CN112574970A - 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用。所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第59位、第119位或第149位中的任意一个或至少两个氨基酸经取代获得的氨基酸序列，且其具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的活性。本发明中对烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的位点进行筛选，定点突变其中与催化相关的位点，获得了酶活较高的突变体，能够提升烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产量，降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产成本。

Description

一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，尤其涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，氧化型(NAD+)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，通过各种脱氨酶，从底物中接受一个氢原子和一个电子，变成还原型(NADH)，在340nm处有最大吸收。
研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。此外，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与疾病的发生密切相关。
目前，工业中大量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)产品主要为从酵母中提取分离获得。该过程虽然工艺成熟，但是耗费能源和材料巨大，产品昂贵，限制了的生产和其后续应用过程中的开发。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)也可通过酶催化制备。例如，CN102605026A公开了一种氧化型辅酶I(即NAD+)的制备方法，使烟酰胺核甘(NR)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP-Na2)在pH为5.0～8.0的缓冲液中，在烟酰胺核甘激酶(NRK)的催化作用下以及二价金属离子存在下，在温度30～40℃下反应得到(NAD+)；或者，以烟酰胺单核苷酸(NMN)为起点，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide Mononucleotide Adenylyltransferase，NMNATs，EC2.7.7.1)催化NMN的腺苷化合成NAD+，而使用的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶粗提取物中存在大量降解ATP和烟酰胺单核苷酸的酶，令昂贵的前体ATP和烟酰胺单核苷酸大量消耗，从而增加NAD的生产成本。其反应过程可以由式I表示：
Figure BDA0002852881820000021
因此，提供一种催化效率较高的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶对于提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产量，降低生产成本具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNATs)突变体及其应用。对野生型NMNATs的位点进行筛选，定点突变其中一个或多个位点与催化相关的位点，提高野生型NMNATs的酶活，提升烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的产量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的第59位、第119位或第149位中的任意一个或至少两个氨基酸经取代获得的氨基酸序列。
其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的活性。
本发明中提供的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体来源于海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)的NMNATs，所述NMNATs的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码其的核苷酸序列可以如SEQ ID No.2所示。
其中，SEQ ID NO.1为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKTLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELYNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVKVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
SEQ ID NO.2为：
ATGCGCGCGTTTCTGATTGGCCGCTGGCAGCCGTTTCATAAAGGCCATCTGGAAATTATTAAAAAAATTAGCGCGGAAGTGGATGAAATTATTGTGGGCATTGGCAGCTGCCAGAAAAGCCATACCCTGACCGATCCGTTTACCGCGGGCGAACGCATGATGATGATTACCAAAACCCTGGAAAACTATGATATTAACTATTATGCGATTCCGATTATTGATATTGATTATAACGCGGTGTGGGTGAGCAGCGTGGAAAGCCTGACCCCGCCGTTTACCACCATTTATACCGGCAACAGCCTGGTGCGCGAACTGTTTAGCGAACGCAACTATGTGGTGAAAAAACCGGAACTGTATAACCGCACCGATTATAGCGGCACCAAAATTCGCAAAAAAATGCTGGATGGCAGCGCGTGGGAACATCTGGTGCCGGAAGAAGTGGTGAAAGTGATTGAAGAAATTGATGGCATTAACCGCATTCGCCGCCTGAGCGAAAAAGATTATGATGAAGAATAA。
作为本发明优选的技术方案，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的突变位点为T59S、Y119F、K149R中的任意一个或至少两个的组合。
优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有如SEQ ID NO.3～9中任一项所示的氨基酸序列。
本发明中，将第59位苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，第119位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)或第149位赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，能够明显提高烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体与底物的结合能力，提升其酶活。本发明中提供的突变体包括NMNATs T59S、NMNATsY119F、NMNATs K149R、NMNATs T59S/Y119F、NMNATs T59S/K149R、NMNATs Y119F/K149R、NMNATs T59S/Y119F/K149R。其中，单点突变后得到的突变体的相对酶活较野生型的酶活提升185～320％，双点突变后提升450～670％，三点同时突变后，酶活上升最为明显，较野生型提升了985％。
其中，NMNATs T59S(SEQ ID NO.3)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKSLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELYNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVKVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs Y119F(SEQ ID NO.4)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKTLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELFNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVKVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs K149R(SEQ ID NO.5)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKTLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELYNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVRVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs T59S/Y119F(SEQ ID NO.6)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKSLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELFNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVKVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs T59S/K149R(SEQ ID NO.7)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKSLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELYNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVRVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs Y119F/K149R(SEQ ID NO.8)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKTLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELFNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVRVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
NMNATs T59S/Y119F/K149R(SEQ ID NO.9)为：
MRAFLIGRWQPFHKGHLEIIKKISAEVDEIIVGIGSCQKSHTLTDPFTAGERMMMITKSLENYDINYYAIPIIDIDYNAVWVSSVESLTPPFTTIYTGNSLVRELFSERNYVVKKPELFNRTDYSGTKIRKKMLDGSAWEHLVPEEVVRVIEEIDGINRIRRLSEKDYDEE；
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的方法，包括如下步骤：
以编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列为模板，加入点突变引物对，扩增，测序，得到所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。
作为本发明优选的技术方案，突变位点T59S所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
优选地，突变位点Y119F所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQID NO.13所示。
优选地，突变位点K149R所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14和SEQID NO.15所示。
NMNATs突变体可通过定向进化的技术进行构建，例如易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维机构模拟等定向进行技术，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟NMNATs的三维机构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行定点突变，从而筛选出活性有显著提高的突变体。
本发明通过三维结构模拟技术预测出可能与催化和底物结合相关的位点为第T59位，第Y119位，第K149位。
以NMNATs-pET29a(+)重组质粒为模板，对T59位，Y119位，K149位这三个位点进行定点突变。其中，所用的扩增引物如下表1所示：
表1
Figure BDA0002852881820000061
Figure BDA0002852881820000071
作为本发明优选的技术方案，所述模板包括重组质粒。
优选地，所述DNA聚合酶包括FAST pfu fly聚合酶。
优选地，所述扩增中退火温度为55～60℃，例如可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等。
本发明中，直接以含有野生型NMNAT的质粒作为扩增模板进行扩增，所述扩增的程序按照DNA聚合酶的使用说明进行。本发明中所述延伸的时间根据质粒的长度确定，一般延伸的速度为1kb/min，共需要6～8min。
例如，本发明中所用的扩增程序为：
①95℃预变性5min，②95℃变性20s，③55℃退火20s，④72℃延伸6～8min(1kb/min)②～④重复20～30个循环，⑤72℃终延伸15min，⑥12℃保持。
本发明中，所得突变体及其重组宿主细胞的培养和筛选方法如下：
(1)获得突变体之后，将所得的质粒转化至宿主细胞中，涂布于含有抗生素的固体培养基上，倒置培养过夜，随后从平板上挑取克隆置于96孔板中进行培养；
(2)过夜培养的菌液再转接于含有新鲜培养基的96孔板中，37℃，220rpm振荡培养一段时间后，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，25℃培养过夜；
(3)离心收集菌体，然后重悬于缓冲液中，超声破碎，4℃离心后取上清冷冻干燥，即得酶干粉进行筛选反应；
(4)将5～10mM烟酰胺单核苷酸(NMN)、5～15mM的三磷酸腺苷二钠(ATP)、80～200mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10～20mM MgCl2混合，调pH至7.5，加入步骤(3)所得的酶干粉，25℃水浴反应20小时后取样进行HPLC检测；
(5)针对上述检测结果选出对应的突变体，结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆位点含有的突变位点如下：
第T59位的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，第Y119位的酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)，K149位的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)。同时，当将上述3个位点的突变两两联合突变或三个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。
第三方面，本发明提供一种编码如第一方面所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第三方面所述的核苷酸序列。
优选地，所述表达载体包括pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的核苷酸序列或如第四方面所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕氏酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
目前已知基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞之后，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，NMNATs酶及其突变体表达的载体可以为pET、pCW、pUC或pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌，枯草芽孢杆菌等。
本发明中，含有NMNATs突变体的表达载体可以使用大肠杆菌进行表达，所使用的大肠杆菌发酵培养基可以是以植物源蛋白胨作为氮源的发酵培养基，例如所述大肠杆菌发酵培养基包括：植物源蛋白胨20～50g/L、碳源20～50g/L、磷酸盐10～25g/L、钠盐5～10g/L和镁盐0.1～1g/L；在该培养基中，能够实现大肠杆菌的高密度培养，且蛋白表达量较高，与动物源培养基在同一表达水平，且无潜在的病毒污染风险。
第六方面，本发明提供一种利用如第五方面所述的宿主细胞制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，所述方法包括：
培养所述宿主细胞，诱导，收集菌体后破碎，取上清，得到含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的酶干粉；
将NMN、ATP、缓冲液、Mg2+和所述酶干粉混合，得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、如第三方面所述的核苷酸序列、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞在催化合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种催化合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、其编码基因、包含其的表达载体、宿主细胞及其应用。通过对海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)的NMNATs序列进行定点突变，形成突变体NMNATs T59S、NMNATs Y119F、NMNATs K149R、NMNATs T59S/Y119F、NMNATs T59S/K149R、NMNATs Y119F/K149R、NMNATs T59S/Y119F/K149R，所述突变体均具有高催化活性，其中单点突变后得到的突变体的相对酶活较野生型的酶活提升185～320％，双点突变后提升450～670％，三点同时突变后，酶活上升最为明显，较野生型提升了985％；
(2)本发明提供了所述突变体的制备方法和使用方法，所述突变体的纯化方法也较为简单，降低了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产成本，所得突变体将烟酰胺单核苷酸转化为NAD+的转化率大于90％，同时，经离子交换树脂分离和冻干后，纯化得到NAD+的纯度大于99％，大大提高了产品的竞争力。
附图说明
图1为实施例1中重组质粒NMNATs-pET 29a(+)的结构示意图。
图2为突变体NMNATs T59S的蛋白凝胶电泳图，其中泳道M表示蛋白Marker，泳道1表示上清液。
图3为应用例中通过突变体NMNATs T59S/Y119F/K149R冻干粉催化反应后得到的上清液的高效液相色谱检测结果图。
图4为应用例中通过突变体NMNATs T59S/Y119F/K149R冻干粉催化反应后得到的产物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商，并且，未注明具体条件的试验方法，按本领域技术人员熟知的试验方法进行。
实施例1
本实施例中提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其制备方法。具体步骤包括：
(1)表达载体的构建
将全基因合成的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶片段NMNATs(序列如SEQ ID NO.1所示，由常州基宇生物技术有限公司合成)，经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ(购自New EnglandBiolabs公司)酶切后重组到载体pET 29a(+)，转化到E.coli Top10感受态(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NMNATs-pET 29a(+)，如图1所示。
(2)突变体的构建及筛选
以NMNATs-pET29a(+)重组质粒为模板，对T59位，Y119位，K149位这三个位点进行定点突变。
其中第T59突变正向引物(SEQ ID NO.10)：
GATGATGATTACCAAAAGCCTGGAAAACTATGATATTAAC；
第T59突变反向引物(SEQ ID NO.11)：
GTTAATATCATAGTTTTCCAGGCTTTTGGTAATCATCATC；
以含有该表达载体的BL21(DE3)菌液作为扩增模板，DNA聚合酶采用FAST pfufly，扩增程序按照DNA聚合酶的使用说明进行，实现整个质粒的扩增。其中，扩增程序如下表2所示：
表2
Figure BDA0002852881820000121
在扩增产物中加入1μL DpnI酶消化模板2h，只剩下扩增出来的非甲基化质粒，转化到DH5α感受态细胞，涂板过夜，挑单菌落培养，测序后证实突变成功，得到了烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体NMNATs T59S。
实施例2～7
利用与实施例1中记载的相同的方法制备烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体NMNATs Y119F(实施例2)、NMNATs K149R(实施例3)、NMNATs T59S/Y119F(实施例4)、NMNATsT59S/K149R(实施例5)、NMNATs Y119F/K149R(实施例6)、NMNATs T59S/Y119F/K149R(实施例7)。
其中，第Y119突变正向引物(SEQ ID NO.12)为：
GAAAAAACCGGAACTGTTTAACCGCACCGATTATAG，
第Y119突变反向引物(SEQ ID NO.13)为：
CTATAATCGGTGCGGTTAAACAGTTCCGGTTTTTTC，
第K149突变正向引物(SEQ ID NO.14)为：
CCGGAAGAAGTGGTGAGAGTGATTGAAGAAATTG，
第K149突变反向引物(SEQ ID NO.15)为：
CAATTTCTTCAATCACTCTCACCACTTCTTCCGG.
对比例1
本对比例中以野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NMNATs作为对比。
对比例2
本对比例中构建烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体T59A，突变所用的引物按本领域常规的方法进行设计，构建方法与实施例1中保持一致。
对比例3
本对比例中构建烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体Y119A，突变所用的引物按本领域常规的方法进行设计，构建方法与实施例1中保持一致。
对比例4
本对比例中构建烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体K149A，突变所用的引物按本领域常规的方法进行设计，构建方法与实施例1中保持一致。
应用例1
本应用例中，分别对实施例1～7和对比例1～4中所述的含有突变体的菌株进行培养，具体步骤如下：
(1)将上述突变得到的质粒转化至BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；
(2)随后从平板上挑取克隆置于96孔板中进行培养，过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中；
(3)37℃，220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，25℃培养过夜；
(4)4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，然后重悬于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(20 0w，3s/5s，20min)，4℃、12000rpm离心20min，取小部分上清用于蛋白凝胶电泳，剩余上清冷冻干燥，即得酶干粉；
其中，实施例1中所述突变体NMNATs T59S的蛋白凝胶电泳图如图2所示，其中，泳道M表示蛋白Marker，泳道1表示表达突变体NMNATs T59S的上清液的蛋白条带，由图可知，突变体NMNATs T59S在大肠杆菌中大量表达；
(5)5mM烟酰胺单核苷酸(NMN)、10mM的三磷酸腺苷二钠(ATP)、100mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10mM MgCl2，调pH至7.5；
加入上述制备的酶干粉，水浴25℃反应20小时取样进行HPLC检测；经计算其相对酶活如下表3所示：
表3
Figure BDA0002852881820000141
Figure BDA0002852881820000151
结果显示，单点突变后得到的突变体的相对酶活较野生型的酶活提升185～320％，双点突变后提升450～670％，三点同时突变后，酶活上升最为明显，较野生型提升了985％。
同时，本应用例中还将5mM NMN、10mM ATP、100mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10mM MgCl2混合，调pH至7.5，加入实施例7中制备的突变体NMNATs T59S/Y119F/K149R冻干粉；
水浴25℃反应20小时，离心(4℃，10000g，10min)并收集上清液；
通过高效液相色谱测定所得上清液中的NAD+的含量，所得检测结果如图3所示，由图可知，在16.738min得到明显峰值，峰面积为99.737％；此外，通过核磁共振氢谱确定所得产物的结构，所得核磁共振氢谱图如图4所示；结合图3和图4可知，本应用例中通过实施例7中通过的突变体NMNATs T59S/Y119F/K149R冻干粉能够制备得到纯度较高的NAD+。
综上所述，本发明通过三维结构模拟技术预测出可能与催化和底物结合相关的位点为第T59位，第Y119位，第K149位，并将其突变为特定的氨基酸后获得的突变体具有较好的酶活性能，能够明显提升烟酰胺单核苷酸的转化率，提高NAD+的产量。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏诚信药业有限公司
<120> 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用
<130> 20201216
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Claims (10)

1.一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第59位、第119位或第149位中的任意一个或至少两个氨基酸经取代后获得的氨基酸序列；
其中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的活性。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的突变位点为T59S、Y119F、K149R中的任意一个或至少两个的组合；
优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体具有如SEQ ID NO.3～9中任一项所示的氨基酸序列。
3.一种制备如权利要求1或2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列为模板，加入点突变引物对，扩增，测序，得到所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，突变位点T59S所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
优选地，突变位点Y119F所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；
优选地，突变位点K149R所用的点突变引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15所示。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述模板包括重组质粒；
优选地，所述DNA聚合酶包括FAST pfu fly聚合酶；
优选地，所述扩增中退火温度为55～60℃。
6.一种编码如权利要求1或2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的核苷酸序列。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含至少一个拷贝的如权利要求6所述的核苷酸序列；
优选地，所述表达载体包括pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的核苷酸序列或如权利要求7所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕氏酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种利用如权利要求8所述的宿主细胞制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
培养所述宿主细胞，诱导，收集菌体后破碎，取上清，得到含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的酶干粉；
将烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷二钠、缓冲液、Mg2+和所述酶干粉混合，得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
10.如权利要求1或2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体、如权利要求6所述的核苷酸序列、如权利要求7所述的表达载体或如权利要求8所述的宿主细胞在催化合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106080A (zh) * 2021-03-31 2021-07-13 深圳希吉亚生物技术有限公司 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
CN114426959A (zh) * 2022-01-20 2022-05-03 郑州大学 一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶突变体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718915A (zh) * 2020-06-16 2020-09-29 仙居两山生物科技有限公司 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、包含该突变体的重组表达载体和重组菌及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718915A (zh) * 2020-06-16 2020-09-29 仙居两山生物科技有限公司 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、包含该突变体的重组表达载体和重组菌及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
匿名: ""NCBI Reference Sequence: WP_181492802.1"", 《GENBANK》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106080A (zh) * 2021-03-31 2021-07-13 深圳希吉亚生物技术有限公司 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
CN113106080B (zh) * 2021-03-31 2022-02-25 深圳希吉亚生物技术有限公司 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
CN114426959A (zh) * 2022-01-20 2022-05-03 郑州大学 一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶突变体及其应用

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