JP2022509826A - デフルビーモナス属（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓ）種由来のＣａｓ９タンパク質に基づくＤＮＡカット手段 - Google Patents
デフルビーモナス属（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓ）種由来のＣａｓ９タンパク質に基づくＤＮＡカット手段 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、細菌デフルビーモナス属（Ｄｅｆｌｕｖｉｉｍｏｎａｓ）種２０Ｖ１７由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の新規細菌ヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡ分子において厳密に特異的な二本鎖切断を形成するためのその使用を記載する。このヌクレアーゼは独自の特性を有し、そして単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中の厳密に定義された部位に、修飾を導入するためのツールとして使用可能である。したがって、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性が増加し、これにより、より多数の特定の部位および特定の条件で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするため、多様な生物由来のＣａｓ９ヌクレアーゼの使用が可能になるであろう。
Description
本発明は、バイオテクノロジーに、特に、ＤＮＡをカットし、そして多様な生物のゲノムを編集するために用いられる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の新規Ｃａｓヌクレアーゼ酵素に関する。この技術を、遺伝性ヒト疾患の遺伝子治療のため、ならびに他の生物のゲノムを編集するために、将来、用いてもよい。
ＤＮＡ配列の修飾は、今日のバイオテクノロジー分野における時事問題の１つである。真核および原核生物のゲノムの編集および修飾、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの操作は、ＤＮＡ配列における二本鎖切断のターゲティングされた導入を必要とする。
この問題を解決するため、現在、以下の技術：ジンクフィンガー型のドメインを含有する人工的ヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、および細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が用いられる。最初の２つの技術は、特定のＤＮＡ配列の認識のため、ヌクレアーゼアミノ酸配列を最適化する労力を要する。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合は、ＤＮＡターゲットを認識する構造はタンパク質ではなく、小分子ガイドＲＮＡである。特定のＤＮＡターゲットのカットには、ヌクレアーゼまたはその遺伝子を新規に合成する必要はなく、ターゲット配列に相補的なガイドＲＮＡを用いることによって行われる。このため、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、多様なＤＮＡ配列をカットするための好適でそして効率的な手段となっている。該技術は、異なる配列のガイドＲＮＡを用いて、いくつかの領域でＤＮＡを同時にカットすることを可能にする。こうしたアプローチはまた、真核生物において、いくつかの遺伝子を同時に修飾するためにも用いられる。
その性質により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルス遺伝物質内に非常に特異的に切断を導入することが可能な、原核生物免疫系である（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２）。略語ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、「クラスター化され、規則的に間隔を空けられた、短いパリンドローム反復およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ）」を表す（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。すべてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲカセットおよび多様なＣａｓタンパク質をコードする遺伝子からなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットは、各々、ユニークなヌクレオチド配列を有するスペーサー、および反復パリンドロームリピートからなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５）。ＣＲＩＳＰＲカセットの転写、その後のそのプロセシングの結果、ガイドｃｒＲＮＡが形成され、該ガイドｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とともに、エフェクター複合体を形成する（Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４）。ｃｒＲＮＡおよびプロトスペーサーと呼ばれるターゲットＤＮＡ部位の間の相補的対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡターゲットを認識し、そしてその中に、非常に特異的に切断を導入する。
単一エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、系に含まれるＣａｓタンパク質に応じて、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ型）にグループ分けされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、単純な組成および活性機構が特徴であり、すなわちその機能には、１つのＣａｓ９タンパク質および以下のような２つの小分子ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるエフェクター複合体の形成しか必要としない。トレーサーＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲリピートから生じるｃｒＲＮＡ領域と相補的に対形成して、ガイドＲＮＡがＣａｓエフェクターに結合するために必要な二次構造を形成する。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ターゲットＤＮＡの相補鎖内に切断を導入する２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を持ち、したがって、二本鎖ＤＮＡ切断を形成する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼである（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２）。
これまでに、ＤＮＡ内に二本鎖切断をターゲティングし、そして特異的に導入することが可能な、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが知られる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用を制限する主な特性の１つは、ＤＮＡターゲットの３’端に隣接し、そしてその存在が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるＤＮＡの正確な認識のために必要である、ＰＡＭ配列である。多様なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は異なるＰＡＭ配列を有し、このため、任意のＤＮＡ領域でのヌクレアーゼの使用の潜在的可能性が制限される。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび生物ゲノムの両方で、任意のＤＮＡ領域を修飾することを可能にするには、新規の多様なＰＡＭ配列を持つＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の使用が必要である。真核ゲノムの修飾はまた、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＡＡＶ仲介性送達を提供するため、小さいサイズのヌクレアーゼの使用も必要とする。
ＤＮＡをカットし、そしてゲノムＤＮＡ配列を修飾するための多くの技術が知られるが、多様な生物において、そしてＤＮＡ配列の厳密に特定の部位で、ＤＮＡを修飾するための新規の有効な手段に関する必要性がなおある。本発明は、この問題を解決するために必要ないくつかの特性を提供する。
Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５． Ｖｏｌ． ６０． Ｉｓｓｕｅ ２． ｐｐ．１７４－１８２
Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２． Ｖｏｌ． ４３． Ｉｓｓｕｅ ６． ｐｐ．１５６５－１５７５
Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ． Ｊ． Ｊ．ら Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８． Ｖｏｌ． ３２１． Ｉｓｓｕｅ ５８９１． ｐｐ．９６０－９６４
Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．ら ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ． ２０１１． Ｖｏｌ． ４７１． Ｉｓｓｕｅ ７３４０． ｐ．６０２
本発明の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いて、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための新規手段を提供することである。現在の系は、修飾しようとするＤＮＡ領域の３’端に存在しなければならない、特定のＰＡＭ配列のため、使用に制限がある。他のＰＡＭ配列を持つ新規Ｃａｓ９酵素の検索は、多様な生物のＤＮＡ分子における望ましい厳密な特定の部位に、二本鎖切断を形成するための利用可能な手段の範囲を拡張するであろう。この問題を解決するため、著者らはデフルビーモナス属種２０Ｖ１７に関して以前予期されていたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＤｆＣａｓ９を特徴づけ、該酵素を用いて、上記のおよび他の生物の両方のゲノム内に定向性修飾を導入することも可能である。本発明は、以下の本質的な特徴：（ａ）他の既知のＰＡＭ配列とは異なる短いＰＡＭ配列；（ｂ）１０７９アミノ酸残基（ａ．ａ．ｒ．）である、特徴づけられたＤｆＣａｓ９の比較的小さいサイズを有することで特徴づけられる。
前記問題は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして配列番号１と非保存性アミノ酸残基においてのみ異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質を用いて、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成することによって、解決される。本発明のいくつかの態様において、この使用は、３５℃～３７℃の温度で、そしてＭｎ２＋イオンの存在下で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる。本発明の好ましい態様において、この使用は、Ｍｎ２＋イオン濃度が５ｍＭより高いことで特徴づけられる。
前記問題は、配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’にすぐ隣接する、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中に二本鎖切断を生成するための方法であって、当該生物の少なくとも１つの細胞内に、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、並びにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であって、前記タンパク質とガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’との間の相互作用が、配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’にすぐ隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる、前記ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、を導入する工程を含む、前記方法を用いることによって、さらに解決される。本発明のいくつかの態様において、方法は、ガイドＲＮＡと同時に、外因性ＤＮＡ配列の導入をさらに含むことで特徴づけられる。
ターゲットＤＮＡ領域およびＤｆＣａｓ９タンパク質と複合体を形成可能であるｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の混合物を、ガイドＲＮＡとして用いてもよい。本発明の好ましい態様において、ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡに基づいて構築されたハイブリッドＲＮＡをガイドＲＮＡとして用いてもよい。ハイブリッドガイドＲＮＡを構築するための方法は、当業者に知られる（Ｈｓｕ ＰＤら， ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－３２）。ハイブリッドＲＮＡを構築するためのアプローチの１つを、以下の実施例に開示している。
本発明を、ターゲットＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏカットのため、そしていくつかの生物のゲノムを修飾するための両方に用いてもよい。直接方式で、すなわち対応する部位でゲノムをカットすることによって、ならびに相同修復を通じて、外因性ＤＮＡ配列を挿入することによって、ゲノムを修飾してもよい。
投与に用いる以外の生物ゲノム由来の二本鎖または一本鎖ＤＮＡの任意の領域（またはそれら自体の中のこうした領域の組成物、および他のＤＮＡ断片を含むもの）を外因性ＤＮＡ配列として用いてもよく、ここで前記領域（または領域の組成物）は、ＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導されて、ターゲットＤＮＡ中の二本鎖切断の部位内に組み込まれるよう意図される。本発明のいくつかの態様において、ＤｆＣａｓ９タンパク質の導入のために用いられるが、突然変異（ヌクレオチド置換）によって、ならびに１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入または欠失によって、さらに修飾されている、生物ゲノム由来の二本鎖ＤＮＡ領域を、外因性ＤＮＡ配列として用いてもよい。
本発明の技術的結果は、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の多用途性を増加させて、より多数の特定の部位および特定の条件で、ゲノムまたはプラスミドＤＮＡをカットするためのＣａｓ９ヌクレアーゼの使用を可能にすることである。
本発明の説明で用いた際、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「他のものの中でも、含む」を意味するよう解釈すべきである。前記用語は、「のみからなる」と解釈されるとは意図されない。別に定義しない限り、本出願中の技術的および科学的用語は、科学的および技術的文献中に一般的に認められる典型的な意味を有する。
本明細書において、用語「２つの配列の相同性パーセント」は、用語「２つの配列の同一性パーセント」と同等である。配列同一性は、参照配列に基づいて決定される。配列分析のためのアルゴリズムが当該技術分野に知られ、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ｐｐ．４０３－１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴがある。本発明の目的のため、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の間の同一性および類似性のレベルを決定するため、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較を用いてもよく、これは、標準パラメータを伴い、ギャップ化整列を用いて、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって提供されるＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって実行される。２つの配列の同一性パーセントは、整列による２つの配列の最適比較のために挿入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、これらの２つの配列中の同一アミノ酸位の数によって決定される。同一性パーセントは、配列整列を考慮に入れ、所定の位で同一であるアミノ酸の数を、位の総数で割り、そして１００を乗じたものに等しい。
用語「特異的にハイブリダイズする」は、２つの一本鎖核酸分子または十分に相補的な配列の間の会合を指し、これは、当該技術分野において典型的に用いられるあらかじめ決定した条件下でのこうしたハイブリダイゼーションを可能にする。
句「ヌクレオチドＰＡＭ配列の直前に位置する二本鎖切断」は、ターゲットＤＮＡ配列中の二本鎖切断が、ヌクレオチドＰＡＭ配列の０～２５ヌクレオチド前の距離で作製されることを意味する。
ガイドＲＮＡと同時に導入される外因性ＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断部位で、二本鎖ターゲットＤＮＡの特異的修飾のために特に調製されたＤＮＡ配列を指すよう意図される。こうした修飾は、例えば、ターゲットＤＮＡにおける切断部位での特定のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。外因性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域またはターゲットＤＮＡのものと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれであってもよい。
特定のアミノ酸配列を含むタンパク質は、前記アミノ酸配列、および前記アミノ酸配列にペプチド結合によって連結されるありうる他の配列で構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指すよう意図される。他の配列の例は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または前記アミノ酸配列の機能性増加を提供する他の配列であってもよい。
ガイドＲＮＡと同時に導入される外因性ＤＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断の部位での二本鎖ターゲットＤＮＡの特異的修飾のために特に調製されるＤＮＡ配列を指すよう意図される。こうした修飾は、例えば、ターゲットＤＮＡ中の切断部位での特定のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。外因性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域またはターゲットＤＮＡのものと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれであってもよい。
細胞内に導入されるタンパク質およびＲＮＡの有効量は、前記細胞内に導入された際、機能的複合体、すなわちターゲットＤＮＡに特異的に結合し、そして該ＤＮＡ中で、ガイドＲＮＡおよびＤＮＡ上のＰＡＭ配列によって決定される部位で二本鎖切断を生じるであろう複合体を形成可能であるような、タンパク質およびＲＮＡの量を指すよう意図される。このプロセスの効率は、当業者に知られる慣用的技術を用いて、前記細胞から単離されたターゲットＤＮＡを分析することによって評価されうる。
多様な技術によって、タンパク質およびＲＮＡを細胞に送達してもよい。例えば、タンパク質を、このタンパク質の遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドとして、細胞質においてこのタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡとして、またはこのタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体として、送達してもよい。当業者に知られる多様な技術によって、送達を行ってもよい。
系の構成要素をコードする核酸を、以下のように：当業者に知られる方法による細胞のトランスフェクションまたは形質転換によって、組換えウイルスの使用によって、細胞に対する操作、例えばＤＮＡマイクロインジェクション等によって、直接または間接的に細胞内に導入してもよい。
ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡおよび外因性ＤＮＡ（必要な場合）からなるリボ核酸複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）を、複合体を細胞内にトランスフェクションすることによって、または複合体を細胞内に機械的に導入することによって、例えばマイクロインジェクションによって、送達してもよい。
細胞内に導入しようとするタンパク質をコードする核酸分子は、染色体内に組み込まれてもよいし、または染色体外で複製されるＤＮＡであってもよい。いくつかの態様において、細胞内に導入されたＤＮＡでのタンパク質遺伝子の有効な発現を確実にするために、多様な生物ゲノムのコード領域において、同義のコドンの出現頻度は不均等であるため、発現のためコドンを最適化するように、細胞タイプにしたがって、前記ＤＮＡの配列を修飾することが必要である。コドン最適化は、動物、植物、真菌、または微生物細胞において、発現を増加させるために必要である。
配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である配列を有するタンパク質が、真核細胞において機能するには、このタンパク質が、最終的にこの細胞の核中に行きつくことが必要である。したがって、本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして１つまたはそれより多い核局在化シグナルの付加によって一端または両端でさらに修飾されている配列を有するタンパク質を用いて、ターゲットＤＮＡ中に二本鎖切断を形成する。例えば、ＳＶ４０ウイルス由来の核局在化シグナルを用いてもよい。核への効率的な送達を提供するため、例えば、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載される、スペーサー配列によって、主要タンパク質配列から核局在化シグナルを分離してもよい。さらに、他の態様において、異なる核局在化シグナル、または前記タンパク質を細胞核内に送達するための代替法を用いてもよい。
本発明は、厳密に特定される位で、ＤＮＡ分子内に二本鎖切断を導入するための、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に相同であるデフルビーモナス属種２０Ｖ１７生物由来のタンパク質の使用を含む。ゲノムにターゲティング化修飾を導入するためのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの使用は、いくつかの利点を有する。第一に、系の活性の特異性は、ｃｒＲＮＡ配列によって決定され、これは、すべてのターゲット遺伝子座に対して１つのタイプのヌクレアーゼを使用することを可能にする。第二に、該技術は、異なる遺伝子ターゲットに相補的ないくつかのガイドＲＮＡを、細胞内に同時に送達することを可能にし、それによって、いくつかの遺伝子を同時に修飾することを可能にする。
デフルビーモナス属種２０Ｖ１７細菌由来のＣａｓ９タンパク質の生化学的特徴づけのため、主な系の構成要素（ＤｆＣａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２タンパク質遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲカセットおよびガイドＲＮＡ）をコードするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、単一コピー細菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４内にクローニングした。Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖からなるエフェクター・リボ核酸複合体は、ｃｒＲＮＡスペーサー－プロトスペーサー相補性に加えて、ＤＮＡの認識およびそれに続く加水分解のため、ＤＮＡターゲット上に、ＰＡＭ（プロトスペーサー調節モチーフ）の存在を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ． Ｊ． Ｍ．ら Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ／／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００９． Ｖｏｌ． １５５． Ｉｓｓｕｅ ３． ｐｐ．７３３－７４０）。ＰＡＭは、オフターゲット鎖上のプロトスペーサーの３’端に隣接するかまたは数ヌクレオチド離れて、ＩＩ型系中に位置する、数ヌクレオチドの厳密に定義された配列である。ＰＡＭが存在しない場合、二本鎖切断の形成を伴うＤＮＡ結合の加水分解は起こらない。ターゲット上のＰＡＭ配列の存在の必要性は、認識特異性を増加させるが、同時に、切断を導入するためのターゲットＤＮＡ領域の選択に制約を課す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のガイドＲＮＡの配列を決定するため、生成されたＤｆＣａｓ９＿ｐａｃｙｃ１８４構築物を所持する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファ細菌のＲＮＡ配列決定を行った。配列決定は、系のＣＲＩＳＰＲカセットが活発に転写され、トレーサーＲＮＡも同様であることを示した（図１）。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の分析によって、これらが、おそらくＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される二次構造を形成可能であると考えることを可能にした。
さらに、著者らは、細菌ＰＡＭスクリーニングを用いて、ＤｆＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定した。ＤｆＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定するため、ＤｆＣａｓ９＿ｐａｃｙｃ１８４プラスミドを所持する大腸菌ＤＨ５アルファ細胞を、５’または３’端にランダム７文字配列が隣接する、ＤｆＣａｓ９系のＣＲＩＳＰＲカセットのスペーサー配列５’－ＴＡＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡＴＣ－３’を含有するプラスミドライブラリーによって形質転換した。ＤｆＣａｓ９系のＰＡＭ配列に対応する配列を所持するプラスミドを、機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の作用の下で分解に供する一方、残りのライブラリープラスミドを細胞内に有効に形質転換して、これらを抗生物質アンピシリンに耐性にした。形質転換し、そして抗生物質を含有するプレート上で細胞をインキュベーションした後、コロニーを寒天表面から洗い流し、そしてＱｉａｇｅｎプラスミド精製Ｍｉｄｉキットを用いて、そこからＤＮＡを抽出した。プラスミドの単離プールから、ＰＣＲによって、ランダム化ＰＡＭ配列を含有する領域を増幅し、そして次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でハイスループット配列決定に供した。ＤｆＣａｓ９＿ｐａｃｙｃ１８４を所持する細胞への、または空ベクターｐａｃｙｃ１８４を所持する対照細胞への、ライブラリー中に含まれるユニークなＰＡＭを含むプラスミドの形質転換効率を比較することによって、生じた読み取りを分析した。バイオインフォマティクス法を用いて、結果を分析した。その結果、ＤｆＣａｓ９系のＰＡＭを同定することが可能であり、これは３文字配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’（図２）である。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡをカットするための系を開発するため、以下のようなエフェクターＤｆＣａｓ９複合体の部分である構成要素：ガイドＲＮＡおよびＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼをすべて得る必要がある。ＲＮＡ配列決定によるガイドＲＮＡ配列の決定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を合成することを可能にした。ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キットを用いて、合成を行った。
３’端の配列ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎに制限されたＤＮＡターゲットをカットするため、以下の配列のガイドＲＮＡを用いた：
ｃｒＲＮＡ配列中に含まれる最初の２０ヌクレオチドは、ＤＮＡターゲット上の対応する配列と相補的に対形成し、そしてＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼによるその特異的認識を提供する。異なるＤＮＡターゲットをカットすることが望ましい場合、この２０文字スペーサー配列を修飾する（図３）。
組換えＤｆＣａｓ９タンパク質を得るため、その遺伝子をプラスミドｐＥＴ２１ａ内にクローニングした。生じたプラスミドＤｆＣａｓ９＿ｐＥＴ２１ａによって、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ細胞を形質転換した。プラスミドを所持する細胞をＯＤ６００＝０．６の光学密度まで増殖させ、次いで、１ｍＭ濃度までＩＰＴＧを添加することによって、ＤｆＣａｓ９遺伝子の発現を誘導した。細胞を２５℃で４時間インキュベーションした後、溶解した。組換えタンパク質を以下のように：アフィニティクロマトグラフィ（Ｎｉ－ＮＴＡ）により、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上のタンパク質サイズ排除により、２段階で精製した。Ａｍｉｃｏｎ ３０ｋＤａフィルターを用いて、生じたタンパク質を濃縮した。その後、マイナス８０℃でタンパク質を凍結し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に用いた。
ターゲットＤＮＡとして、３７８塩基対（ｂｐ）の長さの二本鎖ＤＮＡ断片を用い、該ＤＮＡは、細菌に対する実験において決定されたように、対応するＰＡＭ配列：ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎに制限された、３’端から約３０ｂｐの距離のプロトスペーサー配列を所持した。
Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの活性には、二価イオンの存在が必要である。これに関連して、マグネシウム、マンガン、カルシウムおよび亜鉛塩の存在下で、ＤＮＡターゲットのカットに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行った。ＤＮＡターゲットをカットするｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を、以下の条件で行った：
１ｘＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．９（２５℃）４００ｎＭ
ＤｆＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡターゲット
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
１ｍＭの対応するイオンの塩
総反応体積は２０μｌであり、反応時間は３０分間であり、そしてインキュベーション温度は３７℃であった。
１ｘＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．９（２５℃）４００ｎＭ
ＤｆＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡターゲット
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
１ｍＭの対応するイオンの塩
総反応体積は２０μｌであり、反応時間は３０分間であり、そしてインキュベーション温度は３７℃であった。
反応産物を１．５％アガロースゲル上に適用し、そして電気泳動に供した。ＤＮＡターゲットのカットが成功したならば、断片は２つの部分に分割され、そのうちの１つ（長さ約３２５ｂｐ）はゲル上に区別可能なバンドを形成した（図４）。実験の結果によって、ＤｆＣａｓ９タンパク質は、それ自体の活性のために、マグネシウムイオンよりもマンガンイオンを必要とすることが示され、これは現在までに特徴づけられているＣａｓ９ヌクレアーゼに関しては普通でない特性である。
異なるＤｆＣａｓ９ ＰＡＭ配列の有意性を確認するため、以前用いられたものと類似であるが、ＰＡＭ配列５’－ＡＡＡＡＡＣＧ－３’中に点（一ヌクレオチド）突然変異を含む、ＤＮＡターゲットのｉｎ ｖｉｔｒｏカットに関する実験を行った（図５）。
実験結果は、ＤｆＣａｓ９酵素が３’端のＰＡＭ配列ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎに制限されてＤＮＡ配列中に二本鎖切断を導入可能であることを確認した。ＰＡＭの３、５、および６位での置換は、ＤｆＣａｓ９エフェクター複合体に非常に重要であり、そしてターゲットＤＮＡの有効なカットを防止する。
さらに、ＤｆＣａｓ９活性に最適な温度を見出す実験を行った：これは３５～３７℃であることが見出され、これにより、ヒト細胞においてＤｆＣａｓ９を用いる見込みが生じる。
方法の以下の例示的態様は、本発明の特性を開示する目的のために提供され、そしていかなる意味でも本発明の範囲を制限するとは見なされないものとする。
実施例１． 多様なＤＮＡターゲットのカットにおけるＤｆＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
実施例１． 多様なＤＮＡターゲットのカットにおけるＤｆＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
モチーフ５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’が隣接している異なるＤＮＡ配列を認識するＤｆＣａｓ９の能力を試験するため、ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子配列由来のＤＮＡターゲット（表１を参照されたい）のｉｎ ｖｉｔｒｏカットにおける実験を行った。
表１． ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子から単離されたＤＮＡターゲット
先の実験と類似の条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡカット反応を行った。ターゲット配列各々に関してガイドｃｒＲＮＡを合成した。ＤＮＡターゲットとして、サイズが約７６０ｂｐのヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子断片を用いた：
ＰＡＭ配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’に対応するＤＮＡ領域が３’端に隣接している配列を、ＤＮＡターゲットとして選択した。選択した配列６つのうち、２つのみがＤｆＣａｓ９タンパク質によって有効にカットされた：エフェクター複合体によってカットされた適切なサイズのＤＮＡ断片が、ゲル上に見られる（図６）。異なるターゲットのカットにおける選択性は、異なる二次ＤＮＡ構造のＤｆＣａｓ９認識の効率が異なることによって、または他の理由によって説明可能である。異なるターゲットのカットにおけるＤｆＣａｓ９選択性は、真核細胞のゲノムをカットする際、タンパク質の特異性を増加させうる。
したがって、ガイドＲＮＡと組み合わせたＤｆＣａｓ９は、３５℃～３７℃の特徴的な活性温度範囲を伴い、配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’に制限された二本鎖ＤＮＡカットの新規手段である。
実施例２． ヌクレアーゼ機能性に対するＭｎ２＋イオン濃度の影響。
ＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼ活性に対するＭｎ２＋イオンの影響を試験するため、コンセンサス配列３’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）－５’を有するＰＡＭ配列
ＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼ活性に対するＭｎ２＋イオンの影響を試験するため、コンセンサス配列３’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）－５’を有するＰＡＭ配列
に制限されたターゲットＤＮＡ配列を含有する二本鎖ＤＮＡ断片のカットにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実験を行った。１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）、２０ｎＭの濃度のターゲットＤＮＡ、および２μＭの濃度のｔｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡを用いて、反応を行った。
ＤＮＡターゲットとして、本発明者らは
を用いた。
反応は、ｔｒａｃｒＲＮＡ：
反応は、ｔｒａｃｒＲＮＡ：
を用いた。
図７は、５ｍＭから１０ｍＭへのＭｎＣｌ２の濃度の増加が、ＤＮＡターゲットのより効率的なカットを生じる一方、二価イオン濃度のさらなる増加は、反応効率に影響を及ぼさないことを示した。したがって、有効なＤｆＣａｓ９活性は、１０ｍＭまたはそれより高い濃度でのマンガンイオンの存在を必要とする。
図７は、５ｍＭから１０ｍＭへのＭｎＣｌ２の濃度の増加が、ＤＮＡターゲットのより効率的なカットを生じる一方、二価イオン濃度のさらなる増加は、反応効率に影響を及ぼさないことを示した。したがって、有効なＤｆＣａｓ９活性は、１０ｍＭまたはそれより高い濃度でのマンガンイオンの存在を必要とする。
実施例３． ＤＮＡターゲットをカットするためのハイブリッドガイドＲＮＡの使用。
ｓｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの１つの型であり、融合したｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡである。最適なｓｇＲＮＡを選択するため、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なる、この配列の３つの変異体を構築した。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、そしてＤＮＡターゲットのカットにおいて、これらに対する実験を行った（図８は、多様なｓｇＲＮＡ変異体を用いたＤｆＣａｓ９によるＤＮＡのカット反応を示す）。
ｓｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡの１つの型であり、融合したｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡである。最適なｓｇＲＮＡを選択するため、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なる、この配列の３つの変異体を構築した。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、そしてＤＮＡターゲットのカットにおいて、これらに対する実験を行った（図８は、多様なｓｇＲＮＡ変異体を用いたＤｆＣａｓ９によるＤＮＡのカット反応を示す）。
選択したｓｇＲＮＡは、天然ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列とちょうど同じ程度に有効であり、ＤＮＡターゲットの５０％より多くがカットされた。
ＤＮＡターゲットと直接対形成する配列を修飾する際、ｓｇＲＮＡのこの変異体を用いて、任意の他のターゲットＤＮＡをカットしてもよい。
ＤＮＡターゲットと直接対形成する配列を修飾する際、ｓｇＲＮＡのこの変異体を用いて、任意の他のターゲットＤＮＡをカットしてもよい。
ハイブリッドＲＮＡとして、以下のＲＮＡ配列を用いた：
太字は、ターゲットＤＮＡとの対形成を提供する２０ヌクレオチド配列を示す（ｓｇＲＮＡの可変部分）。実験は、ＲＮＡを含まない対照試料、およびｃｒＲＮＡ＋ｔｒＲＮＡを用いたターゲットのカットである陽性対照を用いた。
以下の条件下で反応を行った：ＰＡＭ（ＡＡＡＡＣＧ）を含有するＤＮＡ配列の濃度は２０ｎＭであり、タンパク質濃度は４００ｎＭであり、ＲＮＡ濃度は２μＭであり；インキュベーション時間は３０分間であり、インキュベーション温度は３７℃であった。
ＤＮＡターゲットと直接対形成する配列を修飾した後、このハイブリッドＲＮＡ変異体を用いて、任意の他のターゲットＤＮＡをカットしてもよい。
実施例４． デフルビーモナス属種に属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
実施例４． デフルビーモナス属種に属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
今日まで、デフルビーモナス属ではＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素は特徴づけられてこなかった。サイズが匹敵する黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質は、ＤｆＣａｓ９と２１％同一であり、カンピロバクター・ジェジュニ由来のＣａｓ９は、ＤｆＣａｓ９と２８％同一である（ＢＬＡＳＴｐソフトウェア、デフォルトパラメータを用いて、同一性の度合いを計算した）。
したがって、ＤｆＣａｓ９タンパク質は、今日までに研究されている他のＣａｓ９タンパク質とは、アミノ酸配列が有意に異なる。
遺伝子操作の当業者は、本出願者らによって得られ、そして特徴づけられているＤｆＣａｓ９タンパク質配列変異体を、タンパク質自体の機能を変化させずに修飾しうる（例えば機能活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１５．３－１５．１０８））ことを認識するであろう。特に、当業者は、タンパク質機能性に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく、非保存性アミノ酸残基を修飾しうることを認識するであろう。こうした修飾の例には、相同のものでの非保存性アミノ酸残基の置換が含まれる。非保存性アミノ酸残基を含有する領域のいくつかを図９に示す。本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子において、前記ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’の直前に位置する二本鎖切断を形成することが可能である。対応する核酸分子を突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発）することによって、相同タンパク質を得て、その後、本明細書に記載する機能分析にしたがって、その機能の保持に関して、コードされる修飾Ｃａｓ９タンパク質を試験してもよい。
遺伝子操作の当業者は、本出願者らによって得られ、そして特徴づけられているＤｆＣａｓ９タンパク質配列変異体を、タンパク質自体の機能を変化させずに修飾しうる（例えば機能活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１５．３－１５．１０８））ことを認識するであろう。特に、当業者は、タンパク質機能性に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく、非保存性アミノ酸残基を修飾しうることを認識するであろう。こうした修飾の例には、相同のものでの非保存性アミノ酸残基の置換が含まれる。非保存性アミノ酸残基を含有する領域のいくつかを図９に示す。本発明のいくつかの態様において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子において、前記ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’の直前に位置する二本鎖切断を形成することが可能である。対応する核酸分子を突然変異誘発（例えば部位特異的またはＰＣＲ仲介性突然変異誘発）することによって、相同タンパク質を得て、その後、本明細書に記載する機能分析にしたがって、その機能の保持に関して、コードされる修飾Ｃａｓ９タンパク質を試験してもよい。
実施例５． 本発明記載のＤｆＣａｓ９系を、ガイドＲＮＡと組み合わせて用いて、真核生物を含む多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾してもよい。この生物の細胞内に（すべての細胞内にまたは一部の細胞内に）、ガイドＲＮＡを含む複合体中のＤｆＣａｓ９系を導入するため、当業者に知られる多様なアプローチを適用してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を生物の細胞に送達するための方法は、情報源中（Ｌｉｕ Ｃら， Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｎｏｖ ２８；２６６：１７－２６； Ｌｉｎｏ ＣＡら， Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２０１８ Ｎｏｖ；２５（１）：１２３４－１２５７）に、そしてこれらの情報源内にさらに開示される情報源中に開示されている。
真核細胞におけるＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な発現のため、当業者に知られる方法（例えば、ＩＤＴコドン最適化ツール）によって、ＤｆＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列に関してコドンを最適化することが望ましいであろう。
真核細胞におけるＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な活性のため、真核細胞の核内にタンパク質を移入することが必要である。これは、Ｓｈｅｎ Ｂら ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；２３（５）：７２０－３に記載されるスペーサー配列を通じて、またはスペーサー配列を含まずに、ＤｆＣａｓ９配列に連結された、ＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｌａｎｆｏｒｄら， Ｃｅｌｌ， １９８６， ４６：５７５－５８２）由来の核局在化シグナルを用いることによって行われてもよい。したがって、真核細胞の核内に輸送されるべきヌクレアーゼの完全アミノ酸配列は、以下の配列であろう：ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ－ＤｆＣａｓ９－ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（以後、ＤｆＣａｓ９ ＮＬＳと称される）。上記アミノ酸配列を含むタンパク質を、少なくとも２つのアプローチを用いて送達してもよい。
遺伝子送達は、プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の制御下でＤｆＣａｓ９ ＮＬＳ遺伝子を、そしてＵ６プロモーターの制御下でガイドＲＮＡをコードする配列を所持するプラスミドを生成することによって達成される。ターゲットＤＮＡとして、３’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）－５’が隣接するＤＮＡ配列を用い、これは例えばヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子の配列である：
したがって、ｃｒＲＮＡ発現カセットは以下のようになる：
太字は、Ｕ６プロモーター配列を示し、この後に、ターゲットＤＮＡ認識に必要な配列が続き、一方、ダイレクトリピート配列は、大文字で強調される。
トレーサーＲＮＡ発現カセットは、以下のようになる：
トレーサーＲＮＡ発現カセットは、以下のようになる：
太字は、Ｕ６プロモーター配列を示し、この後に、トレーサーＲＮＡをコードする配列が続く。
プラスミドＤＮＡを精製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションする。細胞を７２時間インキュベーションし、その後、ゲノムＤＮＡ精製カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、そこからゲノムＤＮＡを抽出する。定向性二本鎖切断、その後、その修復によりターゲット部位で行われたＤＮＡ中の挿入／欠失の数を決定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することによって、ターゲットＤＮＡ部位を分析する。
プラスミドＤＮＡを精製し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションする。細胞を７２時間インキュベーションし、その後、ゲノムＤＮＡ精製カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、そこからゲノムＤＮＡを抽出する。定向性二本鎖切断、その後、その修復によりターゲット部位で行われたＤＮＡ中の挿入／欠失の数を決定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することによって、ターゲットＤＮＡ部位を分析する。
例えば、上述のｇｒｉｎ２ｂ遺伝子部位に関して、切断導入の推定部位に隣接するプライマーを用いて、ターゲット断片の増幅を行う：
増幅後、ハイスループット配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）試薬試料調製プロトコルに関してＵｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリープレップキットにしたがって、試料を調製する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上、３００サイクル、直接読み取りで、配列決定を行う。バイオインフォマティクス法によって、配列決定結果を分析する。ターゲットＤＮＡ配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失を、カット検出と見なす。
ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中、ガイドＲＮＡと組換えＤｆＣａｓ９ ＮＬＳをインキュベーションすることによって、リボ核酸複合体としての送達を行う。サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を伴うアフィニティクロマトグラフィ（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）により、組換えタンパク質を精製することによって、細菌産生細胞から組換えタンパク質を産生する。
タンパク質を、１：２：２（ＤｆＣａｓ９ ＮＬＳ：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）の比でＲＮＡと混合し、該混合物を室温で１０分間インキュベーションし、そして次いで細胞内にトランスフェクションする。
次に、そこから抽出したＤＮＡを、ターゲットＤＮＡ部位での挿入／欠失に関して分析する（上述の通り）。
深海細菌デフルビーモナス属種２０Ｖ１７由来の本発明で特徴づけられるＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼは、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に比較して、いくつかの利点を有する。例えば、ＤｆＣａｓ９は、他の既知のＣａｓヌクレアーゼとは異なり、比較的単純な３文字ＰＡＭを有し、ＰＡＭは系が機能するのに必要である。ＤＮＡ中に二本鎖切断を導入可能な現在知られるＣａｓヌクレアーゼの大部分は、多文字の複雑なＰＡＭを有し、これがカットに適切な配列の選択を制限する。今日までに研究される、短いＰＡＭを認識するＣａｓヌクレアーゼの中で、ＤｆＣａｓ９のみが、５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’ヌクレオチドに制限された配列を認識しうる。
深海細菌デフルビーモナス属種２０Ｖ１７由来の本発明で特徴づけられるＤｆＣａｓ９ヌクレアーゼは、以前特徴づけられたＣａｓ９タンパク質に比較して、いくつかの利点を有する。例えば、ＤｆＣａｓ９は、他の既知のＣａｓヌクレアーゼとは異なり、比較的単純な３文字ＰＡＭを有し、ＰＡＭは系が機能するのに必要である。ＤＮＡ中に二本鎖切断を導入可能な現在知られるＣａｓヌクレアーゼの大部分は、多文字の複雑なＰＡＭを有し、これがカットに適切な配列の選択を制限する。今日までに研究される、短いＰＡＭを認識するＣａｓヌクレアーゼの中で、ＤｆＣａｓ９のみが、５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’ヌクレオチドに制限された配列を認識しうる。
ＤｆＣａｓ９の第二の利点は、比較的小さいタンパク質サイズ（１０７９ａ．ａ．ｒ．）である。今日まで、該酵素は、単純なＰＡＭ配列を有し、そして３７℃で活性である、研究されるわずかな小サイズタンパク質の１つである。ＤｆＣａｓ９の独自の特性は、ＤＮＡターゲットを成功裡にカットするために、マンガンイオンの存在を必要とする。この特性を用いて、Ｃａｓ９複合体の活性を制御してもよい。
本発明は、開示する態様に言及して記載されてきているが、当業者は、詳細に記載される特定の態様が、本発明を例示する目的のために提供されており、そしていかなる意味でも本発明の範囲を限定するとは見なされないことを認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなく、多様な修飾を行ってもよいことが理解されるであろう。
Claims (5)
- ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’の直前に位置する、前記ＤＮＡ分子中の二本鎖切断を形成するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であり、そして非保存性アミノ酸残基でのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質の使用。
- ３５℃～３７℃の温度で、そしてＭｎ２＋イオンの存在下で、ＤＮＡ分子中に二本鎖切断が形成されることで特徴づけられる、請求項１記載の使用。
- タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のタンパク質の使用。
- 配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’に直接隣接する、単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列中に二本鎖切断を生成するための方法であって、該生物の少なくとも１つの細胞内に、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、並びにｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’にすぐ隣接する生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、そして二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、を導入する工程を含む、
ここで、前記タンパク質と該ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’の間の相互作用が、配列５’－ＮＮ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｃ／Ｔ）Ｎ－３’に直接隣接するゲノムＤＮＡ配列中の二本鎖切断の形成を生じる
前記方法。 - ガイドＲＮＡと同時に、外因性ＤＮＡ配列の導入をさらに含む、請求項４記載の方法。
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