regeneração de ATP de volume de 100 μΙ.
  120. 120. Sistema de expressão de proteína in vitro, como descrito na reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos componentes de reação isentos de células compreendem componentes de reação isentos de células selecionados do grupo consistindo em:
    - aminoácidos;
    - polifosfato;
    - Tris-Acetato;
    - Mg(OAc)2;
    - K+-glutamato;
    - amino-acetato;
    - NaCI;
    - KCI;
    - MgCI2;
    - DTT;
    - octil-b-glicosídeo;
    - NAD (que pode ser convertido a NADH no sistema);
    - NADP (que pode ser convertido a NADPH no sistema);
    - sorbitol;
    - FADH (que pode ser regenerado por processos celulares de NADH/FADH);
    -ATP
    - GTP, UTP, e/ou CTP;
    -CoA;
    - PLP; e
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 101/125
    26/33
    - SAM, ou qualquer combinação destes.
  121. 121. Sistema de expressão de proteína isento de células suplementados com energia CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - uma quantidade de Sorbitol-desidrogenase (SDH); e
    - uma quantidade de sorbitol.
  122. 122. Sistema de expressão isento de células, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um sistema de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular tendo todos os componentes de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - um sistema de regeneração de energia de trifosfato de adenosina (ATP) celular compreendendo:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (Gst AdK) termoestável purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (TaqPPK) termoestável purificada.
  123. 123. Sistema de expressão de proteína isento de células suplementados com energia termoestável, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um biorreator de expressão isento de células tendo:
    - uma mistura de reação contendo um extrato celular todos os componentes
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 102/125
    27/33 de reação isentos de células necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - pelo menos um padrão de síntese de ácido nucleico;
    - uma quantidade de termoestável Sorbitol-desidrogenase (tSDH); e
    - uma quantidade de sorbitol.
  124. 124. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um sistema dependente de ATP suplementado com o seguinte:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) purificada;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
  125. 125. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, como descrito na reivindicação 124, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK compreende uma quantidade de enzima AdK derivada de G. stearothermophilus (Gst Adk).
  126. 126. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, como descrito na reivindicação 125, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima PPK compreende uma quantidade de termoestável purificada derivada de Thermus aquaticus (TaqPPK).
  127. 127. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, como descrito na reivindicação 125, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima Gst Adk compreende a SEQ ID NO. 8.
  128. 128. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, como descrito na reivindicação 126, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita TaqPPK compreende a SEQ ID NO. 11.
  129. 129. Sistema de expressão de proteína isento de células como descrito nas reivindicações XX101 e XX102, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 103/125
    28/33 de enzima Gst Adk é maior do que a quantidade de enzima TaqPPK.
  130. 130. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, como descrito na reivindicação 129, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima Gst Adk é maior do que a dita quantidade de enzima TaqPPK e compreende um sistema de expressão de proteína isento de células em que a dita razão molar de enzima Gst Adk:TaqPPK é aproximadamente 3:1.
  131. 131. Sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    - um sistema dependente de ATP suplementado com o seguinte:
    - uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (Gst AdK) termoestável purificada; e
    - uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (TaqPPK) termoestável purificada;
    - uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi); e
    - uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP).
  132. 132. Método de expressão proteica isenta de células incorporando um sistema de regeneração de energia com base em polifosfato inorgânico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas:
    - estabelecer um microrganismo de Geobacillus termofílico, em que o dito Geobacillus termofílico é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 104/125
    29/33 destes.
    - gerar uma cultura celular do dito microrganismo de Geobacillus termofílico geneticamente engendrado;
    - gerar um lisato ceular da dita cultura celular;
    - gerar um extrato celular derivado do dito lisato celular;
    - suplementar o dito extrato celular com um ou mais componentes de reação isentos de células formando uma mistura de reação tendo componentes necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - suplementar a dita mistura de reação com tRNAs purificados derivados da mesma cepa como o dito microrganismo de Geobacillus termofílico;
    - suplementar a dita mistura de reação com tRNAs purificados derivados de
    E. coli;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de Sorbitoldesidrogenase termoestável (Gst SDH);
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de sorbitol;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) termoestável;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) termoestável;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi);
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP);
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de RNAP termoestável purificada (Gst RNAP);
    - introduzir um padrão de síntese de DNA linear configurado para gerar um ou mais produtos de expressão;
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 105/125
    30/33
    - incubar a dita mistura de reação em um biorreator de expressão isento de células;
    - gerar o dito um ou mais produtos de expressão no dito biorreator de expressão isento de células; e
    - isolar e purificar um ou mais dos ditos produtos de expressão da dita mistura de reação.
  133. 133. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas:
    - gerar uma cultura celular de um microrganismo de Geobacillus termofílico;
    - gerar um lisato celular da dita cultura celular;
    - gerar um extrato celular derivado do dito lisato celular;
    - suplementar o dito extrato celular com um ou mais componentes de reação isentos de células formando uma mistura de reação tendo componentes necessários para a síntese de macromolécula in vitro;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de enzima Adenosil Cinase (AdK) termoestável;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de enzima Polifosfato Cinase (PPK) termoestável;
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de polifosfato inorgânico (PPi);
    - suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de monofosfato de adenosina (AMP);
    - introduzir um padrão de síntese de ácido nucleico configurado para gerar um ou mais produtos de expressão;
    - incubar a dita mistura de reação em um biorreator de expressão isento de células;
    - gerar o dito um ou mais produtos de expressão no dito biorreator de
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    31/33 expressão isento de células; e
    - isolar e purificar um ou mais dos ditos produtos de expressão da dita mistura de reação, em que em o dito produto de expressão é uma proteína.
  134. 134. Método CARACTERIZADO pelo fato de ser de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 133 e compreendendo ainda a etapa de suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de RNAP termoestável purificada (Gst RNAP);
  135. 135. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 133 CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Geobacillus termofílico é geneticamente modificado para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  136. 136. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 133, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima AdK termoestável compreende uma quantidade de enzima AdK derivada de G. stearothermophilus (Gst Adk).
  137. 137. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 133, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita quantidade de enzima PPK termoestável compreende uma quantidade de termoestável purificada derivada de Thermus aquaticus (TaqPPK).
  138. 138. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 107/125
    32/33 isento de células, como descrito na reivindicação 136, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima Gst Adk compreende a SEQ ID NO. 8.
  139. 139. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 137, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita TaqPPK compreende a SEQ ID NO. 11.
  140. 140. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 138, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de suplementar a dita mistura de reação com uma quantidade de RNAP derivada de G. stearothermophilus (Gst RNAP).
  141. 141. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 140, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita Gst RNAP derivada de G. stearothermophilus compreende subunidades de RNAP:
    - subunidade alfa tendo a SEQ ID NO. 1;
    - subunidade beta tendo a SEQ ID NO. 2;
    - subunidade beta’ tendo a SEQ ID NO. 3 e/ou subunidade beta’ (opt) tendo a SEQ ID NO. 4;
    - subunidade delta tendo a SEQ ID NO. 5; e
    - subunidade ômega tendo a SEQ ID NO. 6.
  142. 142. Método de gerar uma proteína através de um sistema de expressão isento de células, como descrito na reivindicação 141, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito extrato celular compreende extrato celular de Geobacillus.
  143. 143. Microrganismo termofílico geneticamente modificado para o uso em um sistema de expressão isento de células CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cepa de Geobacillus termofílico é geneticamente modificada para:
    - inativar a expressão de OmpT-homólogo;
    - inativar a expressão de RNasel;
    Petição 870190061519, de 01/07/2019, pág. 108/125
    33/33
    - inativar a expressão de DNase dependente de metilação de DNA;
    - reduzir a expressão de operon de esporulação dependente de densidade de cultura;
    - super-expressar o fator sigma RpoD; e
    - super-expressar a RNA polimerase (RNAP), ou qualquer combinação destes.
  144. 144. Polipeptídeo de Adenosil Cinase Gst Adk recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de ser identificado como a SEQ ID. 8.
  145. 145. Polipeptídeo de Polifosfato Cinase TaqPPK recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de ser identificado como a SEQ I D, 11.
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