RU2749307C1 - Новая компактная нуклеаза CAS9 II типа из Anoxybacillus flavithermus - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и геномного редактирования. Описан фермент термостабильная нуклеаза AflCas9 из Anoxybacillus flavithermus и применение данного фермента. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данную нуклеазу, генетической конструкции, экспрессионному вектору, которые включают данную нуклеиновую кислоту. Изобретение расширяет арсенал нуклеаз для геномного редактирования. В связи с широким температурным диапазоном AflCas9 ожидается, что фермент AflCas9 подойдет для редактирования геномов широкого круга организмов, которые могут расти при температурах от 20 до 60°С. Расширенный диапазон активности и стабильности АflСа89 позволит применять его в методах молекулярной биологии, которые требуют манипуляций с ДНК при температуре 20-60°С, а также использовать в сложных условиях, требующих высокой ферментативной активности и повышенной стабильности фермента. 5 н.п. ф-лы, 5 пр., 2 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области систем CRISPR-Cas для геномного редактирования. Настоящее изобретение раскрывает новую нуклеазу Cas9 из штамма Anoxybacillus flavithermus, а также ее получение и применение. Изобретение расширяет арсенал нуклеаз для геномного редактирования, позволяя проводить редактирование при температуре 20-60°С, а также использовать в сложных условиях, требующих высокой ферментативной активности и повышенной стабильности фермента. Работа выполнена в соответствии с Соглашением от 31 октября 2019 г. №075-15-2019-1667 с Министерством Науки и Высшего Образования Российской Федерации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сайт-специфичные нуклеазы представляют собой эффективные реагенты для специфического и эффективного редактирования и модификации последовательностей ДНК в сложных геномах. Существует множество применений геномной инженерии с помощью сайт-специфичных нуклеаз, от фундаментальных исследований до биоиндустриальных применений и терапии человека. Для этой цели реинжиниринг ДНК-связывающего белка может быть выполнен с использованием природных эндонуклеаз LADLIDADG (LHE), искусственных белков цинковых пальцев (ZFP) и эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALE-нуклеазы). В основном это ограничивалось дизайном и производством белка.

Система, связанная с CRISPR (Cas), была впервые обнаружена у бактерий и действует как защита от чужеродной ДНК, будь то вирусы или плазмиды. На сегодняшний день наиболее хорошо изучены и идентифицированы три разные бактериальные системы CRISPR, которые называются Типом I, Типом II и Типом III. Система типа II является наиболее перспективной для технологии геномной инженерии и часто называется просто CRISPR. Локус CRISPR / Cas типа II представляет собой оперон гена, кодирующего белок Cas9, Cas1, Cas2 и/или Csn2, лидерную последовательность и множество идентичных повторов позади нее, а также уникальный геном, вставленный между повторами матрицы CRISPR, состоящей из протоспейсера и последовательности, кодирующей трансактивирующую tracrRNA.

Cas9 - это большая эндонуклеаза, которая может распознавать любую потенциальную мишень из 12-20 нуклеотидов и конкретный мотив РАМ длиной 3-8 нуклеотидов. Потенциальной мишени достаточно для обеспечения уникального сайта расщепления в прокариотическом геноме на статистической основе, но такая последовательность-мишень может быть найдена много раз, например, в эукариотических клетках. Это опасно для больших геномов. Следовательно, существует необходимость в разработке стратегий для повышения специфичности и снижения потенциальной удаленности при использовании системы CRISPR типа II. Кроме того, наиболее изученный белок Cas9 из S. pyogenes имеет большой размер (1368 аминокислот), что проблемно для эффективной экспрессии в бактериальных клетках и для доставки генов систем CRISPR методами геномной инженерии.

Сущность настоящего изобретения состоит в получении более компактного и стабильного рекомбинантного Cas9.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если здесь не указано иное, все используемые технические и научные термины обычно понимаются специалистами в области генной инженерии, биохимии, генетики, молекулярной биологии и имеют то же значение, что и общепринятое.

Все методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, с соответствующими методами и материалами, описанными в данном документе, можно использовать на практике или при тестировании настоящего изобретения. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречия преимущественную силу имеет настоящее описание, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения, если не указано иное.

В практике настоящего изобретения, если не указано иное, культура клеток, молекулярная биология, трансгенная биология, микробиологияи рекомбинантная ДНК находятся в компетенции специалистов в данной области. Будут использоваться обычные методы. Такие методы полностью объяснены в литературе. Например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc., Библиотека Конгресса США); Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, третье издание (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Олигонуклеотидный синтез (изд. MJ Gait, 1984); Б. Пербал, Практическое руководство по молекулярному клонированию (1984)); «Методы в энзимологии» (Дж. Абельсон и М. Саймон, главные редакторы, Academic Press, Inc., Нью-Йорк).

НОВЫЙ ВАРИАНТ CAS9

Сгруппированные короткие палиндромные повторы (CRISPR) и CRISPR-ассоциированные (Cas) белки обеспечивают адаптивный и наследуемый иммунитет у прокариот против инвазивных генетических элементов - вирусов и плазмид [1-4]. Системы CRISPR-Cas подразделяются на два класса (1 и 2) и шесть типов (I-VI), в зависимости от их сложности и входящих в них белков [5]. Системы класса 2, включая CRISPR-Cas9 типа II и CRISPR-Cas12a типа V (ранее называвшиеся CRISPR-Cpf1), недавно использовались в качестве инструментов для геномной инженерии как дляэукариот [6-9], так и для прокариот [11-13]. Эти системы являются одними из самых простых систем CRISPR-Cas, известных тем, что они вводят целевые двухцепочечные разрывы ДНК на основе комплекса рибонуклеопротеина (RNP), образованного одной эндонуклеазой Cas и направляющей РНК.

Комплекс Cas9 состоит из дуплекса crRNA (CRISPR RNA): tracrRNA (trans-activating-CRISPR-RNA). В инженерных целях дуплекс crRNA: tracrRNA был упрощен путем создания химерной одиночной направляющей РНК (sgRNA), чтобы нацеливать Cas9 при совместной экспрессии [14]. Кроме того, для расщепления ДНК-мишени требуется соседний мотив протоспейсера (РАМ): последовательность длиной 3-8 нуклеотидов (nt), расположенная рядом с протоспейсером-мишенью, которая сильно варьируется между различными белками Cas9 [15-17]. Эндонуклеазы Cas9 содержат два каталитических домена, обозначенных как RuvC и HNH. Замена каталитических остатков в одном из этих доменов приводит к вариантам никазы Cas9, а в обоих доменах - к неактивному варианту [18-20]. Неактивный Cas9 (dCas9) используется в качестве эффективной системы сайленсинга генов и для модуляции их экспрессии [21-22]. Применение кластерных равномерно распределенных коротких палиндромных повторов (CRISPR) и CRISPR-ассоциированных (Cas) белков произвело революцию в молекулярной биологии, сделав редактирование генома доступным как у прокариот, так и у эукариот [23-24].

Представляя наследственную иадаптивную иммунную систему прокариот, системы CRISPR-Cas9 присутствуют у архейи бактерий из разных сред обитания [25]. Существует большое разнообразие систем CRISPR-Cas9, в частности, систем типа II, которые были хорошо охарактеризованы и широко внедрены, отчасти потому, что эти системы основаны на одном эффекторном белке, Cas9, и дуплексе РНК, который может быть заменен одной направляющей РНК (sgRNA). Системы CRISPR-Cas9, особенно системы Streptococcus pyogenes, были использованы для редактирования геномов у разных организмов, создания новых инструментов для приложений секвенирования и многого другого [26].

Использование CRJSPR-Cas9 революционно изменило способность редактировать и модулировать геномы широкого спектра организмов. Эта технология, полученная из адаптивных иммунных систем, обнаруженных в тысячах видов бактерий, основана на распознавании с помощью РНК гомологичного участка и расщеплении инвазивной вирусной и плазмидной ДНК. Белки Cas9 сильно различаются по размеру и активности расщепления [25-27]. Несмотря на обилие и разнообразие этих систем, в подавляющем большинстве разработанных приложений использовался первый открытый гомолог Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes (SpyCas9) [28-32]. Хотя эти белки вместе обеспечивают надежный набор инструментов, все они происходят от мезофильных хозяев, что делает их непригодными для применений, требующих расщепления при более высоких температурах или повышенной стабильности белка. Недавно было сообщено о двух белках Cas9 из термофилов, которые обеспечивают повышенную стабильность в условиях in vivo и позволяют редактировать геномы у термофильных организмов [27-33]. Эти 2 белка, GeoCas9 и ThermoCas9, были идентифицированы путем секвенирования образцов окружающей среды, и их хозяева живут при температурах 65 и 70°С соответственно. Характеристика таких систем CRISPR-Cas была бы интересна, чтобы получить фундаментальную информацию, а также разработать новые приложения для редактирования геномов.

CRISPR-Cas9 разрабатывается в качестве потенциального технологического подхода для редактирования геномов различных организмов [34-35]. Одна из основных проблем этого подхода заключается в том, что Cas9 должен быть достаточно стабильным, чтобы пережить деградацию протеазами и РНКазами в ткани-мишени для эффективной доставки. Ограниченная продолжительность жизни белка потребует доставки более высоких доз Cas9 в клетки или приводит к плохой эффективности редактирования. Напротив, использование Cas9 с улучшенной стабильностью может значительно повысить эффективность редактирования генома in vivo.

Чтобы решить эти проблемы, нами был проклонирован термостабильный белок Cas9 из Anoxybacillus flavithermus (AflCas9). По нашим расчетам AflCas9 должен поддерживать активность в широком диапазоне температур. Функциональный температурный диапазон AflCas9 должен дополнятьарсенал ранее разработанных систем Cas9, значительно расширяя возможности эксперимента, в котором Cas9 можно использовать как для расщепления in vitro, так и для редактирования геномав диапазоне температур от 20-50°С.

Хотя тысячи гомологов Cas9 были секвенированы, не было функционально подтвержденного Cas9 из архебактерий [36], ограничивающего наш поиск термофильного Cas9 термофильными бактериями. Нами был проведен поиск всех изолятов в базе данных Integral Microbial Genomes (IMG) выделенных из термофильной среды, содержащей Cas9-подобный белок [37]. Из них выделялся Cas9 из Anoxybacillus flavithermus потому что длина его белковой последовательность короче, чем у среднего Cas9. Наиболее важно, что этот фермент из организма, который может расти в диапазоне температур от 25 до 65°С (оптимально при 45-50°С). Имеется несколько почти идентичных гомологов AflCas9 (от 93,19 до 99,91% идентичных а.к. по всей длине) у трех других видов Anoxybacillus, которые являются проверенным источником ферментов для метаболической инженерии [38]. Более того, широкий температурный диапазон для существования этого микроорганизма, позволяет надеяться, что Cas9 из этого вида (AflCas9) может поддерживать активность как при мезофильной, так и при термофильной температуре. Примечательно, что AflCas9 значительно меньше, чем SpyCas9 (AflCas9, 1081 аминокислот; SpyCas9, 1368 аминокислот). Модель гомологии AflCas9, основанная на доступных кристаллических структурах Cas9, наряду с выравниванием последовательностей, показала, что небольшой размер AflCas9 в значительной степени является результатом уменьшения доли REC домена, как в случае с другими компактными гомологами Cas9 из Staphylococcusaureus (SauCas9) и Actinomyces naeslundii (AnaCas9). Таким образом, настоящая заявка раскрывает следующие изобретения:

Нуклеаза AflCas9, кодируемая последовательностью SEQ ID NO 2, для редактирования генома в диапазоне температур от 20-50°С;

Экспрессионный вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO 2, кодирующий нуклеазу AflCas9 по п. 1;

Клетка-хозяин для получения нуклеазы AflCas9 по п. 1, содержащая последовательность SEQ ID NO 2;

Способ получения нуклеазы AflCas9 по п. 1, заключающийся в культивировании клеток штамма-продуцента по п. 3 в культуральной среде с последующим выделением и очисткой нуклеазы AflCas9;

Применение нуклеазы по п. 1 для редактирования генома в диапазоне температур от 20-50°С.

ПРИМЕРЫ

1. Получение генно-инженерных конструкций

1.1 Получение плазмидных конструкций, кодирующих последовательность гена белка Cas9 из термофильного микроорганизма Anoxybacillus flavithermus.

1.1.1 Планирование последовательности гена белка Cas9 из бактерий Anoxybacillus flavithermus

Для работы была выбрана Cas9 из Anoxybacillus flavithermus..В качестве исходной последовательности была взята следующая последовательность из NCBI. Нуклеаза из Anoxybacillus flavithermus (AflCas9):type II CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9 [Anoxybacillus flavithermus] GenBank: PIC04413.1 (SEQ ID NO 1).

Создание оптимальной по кодонам нуклеотидной последовательности на основе аминокислотной последовательности проводили с помощью сайта http://www.jcat.de/, для этого использовали штамм Escherichia coli К12. Построение вторичной структуры мРНК проводили с помощью сайта http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-folding.

Ген белка AflCas9 был синтезирован из отдельных фрагментов и проклонирован в векторе pR1517. Вектор pR1517 сконструирован на основе вектора pQE с заменой промоторной области фага Т5 на промотор фага Т7. Клонирование проводились в штамме Е. coli M15[pRep4]. Затем была проведена сборка фрагментов в целый ген. Трансляция гена белка AflCas9 из плазмиды pR1583 представлена в SEQ ID NO 2.

Для проведения экспрессии плазмида pR1583, кодирующая белок AflCas9, была трансформирована в штамм Е. coli BL21(DE3) [pREP4]. Молекулярный вес белка AflCas9 - 127,471 кДа.

2. Изучение стабильности плазмиды в бактериальных штаммах

Клетки Е. ColiBL21(DE3) [pREP4, pR1583], трансформированные плазмидой pR1583 были стабильны в работе. На чашках с твердой агаризованной средой LB (при хранении на +4°С) культуры штаммов-продуцентов в течение 3 месяцев после трансформации сохраняли способность индуцировать целевой рекомбинатный белок, при этом его процентное соотношение с общими белками клетки не уменьшалось. Также в течение этого времени при многократных пересевах первоначальной культуры рекомбинантная плазмида полностью сохраняла свою стабильность.

3. Культивирование клеток продуцентов в колбах

Выращивание посевной (ночной) культуры.

Культуру E.coli BL21(DE3) [pREP4, pR1583] выращивают на жидкой среде LB следующего состава: Триптон - 1%

Дрожжевой экстракт - 0,5% Хлористый натрий - 1% рН среды - 7,0-7,4

Взвешивают все указанные компоненты, растворяют в дистиллированной воде, объем среды доводят до нужного объема. рН корректируют 40% едким натром. Далее полученную среду разливают в колбы объемом 0,5 л по 200 мл и стерилизуют в автоклаве при 121°С 15 мин.

Одновременно готовят раствор требуемых антибиотиков. После того, как среда в колбах остынет, в каждую колбу вносят требуемое количество антибиотика и 0,1% культуры из рабочего банка.

Культуру выращивают на круговой качалке при 37°С и 80 об./мин. в течение 10-16 часов. Суспензия клеток служит для засева колб с целью получения нужного количества биомассы.

С целью получения биомассы культуру выращивают на жидкой среде LB. Приготовление среды аналогично ее приготовлению для посевной культуры. Культивирование проводят в колбах объемом 500 мл (объем среды в колбе 200 мл) на ротационной качалке Multitron Standart при 180 об/мин на среде LB с антибиотиками: канамицином (20 мг/л) и ампициллином (150 мг/л).

Культуру выращивали при 37°С до достижения оптической плотности 0,8-1,0 (при длине волны 600 нм), после чего добавляли 0,25 мМ/л изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и продолжали культивирование в тех же условиях еще 3-4 часа, после чего суспензию клеток центрифугировали и осадок замораживали. Выход биомассы составил 3,0-3,6 г/л. В дальнейшем биомассу использовали для выделения белков.

Экспрессия белка составляет около 3% от тотального белка клетки (см. фиг. 1). 4. Очистка AflCas9

Белки были экспрессированы в штамме Е. coli BL21(DE3)[pREP4, pR1583]. Культуры выращивали до OD600 нм 0,5-0,6. Экспрессию индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ, и инкубацию продолжали при 16°С в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием, и осадок клеток ресуспендировали в 20 мл буфера для лизиса (50 мМ фосфат натрия, рН 8, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 10 мМ имидазол) с лизоцимом. После гомогенизации клетки лизировали ультразвуком (Sonoplus, Bandelin) с использованием ультразвукового зонда с микрочипом MS72 (Bandelin) в течение 5-8 минут, состоящих из импульса 2 с и паузы 2,5 с при 30% амплитуде, а затем центрифугировали при 16000 × g в течение 1 ч при 4°С для удаления нерастворимого материала. Осветленный лизат фильтровали через фильтры 0,22 микрона (мембранные технологии Mdi) и наносили на колонку с гепарином FF (Amersham), предварительно уравновешенную в буфере IEX-A (150 мМ KCl, 20 мМ HEPES / КОН, рН 8). Колонку промывали IEX-A, а затем элюировали градиентом IEX-C (2 М KCl, 20 мМ HEPES / КОН, рН 8). Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE; фракции, содержащие AflCas9, были объединены и сконцентрированы до 200 мкл (50 мМ фосфата натрия рН 8, 2 мМ DTT, 50% глицерин, 500 мМ NaCl) и либо использованы непосредственно для биохимических анализов, либо заморожены при -80°С для хранения.

5. Анализ гидролиза ДНК-субстрата in vitro рекомбинантным AflCas9

Гидролиз модельного ДНК-субстрата проводили с очищенным рекомбинантным AflCas9. Белок AflCas9, sgRNA и ДНК-субстрат инкубировали отдельно при указанной температуре в течение 10 минут с последующим объединением компонентов и их инкубацией при различных температурах анализа в буфере для расщепления (100 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7), 500 мМ NaCl, 25 мМ MgCl2, 25 (об.%) глицерин, 5 мМ дитиотреитол (DTT)) в течение 1 часа. Каждая реакция гидролиза содержала 160 нМ белка AflCas9, 4 нМ субстратной ДНК и 150 нМ sgRNA. Реакции останавливали добавлением красителя и проводили электрофорез на 1,5% агарозном геле. Гель окрашивали ДНК красителем SYBR (Life Technologies) и визуализировали с помощью системы визуализации гелей Gel DocTM EZ (Bio-rad).

Для определения оптимальной температуры эндонуклеазную активность комплекса AflCas9: sgRNA RNP анализировали после инкубации при 10, 15, 20, 25, 30, 35, и 40°С в течение 10 мин. Добавляли предварительно нагретый ДНК-субстрат и реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при соответствующей температуре. Определенный оптимальный температурный интервал для работы белка AflCas9 составляет 20-50°С, что позволяет использовать фермент для редактирования геномов как мезофильных, так и термофильных организмов.

Описание фигур

Фиг.1

Экспрессия белка AflCas9.

(1) маркер BioRad 14,4-21,5-31-45-66,6-97,4 кДа; (2) Е.coliBL21 [pREP4, pR1583] до индукции;(3) Е.coliBL21 [pREP4, pR1583] после индукции, молекулярный вес белка AflCas9 - 127,471 кДа.

Фиг. 2

Анализ расщепления ДНК-субстрата in vitro рекомбинантным AflCas9.

(1) маркер BioRad950-800-600-100 н.п.; (2)расщепление. ДНК-субстрата in vitro рекомбинантным AflCas9 при 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45 и 50°С.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Brouns SJJ, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. // Science - 2008 - V.321 - P. 960-964.

2. Barrangou R, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. // Science - 2007 - V.315 - P. 1709-1712.

3. Wright A, Nunez J, Doudna J. Biology and applications of CRISPR systems: Harnessing nature's toolbox for genome engineering. // Cell-2016- V.164 - P. 29-44.

4. Mohanraju P, et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. // Science-2016- V.353 - P. 5147.

5. Makarova KS, et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. // Nat. Rev. Microbiol-2015- V.13 - P. 722-736.

6. Komor AC, et al. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. // Cell-2017- V.168 - P. 20-36.

7. Puchta H. Applying CRISPR/Cas for genome engineering in plants: the best is yet to come. // Curr. Opin. Plant Biol.- 2017- V.36 - P. 1-8.

8. Xu J, et al. A toolkit of CRISPR-based genome editing systems in Drosophila. // J. Genet. Genom- 2015 - V. 42 - P. 141-149.

9. Tang X, et al. A CRISPR-Cpfl system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. // Nat. Plants- 2017- V.3:17018.

10. Zetsche B, et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. // Nat. Biotechnol - 2016- V.35 - P. 31-34.

11. Mougiakos I, Bosma EF, de Vos WM, van Kranenburg R, van der Oost J. Next generation prokaryotic engineering: The CRISPR-Cas toolkit. // Trends Biotechnol.- 2016- V.34 - P. 575-587.

12. Yan M-Y, et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. // Appl. Environ. Microbiol - 2017- V.83 - P. 947-17.

13. Jiang Y, et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. // Nat. Commun- 2017- V.8 - P. 15179.

14. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. // Science- 2012- V.337 - P. 816-821.

15. Mojica FJM. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. // Microbiology- 2009- V.155 - P. 733-740.

16. Deveau H, et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. // J. Bacteriol.- 2008- V.190 - P. 1390-1400.

17. Karvelis T, et al. Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. // Genome Biol.- 2015- V. 16 - P. 253.

18. Bikard D, et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. // Nucleic Acids Res.- 2013- V.41 - P. 7429-7437.

19. Qi LS, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. // Cell- 2013- V.152 - P. 1173-1183.

20. Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. // Proc. Natl Acad. Sci. USA-. 2012- V.109 - P. 2579-2586.

21. Lv L, Ren Y-L, Chen J-C, Wu Q, Chen G-Q. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis. // Metab. Eng.- 2015- V.29 - P. 160-168.

22. Choudhary E, Thakur P, Pareek M, Agarwal N, Rajagopalan M. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. // Nat. Commun.- 2015- V.6 - P. 6267.

23. Jinek M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. // Science- 2012- V. 337 - P. 816-821.

24. Cong L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. // Science-2013-V. 339, 819-823.

25. Koonin E.V., Makarova K.S., Zhang F., Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. // Curr. Opin. Microbiol.- 2017- V. 37 - P. 67-78.

26. Wang H., La Russa M., Qi L. S., CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. // Annu. Rev. Biochem.- 2016- V. 85 - P. 227-264.

27. Harrington L.В., et al. A thermostable Cas9 with increased lifetime in human plasma. // Nat. Commun.- 2017- V. 8 - P. 1424.

28. Mougiakos I., et al. Characterizing a thermostable Cas9 for bacterial genome editing and silencing. // Nat. Commun.- 2017- V.8 - P. 1647.

29. Yu F.В., et al. Microfluidic-based mini-metagenomics enables discovery of novel microbial lineages from complex environmental samples. // eLife- 2017- V. 6 - P. 26580.

30. Mir A., Edraki A., Lee J., Sontheimer E. J., Type II-C CRISPR-Cas9 biology, mechanism, and application. // ACS Chem. Biol.- 2018- V. 13 - P. 357-365.

31. Burstein D., et al. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. // Nature -2017-V. 542-P. 237-241.

32. Ran F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. // Nature-2015-V. 520-P. 186-191.

33. Mougiakos I., et al. Characterizing a thermostable Cas9 for bacterial genome editing and silencing. // Nat. Commun.-2017-V. 8, 1647-1656.

34. Porteus M. Genome editing: a new approach to human therapeutics. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.- 2016- V.56 - P. 163-190.

35. Staahl, В. T. et al. Efficient genome editing in the mouse brain by local delivery of engineered Cas9 ribonucleoprotein complexes. // Nat. Biotechnol.- 2017- V. 35 - P. 431-434.

36. Burstein D, Harrington LB, Strutt SC, Probst AJ. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. // Nat. Publ. Gr.- 2017- V.542 - P. 237-241.

37. Markowitz VM, et al. IMG: the integrated microbial genomes database and comparative analysis system. // Nucleic Acids Res.- 2012- V.40 - P. 115-122.

38. Ingram, L.O. et al. Metabolic engineering for production of biorenewable fuels and chemicals: contributions of synthetic biology. // J. Biomed. Biotechnol.-2010- V. 76 - P. 1042-1053.

39. K.H. Сорокина, A.C. Розанов, A.B. Брянская, СЕ. Пельтек // Вавиловский журнал генетики и селекции- 2013, - Том 17-№4/1. - 651-658.

40. Weinberger AD, Wolf YI, Lobkovsky AE, Gilmore MS, Koonin EV. // Viral diversity threshold for adaptive immunity in prokaryotes. MBio.- 2012- V.3 - P. 1-9.

Claims (5)

1. Нуклеаза AflCas9, кодируемая последовательностью SEQ ID NO 2, для редактирования генома в диапазоне температур от 20-50°С.

2. Экспрессионный вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO 2, кодирующий нуклеазу AflCas9 по п. 1.

3. Клетка-хозяин для получения нуклеазы AflCas9 по п. 1, содержащая последовательность SEQ ID NO 2.

4. Способ получения нуклеазы AflCas9 по п. 1, заключающийся в культивировании клеток штамма-продуцента по п. 3 в культуральной среде с последующим выделением и очисткой нуклеазы AflCas9.

5. Применение нуклеазы по п. 1 для редактирования генома в диапазоне температур от 20-50°С.

Images