CN117511889B - 酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用。本发明利用来源于葡萄球菌(Staphylococcus sp.)的“ATP‑grasp domain‑containing protein”蛋白(Uniprot：A0A6P1WUE2)为模板进行改造，通过对其催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产肌肽。

Description

酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用。

背景技术

非天然氨基酸是指动物组织中不存在的、自然界稀少的或者人工合成的氨基酸，包括各种DL-型氨基酸、D-型氨基酸和稀有的L-型氨基酸。包含非天然氨基酸的多肽，为非天然氨基酸肽。例如：肌肽(L-Carnosine)由β-Alanine与Histidine缩合形成。

肌肽是一种有助于缓冲肌肉酸的分子，具有调节免疫、维持人体内分泌平衡以及滋养身体等作用。肌肽的制备方法包括化学合成法和生物法制备。

化学合成法：先用邻苯二甲酸酐保护β-丙氨酸氨基，然后利用氯化亚砜活化羧基，最后与三甲基氯硅烷保护的L-组氨酸缩合得保护的肌肽，最后再脱保护。该路线长，整体收率低且过程中容易外消旋。

生物法制备：采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸合成肌肽，该方法需要酯化的β-丙氨酸，同时由于氨肽酶反应为可逆反应，所以转化不完全，这直接导致整体收率低，最终产品分离纯化困难；此外，还有利用分离的活性微生物培养发酵，然后对发酵液进行分离纯化获得肌肽的方法，但由于产品浓度不高，且细胞培养液成分复杂，这导致最终分离纯化困难。

如前所述，迄今为止，由于肌肽生产工艺还主要以传统的化学合成为主，通常需要经过繁琐的官能团化学保护/脱保护的步骤，这直接导致该产品生产成本过高，从而大大的制约其进一步推广应用。同时，与化学合成工艺相比较，生物合成技术在成分和原料的安全性、稳定性以及产品的生物活性，还有对环境的友好性更具有优势。因此开发新的、更优的肌肽合成酶，以及利用这个酶进行肌肽的工业化生产是非常有意义的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用，特别是提供适用于肌肽合成的酶。

本发明提供的酶为SEQ ID NO:1所示蛋白的突变体：所述突变的位点包括第80位、第110位、第114位、第274位、第332位或第381位。

本发明提供的酶根据ATP-grasp酶具有广泛的连接氨基酸的活性，对来源于葡萄球菌(Staphylococcus sp.)的“ATP-grasp”蛋白(Uniprot：A0A6P1WUE2，氨基酸序列如SEQID NO:1所示)进行定点突变，最终实现了肌肽的高效合成，可运用于工业化催化制备。该酶制备方法具有多方面的优势，如制备简便、收率高、产品品质好，环境兼容性好，碳排放低，容易规模化生产等等。

一些实施例中，本发明提供的酶包括如下突变中的至少一个：

第80位的M突变为H、K、F或S

第110位的N突变为Q或S；

第114位的V突变为I；

第274位的T突变为V或I；

第332位的G突变为A；

第381位的H突变为K。

一些实施例中，所述酶的突变位点的个数为3～5个。

一些具体实施例中，所述突变体中的突变位点为：

M80H、N110Q和H381K(A0A6P1-M01，SEQ ID NO:2)；

或M80H、V114I、T274V、G332A和H381K(A0A6P1-M02，SEQ ID NO:3)；

或M80H、V114I、T274I和H381K(A0A6P1-M03，SEQ ID NO:4)；

或M80K、V114I、T274V和H381K(A0A6P1-M04，SEQ ID NO:5)；

或M80F、N110S、T274V和H381K(A0A6P1-M05，SEQ ID NO:6)；

或M80S、N110S、T274V和H381K(A0A6P1-M06，SEQ ID NO:7)；

或M80S、N110S、V114I、T274V和H381K(A0A6P1-M07，SEQ ID NO:8)；

或M80H、N110Q、V114I、T274V和H381K(A0A6P1-M08，SEQ ID NO:9)。

本发明还提供了编码本发明所述酶的核酸。

进一步的，本发明还提供了一种表达载体，其包括编码本发明所述的所述的核酸。

一些实施例中，所述表达载体的骨架载体选自pET系列载体。一些具体实施例中，所述表达载体的骨架载体为pET28a。外源片段的插入位点为NdeI和XhoI。

更进一步的，本发明还提供了宿主细胞，其基因组整合有如前所述的核酸，或者其转化或转染如前所述的表达载体。

一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。一些具体实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)。

一些具体实施例中，所述宿主细胞的构建方法包括：将构建获得的表达载体转化入宿主细胞。所述转化的方法为热激转化。

更进一步的，本发明还提供了所述酶的制备方法，包括：培养如前所述的宿主细胞，诱导所述酶的表达。

更进一步的，本发明还提供了如前所述的酶、核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物，在非天然氨基酸二肽制备中的应用。

一些实施例中，所述非天然氨基酸二肽为肌肽。即，本发明提供了如前所述的酶、核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物，在促进β-Alanine与Histidine缩合反应中的应用。从而克服了天然氨基酸连接酶仅能以L构型的氨基酸为底物的缺陷，实现了肌肽的高效合成。

更进一步的，本发明还提供了一种制备非天然氨基酸二肽的制剂，其包括：如前所述的酶、核酸，表达载体，宿主细胞或所述制备方法制得的产物。

本发明所述的制剂可以促进肌肽的合成，其中，还可以包括PPK酶和偏六磷酸。β-Alanine与Histidine缩合反应的过程中需要不断地消耗ATP，生成ADP。PPK酶可以通过偏六磷酸钠提供磷酸根基团，不断地将生成的ADP再转化为ATP，从而实现了ATP的再被利用，大大减少了ATP的需求量。本发明实施例中，反应体系中不添加PPK酶，需要158.8mM三磷酸腺苷二钠盐，而添加PPK酶，只需要大约4.9mM的ATP就可以完成反应。

一些实施例中，所述制剂中还包括ATP·Na₂、Mg²⁺和Tris。

更进一步的，本发明还提供了非天然氨基酸二肽的制备方法，本发明所述的制备方法可在体外提供适宜的酶促反应条件从而制得目标产物，也可通过生物体代谢使非天然氨基酸缩合获得目标产物。

一些实施例中，所述非天然氨基酸二肽的制备方法包括：使含有非天然氨基酸的原料，在如前所述的制剂中反应，制得非天然氨基酸二肽；

另一些实施例中，所述非天然氨基酸二肽的制备方法包括：以含有非天然氨基酸的基质，培养如前所述的宿主细胞，获得含有非天然氨基酸二肽的产物。

本发明具体实施例中，肌肽的制备方法，其包括：将β-Alanine、Histidine在如前所述的制剂中反应，获得肌肽。

更具体的，所述反应体系包括所述的酶或宿主细胞或所述制备方法制得的产物以及：

一个实施例中，所述反应体系包括：反应体系包括所述的酶或宿主细胞或所述制备方法制得的产物以及：

另一个实施例中，所述反应体系包括：反应体系包括所述的酶或宿主细胞或所述制备方法制得的产物以及：

本发明所述反应的条件包括：30～38℃，pH＝7.0～9.0，摇床反应。

本发明利用来源于葡萄球菌(Staphylococcus sp.)的“ATP-grasp domain-containing protein”蛋白(Uniprot：A0A6P1WUE2)为模板进行改造，通过对其催化活性口袋以及其他相关部位氨基酸残基进行突变，最终获得高催化活性生产肌肽。该方法大大优于化学合成制备工艺，在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是上述二肽生产的优先选项。

附图说明

图1示野生型A0A6P1及位点突变型突变酶96孔板反应2h的液相(HPLC)色谱图，从上至下依次为A0A6P1、A0A6P1-M01、A0A6P1-M02、A0A6P1-M03、A0A6P1-M04、A0A6P1-M05、A0A6P1-M06、A0A6P1-M07、A0A6P1-M08；

图2示野生型A0A6P1及位点突变型突变酶96孔板反应2h的肌肽产量结果，根据液相反应结果，确定出反应最优的突变体：A0A6P1-M08

图3示A0A6P1和A0A6P1-M08的蛋白表达胶图；

图4示连接酶突变体(A0A6P1-M08)催化合成肌肽反应4小时；

图5示实施例4反应获得产物质谱图。

具体实施方式

本发明提供了酶及其在非天然氨基酸二肽制备中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。

术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的酶。

本文术语“表达载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。

本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

酶相关信息：

本发明中氨基酸连接酶模板蛋白质是来源于葡萄球菌(Staphylococcus sp.)的“ATP-grasp domain-containing protein”蛋白(Uniprot：A0A6P1WUE2)，本专利中编号为A0A6P1；以它为模板进行改造，以下是具体突变位点信息(A0A6P1-M01；A0A6P1-M02；M03,M04,M05,M06,M07,M08)突变后的位点被标记为红色。

多聚磷酸激酶(PPK)，首次表达进行酶催化反应:来源于一种鲑鱼鱼细菌：肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的多聚磷酸激酶，(Uniprot ID:A9WPD3).

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.突变体的构建

1.1构建A0A6P1目标基因。通过基因合成目标基因A0A6P1，基因序列如SEQ ID NO:10。合成后的基因连接插入到pET28a表达载体，使用NdeI和XhoI限制性内切酶的两个位点。形成pET28a-A0A6P1原始质粒。

1.2构建突变：A0A6P1-M01，A0A6P1-M02，A0A6P1-M03，A0A6P1-M04，A0A6P1-M05，A0A6P1-M06，A0A6P1-M07，A0A6P1-M08

1.2.1突变点及突变方案：

突变名称	突变点
		A0A6P1-M01	M80H-N110Q-H381K
A0A6P1-M02	M80H-V114I-T274V-G332A-H381K
		A0A6P1-M03	M80H-V114I-T274I-H381K
A0A6P1-M04	M80K-V114I-T274V-H381K
		A0A6P1-M05	M80F-N110S-T274V-H381K
A0A6P1-M06	M80S-N110S-T274V-H381K
		A0A6P1-M07	M80S-N110S-V114I-T274V-H381K
A0A6P1-M08	M80H-N110Q-V114I-T274V-H381K

1.2.2引物设计

1.2.3分段PCR:

利用不同位点突变的引物，进行分段PCR，构建出含有目标突变的基因片段。以M01，M02为例：

PCR反应体系：

按照如下配方进行反应体系配置：

primer PF(10uM)	1ul
		primer PR(10uM)	1ul
Template(A0A6P1)	0.5ul(20ng/ul)
		5X Q5 reaction Buffer	5ul
10mM dNTP	0.5ul
		Q5 polymerase	0.3ul
ddH2O	up to 25ul

PCR上机体系：

按照如下程序在PCR仪进行扩增：

PCR结束下机，PCR产物跑凝胶电泳，PCR阳性的产物，做胶回收纯化。

1.2.4融合PCR:

将构建好的基因片段，进行融合构建，获得完整的目的基因片段。

PCR反应体系：

按照如下配方进行反应体系配置：

primer PF(10uM)	1ul
		primer PR(10uM)	1ul
Template(分段PCR回收片段)	0.5ul/each
		5X Q5 reaction Buffer	5ul
10mM dNTP	0.5ul
		Q5 polymerase	0.3ul
ddH2O	up to 25ul

PCR上机体系：

按照如下程序在PCR仪进行扩增：

PCR结束下机，PCR产物跑凝胶电泳，PCR阳性的产物，做胶回收纯化。

1.2.5同源重组：

pET28a表达载体，NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切，获得载体骨架，再与构建好的目标基因片段进行重组融合：

按照如下配方进行反应体系配置：

融合PCR片段(100ng/ul)	1ul
		Pet28a双酶切载体(50ng/ul)	1ul
2x seamless cloning Mix	2ul

反应条件：50℃反应30min，在PCR仪上进行反应

1.2.6转化：

同源重组产物取4ul产物，转入40ul BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激45s，冰浴2-3min，加入500ul SOC，摇床培养1.5小时，离心全涂平板，37℃培养箱过夜培养12-16小时。

实施例2. 96孔板反应筛选

2.1反应条件和筛选过程：孔板设计，反应液成分，

2.1.1细胞破碎

按照下表配置20mL溶菌酶溶液：

试剂	浓度	用量
			溶菌酶	/	20mg
Tris-HCl	10mM,pH 8.0	19.8mL
			DnaseⅠ	2000U/mL	2.5μL
MgCl2	1M	0.2mL

从-20℃冰箱取出培养好的只含有菌体的96孔板，每孔加入100μL溶菌酶溶液，充分吹打悬浮菌体后进行菌体破碎，破碎条件为37℃，800rpm，2h。

2.1.2肌肽反应

按照下表配制20mL 2x反应液：

试剂	反应浓度/mM	母液浓度/mM	理论量/g
				β-Ala	60	120	0.2138
L-His	50	100	0.3103
				ATP·2Na	50	100	1.1023
MgCl2	50	100	0.1906
				Tris	50	100	0.2423
H2O	/	/	Up to 20mL

称取上述试剂完全溶于15mL水中,添加4M NaOH调节pH至9.0，后定容至20mL。每孔中添加200μL 2x反应液+100μL H₂O，吹打混匀，置于摇床38℃，800rpm，反应2h。

2.2筛选过程：

每孔分别吸取100μL上清于96孔板中，按照稀释10倍添加900μL 60％乙腈进行反应淬灭，37℃，1000rpm振荡10min，4000rpm 10min离心。取上清用0.45um过滤头过滤后进行液相检测。

2.3反应结果：

2.3.1液相反应结果如图1，肌肽产量如图2。野生型在相应位置不出峰，反应最优的突变体为A0A6P1-M08。

实施例3：酶的发酵生产

所需的酶都是通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养和单克隆筛选，以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm,20min)获得酶过量表达湿细胞25-50g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达(tu 3)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

实施例4：利用连接酶突变体(A0A6P1-M08)进行酶催化反应制备肌肽(L-carnosine)

4.1将菌体与Tris.HCl缓冲液(50mM,pH 8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞:200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在500～1000U/ml,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。

4.2在3L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM),14.7克β-丙氨酸(165mM),87.5克三磷酸腺苷二钠盐(ATP-Na₂,158.8mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值调节到8.0-8.5后，加入连接酶A0A6P1-M08粗酶液启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0-9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。HPLC液相检测反应，见图4。然后用HCl水溶液调节pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液pH调至7.0后，直接上样D201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水＝2:1,v:v)得31.8克白色肌肽固体(收率94％)。经送样质谱确认产物为肌肽。质谱结果图见图5.

实施例5：利用连接酶(A0A6P1-M08)及ATP再生系统制备肌肽(L-Carnosine)

同样在3L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入23.2克L-组氨酸(150mM),14.7克L-丙氨酸(165mM),2.7克三磷酸腺苷二钠盐(ATP-Na₂,4.9mM)，33.6克偏六磷酸钠(55mM),调节溶液pH值到7.5后加入多聚磷酸激酶PPK酶2000U、连接酶A0A6P1-M08粗酶液，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0-8.5之间，3小时后通过HPLC检测到组氨酸基本反应完全。然后用HCl水溶液调节pH到2.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去蛋白固体，再将反应溶液pH调至7.0后，直接上样D201阴离子交换树脂纯化柱，去除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水,2:1,v:v)得32.2克白色肌肽(收率95％)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.酶，其氨基序列如SEQ ID NO:2~9中任一项所示。

2.编码权利要求1所述的酶的核酸。

3.表达载体，其包括权利要求2所述的核酸。

4.宿主细胞，其基因组整合有权利要求2所述的核酸，或者其转化或转染权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述的酶的制备方法，包括：培养权利要求4所述的宿主细胞，诱导所述酶的表达。

6.权利要求1所述的酶、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的宿主细胞或权利要求5所述制备方法制得的产物在肌肽制备中的应用。

7.一种制备肌肽的制剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的酶、权利要求4所述的宿主细胞或权利要求5所述制备方法制得的产物。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，还包括PPK酶和六偏磷酸。

9.根据权利要求7或8所述的制剂，其特征在于，还包括ATP·Na₂、Mg²⁺和Tris。

10.肌肽的制备方法，其特征在于，包括：将β-Alanine、Histidine在权利要求7~9任一项所述的制剂中反应，获得肌肽。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1~4任一项所述的酶或权利要求4所述的宿主细胞或权利要求5所述制备方法制得的产物以及：

β-Alanine 130~170 mmol/L；

Histidine 150~180 mmol/L；

ATP·Na₂ 4.9~158.8 mmol/L；

Mg²⁺ 5~180 mmol/L；

Tris 150~180 mmol/L；

六偏磷酸钠 0~55 mmol/L；

PPK酶 0~2000U。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述反应的条件包括：30~38℃，pH=7.0~9.0，摇床反应。