CN114381416B - 一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于生产5‑氨基乙酰丙酸(5‑ALA)的重组大肠杆菌菌株；本发明还公开了一条高效合成5‑氨基乙酰丙酸的途径：强化大肠杆菌自身的5‑氨基乙酰丙酸合成酶（HemL和HemA），菌株初步具有合成5‑氨基乙酰丙酸的能力；强化5‑氨基乙酰丙酸外排蛋白eamA基因的表达，提高菌株的5‑氨基乙酰丙酸外排能力；引入外源5‑氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因，增强菌株的5‑氨基乙酰丙酸合成能力；改造葡萄糖利用途径的galR、glk、ppc基因，提高葡萄糖的利用效率；敲除代谢旁路的基因（hemF、poxB和aceB）。本发明构建的重组大肠杆菌菌株具有高效利用葡萄糖和甘氨酸合成5‑氨基乙酰丙酸的能力，使其具有工业生产5‑氨基乙酰丙酸的用途。

Description

一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及代谢工程和微生物发酵领域，具体地，涉及一种高产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的重组大肠杆菌菌株及其应用。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，简称5-ALA)是一种广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的非蛋白类的氨基酸，是吡咯类化合物的生物合成中的重要中间代谢产物。在农业领域，由于5-ALA在环境中易降解，对农作物、动物和人无毒性，可用作植物生长调节剂、绿色除草剂和杀虫剂。在医学领域，5-ALA作为一种副作用小、渗透性好的光动力学药物，已被广泛应用于痤疮、皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌、上消化道癌等的诊断与光动力治疗中。
目前5-ALA的合成方法主要包括为化学合成法和生物合成法。
化学合成法主要有：（1）以马尿酸和琥珀酸为原料合成5-ALA；（2）以糠醛、吡啶等杂环物质为原料合成5-ALA；（3）以乙酰丙酸或其衍生物为原料合成5-ALA。但是，化学合成法由于反应步骤多、副产物多、产物的分离纯化难、得率低限制了其推广应用，并且化学合成中采用的有毒试剂也会造成环境污染。
生物体内主要有两种合成5-ALA的途径：C4途径和C5途径。C4途径是琥珀酰辅酶A和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶的催化下生成5-ALA；而C5途径则是谷氨酸经过谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶三步催化生成5-ALA。目前生物合成法主要为：（1）从自然界中筛选生产5-ALA的菌株进行诱变育种，筛选5-ALA高产菌株；（2）对5-ALA合成酶进行修饰调节；（3）对5-ALA生产菌株进行代谢工程改造。
生物合成法需要建立廉价的原料路线，提高产物转化率，降低生产成本，形成具有推广前景的生产模式。随着基因工程和代谢工程的逐渐成熟，通过对微生物进行代谢改造，使其能以廉价的葡萄糖为底物发酵生产5-ALA，已成为未来的研究方向。
发明内容
一方面，本发明提供一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的重组大肠杆菌菌株，所述菌株含包含下任意一种或多种基因修饰：
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；优选地，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；优选地，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；优选地，所述eamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；优选地，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；优选地，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；优选地，所述galR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
（7） 增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；优选地，所述ppc的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
（8）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；优选地，所述poxB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
（9）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性；优选地，所述glk的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
（10）抑制aceB基因的表达或/和抑制aceB基因所编码的苹果酸合酶的活性。优选地，所述aceB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明的重组大肠杆菌菌株通过优化葡萄糖利用途径，产生大量磷酸烯醇式丙酮酸，生成草酰乙酸，进入三羧酸循环，加强5-ALA合成途径相关靶点，引入外源5-ALA合成途径，敲除副产物竞争旁路，从而获得一条高效合成5-ALA的途径。
在本发明的一些实施例中，所述重组大肠杆菌菌株包含如下任意一种或两种基因修饰：
（1）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；
（2）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性。
在本发明的一些实施例中，在上述重组大肠杆菌菌株的基础上，所述菌株还含有如下任意一种或多种修饰：
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达。
在本发明的一些实施例中，在上述重组大肠杆菌菌株的基础上，所述菌株还含有如下任意一种或多种修饰：
（1）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（2） 增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；
（3）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；
（4）抑制aceB基因的表达或/和抑制aceB基因所编码的苹果酸合酶的活性。
在本发明的一些实施例中，所述重组大肠杆菌菌株包含修饰：
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；或，
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；或，
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；
（7）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；或，
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；
（7）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；
（8）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；或，
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；
（7） 增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；
（8）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；
（9）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性；或，
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性；
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性；
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性；
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达；
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性；
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性；
（7）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；
（8）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；
（9）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性；
（10）抑制aceB基因的表达或/和抑制aceB基因所编码的苹果酸合酶的活性。
在本发明的一些实施例中，所述外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
在本发明的一些实施例中，所述大肠杆菌在基因修饰前插入T7 RNAP基因。
在本发明的一些实施例中，所述大肠杆菌为BW25113或MG1655或BL21（DE3）。
另一方面，本发明还提供一种5-氨基乙酰丙酸，所述5-氨基乙酰丙酸是由上述的重组大肠杆菌菌株合成获得的。
另一方面，本发明还提供一种重组大肠杆菌菌株的构建方法，所述构建方法包含以下步骤：
（1）构建包含目的基因的重组质粒：所述基因为编码谷氨醛氨基转移酶的hemL、编码谷氨酰胺tRNA还原酶的hemA、编码半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的eamA、编码5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA中的任意一种或几种基因的组合；
（2）构建宿主菌：以BW25113-T7菌株为基础，构建（通过敲除和/或插入目的基因）宿主菌：所述敲除的基因为编码共卟啉原III氧化酶的hemF、编码半乳糖抑制子GalR的galR、编码丙酮酸氧化酶的poxB、编码苹果酸合酶的aceB中的任意一种或几种基因的组合，所述插入的目的基因为编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc、编码丙酮酸氧化酶的glk；
（3）构建重组大肠杆菌菌株：将把步骤（2）构建的宿主菌制备感受态，转入步骤（1）构建的重组质粒，涂相应抗性平板，筛选阳性单克隆获得重组大肠杆菌菌株；
优选地，所述重组大肠杆菌菌株还可转入外源5-氨基乙酰丙酸合成酶的基因hemA，当转入hemA基因时，在步骤（1）还包括构建重组质粒pACYCD-RshemA。
在本发明的一些实施例中，所述步骤（2）中敲除目的基因的方法采用CRISPR/Cas9（CRISPR/Cas9，规律成簇的间隔短回文重复与Cas9核酸内切酶组， Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats）技术敲除。
另一方面，本发明还提供一种5-氨基乙酰丙酸的生产方法，所述方法以葡萄糖为底物，培养上述的重组大肠杆菌菌株合成5-氨基乙酰丙酸。
在本发明的一些实施例中，所述培养过程中采用的培养基为：Na2HPO4·12H2O16.0 g/L -18.0g/L，KH2PO42.0 g/L -4.0g/L，NaCl 0.4 g/L -0.6g/L，NH4Cl 0.9 g/L -1.1g/L，MgSO4 1.5 mM -2.5mM，CaCl2 0.05 mM -0.15mM，葡萄糖9.0 g/L -11.0g/L，酵母粉1.5 g/L -2.5g/L，甘氨酸1.5 g/L -2.5g/L。
在本发明的一些优选实施例中，所述培养过程中采用的培养基为：Na2HPO4·12H2O17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO4 2mM，CaCl2 0.1mM，葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸2g/L。
另一方面，本发明还提供上述重组大肠杆菌菌株、上述重组大肠杆菌菌株的构建方法、上述5-氨基乙酰丙酸的生产方法在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
本发明构建了一条高效合成5-氨基乙酰丙酸的途径：强化大肠杆菌自身的5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemL和HemA），菌株初步具有合成5-氨基乙酰丙酸的能力；强化5-氨基乙酰丙酸外排蛋白eamA基因的表达，提高菌株的5-氨基乙酰丙酸外排能力；引入外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA，增强菌株的5-氨基乙酰丙酸合成能力；改造葡萄糖利用途径中的galR、glk、ppc基因，提高葡萄糖的利用效率；敲除代谢旁路中的一些基因（hemF、poxB和aceB），使5-氨基乙酰丙酸的合成路径更加优化。本发明构建的重组大肠杆菌菌株具有高效利用葡萄糖和甘氨酸合成5-氨基乙酰丙酸的能力，使其具有工业生产5-氨基乙酰丙酸的用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.重组大肠杆菌工程菌株利用葡萄糖为原料生产5-ALA的产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大肠杆菌BW25113菌株：购自深圳市辉诺生物科技有限公司，产品货号T0035
大肠杆菌BL21(DE3)菌株：购自深圳市辉诺生物科技有限公司，产品货号T0041
pET28b空质粒：购自深圳市辉诺生物科技有限公司，产品货号P0346。
pACYCDuet-1质粒：购自深圳市辉诺生物科技有限公司，产品货号P0049。
pUC57载体：购自深圳市辉诺生物科技有限公司，产品货号P0087。
IPTG：购自北京兰博利德商贸有限公司。
细菌基因组提取试剂盒：购自宝日医生物技术(北京)有限公司，产品目录为9763。
Phanta max Super-Fidelity DNA聚合酶：购自南京诺唯赞生物科技有限公司，产品目录为P505。
大肠杆菌Trans5α感受态细胞：购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201。
实施例一、构建表达5-ALA合成酶的重组质粒
1、构建重组质粒pET28b-hemL
（1）大肠杆菌基因组DNA的提取和hemL基因的PCR扩增。
采用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌BW25113或BL21(DE3)基因组DNA。以提取的基因组为模板，以hemL-F和hemL-R为引物，用高保真Phanta max Super-Fidelity DNA聚合酶PCR扩增出基因片段hemL，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
（2）构建含有hemL基因的重组质粒。
以pET28b空质粒作为模板，以V-pET28b-F和V-pET28b-R为引物，用高保真Phantamax Super-Fidelity DNA聚合酶PCR扩增出载体片段ET28b，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；用In-Fusion无缝克隆方法将上述hemL基因片段与ET28b载体片段进行连接反应。用CaCl2-MgCl2法转化至大肠杆菌Trans5α感受态细胞中。37℃、200rpm培养1h后，取100μL将其均匀涂布于含卡那青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑选克隆，用引物hemL-F/pET28b-R鉴定并将阳性克隆送测序，获得阳性质粒命名为pET28b-hemL。
2、构建重组质粒pET28b-hemL-hemA
协同表达大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨醛氨基转移酶基因hemL与大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨酰胺tRNA还原酶基因hemA的质粒的构建。
以提取的大肠杆菌基因组为模板，用引物RBS-hemA-F/hemA-R扩增hemA基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。以pET28b-hemL质粒作为模板，以V-pET28b-hemL-F和V-pET28b-hemL-R为引物，扩增载体片段ET28b-hemL。将hemA基因片段与ET28b-hemL载体片段进行连接反应。转化至大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用引物RBS-hemA-F/pET28b-R鉴定并将阳性克隆送测序，获得阳性质粒命名为pET28b-hemL-hemA。
3、构建表达5-ALA外排蛋白酶的重组质粒pET28b-hemL-hemA-eamA
协同表达大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨醛氨基转移酶基因hemL与大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨酰胺tRNA还原酶基因hemA和大肠杆菌（Escherichia coli）半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸外排蛋白基因eamA的质粒的构建。
以提取的大肠杆菌基因组为模板，用引物RBS-eamA-F/eamA-R扩增eamA基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。以pET28b-hemL-hemA质粒作为模板，以V-pET28b-hemLA-F和V-pET28b-hemLA-R为引物，扩增载体片段ET28b-hemLA。将eamA基因片段与ET28b-hemLA载体片段进行连接反应。转化至大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用引物RBS-eamA-F/pET28b-R鉴定并将阳性克隆送测序，获得阳性质粒命名pET28b-hemL-hemA-eamA。
4、构建重组质粒pACYCD-RshemA
全基因合成类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA，并用大肠杆菌密码子进行优化，连接在pUC57载体上，获得质粒pUC57-RshemA。以RshemA-F和RshemA-R为引物，质粒pUC57-RshemA为模板，用高保真Phanta max Super-Fidelity DNA聚合酶PCR扩增出RshemA基因片段。以pACYCDuet-1质粒作为模板，以V-pACYCD-F和V-pACYCD-R为引物，扩增载体片段ACYCD。用In-Fusion无缝克隆方法将RshemA基因片段与ACYCD载体片段进行连接反应。转化至大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用引物pACYCD-F/RshemA-R鉴定并将阳性克隆送测序，获得阳性质粒命名pACYCD-RshemA。
实施例二、构建生产5-ALA的重组大肠杆菌菌株
1、构建宿主菌
以大肠杆菌E.coli BW25113作为出发菌株，用CRISPR/Cas9技术（参见文献“CRISPR/Cas9 mediated T7 RNA polymerase gene knock-in in E. coli BW25113makes T7 expression system work efficiently”，叶长川）向BW25113中插入T7 RNAP基因，构建BW25113-T7菌株。
以BW25113-T7为出发菌，构建包括下列一种或多种性状的宿主菌，各宿主菌的基因型如下表1所示。
表1. 宿主菌及其基因型
宿主菌 基因型
BW-T7 BW25113 int::(lacI::PlacUV5::T7 gene) ΔybhC
5-ALA01 BW-T7 △hemF
5-ALA02 BW-T7 △hemF △galR
5-ALA03 BW-T7 △hemF △galR::119-ppc
5-ALA04 BW-T7 △hemF △galR::119-ppc △poxB
5-ALA05 BW-T7 △hemF △galR::119-ppc △poxB::119-glk
5-ALA06 BW-T7 △hemF △galR::119-ppc △poxB::119-glk △aceB
所涉及到的引物序列如表2所示。
表2. 引物名称及其序列
引物 序列（5'→3'）
hemL-F ctttaagaaggagatataccatatgagtaagtctgaaaatct
hemL-R ggttatgctagttattgctctcacaacttcgcaaacaccc
V-pET28b-F gagcaataactagcataacc
V-pET28b-R atggtatatctccttcttaaag
pET28b-R atccggatatagttcctcct
RBS-hemA-F gggtgtttgcgaagttgtgacaggaggaattaacatgacccttttagcactcggtatca
hemA-R aggggttatgctagttattgctcctactccagcccgaggctgt
V-pET28b-hemL-F gagcaataactagcataacccct
V-pET28b-hemL-R tcacaacttcgcaaacaccc
RBS-eamA-F acagcctcgggctggagtaggtcgactgcagaggcctgcatgcatgtcgcgaaaagatggggt
eamA-R cccaaggggttatgctagttattgctcttaacttcccacctttaccg
V-pET28b-hemLA-F GAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGG
V-pET28b-hemLA-R CTACTCCAGCCCGAGGCTGT
RshemA-F atcatcaccacagcggatccatgtcgcgaaaagatggggt
RshemA-R ttaccagactcgagggtaccttaacttcccacctttaccg
V-pACYCD-F ggtaccctcgagtctggtaa
V-pACYCD-R ggatccgctgtggtgatgat
pACYCD-F gagcggataacaattcccct
N20-F-P gttttagagctagaaatagcaagttaaaat
N20-hemF-R CTCATCGCCCGGAACTTGCCACTAGTATTATACCTAGGACTGA
hemF-up-F aactgcacagccgcaacac
hemF-up-R GCTGGTGGGAACATACGGGGCCTGCCTGTTCGAAAACAC
hemF-down-F gtgttttcgaacaggcaggccccgtatgttcccaccagc
hemF-down-R GGAAATTGCGCTCGCGCT
galR-up-F attcacccaaagccagcgaa
galR-down-R gcgacggagttgacactgaa
poxB-up-F agcgcctattgttcatgccc
poxB-down-R tggctaactcttctttggcg
aceB-up-F atgactgaacaggcaacaac
aceB-down-R ctttgctcggaataaacgcc
（1）敲除粪卟啉原III氧化酶基因hemF
采用“CRISPR/Cas9”技术敲除基因hemF，包括以下步骤：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
电转感受态的制备
将大肠杆菌BW25113-T7菌株制备成化转感受态，转入质粒pCAS，得到重组大肠杆菌pCAS/BW-T7。将该重组菌转接到含kan抗性的LB培养基中，并加入阿拉伯糖进行诱导，使其表达λ噬菌体的Red重组蛋白，将其制成电转感受态，使具有同源重组的能力。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
pTarget-N20-hemF质粒的制备
在NCBI上得到hemF及其周围序列（CDS前后各400bp），用Broad institute的CRISPR/Cas9在线设计工具设计sgRNA[（sgRNA包括PAM（NGG）+crRNA（待敲除基因的N20）+tracrRNA（与cas9蛋白结合）]，再用Rgenome的在线设计工具评价设计的N20是否有脱靶现象，从中选择合适的N20。设计PCR引物N20-F-P和N20-hemF-R以扩增N20位点，并通过磷酸化末端自连的方式获取目的pTarget质粒，该质粒可以表达sgRNA。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
打靶片段Donor DNA-hemF的制备：
确定N20位置后，以N20位置为中心，设计引物hemF-up-F和hemF-up-R扩增上游同源臂，hemF-down-F和hemF-down-R扩增下游同源臂，再以上、下游同源臂共同作为模板，以hemF-up-F和hemF-down-R为引物，通过SOE PCR扩增得到打靶片段Donor DNA-hemF。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
同源重组：将打靶片段Donor DNA-hemF和pTarget-N20-hemF质粒一起电转入重组大肠杆菌pCAS/BW-T7的电转感受态细胞中，利用含Kan+Amp的LB平板（卡那霉素浓度为50μg/mL，氨苄青霉素浓度为100μg/mL），筛选阳性克隆。再用引物hemF-up-F和引物hemF-down-R进行PCR验证，得到阳性单克隆5-ALA01-KA:BW-T7 △hemF/pCAS pTarget-N20-hemF。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
抗性消除：将获得的BW-T7 △hemF/pCAS pTarget-N20-hemF菌株转接至含Kan的LB培养基中，并加入终浓度1mM的IPTG诱导，30℃ 200rpm震荡培养，再传代一次后，将菌液分别划含有Kan、Amp的LB平板，30℃倒置培养过夜。若含有Amp的LB平板未长菌，而含有Kan的LB平板长菌，则菌株中的pTarget-N20-hemF质粒已经消除，挑取含有Kan的LB平板上的单克隆，得到BW-T7 △hemF/pCAS菌株，保菌。将BW-T7 △hemF/pCAS菌株转接至LB无抗性培养基中，42℃、200rpm培养，使其消除温敏质粒pCAS，然后划线于无抗性LB平板，42°C倒置培养过夜，挑取单克隆42℃ 200rpm培养8h后，分别在含有Kan的LB平板上进行划线，30°C倒置培养过夜，若Kan平板上不生长单克隆，证明其消除了温敏型质粒pCAS，将该单克隆命名为5-ALA01:BW-T7 △hemF。
（2）编码半乳糖抑制子GalR的基因galR的敲除；
使用与上述步骤（1）中相同的方法，以5-ALA01为受体菌，采用“CRISPR/Cas9”技术敲除基因galR，利用引物galR-up-F/galR-down-R验证，获得阳性单克隆5-ALA02-KA：5-ALA01 △galR/pCAS pTarget-N20-galR，经抗性消除获得的单克隆命名为5-ALA02：5-ALA01 △galR。
（3）在半乳糖抑制子基因galR处插入大肠杆菌来源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc
使用与上述步骤（1）中相同的方法，将受体菌换为5-ALA02，打靶片段为galRup-119-ppc-galRdown，含有敲除基因galR上游同源臂序列、119启动子、大肠杆菌来源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、TrrnB终止子、以及敲除基因galR的下游同源臂序列。验证引物为galR-up-F/galR-down-R。获得阳性单克隆为5-ALA03-KA：5-ALA01 △galR::119-ppc/pCAS pTarget-N20-galR，经抗性消除获得的单克隆命名为5-ALA03：5-ALA01△galR::119-ppc。
（4）编码丙酮酸氧化酶的基因poxB的敲除
使用与上述步骤（1）中相同的方法，以5-ALA03为受体菌，采用“CRISPR/Cas9”技术敲除基因poxB，利用引物poxB-up-F/poxB-down-R验证，获得阳性单克隆5-ALA04-KA：5-ALA03 △poxB/pCAS pTarget-N20-poxB，经抗性消除获得的单克隆命名为5-ALA04：5-ALA03 △poxB。
（5）在丙酮酸氧化酶基因poxB处插入大肠杆菌来源葡萄糖激酶基因glk；
使用与上述步骤（1）中相同的方法，将受体菌换为5-ALA03，打靶片段为poxBup-119-glk-poxBdown，含有敲除基因poxB上游同源臂序列、119启动子、大肠杆菌来源葡萄糖激酶基因glk、TrrnB终止子、以及敲除基因poxB的下游同源臂序列。验证引物为poxB-up-F/poxB-down-R。获得阳性单克隆为5-ALA05-KA：5-ALA03 △poxB::119-glk/pCAS pTarget-N20-poxB，经抗性消除获得的单克隆命名为5-ALA05：5-ALA03 △poxB::119-glk。
（6）编码苹果酸合酶的基因aceB的敲除
使用与上述步骤（1）中相同的方法，以5-ALA05为受体菌，采用“CRISPR/Cas9”技术敲除基因aceB，利用引物aceB-up-F/aceB-down-R验证，获得阳性单克隆5-ALA06-KA：5-ALA05 △aceB/pCAS pTarget-N20-aceB，经抗性消除获得的单克隆命名为5-ALA06：5-ALA05 △aceB。
2、构建重组大肠杆菌菌株
将实施例二中构建的宿主菌用氯化钙法制备感受态，单转或共转入实施例一中构建的重组质粒(pET28b-hemL-hemA-eamA、pACYCD-Rs-hemA)，涂相应抗性平板，筛选阳性单克隆；-80℃保存阳性单克隆。
实施例三、利用重组大肠杆菌工程菌株生产5-ALA
1、5-ALA生产菌株的诱导
将-80℃保存的阳性单克隆菌液划线到相应抗性的LB平板上，37℃倒置培养12h。挑取单克隆，接种到含相应抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜震荡培养。将过夜培养的生产菌株按2%接种量，转接至30mL M9+酵母粉+gly培养基中，37℃、200rpm培养至OD600=0.8左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，37℃、200rpm诱导培养。
M9+酵母粉+gly培养基配方:Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO4 2mM，CaCl2 0.1mM，葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸2g/L。
2、5-ALA的检测
加入诱导剂IPTG后，37℃、200rpm发酵24h后取样，每个摇瓶取样1mL，13300rpm离心10min。取上清，梯度稀释到合适的倍数后，分别取500μL上清于2mL EP管中，依次加入250μL乙酸盐缓冲液，125μL乙酰丙酮，沸水浴加热15min后，自然冷却至室温，加入等体积的DMAB显色剂，室温下显色反应15min。以水做空白对照，测定554nm处的吸光值(A554)，计算生产菌株的5-ALA产量，实验设置三次重复，结果取平均值。
5-ALA产量的结果如图1所示。
结果表明：
（1）单独强化C5途径中的谷氨醛氨基转移酶基因hemL，5-ALA产量增加并不明显，同时强化谷氨醛氨基转移酶基因hemL和谷氨酰胺tRNA还原酶基因hemA，可有效提高5-ALA的产量；
（2）增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性，5-ALA产量提高了13.66%；
（3）引入类球红细菌来源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA，5-ALA产量提高了113.00%；
（4）抑制5-ALA下游代谢途径中hemF基因所编码的粪卟啉原III氧化酶的活性，5-ALA产量提高了18.21%；
（5）抑制半乳糖抑制子GalR的活性，5-ALA产量提高了25.91%；
（6）增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，5-ALA产量提高了21.70%；
（7）抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性，5-ALA产量提高了5.71%；
（8）增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性，5-ALA产量提高了7.15%；
（9）抑制aceB基因所编码的苹果酸合酶的活性，5-ALA产量提高了4.96%。
重组菌株BW-T7 △hemF △galR::119-ppc △poxB::119-glk △aceB/pET-hemLA-eamA pACYCD-RshemA能够以10g/L葡萄糖为底物生成3.349g/L的5-ALA，5-ALA的转化率为0.33g/g葡萄糖。
序列表
<110> 北京道合成企业管理有限公司
<120> 一种用于5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其构建方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtaagt ctgaaaatct ttacagcgca gcgcgcgagc tgatccctgg cggtgtgaac 60
tcccctgttc gcgcctttac tggcgtgggc ggcactccac tgtttatcga aaaagcggac 120
ggcgcttatc tgtacgatgt tgatggcaaa gcctatatcg attatgtcgg ttcctggggg 180
ccgatggtgc tgggccataa ccatccggca atccgcaatg ccgtgattga agccgccgag 240
cgtggtttaa gctttggtgc accaaccgaa atggaagtga aaatggcgca actggtgacc 300
gaactggtcc cgaccatgga tatggtgcgc atggtgaact ccggcactga agcgaccatg 360
agcgccatcc gcctggcccg tggttttacc ggtcgcgaca aaattattaa atttgaaggg 420
tgttaccatg gtcacgctga ctgcctgctg gtgaaagccg gttctggcgc actcacgtta 480
ggccagccaa actcgccggg cgttccggca gatttcgcca aatatacctt aacctgtact 540
tataatgatc tggcttctgt acgcgccgca tttgagcaat acccgcaaga gattgcctgt 600
attatcgtcg agccggtggc aggcaatatg aactgtgttc cgccgctgcc agagttcctg 660
ccaggtctgc gcgcgctgtg cgacgaattt ggcgcgttgc tgatcatcga tgaagtgatg 720
accggtttcc gcgtagcgct agctggcgca caggattatt acggcgtagt gccagattta 780
acctgcctcg gcaaaatcat cggcggtgga atgccggtag gcgcattcgg tggtcgtcgt 840
gatgtaatgg atgcgctggc cccgacgggt ccggtctatc aggcgggtac gctttccggt 900
aacccgattg cgatggcagc gggtttcgcc tgtctgaatg aagtcgcgca gccgggcgtt 960
cacgaaacgc tggatgagct gacaacacgt ctggcagaag gtctgctgga agcggcagaa 1020
gaagccggaa ttccgctggt cgttaaccac gttggcggca tgttcggtat tttctttacc 1080
gacgccgagt ccgtgacgtg ctatcaggat gtgatggcct gtgacgtgga acgctttaag 1140
cgtttcttcc atatgatgct ggacgaaggt gtttacctgg caccgtcagc gtttgaagcg 1200
ggctttatgt ccgtggcgca cagcatggaa gatatcaata acaccatcga tgctgcacgt 1260
cgggtgtttg cgaagttgtg a 1281
<210> 2
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacccttt tagcactcgg tatcaaccat aaaacggcac ctgtatcgct gcgagaacgt 60
gtatcgtttt cgccggataa gctcgatcag gcgcttgaca gcctgcttgc gcagccgatg 120
gtgcagggcg gcgtggtgct gtcgacgtgc aaccgcacgg aactttatct tagcgttgaa 180
gagcaggaca acctgcaaga ggcgttaatc cgctggcttt gcgattatca caatcttaat 240
gaagaagatc tgcgtaaaag cctctactgg catcaggata acgacgcggt tagccattta 300
atgcgtgttg ccagcggcct ggattcactg gttctggggg agccgcagat cctcggtcag 360
gttaaaaaag cgtttgccga ttcgcaaaaa ggtcatatga aggccagcga actggaacgc 420
atgttccaga aatctttctc tgtcgcgaaa cgcgttcgca ctgaaacaga tatcggtgcc 480
agcgctgtgt ctgtcgcttt tgcggcttgt acgctggcgc ggcagatctt tgaatcgctc 540
tctacggtca cagtgttgct ggtaggcgcg ggcgaaacta tcgagctggt ggcgcgtcat 600
ctgcgcgaac acaaagtaca gaagatgatt atcgccaacc gcactcgcga acgtgcccaa 660
attctggcag atgaagtcgg cgcggaagtg attgccctga gtgatatcga cgaacgtctg 720
cgcgaagccg atatcatcat cagttccacc gccagcccgt taccgattat cgggaaaggc 780
atggtggagc gcgcattaaa aagccgtcgc aaccaaccaa tgctgttggt ggatattgcc 840
gttccgcgcg atgttgagcc ggaagttggc aaactggcga atgcttatct ttatagcgtt 900
gatgatctgc aaagcatcat ttcgcacaac ctggcgcagc gtaaagccgc agcggttgag 960
gcggaaacta ttgtcgctca ggaaaccagc gaatttatgg cgtggctgcg agcacaaagc 1020
gccagcgaaa ccattcgcga gtatcgcagc caggcagagc aagttcgcga tgagttaacc 1080
gccaaagcgt tagcggccct tgagcagggc ggcgacgcgc aagccattat gcaggatctg 1140
gcatggaaac tgactaaccg cttgatccat gcgccaacga aatcacttca acaggccgcc 1200
cgtgacgggg ataacgaacg cctgaatatt ctgcgcgaca gcctcgggct ggagtag 1257
<210> 3
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtcgcgaa aagatggggt gttggcgcta ctggtagtgg tcgtatgggg gctaaatttt 60
gtggtcatca aagtggggct tcataacatg ccaccgctga tgctggccgg tttgcgcttt 120
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ctgctggggt atggattaac catcagtttt gcgcagtttg cttttctttt ttgtgccatt 240
aacttcggta tgcctgctgg actggcttcg ctggtgttac aggcacaggc gttttttact 300
atcatgcttg gcgcgtttac tttcggggag cgactgcatg gcaaacaatt ggcggggatc 360
gccttagcga tttttggcgt actggtgtta atcgaagata gtctgaacgg tcagcatgtg 420
gcgatgctcg gctttatgtt gaccctggcg gcagcattta gttgggcgtg tggcaacatc 480
ttcaataaaa agatcatgtc gcactcaacg cgtccggcgg tgatgtcgct ggtaatctgg 540
agcgctttaa tcccaatcat tcccttcttt gttgcctcgc tgattctcga tggttccgca 600
accatgattc acagtctggt tactatcgat atgaccacca tcttgtctct gatgtatctg 660
gcgtttgtgg cgacaattgt tggttatggg atctggggga cgttactggg acgctatgaa 720
acctggcggg ttgcaccgtt atcgttactg gtgcccgtag taggactggc aagtgcggca 780
ctattgttgg atgaacgctt aacgggtctg caatttttag gtgcggtgct cattatgacc 840
gggctgtata tcaatgtatt tggcttgcgg tggcgtaaag cggtaaaggt gggaagttaa 900
<210> 4
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggattata atttagcact agacacagct ttaaacagac ttcacaccga gggccgttac 60
cgaaccttta tcgacatcga gcgccgcaaa ggtgctttcc cgaaagctat gtggcgtaag 120
ccggatggta gcgaaaagga gataaccgtg tggtgcggta atgactacct gggtatgggc 180
cagcatccgg ttgtcttagg cgctatgcat gaagcgttgg attccaccgg tgcgggttcg 240
ggaggcaccc gtaacatctc cggcaccacc ctgtaccaca aacgtctgga agcagagctg 300
gctgaccttc atggcaagga ggctgcactc gttttttcta gcgcatacat cgcgaatgat 360
gctaccctct ctacgctccc gcaactgatt ccgggtttgg ttattgtatc cgacaaactg 420
aaccatgcga gcatgattga aggcattcgt cgtagcggta ctgagaagca catcttcaaa 480
cacaacgacc tggatgatct gcgtcgcatc ctgaccagca ttggtaagga cagaccgatt 540
ctggtcgcct ttgaaagcgt ttatagcatg gacggcgatt ttggccgtat caaagaaatc 600
tgcgatatcg cggatgaatt cggggcgctg aagtacattg acgaggtgca tgcggttgga 660
atgtatggtc cgcgcggtgg tggcgtggcc gaacgtgatg gtttaatgga ccgcattgat 720
attatcaatg gtactctggg taaagcgtac ggcgttttcg gcggctatat cgccgcgtcc 780
tccaaaatgt gtgacgcagt tcgtagttat gcaccgggtt tcattttcag cacgagcctg 840
cctccggtgg tggccgcggg tgcggcggcg tctgtacgcc atctgaaggg tgatgttgag 900
ctgcgtgaaa agcaccagac ccaagcgcgt atcctgaaga tgcgtctgaa gggcttgggt 960
ttgcccatca tcgaccacgg ttcacatatc gtgccagtgc acgtgggtga cccggtgcat 1020
tgtaaaatga ttagcgatat gctgctggag cactttggca tttatgtgca gccgatcaac 1080
tttccgacgg ttccacgtgg tacggaacgc ttgcgcttca ccccgtcgcc ggtccacgat 1140
tctggcatga tcgaccactt ggttaaagcg atggacgttc tgtggcaaca ctgcgcactg 1200
aaccgtgcag aggtggtggc ataa 1224
<210> 5
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaacccg acgcacacca ggttaaacag tttctgctca accttcagga tacgatttgt 60
cagcagctga ccgccgtcga tggcgcagaa tttgtcgaag atagttggca gcgcgaagct 120
ggcggcggcg ggcgtagtcg ggtgttgcgt aatggtggtg ttttcgaaca ggcaggcgtc 180
aacttttcgc atgtccacgg tgaggcgatg cctgcttccg ccaccgctca tcgcccggaa 240
cttgccgggc gcagtttcga ggcgatgggc gtttcactgg tagtgcatcc gcataacccg 300
tatgttccca ccagccacgc gaatgtgcgg ttttttattg ccgaaaaacc gggtgccgat 360
cccgtctggt ggtttggcgg tggcttcgac ttaaccccat tctatggttt tgaagaagat 420
gctattcact ggcatcgcac cgcccgtgac ctgtgcctgc catttggcga agacgtttat 480
ccccgttaca aaaagtggtg cgacgaatac ttctacctca aacatcgcaa cgaacagcgc 540
ggtattggcg ggctgttctt tgatgacctg aacacgccag atttcgaccg ctgttttgcc 600
tttatgcagg cggtaggcaa aggctacacc gacgcttatt taccaattgt cgagcgacgg 660
aaagcgatgg cctacggcga gcgcgagcgc aatttccagt tatatcgtcg cggtcgttat 720
gtcgagttca atctggtctg ggatcgcggc acgctgtttg gcctgcaaac tggcgggcgc 780
accgagtcta tcctgatgtc aatgccgcca ctggtacgct gggaatatga ttatcagcca 840
aaagatggca gcccagaagc ggcgttaagt gagtttatta aggtcaggga ttgggtgtaa 900
<210> 6
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcgacca taaaggatgt agcccgactg gcaggcgttt cagtcgccac cgtttcccgc 60
gtcattaata attcacccaa agccagcgaa gcttcccggc tggctgtgca tagtgcaatg 120
gagtctctta gctatcaccc gaacgccaac gcccgtgcgc tggcgcagca gaccactgaa 180
acggtcggtc tggtcgttgg tgatgtttcc gatccgtttt tcggtgcaat ggtgaaagcg 240
gtcgaacagg tggcttatca caccggtaat tttttattga ttggcaacgg ttaccacaac 300
gaacaaaaag agcgtcaggc cattgagcaa ctgatccgcc atcgctgtgc tgcgttggtc 360
gtccatgcca aaatgatccc ggatgctgat ttagcctcat taatgaaaca aatgcccggt 420
atggtgctga tcaaccgtat cctgcctggc tttgaaaacc gttgtattgc tctggacgat 480
cgttacggtg cctggctggc aacgcgtcat ttaattcagc aaggtcatac ccgcattggt 540
tatctgtgct ctaaccactc tatttctgac gccgaagatc gtctgcaagg gtattacgat 600
gcccttgctg aaagtggtat tgcggccaat gaccggctgg tgacatttgg cgaaccagac 660
gaaagcggcg gcgaacaggc aatgaccgag cttttgggac gaggaagaaa tttcactgcg 720
gtagcctgtt ataacgattc aatggcggcg ggtgcgatgg gcgttctcaa tgataatggt 780
attgatgtac cgggtgagat ttcgttaatt ggctttgatg atgtgctggt gtcacgctat 840
gtgcgtccgc gcctgaccac cgtgcgttac ccaatcgtga cgatggcgac ccaggctgcc 900
gaactggctt tggcgctggc ggataatcgc cctctcccgg aaatcactaa tgtctttagt 960
ccgacgctgg tacgtcgtca ttcagtgtca actccgtcgc tggaggcaag tcatcatgca 1020
accagcgact aa 1032
<210> 7
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60
gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120
ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180
caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240
ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300
ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360
accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420
gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480
ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540
ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600
gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660
ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720
gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780
gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840
aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900
gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960
tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020
aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080
cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140
cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200
cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260
tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320
ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380
attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440
tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500
gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560
ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620
tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680
caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740
cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800
ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa 1860
tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920
gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980
tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040
tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100
gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160
tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220
gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280
tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340
tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400
ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460
gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520
gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580
gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640
aataccggct aa 2652
<210> 8
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60
atctggggag tcacaggcga ctctctgaac ggtcttagtg acagtcttaa tcgcatgggc 120
accatcgagt ggatgtccac ccgccacgaa gaagtggcgg cctttgccgc tggcgctgaa 180
gcacaactta gcggagaact ggcggtctgc gccggatcgt gcggccccgg caacctgcac 240
ttaatcaacg gcctgttcga ttgccaccgc aatcacgttc cggtactggc gattgccgct 300
catattccct ccagcgaaat tggcagcggc tatttccagg aaacccaccc acaagagcta 360
ttccgcgaat gtagtcacta ttgcgagctg gtttccagcc cggagcagat cccacaagta 420
ctggcgattg ccatgcgcaa agcggtgctt aaccgtggcg tttcggttgt cgtgttacca 480
ggcgacgtgg cgttaaaacc tgcgccagaa ggggcaacca tgcactggta tcatgcgcca 540
caaccagtcg tgacgccgga agaagaagag ttacgcaaac tggcgcaact gctgcgttat 600
tccagcaata tcgccctgat gtgtggcagc ggctgcgcgg gggcgcataa agagttagtt 660
gagtttgccg ggaaaattaa agcgcctatt gttcatgccc tgcgcggtaa agaacatgtc 720
gaatacgata atccgtatga tgttggaatg accgggttaa tcggcttctc gtcaggtttc 780
cataccatga tgaacgccga cacgttagtg ctactcggca cgcaatttcc ctaccgcgcc 840
ttctacccga ccgatgccaa aatcattcag attgatatca acccagccag catcggcgct 900
cacagcaagg tggatatggc actggtcggc gatatcaagt cgactctgcg tgcattgctt 960
ccattggtgg aagaaaaagc cgatcgcaag tttctggata aagcgctgga agattaccgc 1020
gacgcccgca aagggctgga cgatttagct aaaccgagcg agaaagccat tcacccgcaa 1080
tatctggcgc agcaaattag tcattttgcc gccgatgacg ctattttcac ctgtgacgtt 1140
ggtacgccaa cggtgtgggc ggcacgttat ctaaaaatga acggcaagcg tcgcctgtta 1200
ggttcgttta accacggttc gatggctaac gccatgccgc aggcgctggg tgcgcaggcg 1260
acagagccag aacgtcaggt ggtcgccatg tgcggcgatg gcggttttag catgttgatg 1320
ggcgatttcc tctcagtagt gcagatgaaa ctgccagtga aaattgtcgt ctttaacaac 1380
agcgtgctgg gctttgtggc gatggagatg aaagctggtg gctatttgac tgacggcacc 1440
gaactacacg acacaaactt tgcccgcatt gccgaagcgt gcggcattac gggtatccgt 1500
gtagaaaaag cgtctgaagt tgatgaagcc ctgcaacgcg ccttctccat cgacggtccg 1560
gtgttggtgg atgtggtggt cgccaaagaa gagttagcca ttccaccgca gatcaaactc 1620
gaacaggcca aaggtttcag cctgtatatg ctgcgcgcaa tcatcagcgg acgcggtgat 1680
gaagtgatcg aactggcgaa aacaaactgg ctaaggtaa 1719
<210> 9
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgacaaagt atgcattagt cggtgatgtg ggcggcacca acgcacgtct tgctctgtgt 60
gatattgcca gtggtgaaat ctcgcaggct aagacctatt cagggcttga ttaccccagc 120
ctcgaagcgg tcattcgcgt ttatcttgaa gaacataagg tcgaggtgaa agacggctgt 180
attgccatcg cttgcccaat taccggtgac tgggtggcga tgaccaacca tacctgggcg 240
ttctcaattg ccgaaatgaa aaagaatctc ggttttagcc atctggaaat tattaacgat 300
tttaccgctg tatcgatggc gatcccgatg ctgaaaaaag agcatctgat tcagtttggt 360
ggcgcagaac cggtcgaagg taagcctatt gcggtttacg gtgccggaac ggggcttggg 420
gttgcgcatc tggtccatgt cgataagcgt tgggtaagct tgccaggcga aggcggtcac 480
gttgattttg cgccgaatag tgaagaagag gccattatcc tcgaaatatt gcgtgcggaa 540
attggtcatg tttcggcgga gcgcgtgctt tctggccctg ggctggtgaa tttgtatcgc 600
gcaattgtga aagctgacaa ccgcctgcca gaaaatctca agccaaaaga tattaccgaa 660
cgcgcgctgg ctgacagctg caccgattgc cgccgcgcat tgtcgctgtt ttgcgtcatt 720
atgggccgtt ttggcggcaa tctggcgctc aatctcggga catttggcgg cgtgtttatt 780
gcgggcggta tcgtgccgcg cttccttgag ttcttcaaag cctccggttt ccgtgccgca 840
tttgaagata aagggcgctt taaagaatat gtccatgata ttccggtgta tctcatcgtc 900
catgacaatc cgggccttct cggttccggt gcacatttac gccagacctt aggtcacatt 960
ctgtaa 966
<210> 10
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgactgaac aggcaacaac aaccgatgaa ctggctttca caaggccgta tggcgagcag 60
gagaagcaaa ttcttactgc cgaagcggta gaatttctga ctgagctggt gacgcatttt 120
acgccacaac gcaataaact tctggcagcg cgcattcagc agcagcaaga tattgataac 180
ggaacgttgc ctgattttat ttcggaaaca gcttccattc gcgatgctga ttggaaaatt 240
cgcgggattc ctgcggactt agaagaccgc cgcgtagaga taactggccc ggtagagcgc 300
aagatggtga tcaacgcgct caacgccaat gtgaaagtct ttatggccga tttcgaagat 360
tcactggcac cagactggaa caaagtgatc gacgggcaaa ttaacctgcg tgatgcggtt 420
aacggcacca tcagttacac caatgaagca ggcaaaattt accagctcaa gcccaatcca 480
gcggttttga tttgtcgggt acgcggtctg cacttgccgg aaaaacatgt cacctggcgt 540
ggtgaggcaa tccccggcag cctgtttgat tttgcgctct atttcttcca caactatcag 600
gcactgttgg caaagggcag tggtccctat ttctatctgc cgaaaaccca gtcctggcag 660
gaagcggcct ggtggagcga agtcttcagc tatgcagaag atcgctttaa tctgccgcgc 720
ggcaccatca aggcgacgtt gctgattgaa acgctgcccg ccgtgttcca gatggatgaa 780
atccttcacg cgctgcgtga ccatattgtt ggtctgaact gcggtcgttg ggattacatc 840
ttcagctata tcaaaacgtt gaaaaactat cccgatcgcg tcctgccaga cagacaggca 900
gtgacgatgg ataaaccatt cctgaatgct tactcacgcc tgttgattaa aacctgccat 960
aaacgcggtg cttttgcgat gggcggcatg gcggcgttta ttccgagcaa agatgaagag 1020
cacaataacc aggtgctcaa caaagtaaaa gcggataaat cgctggaagc caataacggt 1080
cacgatggca catggatcgc tcacccaggc cttgcggaca cggcaatggc ggtattcaac 1140
gacattctcg gctcccgtaa aaatcagctt gaagtgatgc gcgaacaaga cgcgccgatt 1200
actgccgatc agctgctggc accttgtgat ggtgaacgca ccgaagaagg tatgcgcgcc 1260
aacattcgcg tggctgtgca gtacatcgaa gcgtggatct ctggcaacgg ctgtgtgccg 1320
atttatggcc tgatggaaga tgcggcgacg gctgaaattt cccgtacctc gatctggcag 1380
tggatccatc atcaaaaaac gttgagcaat ggcaaaccgg tgaccaaagc cttgttccgc 1440
cagatgctgg gcgaagagat gaaagtcatt gccagcgaac tgggcgaaga acgtttctcc 1500
caggggcgtt ttgacgatgc cgcacgcttg atggaacaga tcaccacttc cgatgagtta 1560
attgatttcc tgaccctgcc aggctaccgc ctgttagcgt aa 1602

Claims (8)

1.一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株包含如下基因修饰：
（1）增强hemL基因的表达或/和增强hemL基因所编码的谷氨醛氨基转移酶的活性，
（2）增强hemA基因的表达或/和增强hemA基因所编码的谷氨酰胺tRNA还原酶的活性，
（3）增强eamA基因的表达或/和增强eamA基因所编码的半胱氨酸/邻乙酰丝氨外排蛋白的活性，
（4）引入或增强外源5-氨基乙酰丙酸合成酶基因hemA的表达，
（5）抑制hemF基因的表达或/和抑制hemF基因所编码的共卟啉原III氧化酶的活性，
和，
（6）抑制galR基因的表达或/和抑制galR基因所编码的半乳糖抑制子GalR的活性。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株还包含如下的基因修饰：
（1）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；或，
（1）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，和（2）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性；或，
（1）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，（2）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性，和（3）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性；或，
（1）增强ppc基因的表达或/和增强ppc基因所编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，（2）抑制poxB基因的表达或/和抑制poxB基因所编码的丙酮酸氧化酶的活性，（3）增强glk基因的表达或/和增强glk基因所编码的葡萄糖激酶的活性，和（4）抑制aceB基因的表达或/和抑制aceB基因所编码的苹果酸合酶的活性。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述大肠杆菌在基因修饰前插入T7 RNAP基因。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为BW25113或MG1655或BL21(DE3)。
5.一种5-氨基乙酰丙酸的生产方法，其特征在于，所述方法由权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌菌株合成获得5-氨基乙酰丙酸。
6.一种5-氨基乙酰丙酸的生产方法，其特征在于，所述方法以葡萄糖为底物，培养权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌菌株合成5-氨基乙酰丙酸。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述培养过程中采用的培养基为：Na2HPO4·12H2O 16.0 g/L -18.0g/L，KH2PO42.0 g/L -4.0g/L，NaCl 0.4 g/L -0.6g/L，NH4Cl 0.9 g/L -1.1g/L，MgSO4 1.5 mM -2.5mM，CaCl2 0.05 mM -0.15mM，葡萄糖9.0 g/L-11.0g/L，酵母粉1.5 g/L -2.5g/L，甘氨酸1.5 g/L -2.5g/L。
8.权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌菌株、权利要求5-7任一项所述5-氨基乙酰丙酸的生产方法在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540396A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 天津大学 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法
CN115747125A (zh) * 2022-08-07 2023-03-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌株及5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法
CN115975831A (zh) * 2022-09-29 2023-04-18 天津大学 一种高产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101041839A (zh) * 2007-04-20 2007-09-26 浙江大学 用工程菌生产5－氨基乙酰丙酸的方法
CN101063104A (zh) * 2007-04-20 2007-10-31 浙江大学 一种生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法
CN103981203A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
CN104195190A (zh) * 2014-09-04 2014-12-10 山东大学 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101041839A (zh) * 2007-04-20 2007-09-26 浙江大学 用工程菌生产5－氨基乙酰丙酸的方法
CN101063104A (zh) * 2007-04-20 2007-10-31 浙江大学 一种生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法
CN103981203A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
CN104195190A (zh) * 2014-09-04 2014-12-10 山东大学 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosynthesis,biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid;SAsaki K等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20021231;第58卷(第1期);第23-29页 *
SAsaki K等.Biosynthesis,biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid.《Appl Microbiol Biotechnol》.2002,第58卷(第1期),第23-29页. *
康振等.微生物发酵生产5-氨基乙酰丙酸研究进展.《生物工程学报》.2013,(第09期), *
微生物发酵生产5-氨基乙酰丙酸研究进展;康振等;《生物工程学报》;20130925(第09期);第1214-1222页 *

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