CN115029363A

CN115029363A - 一种体内连续定向进化系统及其应用

Info

Publication number: CN115029363A
Application number: CN202110254263.5A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 刘展志; 张昕昱; 许滢
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: WO2022183706A1; US20230044600A1; CN115029363B

Abstract

本发明公开了一种体内连续定向进化系统及其应用，属于基因工程和酶工程领域。该系统包括携带随机突变模块MP、程序化死亡模块TAS以及目的基因表达模块TP的大肠杆菌宿主菌。模块间通过相互偶联，最终实现对宿主菌中目的基因的高效进化以及筛选。该系统具有较好的实用价值，可应用于多种不同功能型蛋白质的定向进化。

Description

一种体内连续定向进化系统及其应用

技术领域

本发明涉及一种体内连续定向进化系统及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

定向进化也被称为实验室进化，是一种在实验室环境中，从分子水平上模拟进化过程，最终得到具有期望特征的蛋白质的方法。然而，这一进化过程存在着单轮突变效率过低、筛选工作量极大、筛选手段过于复杂等问题，为获得理想的蛋白质特性通常需要几轮进化甚至几十轮进化。基于上述问题，哈佛大学David Liu实验室提出了一种由噬菌体辅助的连续进化系统(PACE)，该系统通过将定向进化与M13噬菌体的生命周期相偶联，并利用诱变质粒使目的基因产生随机突变，能够使目的基因持续进化，并对其进行定向筛选。在PACE中，目的基因取代了编码关键噬菌体外壳蛋白的基因pIII，被整合在M13噬菌体的基因组中。David Liu实验室使用恒浊器-泻湖系统或恒化器-泻湖系统持续向噬菌体提供新鲜大肠杆菌宿主细胞，以防止宿主基因组突变的积累。宿主细胞中包含了pIII的表达载体，并且pIII的表达与相关基因的某些预期功能偶联在一起。不能诱导pIII表达的噬菌体无法繁殖，并被不断流入的噬菌体冲刷出系统。噬菌体具有传代时间短的优点，单个细胞在感染宿主菌1小时内可产生近1000个子代噬菌体，在感染10分钟后出现新的噬菌体颗粒，每一代噬菌体都代表着一轮进化。该系统可以在一天完成数十轮进化，包括目的基因的复制、突变和定向选择。与传统方法相比，该系统只需要最少的人工干预，可在更短的时间内使目的蛋白产生新的活性或改进目的蛋白已有的活性。PACE系统目前已成功应用于定向进化T7 RNAp聚合酶，利用PACE的进化系统T7 RNAp聚合酶在几天内产生了对T3启动子的识别活性。

尽管具有上述优点，但由于PACE系统是一种基于噬菌体的定向进化系统，因此对于设备、实验室研究人员的操作以及实验室规格标准要求较高。此外，该系统对目的基因的靶向性较差，无法使突变准确定位于目的基因上，而非目的基因区域的随机突变可能会对宿主的生理代谢产生不利影响，降低了PACE系统的普适性。因此，开发新型高效的体内连续定向进化系统并提高对目的基因的靶向性具有较高的理论和应用意义。

发明内容

[技术问题]

现有的定向进化系统对目的基因的靶向性较差，无法使突变准确定位于目的基因上。且现有的定向进化系统，对实验室规格标准以及操作规范要求较高，不利于技术推广应用。

[技术方案]

本发明第一个目的是提供一种体内连续定向进化系统，该系统可以在体内对目的蛋白进行随机突变，并对其进行定向筛选。

作为本发明的进一步改进的方案，所述系统宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

作为本发明的进一步改进的方案，所述系统中宿主菌包含两种及两种以上功能模块。

作为本发明的进一步改进的方案，所述功能模块中包括随机突变模块MP、程序化死亡模块TAS以及目的基因表达模块TP；随机突变模块MP与目的基因表达模块TP偶联，目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS偶联。

在一种实施方式中，所述目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS的偶联是指TP模块上目的基因在随机突变后能诱导TAS模块上抗毒蛋白的表达；并不局限于以下几种：(1)DNA结合蛋白：如将抗毒蛋白转录因子的进化与抗毒蛋白的表达相偶联等；(2)作用于小分子的蛋白：如将部分糖酶、角质酶或其他参与代谢或非代谢物生物合成的酶的反应产物与抗毒蛋白的表达相偶联等；(3)荧光蛋白：如利用光敏性启动子将荧光蛋白与抗毒蛋白的表达相偶联等；(4)核酸酶，如Cas9:通过相应的基因调控将Cas9功能与抗毒蛋白的表达相偶联等。

作为本发明的进一步改进的方案，所述随机突变模块MP上含有诱变基因和辅助基因；目的基因表达模块TP上含有目的基因和能被随机突变模块MP辅助基因识别或结合的元件；所述程序化死亡模块TAS上含有编码毒蛋白的基因和相对应的编码抗毒蛋白的基因。

作为本发明的优选方案，所述诱变基因选自但不限于低保真性的DNA聚合酶I的编码基因PolA、胞嘧啶脱氨酶的编码基因AID、胞嘧啶脱氨酶的编码基因APOBEC、腺嘌呤脱氨酶的编码基因TadA等基因中的至少一种。

作为本发明的优选方案，所述辅助基因选自但不限于T7 RNA聚合酶的编码基因、缺少切割非互补链活性的nCas9的编码基因、仅具有DNA结合能力的dCas9的编码基因等基因中的一种或多种。

作为本发明的进一步改进的方案，所述目的基因为一种或多种蛋白的编码基因和/或非编码基因。

作为本发明的优选方案，所述目的基因包括但不限于T7 RNA聚合酶的编码基因、抗生素的抗性基因、分解代谢途径中的酶的编码基因、合成代谢途径中的酶的编码基因、DNA结合蛋白的编码基因、核酸酶的编码基因、糖酶的编码基因、蛋白酶的编码基因等基因中的一种或多种。

作为本发明的优选方案，所述目的基因表达模块TP上被辅助基因识别或结合的元件包括但不限于tac启动子、pac启动子、Sp6启动子、lac启动子、T7启动子、pBAD启动子、trc启动子、npr启动子以及sgRNA。

作为本发明的优选方案，所述程序化死亡模块TAS上毒蛋白的编码基因由pBAD操纵系统启动；抗毒蛋白的编码基因由目的基因定向进化后识别并启动表达。

作为本发明的优选方案，所述程序化死亡模块TAS中毒蛋白的编码基因包括但不限于可引起细胞破裂的YdfD等；阻遏细胞膜生成的PezT、SezT、zeta toxin等；对DNA的复制有抑制作用的FicT、CcdB等；对翻译有抑制作用的TacT等；抗毒蛋白的编码基因选自与毒蛋白对应的DicB/SulA、PezA、SezA、epsilon antitoxin、FicA、CcdA、TacA等。

在一种实施方式中，所述随机突变模块MP、目的基因表达模块TP和程序化死亡模块的表达载体包括但不限于pET系列，或pSB1C3，或pRSFDuet，或pCDFDuet质粒。

在一种实施方式中，所述随机突变模块MP、目的基因表达模块TP和程序化死亡模块的表达载体各不相同。

本发明第二个目的是提供一种基因连续定向进化方法，将所述体内连续定向进化系统转化至微生物细胞；诱导随机突变模块MP表达诱导蛋白；诱导程序化死亡模块TAS上毒蛋白的表达。

作为本发明的优选方案，上述方法的具体步骤为：

1)将随机自发突变模块MP、目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS依次转入大肠杆菌，过夜培养；

2)加入诱导剂A，介导随机突变模块MP表达诱变蛋白，靶向性地结合在目的基因表达模块TP启动子下游，识别并介导目的基因表达模块TP中目的基因产生随机突变；

3)加入诱导剂B，介导程序化死亡模块TAS上毒蛋白表达；

4)成功进化的目的蛋白识别并介导程序化死亡模块TAS上抗毒蛋白的表达；

或1)将随机自发突变模块MP、目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS依次转入大肠杆菌，过夜培养；

2)同时加入诱导剂A和B，系统中随机突变模块MP表达诱变蛋白，靶向性地结合在目的基因表达模块TP启动子下游，识别并介导目的基因表达模块TP中目的基因产生随机突变；

3)成功进化的目的蛋白识别并介导程序化死亡模块TAS上抗毒蛋白的表达。

作为本发明的进一步改进的方案，所述方法步骤2)还包括：在进化中，通过系统中的随机突变模块MP对目的基因进行多轮连续突变，以提高目的基因的突变率；所述多轮连续突变是指将诱导后的菌株转接或连续培养，再投入诱导剂或是在含有诱导剂的培养基中生长。

作为本发明的进一步改进的方案，所述方法还包括：在包含诱导剂B的平板上对宿主菌进一步筛选，以提高筛选效率。

作为本发明的进一步改进的方案，所述方法的诱导剂A是指诱导剂IPTG、诱导剂B是指诱导剂L-ara。

本发明还保护所述连续定向化系统或上述方法在蛋白质改造中的作用。

有益效果：

本发明的体内连续定向进化系统对目的基因具有靶向性，诱变蛋白能准确识别并介导目的基因产生随机突变，突变准确定位于目的基因上。且该系统适用于在大肠杆菌体内进行筛选，所选作用对象较为广泛，便于大部分实验室推广使用。

附图说明

图1体内连续定向进化的流程示意图。

图2随机突变模块MP的质粒图谱。

图3目的基因表达模块TP的质粒图谱。

图4程序化死亡模块TAS的致死效果的生长曲线对比图。

图5程序化死亡模块TAS的致死效果的细胞染色对比图。

图6进化筛选产物与对照组在筛选平板上生长形成单菌落数的对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，本发明一个实施方案的大肠杆菌中的连续定向进化系统包括随机突变模块MP、目的基因表达模块TP、程序化死亡模块TAS。其中，程序化死亡模块TAS中抗毒蛋白的表达与目的基因表达模块TP中突变后的目的蛋白质功能相偶联。即成功进化后的目的蛋白可以直接启动或调控TAS中抗毒蛋白的表达；或者成功进化后的目的蛋白可以分解或者合成某种物质，以此启动或调控TAS中抗毒蛋白的表达。在图1所举实例中，获得的T7RNAp突变体可以特异性识别抗毒蛋白的T7(R13)启动子，并启动抗毒蛋白的转录，以拮抗毒蛋白对宿主菌的作用；未发生突变或非优势的T7 RNAp突变体则无法识别T7(R13)启动子，导致抗毒蛋白无法正常表达，因此毒蛋白裂解细胞。

本领域的技术人员应当理解，本发明并不局限于上述以“T7 RNAp的编码基因”作为定向进化的实施例，其他任何类似的技术方案均适用于本发明。当针对不同的目的基因，如糖酶基因、角质酶基因、酯酶基因、荧光蛋白基因，核酸酶基因等时，可以通过不同的原理将它们的功能与程序化死亡模块TAS中抗毒蛋白的表达偶联起来。

本发明将列举几项可以应用于连续定向进化的目的基因实例，需明确的是，在本发明中可供选择的目的基因有很多，并不局限于以下几种：(1)DNA结合蛋白：如可以将抗毒蛋白转录因子的进化与抗毒蛋白的表达相偶联等；(2)作用于小分子的蛋白：如将部分糖酶、角质酶或其他参与代谢或非代谢物生物合成的酶的反应产物与抗毒蛋白的表达相偶联等；(3)荧光蛋白：如利用光敏性启动子将荧光蛋白与抗毒蛋白的表达相偶联等；(4)核酸酶，如Cas9:通过相应的基因调控将Cas9功能与抗毒蛋白的表达相偶联等。

需说明，图1中的程序化死亡模块TAS仅为一种实施例，根据TAS中毒蛋白的毒性机制不同，可适用于本发明的毒蛋白-抗毒蛋白系统可以有多种选择且不局限于以下几种：(1)可以抑制DNA复制、转录等功能的毒蛋白：如来源于P.aeruginosa的FicT/FicA，FicT通过腺苷化修饰DNA旋回酶和拓扑异构酶IV，使细胞DNA打结、连接和松弛而导致可逆的细胞生长停止；(2)对翻译有抑制作用的毒蛋白：如来源于Salmonella的TacT/TacA，TacT是一种乙酰转移酶，它可以阻断带电tRNA分子上氨基酸的伯胺基，从而抑制翻译和促进存留细胞的形成；(3)影响细胞分裂的毒蛋白：如来源于大肠杆菌的YdfD，YdfD在诱导2小时内可溶解99.9％的细胞，而细胞分裂抑制剂的SulA可以消除YdfD诱导的细胞裂解；(4)影响肽聚糖合成的毒蛋白：如来源于Streptococcus Suis Serotype的SezT/SezA，StreptococcusPneumoniae来源的Pez A/T，其可以抑制肽聚糖的合成，最终引起细菌自溶。另外，任意可以引起细胞死亡的毒蛋白以及能够拮抗该毒蛋白的抗毒蛋白均可作为本发明中的程序化死亡模块使用。

在本发明的一个实施例中，负责突变的诱变蛋白为胞苷脱氨酶(AID)，AID能作用于单链DNA，可以使胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶最终转化为胸腺嘧啶；T7 RNAp与AID融合表达，负责使AID可以靶向性地结合在目的基因表达模块TP上T7启动子的下游，使得诱变蛋白对目的基因具有靶向性。除该实施例外，其他具有靶向性的诱变蛋白、诱变蛋白突变体或诱变融合蛋白也可以作为本发明中的自发随机突变模块MP使用。例如但不限于DNA聚合酶PolⅠ(D355A/E357A或D424A/I709N/A759R)，其为一种保真性低的DNA聚合酶突变体，可以特异性识别具有ColE1 Ori的质粒并能使该转录起始位点后一定长度的核苷酸序列发生突变。

本发明提供的定向进化方法，包括：在诱导剂的作用下，系统中随机突变模块MP表达诱变蛋白，其会识别并介导目的基因表达模块TP中目的基因产生随机突变；目的基因突变后，再向系统中加入诱导毒蛋白表达的诱导剂使系统开始定向筛选；成功进化的目的蛋白突变体可以介导程序化死亡模块TAS上抗毒蛋白的表达，使毒蛋白无法作用于宿主细胞，最终只有包含成功进化的目的基因的宿主细胞可以存活。

通过以下实施例说明本发明的可行性，需要说明的是，以下实施例仅是示例性的，并且其目的仅在于说明本发明的可行性，并不意在限制本发明的保护范围。

下述实施例中涉及的质粒和菌株来源如下：

pET20b、pRSFDuet、pCDFDuet质粒购自TaKaRa(大连)生物工程有限公司；大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)由本实验室保藏。

下述实施例中涉及的试剂和培养基如下：

下述实施例中涉及的PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA Marker、Dpn I限制性内切酶等购自TaKaRa(大连)生物工程有限公司。

LB培养基：0.5％(W/V)酵母浸粉，1％(W/V)胰蛋白胨，1％(W/V)氯化钠，添加2％(W/V)琼脂粉即为LB固体培养基。

TB培养基：1.2％(W/V)胰蛋白胨、2.4％(W/V)酵母浸粉、0.4％(V/V)甘油、磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄、72mM K₂HPO₄)。

实施例1：随机自发突变模块MP的构建

具体步骤如下：

以AID-T7 RNAp介导的随机自发突变模块MP为例。合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白编码AID-T7 RNAp(T3)(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，其中T7 RNAp(T3)表示T7 RNAp的T3型突变体。通过酶切连接的方式，将AID-T7 RNAp(T3)连接至大肠杆菌表达载体pCDFDuet构建重组载体pCDFDuet-pT7-AID-T7 RNAp(T3)。将连接产物转化至大肠杆菌JM109中，转化产物涂布于LB固体培养基(含终浓度50μg·mL^-1链霉素)上。37℃倒置培养10～12h之后，挑取平板上的转化子接至LB液体培养基(含终浓度50μg·mL^-1链霉素)中。37℃、200rpm培养12～14h后，提取质粒测序验证，作为随机突变模块MP的一种，并命名为pCDFuet-1-AID-T7 RNAp(T3)(如图2所示)。

实施例2：程序化死亡模块TAS的构建

具体步骤如下：

选取毒蛋白-抗毒蛋白系统(TAS)YdfD/SulA，合成其序列，氨基酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。将其核苷酸序列分别导入pRSFDuet的两个多克隆位点中，并使用MEGAWHOP克隆的方法将载体中表达毒蛋白的T7启动子替换为pBAD操纵系统。对PCR产物进行Dpn I消化后，将其转化至大肠杆菌JM109中，转化产物涂布于LB固体培养基(含终浓度50μg·mL^-1卡那霉素)上。37℃倒置培养10～12h之后，挑取平板上的转化子接至LB液体培养基(含终浓度50μg·mL^-1卡那霉素)中。37℃、200rpm培养12～14h后，提取质粒并将其送至测序公司进行测序。测序结果正确的质粒即为重组载体pRSFDuet–pT7–antitoxin–araC–pBAD–toxin。

实施例3：大肠杆菌中程序化死亡模块TAS的鉴定

具体步骤如下：

将毒蛋白-抗毒蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，并将其接入LB培养基中诱导发酵。首先，将保存于-80℃冰箱的甘油菌接入10mL LB种子液(含终浓度50μg·mL^-1卡那霉素)中，37℃、200rpm过夜培养。将种子液以1：20的比例转接至50mL LB发酵液(含终浓度50μg·mL^-1卡那霉素)中，37℃、200rpm、1.5h后加入诱导剂IPTG、L-ara诱导发酵(另做一组只加IPTG、一组只加L-ara、一组不加诱导剂的作为对照)。加入诱导剂后，测定重组菌生长情况。结果如图4所示，当只存在诱导剂L-ara时，诱导毒蛋白的表达，能有效介导菌株死亡；当同时存在诱导剂IPTG、L-ara，因为IPTG解除lac I对T7类启动子的抑制诱导T7启动子启动抗毒蛋白的表达，菌株生长几乎不受影响。

诱导6h后，用生理盐水清洗并重悬菌体。在重悬液中加入PI/SYTO9核酸染料染色，用激光共聚焦显微镜观察并鉴定重组菌的死活情况。结果如图5所示，染色实验进一步证明了，当只存在诱导剂L-ara时，pBAD操纵系统诱导毒蛋白的表达，能有效介导菌株死亡；当同时存在诱导剂IPTG、L-ara，因为IPTG解除lac I对T7类启动子的抑制诱导T7启动子启动抗毒蛋白的表达，菌株生长几乎不受影响。

上述实验共同验证了大肠杆菌中程序化死亡模块TAS中毒蛋白和抗毒蛋白的表达是受诱导剂IPTG、L-ara和启动子调控的。

利用实施例3的鉴定方法，通过点突变的方式将表达抗毒蛋白的T7启动子突变为T7(R13)启动子(T7(R13)启动子序列见文章Meyer AJ,Ellefson J W,Ellington AD.Directed Evolution of a Panel of Orthogonal T7 RNA Polymerase Variants forin Vivo or in Vitro Synthetic Circuitry[J].Acs Synthetic Biology,2015,4(10).：Table 1“P_CGTA”)，以进行后续含目的基因定向进化的实施。

实施例4：大肠杆菌中目的基因表达模块TP的构建

具体步骤如下：

以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，使用引物T7RNApRF-F和T7RNApRF-R扩增得到T7 RNAp的编码基因作为目的基因，利用MEGAWHOP将其连接至大肠杆菌表达载体pET20b上。将含有T7 RNAp的编码基因的重组表达载体pET20b进行Dpn I消化后，转化至大肠杆菌JM109中，转化产物涂布于LB固体培养基(含终浓度100μg·mL^-1氨苄霉素)上。37℃倒置培养10～12h之后，挑取平板上的转化子接至LB液体培养基(含终浓度100μg·mL^-1氨苄霉素)中。37℃、200rpm培养12～14h后，提取质粒进行测序验证。测序结果正确的质粒即为重组载体pET20b-T7 RNAp(如图3所示)。以点突变的方式将重组载体上的T7启动子突变为T7(T3)启动子，其中T7(T3)启动子表示仅能被随机突变模块MP上辅助基因T7RNAp(T3)识别的启动子(T7(T3)启动子序列见文章Meyer A J,Ellefson J W,Ellington A D.DirectedEvolution of a Panel of Orthogonal T7 RNA Polymerase Variants for in Vivo orin Vitro Synthetic Circuitry[J].Acs Synthetic Biology,2015,4(10).：Table 1“P_T3”)。所得重组质粒pET20b-Pt7(T3)-T7 RNAp为目的基因表达模块TP。

引物T7RNApRF-F:CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACACGATTAACATCGC；

引物T7RNApRF-R：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACGCGAACGCGAAGTCC。

实施例5：大肠杆菌中各个模块的组装与表征

具体步骤如下：

1)将随机自发突变模块MP、目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS依次转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃、200rpm过夜培养。将种子液以1：20的比例转接至50mL TB发酵液中，37℃、200rpm、1.5h后加入诱导剂IPTG和L-ara(终浓度分别为0.4mM和0.3％)进行连续诱导发酵。将诱导后的菌液稀释一定倍数后，涂板(含0.3％L-ara)，计算单菌落数(另作一组未加L-ara的作为对照)。结果如图6所示，将平板上能够生长的单菌落进行目的基因测序，最终得到T7 RNAp的R13型突变体T7 RNAp(R13)。最终突变效率为4x10^-5～-6/bp，筛选周期6天，突变型菌株的生理代谢未受到影响。

2)将随机自发突变模块MP、目的基因表达模块TP与程序化死亡模块TAS依次转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃、200rpm过夜培养。将种子液以1：20的比例转接至50mL TB发酵液中，37℃、200rpm、1.5h后加入诱导剂IPTG(终浓度0.4mM)进行连续诱导发酵，发酵2～4h后加入加入诱导剂L-ara(终浓度0.3％)。将诱导后的菌液稀释一定倍数后，涂板(含0.3％L-ara)，计算单菌落数(另作一组未加L-ara的作为对照)。结果如图6所示，将平板上能够生长的单菌落进行目的基因测序，最终得到T7 RNAp的R13型突变体T7 RNAp(R13)。最终突变效率为4x10^-5～-6/bp，筛选周期6天，突变型菌株的生理代谢未受到影响。

以上实施例是以将识别T7启动子的T7 RNAp进化为识别T7(R13)启动子突变型的T7RNAp突变体T7 RNAp(R13)为例对本发明进行说明。用其它目的基因(如糖酶基因、角质酶基因、核酸酶基因、荧光蛋白基因等)替换TP中的T7 RNAp基因，并TAS质粒中的抗毒蛋白基因的表达调控和表达后的修饰方式进行相应的调整，使得抗毒蛋白的表达与TP上新目的基因的生物活性偶联在一起，就可以使用本系统对新的目的基因进行定向进化。此外，对随机突变模块MP中的诱变蛋白编码基因进行替换和改造也包括在本发明的说明范畴内。

对比例1

目的基因表达模块TP上不含有目的基因T7 RNAP时，重组菌添加诱导剂经过连续传代培养后将菌液涂布在含有L-ara的平板上，37℃过夜培养后没有菌落长出。

对比例2

随机自发突变模块MP上不含有诱导基因AID-T7 RNAP(T3)时，重组菌添加诱导剂经过连续传代培养后将菌液涂布在含有L-ara的平板上，37℃过夜培养后没有菌落长出。

对比例3

目的基因表达模块TP上不含有被辅助基因识别或结合的序列时，重组菌添加诱导剂经过连续传代培养后将菌液涂布在含有L-ara的平板上，37℃过夜培养后没有菌落长出。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种体内连续定向进化系统及其应用

<130> BAA210192A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3273

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatagcc tgctgatgaa tcgtcgcaaa tttctgtatc agtttaaaaa tgtgcgttgg 60

gccaaaggtc gtcgtgaaac ctatctgtgc tatgttgtga aacgtcgtga tagcgcaacc 120

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ctcaccgcgt ggaaacgtgc tgccgctgct gtgtaccgca aggacagggc tcgcaagtct 1800

cgccgtatca gccttgagtt catgcttgag caagccaata agtttgctaa ccataaggcc 1860

atctggttcc cttacaacat ggactggcgc ggtcgtgttt acgccgtgtc aatgttcaac 1920

ccgcaaggta acgatatgac caaaggactg cttacgctgg cgaaaggtaa accaatcggt 1980

aaggaaggtt actactggct gaaaatccac ggtgcaaact gtgcgggtgt cgataaggtt 2040

ccgttccctg agcgcatcaa gttcattgag gaaaaccacg agaacatcat ggcttgcgct 2100

aagtctccac tggagaacac ttggtgggct gagcaagatt ctccgttctg cttccttgcg 2160

ttctgctttg agtacgctgg ggtacagcac cacggcctga gctataactg ctcccttccg 2220

ctggcgtttg acgggtcttg ctctggcatc cagcacttct ccgcgatgct ccgagatgag 2280

gtaggtggtc gcgcggttaa cttgcttcct agtgagaccg ttcaggacat ctacgggatt 2340

gttgctaaga aagtcaacga gattctacaa gcagacgcaa tcaatgggac cgataacgaa 2400

gtagttaccg tgaccgatga gaacactggt gaaatctctg agaaagtcaa gctgggcact 2460

aaggcactgg ctggtcaatg gctggctcac ggtgttactc gcagtgtgac taagcgttca 2520

gtcatgacgc tggcttacgg gtccaaagag ttcggcttcc gtcaacaagt gctggaagat 2580

accattcagc cagctattga ttccggcaag ggtccgatgt tcactcagcc gaatcaggct 2640

gctggataca tggctaagct gatttgggaa tctgtgagcg tgacggtggt agctgcggtt 2700

gaagcaatga actggcttaa gtctgctgct aagctgctgg ctgctgaggt caaagataag 2760

aagactggag agattcttcg caagcgttgc gctgtgcatt gggtaactcc tgatggtttc 2820

cctgtgtggc aggaatacaa gaagcctatt cagaagcgct tggacatgat tttcctcggt 2880

cagttccgct tacagcctac cattaacacc aacaaagata gcgagattga tgcacgcaaa 2940

caggtgtctg gtatcgctcc taactttgta cacagccaag acggtagcca ccttcgtaag 3000

actgtagtgt gggcacacga gaagtacgga atcgaatctt ttgcactgat tcacgactcc 3060

ttcggtacca ttccggctga cgctgcgaac ctgttcaaag cagtgcgcga aactatggtt 3120

gacacatatg agtcttgtga tgtactggct gatttctacg accagttcgc tgaccagttg 3180

cacgagtctc aattggacaa aatgccagca cttccggcta aaggtaactt gaacctccgt 3240

gacatcttag agtcggactt cgcgttcgcg taa 3273

<210> 2

<211> 1090

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys

1 5 10 15

Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val

20 25 30

Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr

35 40 45

Leu Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr

50 55 60

Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp

65 70 75 80

Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp

85 90 95

Phe Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg

100 105 110

Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg

115 120 125

Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn His Glu Arg Thr Phe Lys

145 150 155 160

Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln Leu

165 170 175

Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala

180 185 190

Phe Arg Thr Leu Gly Leu Thr Gly Gln Glu Val Ala Cys Thr Ala Gly

195 200 205

Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu Ala

210 215 220

Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu Ala

225 230 235 240

Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu Ala

245 250 255

Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala

260 265 270

Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys Met

275 280 285

Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg Gly

290 295 300

Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu Ala

305 310 315 320

Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser Ala

325 330 335

Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala Ile

340 345 350

Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys His

355 360 365

Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His Val

370 375 380

Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser Lys

385 390 395 400

Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp Ser

405 410 415

Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr Gly

420 425 430

Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp Ser

435 440 445

Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr Arg

450 455 460

Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val Val

465 470 475 480

Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala Asn

485 490 495

Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala Leu

500 505 510

Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile Asn

515 520 525

Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val

530 535 540

Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro

545 550 555 560

Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp Met

565 570 575

Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val Tyr

580 585 590

Arg Lys Asp Arg Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe Met

595 600 605

Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe Pro

610 615 620

Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe Asn

625 630 635 640

Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys Gly

645 650 655

Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly Ala

660 665 670

Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys Phe

675 680 685

Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro Leu

690 695 700

Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu Ala

705 710 715 720

Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr Asn

725 730 735

Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His

740 745 750

Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn Leu

755 760 765

Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys Lys

770 775 780

Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn Glu

785 790 795 800

Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys Val

805 810 815

Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala His Gly Val

820 825 830

Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly Ser

835 840 845

Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln Pro

850 855 860

Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Pro Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln Ala

865 870 875 880

Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr Val

885 890 895

Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys Leu

900 905 910

Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg Lys

915 920 925

Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp Gln

930 935 940

Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Lys Arg Leu Asp Met Ile Phe Leu Gly

945 950 955 960

Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu Ile

965 970 975

Asp Ala Arg Lys Gln Val Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His Ser

980 985 990

Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu Lys

995 1000 1005

Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr

1010 1015 1020

Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr

1025 1030 1035

Met Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr

1040 1045 1050

Asp Gln Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met

1055 1060 1065

Pro Ala Leu Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu

1070 1075 1080

Glu Ser Asp Phe Ala Phe Ala

1085 1090

<210> 3

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asn Ser Ala Phe Val Leu Val Leu Thr Val Phe Leu Val Ser Gly

1 5 10 15

Glu Pro Val Asp Ile Ala Val Ser Val His Arg Thr Met Gln Glu Cys

20 25 30

Met Thr Ala Ala Thr Glu Gln Lys Ile Pro Gly Asn Cys Tyr Pro Val

35 40 45

Asp Lys Val Ile His Gln Asp Asn Ile Glu Ile Pro Ala Gly Leu

50 55 60

<210> 4

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Tyr Thr Ser Gly Tyr Ala His Arg Ser Ser Ser Phe Ser Ser

1 5 10 15

Ala Ala Ser Lys Ile Ala Arg Val Ser Thr Glu Asn Thr Thr Ala Gly

20 25 30

Leu Ile Ser Glu Val Val Tyr Arg Glu Asp Gln Pro Met Met Thr Gln

35 40 45

Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gln Ser Arg Trp

50 55 60

Gln Leu Trp Leu Thr Pro Gln Gln Lys Leu Ser Arg Glu Trp Val Gln

65 70 75 80

Ala Ser Gly Leu Pro Leu Thr Lys Val Met Gln Ile Ser Gln Leu Ser

85 90 95

Pro Cys His Thr Val Glu Ser Met Val Arg Ala Leu Arg Thr Gly Asn

100 105 110

Tyr Ser Val Val Ile Gly Trp Leu Ala Asp Asp Leu Thr Glu Glu Glu

115 120 125

His Ala Glu Leu Val Asp Ala Ala Asn Glu Gly Asn Ala Met Gly Phe

130 135 140

Ile Met Arg Pro Val Ser Ala Ser Ser His Ala Thr Arg Gln Leu Ser

145 150 155 160

Gly Leu Lys Ile His Ser Asn Leu Tyr His

165 170

Claims

1.一种连续定向进化系统，其特征在于，包含随机突变模块MP、程序化死亡模块TAS以及目的基因表达模块TP；所述随机突变模块MP上含有诱变基因和辅助基因；目的基因表达模块TP上含有目的基因和被所述辅助基因识别或结合的元件；所述程序化死亡模块TAS上含有编码毒蛋白的基因和相对应的编码抗毒蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述随机突变模块MP上的诱变基因包括但不限于低保真性的DNA聚合酶I突变体的编码基因PolA、胞嘧啶脱氨酶的编码基因AID、胞嘧啶脱氨酶的编码基因APOBEC、腺嘌呤脱氨酶的编码基因TadA中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述随机突变模块MP上的辅助基因包括但不限于T7 RNA聚合酶的编码基因、缺少切割非互补链活性的nCas9的编码基因、仅具有DNA结合能力的dCas9的编码基因等基因中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述目的基因表达模块TP上的目的基因为一种或多种蛋白的编码基因和/或非编码基因。

5.根据权利要求1或4所述的系统，其特征在于，所述目的基因包括但不限于T7 RNA聚合酶的编码基因、抗生素的抗性基因、分解代谢途径中的酶的编码基因、合成代谢途径中的酶的编码基因、DNA结合蛋白的编码基因、核酸酶的编码基因、糖酶的编码基因、蛋白酶的编码基因。

6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述程序化死亡模块TAS上毒蛋白的编码基因由pBAD操纵系统启动；抗毒蛋白的编码基因由目的基因定向进化后识别并启动表达。

7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述程序化死亡模块TAS中毒蛋白的编码基因包括但不限于可引起细胞破裂的YdfD；阻遏细胞膜生成的PezT、SezT、zeta toxin；对DNA的复制有抑制作用的FicT、CcdB；对翻译有抑制作用的TacT；抗毒蛋白的编码基因选自与毒蛋白对应的DicB/SulA、PezA、SezA、epsilon antitoxin、FicA、CcdA、TacA基因。

8.根据权利要求1所述系统，其特征在于，所述随机突变模块MP、目的基因表达模块TP和程序化死亡模块的表达载体包括但不限于pET系列，或pSB1C3，或pRSFDuet，或pCDFDuet质粒。

9.含有权利要求1～8任一所述定向进化系统的微生物细胞；所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌。

10.权利要求1～8任一所述连续定向化系统或权利要求9所述方法在蛋白质改造中的应用。