CN106754447A

CN106754447A - 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用

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Publication number: CN106754447A
Application number: CN201611254240.XA
Authority: CN
Inventors: 袁文杰; 李益民; 范超; 吴文忠
Original assignee: DALIAN INNOBIOACTIVES Co Ltd
Current assignee: DALIAN INNOBIOACTIVES Co Ltd; Innobio Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106754447B

Abstract

本发明公开了一种重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用。所述的重组酿酒酵母含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因。本发明进一步公开含有该基因的重组载体及重组酿酒酵母以及利用其进行生物转化合成丙谷二肽的方法。并发现酵母细胞经过多次循环利用后仍具有较高的催化活性，具有明显的产业化优势。本发明所述方法和应用，具有原材料廉价易得、操作简便易控、合成途径绿色高效、生物安全性好、反应速率快、转化率高等优势，为丙谷二肽的工业化生产奠定了基础。

Description

重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用

技术领域

本发明涉及一种简洁、高效的丙谷二肽微生物合成方法，尤其涉及应用重组基因工程酵母菌生物转化合成丙谷二肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

丙谷二肽(L-Ala-Gln)在医疗保健等领域具有巨大的应用价值，其更高的溶解度以及良好的热稳定性，已逐渐替代谷氨酰胺(L-Gln)成为主要的肠外营养用药。然而，已知的丙谷二肽合成方法主要有化学合成法和化学加生物酶催化法。化学合成法生产丙谷二肽的过程中一般需要引入和去除保护基团，存在反应步骤多、副产物多、试剂毒性大且非环境友好等问题[中国专利,含L-谷氨酰胺二肽的合成方法,CN1651456；唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成与反应研究.厦门大学,2004；中国专利,丙－谷二肽合成方法,CN1164611C]。由于化学合成法的不足，国内外研究者尝试在化学法基础上添加生物酶如木瓜蛋白酶和青霉素G合成丙谷二肽(于清新.丙谷二肽的酶促合成研究.天津大学，2010.)。以L-丙氨酸甲酯盐酸盐为起始物，通过引入保护基、催化合成肽键、脱保护基三步合成L-Ala-Gln。具体操作中利用木瓜蛋白酶的酰基转移作用催化Phac-L-Ala-OMe和L-Gln合成肽键，再利用青霉素G酰化酶将保护基脱除得到目标产物L-Ala-Gln。虽然其合成步骤有所简化、污染较少，但也存在用酶量大，肽生产率低且仅能催化部分较高疏水性氨基酸等弊端。

近年来，国外研究人员从枯草杆菌中获得了一种氨基酸连接酶(Lal)，能够以无保护的氨基酸作为底物合成二肽[Tabata K,Ikeda H,Hashimoto S.ywfE in Bacillussubtilis codes for a novel enzyme,l-amino acid ligase[J].Journal ofbacteriology,2005,187(15):5195-5202.新的生成肽的酶、生成该酶的微生物和利用它们合成二肽的方法，CN1671840A，日本，2005.DIPEPTIDE PRODUCTION METHOD，United StatesPatent,2006]。但该连接酶属于ATP依赖酶，需要外源提供ATP，使得二肽的生产成本仍然较高，无法在市场大范围推广使用[Tabata K,Hashimoto S.Fermentative production ofL-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strainexpressing L-amino acidα-ligase.Applied and environmental microbiology,2007,73(20):6378-6385.]。

CN105274174A和CN104480075A公开了两种利用生物酶催化生成丙谷二肽的方法，其分别采用生物酶缓冲液或生物酶冻干粉催化底物转化为丙谷二肽，但存在酶分离纯化成本高，酶活低，且难于回收利用，因此限制了其工业化应用的可能。

CN104480172A公开了一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其利用重组大肠杆菌实现L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产，省去了酶分离纯化的成本，提高了经济效益。但由于表达的转酯酶位于大肠杆菌胞内，存在较大的底物和产物的跨膜阻力，导致丙谷二肽的产量极低，仅为0.49g/L，且反应时间长，远远无法满足工业化需求。为减少底物进入细胞及产物扩散到胞外的阻力，有文献报道使用化学试剂对重组大肠杆菌进行处理，一定程度上降低了底物的跨膜阻力(Appl.Environ.Microbiol.2007:6378–6385)，或者增加催化反应体系中的细胞密度来提高反应速率，但反应时间仍然较长，生产效率低(Biosci,Biotechnol,Biochem.2013,77:618-628)。同时，丙谷二肽主要在医疗保健等领域，使用大肠杆菌进行丙谷二肽的合成，可能带来内毒素污染等生物安全性方面问题，难以在产业化生产中应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一套完整的生物转化生产丙谷二肽的技术方案。从寻找优异的编码丙谷二肽合成酶的外源性基因开始，并期望通过基因工程的方法构建重组工程菌，并据其设计合理的生物发酵工程方案，以实现丙谷二肽绿色、高效、低成本的工业化生产。

为实现上述目的，本发明首先提供一种重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因。

另一方面，本发明也旨在提供上述重组酿酒酵母的制备方法，所述方法是将来源于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因克隆后连接至表达载体，然后将所构建的重组载体转入作为表达宿主的酿酒酵母细胞。

上述方法所制备的重组酿酒酵母可以作为全细胞催化剂高效、快速地将底物转化为丙谷二肽，并且不需要酶的分离纯化的步骤。基于此，本发明再一方面的目的还在于提供一种丙谷二肽的生物合成方法，该方法中包括使用上述本发明的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。

本发明基于新发现的转酯酶基因，成功构建重组酿酒酵母细胞，使其作为全细胞催化剂将底物转化为丙谷二肽，省去了酶的分离纯化，避免了内毒素的隐患及抗生素的使用，具有摩尔转化率高、生产速率快、菌体可多次循环利用等特点，是实现高效、环保、经济化生产丙谷二肽的良好选择。并且可以通过循环利用的工艺过程，有望降低工业化生产成本，解决酶回收难、利用率低且酶活不稳定等问题。

附图说明

本发明附图6幅，其中：

图1为酵母重组表达载体结构示意图。

图2为重组酵母细胞表面展示生物酶的荧光和激光共聚焦验证图。

图3为不同底物浓度对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响。

图4为酵母全细胞催化合成丙谷二肽的相对酶活性随反应温度变化图。

图5为酵母全细胞催化合成丙谷二肽的相对酶活性随反应pH变化图。

图6为酵母全细胞的相对酶活性随循环利用次数变化图。

具体实施方式

在现有技术的基础上，本发明首先确认获得了一段编码丙谷二肽生物合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因的供体为鞘氨醇杆菌属(Sphingobacteriumsp.)。

SEQ ID NO.1的基因序列编码的一段氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该氨基酸序列由619个氨基酸组成。与据所知最为接近的现有技术(ZL03817916.4)相比，有3个氨基酸发生改变：188位氨基酸由Y(酪氨酸)变为F(苯丙氨酸)，两者均属于芳香族氨基酸，由不带电荷的极性R基氨基酸转变为了非极性R基氨基酸；546/547位氨基酸：由AP(丙氨酸/脯氨酸)变为PS(脯氨酸/丝氨酸)，是由中性氨基酸/杂环氨基酸向杂环氨基酸/含羟基氨基酸的转变，同时也由非极性R基氨基酸变为了不带电荷的极性R基氨基酸。进一步酶功能域分析结果显示：转酯酶主要有两个功能域，分别为：Peptidase S15(44-331)和PepX_C(382-613)。其中，Peptidase S15(44-331)域，属于X-Pro dipeptidyl-peptidase(S15family)，是潜在的转酯酶关键催化中心域；而PepX_C(382-613)域，则属于C端非催化域，但与二肽基肽酶(S9B蛋白家族的丝氨酸肽链外切酶)存在许多相似的结构。虽然对其生理功能的研究需进一步深入，但从现有技术中可以获得两个信息：蛋白质二聚化是酶具有催化活性所必需的；酶的糖基化可影响其生理功能。本发明中SEQ ID NO.2氨基酸序列中188位氨基酸突变可能改变了酶的催化功能域；而546/547位氨基酸突变可能对蛋白质二聚化产生改变，并且通过以上两点，大大改变了所述酶的催化活性。

在确定上述生物酶基因的信息之后，本发明进一步扩增和保存质粒。具体地，使用大肠杆菌E.coli DH5α扩增和保存质粒。

在此基础上，将目的基因和表达载体酶切后，经重组构建重组载体，优选的载体是pYD1。然后，将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，具体方法可举例但不限于热击法。继而利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证上述步骤所获得的转化子，保存于斜面培养基。为了获得所需的重组酵母细胞，需继续提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子。将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝0.5～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酵母细胞。原则来讲，上述酿酒酵母感受态细胞包括所有根据现有技术可作为转化宿主的酿酒酵母感受态细胞。本发明具体实施方式中，所述的表达宿主是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。选择该宿主的突出原因之一，是可以利用酵母细胞表面展示技术，使转酯酶蛋白与酵母细胞壁蛋白融合，以天然构象的形式锚定在细胞表面，相当于酶的固定化。同其余的宿主表达相比，展示酶制备简单，省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤，有助于降低酶制剂生产成本。与胞内酶相比，展示酶无底物及产物的跨膜阻力，并且不存在胞内水解酶对催化产物丙谷二肽的降解作用。

如无特殊说明，本发明中所述及的斜面培养基照此制备：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，121℃灭菌15min，冷却后加入终浓度为10～100μg/mL的氨苄青霉素。

所述的种子培养基照此制备：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，如为制备固体培养基加入3.0g/L的琼脂粉，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；

所述的诱导培养基照此制备：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；

上述种子及诱导培养基的制备中所述及的氨基酸混合液中含有如下组分：精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、异亮氨酸0.3g/L、赖氨酸0.3g/L、缬氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。

在此基础上，本发明进一步提供一种丙谷二肽的生物合成方法，该方法在于使用上述本发明的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。

丙谷二肽的生物合成是一项相对成熟的技术，其底物按照现有技术可描述为包括羧基组分和胺组分的底物，本发明中，所述的羧基组分选自氨基酸酯和氨基酸酰氨，最优选L-丙氨酸甲酯氢氯化物；所述的胺组分选自氨基酸、C-保护的氨基酸和胺，优选L-谷氨酰胺。反应体系中的底物浓度按照反应物的比例反应关系设置最有利于生产。反应底物浓度无上下限设置。但最高反应物浓度在一定程度上决定于反应底物在体系中的溶解度，并且随着反应底物浓度的增加，对转化存在一定程度的抑制。本发明的具体实施方式中，谷氨酰胺的溶解度最高约250mM，但我们在生产中可以按照高于此的标准设定反应物投料量，比如用到的600mM，此时原始的反应体系中已经有部分是不溶的固体状态，但随反应进行，可逐步溶解，并不影响转化反应的进行。因此，该投料方法一方面保证反应的顺利进行，另一方面降低操作成本。作为可实施的操作方式，本发明中，所述的羧基组分和胺组分在初始反应体系中的浓度可设置为100～600mM。

另一方面，本发明所述的合成丙谷二肽的方法中，转化反应体系pH是6.0～10.0，优选8.0～9.0。所述的转化反应的温度是10～40℃，优选18～25℃，最优选20～25℃。

再一方面，本发明所述的合成丙谷二肽的方法中，所述的转化反应体系中重组酿酒酵母用量是OD₆₂₀＝0.5～5.0。

根据优化的结果，上述本发明的丙谷二肽的生物合成方法的较为具体的实施方式之一，可以描述为包括下述操作步骤的方法：

(1)将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)溶于溶剂体系中，并调节pH为8.0～9.0；

(2)将重组酿酒酵母加入步骤(1)所得的体系中进行反应，反应温度10～40℃，反应体系pH值为8.0～9.0；

(3)以pH值不再降低作为反应达到终点的标志，收集反应液分离菌体以终止反应。

该具体实施方式中，本发明所述的丙谷二肽的生物合成路径可简单描述为：

上述方法描述中，一方面，步骤(1)中所述的缓冲溶液可以由本领域技术人员根据现有技术确定，该溶剂体系可以是水、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。步骤(1)中优选使用碱液调节体系pH为8.0～9.0。另一方面，步骤(2)中所述及的反应温度优选18～25℃，最优选20～25℃。当然，允许的测量或控制误差所导致的一定范围内的温度波动也是可以接受的；该步骤反应体系的pH值仍然优选8.0～9.0。

基于上文所描述的丙谷二肽的生物合成方法，由于在催化反应合成的体系中使用的全细胞进行生产，反应进行到适当程度可以通过物理分离重组酿酒酵母终止反应，并且分离出来的重组酿酒酵母可以作为工程菌继续添加到生物转化的反应体系中使用，实现循环利用，因此，该方法最为重要的一个实施方式中，还包括菌体循环利用的步骤。亦即将上述步骤(3)反应终止后分离所得的菌体加入至新的反应体系中，循环使用。

具体实施方式中，由于酿酒酵母发酵在发酵体系中自沉降的特点，在转化反应结束后，体系静置，重组酿酒酵母细胞自沉降后可以蠕动泵移出反应清液；分离所得重组酿酒酵母用于新的反应体系。

下述实施方式，将更加完整具体地阐述本发明的内容及优选模式，该具体实施方式中，所述的丙谷二肽的生物合成方法包括如下步骤:

(1)构建重组酿酒酵母；

克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1的目标基因，使用表达载体pYD1构建包括该基因的重组载体，并采用热击法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中；

(2)利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证步骤(1)所获得的转化子，保存于斜面培养基；

所述的斜面培养基：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，121℃灭菌15min，冷却后加入终浓度为10～100μg/mL的氨苄青霉素；

(3)从步骤(2)所得转化子中提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子。将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝0.5～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酵母细胞；

所述的种子培养基：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，如为制备固体培养基加入3.0g/L的琼脂粉，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；

所述的诱导培养基：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；

(4)丙谷二肽的生物合成：将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)溶于溶剂体系中，并加入步骤(3)的培养物，调节pH为8.0～9.0，体系在20±5℃条件下反应，至pH值不再降低作为反应终点，收集反应液分离菌体；

(5)将步骤(4)分离所得菌体加入到新的反应体系中，循环生产丙谷二肽。

下述非限制性实施例用于对本发明的内容作进一步说明，不应当理解为对本发明任何形式的限定。

实施例1

重组酵母细胞的构建：

根据已知的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)，设计上下游引物SEQ ID NO.3/4，以来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心的鞘氨醇杆菌属(Sphingobacteriumsp.)的菌种泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis，CGMCC菌株编号：1.6855)基因组为模板扩增该生物酶基因(SEQ ID NO.1)。

其中，PCR反应体系(50μL)：

PCR反应条件：

PCR反应结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA，USA)对扩增得到的PCR产物进行纯化后保存于-20℃冰箱中备用。

将PCR产物和表达载体pYD1酶切纯化后过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，在LB抗性培养基的平板(培养基组成与斜面培养基相同)上筛选转化子，并对其分别进行PCR和酶切验证，以及DNA测序，验证无误后即得到酵母重组表达载体，如图1所示。通过化学法转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，缺陷型筛选获得能催化合成丙谷二肽的重组酵母细胞，并作为本发明中其余实施例中所使用的重组酵母细胞。

实施例2

重组酵母细胞的发酵培养：

将重组酵母细胞接种至种子培养基中，30℃，180rpm的条件下活化菌体。之后再转接至种子培养基中进行扩大培养，30℃，180rpm振荡培养。待生长至适宜的生物量，再接种到1.0L诱导培养基中，20℃，150rpm通气培养细胞。16～24h后放罐，离心收集细胞。为本发明中所使用的重组酵母细胞。

实施例3

表面展示生物酶的验证：

a.实施例2所培养的重组酵母细胞在3000～5000rpm的条件下离心收集细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗两遍；

b.弃去上清液，用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和1μg抗体(anti-V5-FITC)的磷酸盐缓冲液重悬细胞；

c.置于冰上30min后，在3000～5000rpm的条件下离心收集细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗两遍；

d.最后用磷酸盐缓冲液重悬细胞，置于荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。

当生物酶展示于细胞表面时，暴露的V5抗原表位能与检测方法b中游离的荧光素标记抗体发生特异性结合，然后用磷酸盐缓冲液清洗细胞洗去多余和非特异性结合的抗体，最后在493nm激发波长下检测到的荧光信号，即为特异性结合产生的荧光信号，证明该生物酶已成功展示于细胞表面。

本实施例中所述及的磷酸盐缓冲液中含137mM氯化钠；2.7mM氯化钾；10mM磷酸盐，缓冲液pH 7.4。

在荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下分别检测到的荧光信号，结果如图2所示(A-1/A-2为荧光倒置显微镜验证结果；B-1/B-2为激光共聚焦显微镜验证结果)。其中，图A-1/B-1为在白光照射下的细胞位置图；图A-2/B-2为在493nm激发波长下的细胞荧光信号图，可以发现在相同位置存在能产生绿色荧光信号的细胞，证明该细胞已将生物酶展示于细胞表面。

生物酶展示于细胞表面，实现了酶的固定化。首先，克服了底物和产物跨膜阻力的影响，提高了反应速率；其次，与胞内酶相比，一方面避免了胞内蛋白酶和肽酶的水解作用，有利于维持酶活力的稳定和产物的积累。另一方面，在需要对酶进行富集的工艺中，也省去了破碎细胞和酶的分离纯化等步骤，降低了生产成本，提高了经济效益；最后，伴随细胞的重复利用，可实现酶的重复利用，解决了酶回收难、成本高的问题。

实施例4

100mM底物浓度下酵母全细胞催化合成丙谷二肽的研究：

称取1.396g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(100mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mM L-Gln)，溶解于90mL水中，控制温度为25℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8.5，取零点样置于4℃保存。将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH稳定，反应结束后，离心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得反应时间内丙谷二肽的最高浓度为7.7g/L，如图3所示。

实施例5

200mM底物浓度下酵母全细胞催化合成丙谷二肽的研究：

称取2.792g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(200mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL水中，控制温度为25℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8.5，取零点样置于4℃保存。将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH稳定，反应结束后，离心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得反应时间内丙谷二肽的最高浓度为20.4g/L，如图3所示。

实施例6

底物浓度为(50mM L-Ala-OMe、100mM L-Gln)下酵母全细胞催化合成丙谷二肽的研究：

称取0.698g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(50mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mM L-Gln)，溶解于90mL 0.2M pH8.7磷酸盐缓冲液中，控制温度为20℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8.5，取零点样置于4℃保存。将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH稳定，反应20min，离心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得反应时间内丙谷二肽的浓度为5.8g/L。

实施例7

底物浓度为(100mM L-Ala-OMe、200mM L-Gln)下酵母全细胞催化合成丙谷二肽的研究：

称取1.396g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸盐缓冲液中，控制温度为20℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8.5，取零点样置于4℃保存。将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH稳定，反应40min，离心以终止反应，分别取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得反应时间内丙谷二肽的浓度为14.4g/L。

实施例8

底物浓度为(200mM L-Ala-OMe、400mM L-Gln)下酵母全细胞催化合成丙谷二肽的研究：

称取2.792g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(200mM L-Ala-OMe)和5.848g L-谷氨酰胺(400mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸盐缓冲液中，控制温度为20℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8.5，取零点样置于4℃保存。将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH稳定，反应60min，离心以终止反应，取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得反应时间内丙谷二肽的最高浓度为24.7g/L。

实施例9

不同反应体系对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响：

重组酵母细胞的培养如实施例2相同，离心收集细胞进行丙谷二肽催化反应。研究水、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响。称取2.792g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(200mM L-Ala-OMe)和5.848g L-谷氨酰胺(400mM L-Gln)，分别溶解于90mL上述三种不同反应溶液中，将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH＝8.5，控制温度为25℃，进行催化合成反应，于10/30/60min定点取样，离心以终止酶反应，分别取上清液置于4℃保存。利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定丙谷二肽的浓度，发现最适合的反应溶液为磷酸盐缓冲溶液。

实施例10

不同反应温度对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响：

重组酵母细胞的培养如实施例2相同，离心收集细胞进行丙谷二肽催化反应。研究10/15/20/25/30/40℃不同反应温度，对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响。称取1.396gL-丙氨酸甲酯盐酸盐(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸盐缓冲液溶液中，将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液维持pH＝8.5，分别在上述不同反应温度下进行催化合成反应，30min后离心以终止酶反应，利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定丙谷二肽的浓度。结果发现该酶在较宽泛的温度范围内均具有较高活性，反应的最适温度为20℃，但相比于25℃和30℃差别较小，考虑生产能耗等经济因素，可直接采用室温(20～30℃)进行酶反应，如图4所示。

实施例11

不同反应pH对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响：

重组酵母细胞的培养如实施例2相同，离心收集细胞进行丙谷二肽催化反应。研究pH4/5/6(乙酸盐缓冲液)、6/7/7.5/8/8.5/9(磷酸盐缓冲液)、8/8.5/9/10(硼酸盐缓冲液)不同反应pH对酵母全细胞催化合成丙谷二肽的影响。称取1.396g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL缓冲溶液中，将重组酵母细胞加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，控制温度为20℃，用6MNaOH溶液维持pH在上述不同反应pH下进行催化合成反应，30min后离心以终止酶反应，利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定丙谷二肽的浓度，发现该酶在较宽泛的pH范围内均具有较高活性，反应的最适pH为8.0，再次验证最适反应底物溶液为磷酸盐缓冲溶液，如图5所示。

实施例12

酵母细胞循环使用高效合成丙谷二肽：

重组酵母细胞的培养与实施例2相同，离心收集细胞进行丙谷二肽催化反应。反应条件为称取0.698g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(50mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mML-Gln)，溶解于90mL缓冲液中，控制温度为20℃，并用6M NaOH溶液调节pH至8，于20/30min定点取样，离心以终止酶反应。然后，用蠕动泵泵出或离心弃去反应上清液后，再次按照上述反应条件多次重复反应。最后，利用高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测得丙谷二肽的浓度。将第一反应酵母细胞的相对酶活性定义为100％，则求出第二次反应酵母细胞的相对酶活性为94.0％；第三次反应酵母细胞的相对酶活性为86.7％；第四次反应酵母细胞的相对酶活性为81.0％；第五次反应酵母细胞的相对酶活性为76.7％，如图6所示。回收菌体的过程中，细胞存在部分损失，因此多次循环利用重组酵母细胞催化合成丙谷二肽的过程中酶活性是比较稳定的，可重复使用，以降低工业化生产成本，解决酶回收难、利用率低等问题，更符合工业化生产的要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医诺生物有限公司

<120> 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用

<130> N/A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1860

<212> DNA

<213> Sphingobacterium siyangensis

<400> 1

atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60

caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatc 120

cccatgcgag atgggaagaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180

aaatatccag ttttactcaa tagaacaccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240

tacaaaaaaa gcttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggttatat tttcgtttat 300

caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatattcg tccgaccacc 360

tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgatgc gcttgaatgg 420

ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatgac aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca 480

ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca 540

caggctcccg taacagactg gtttatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt 600

cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc cacgtccaaa acccattaca 660

ccggatcaat ttaagggcaa aattcaaatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca 720

gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aagtattttg gtgactccgt acaattttgg 780

aatggcctgt ttaaacatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat 840

tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat 900

gcttatggaa catttaagac ttaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg 960

attttagtcg cgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta 1020

ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggagcaatt tgaacaaccg 1080

tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc taacattttt 1140

gtctcaggca gcaacgaatg gaaacatttc gaacaatggc cgccaaaaaa tgtagagaca 1200

aaaaaactat acttccaacc tcaggggaaa cttggatttg acaaagttca acgtacagat 1260

tcctgggatg aatatgtaac agaccctaat aaacttgttc cgcatcaagg tgggttaatt 1320

caaaaccgaa cacgggagta tatggtagat gatcagcgtt tcgcagctag tcgccctgat 1380

gtcatggttt atcaaacgga accgttgacg gaggatctga cgatagtagg cccaatcaaa 1440

aacttcctca aagtctcctc aacaggaaca gacgcggact atgttgtcaa actgattgat 1500

gtatacccga acgatgctgc aagttatcaa ggaaaaacaa tggctggata tcaaatgatg 1560

gtacgtggtg agatcatggc ggggaaatac cgaaatggtt ttgataaagc acaggccttg 1620

actccaggta tggtcgaaaa ggttaatttt gaaatgccag acgttgcgca taccttcaaa 1680

aaaggacatc gcattatggt tcaggtacaa aactcatggt ttccgttagc agaacgaaat 1740

ccacaggtat tcttaccgtc ttatacagcc accaaagctg acttccgtaa ggctacccaa 1800

cgtatttttc acgatgtgaa caatgccaca tacatcgaat tttctgtcct caaagattag 1860

<210> 2

<211> 619

<212> PRT

<213> Sphingobacterium siyangensis

<400> 2

Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His

20 25 30

Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu

35 40 45

Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val

50 55 60

Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu

65 70 75 80

Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr

85 90 95

Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp

100 105 110

Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile

115 120 125

Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn

130 135 140

Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys

165 170 175

Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Phe Ile Gly Asp Asp

180 185 190

Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met

195 200 205

Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe

210 215 220

Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala

225 230 235 240

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245 250 255

Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe

260 265 270

Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala

275 280 285

Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr

290 295 300

Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser

305 310 315 320

Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val

405 410 415

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420 425 430

Val Pro His Gln Gly Gly Leu Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met

435 440 445

Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr

450 455 460

Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys

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Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val

485 490 495

Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys

500 505 510

Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly

515 520 525

Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met

530 535 540

Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys

545 550 555 560

Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu

565 570 575

Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Lys

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 1860

<212> DNA

<213> Sphingobacterium sp.

<400> 5

atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60

caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatt 120

cccatgcgag atgggaaaaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180

aaatatccag ttttgctcaa tagaacgccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240

tacaaaaaaa gtttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggctatat tttcgtttac 300

caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatatacg tccgaccacg 360

tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgatgc gcttgaatgg 420

ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatggc aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca 480

ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca 540

caggctcccg taacagactg gtatatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt 600

cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc ctcgtccaaa acccattaca 660

ccggatcaat ttaagggcaa aattcagatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca 720

gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aaatactttg gtgactccgt acaattttgg 780

aatgacctgt ttaagcatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat 840

tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat 900

gcttatggaa catttaagac ctaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg 960

attttagtcg cgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta 1020

ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggaacaatt tgaacaaccg 1080

tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc caacattttt 1140

gtttcaggca gcaacgaatg gaaacatttc gaacaatggc caccaaaaaa tgtagagaca 1200

aaaaaactat acttccaacc tcaggggaaa cttggatttg acaaagttca acgtacagat 1260

tcctgggatg aatatgtaac agacccgaat aaacctgttc cgcatcaagg tgggttaatt 1320

caaaaccgaa cacgggagta tatggtagat gatcaacgtt tcgcggctag tcgccctgat 1380

gtcatggttt atcaaacgga accgttgacg gaggacctga cgatagtagg cccaatcaaa 1440

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gtttatccga atgatgcagc aagttatcaa ggaaaaacaa tggctggata tcaaatgatg 1560

gtacgtggtg agatcatggc ggggaaatac cgaaatggtt tcgataaagc gcaggccttg 1620

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aaaggacatc gcattatggt tcaggtacaa aactcatggt ttccgctggc agaacgaaat 1740

ccacaggtgt ttttagcacc ttatacagct accaaagctg atttccgcaa agctacccaa 1800

cgtatttttc acgatgtgaa caatgccaca tacatcgaat tttctgtcct caaagattag 1860

Claims

1.重组酿酒酵母，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因。

2.权利要求1所述的重组酿酒酵母的制备方法，是将来源于鞘氨醇杆菌属的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因克隆后连接至表达载体，然后将所构建的重组载体转入作为表达宿主的酿酒酵母细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是pYD1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达宿主是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。

5.丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的底物包括羧基组分和胺组分，其中所述的羧基组分选自氨基酸酯和氨基酸酰氨，所述的胺组分选自氨基酸、C-保护的氨基酸和胺。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺溶于溶剂体系中，并调节pH为8.0～9.0；

(3)以pH值不再降低作为反应达到终点的标志，收集反应液离心分离菌体以终止反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对重组酿酒酵母循环利用的步骤。

9.一种丙谷二肽的生物合成方法，包括如下步骤：

(1)构建重组酿酒酵母；

(3)从步骤(2)所得转化子中提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子，将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝0.5～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酵母细胞；

(4)丙谷二肽的生物合成：将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺溶于溶剂体系中，并加入步骤(3)的培养物，调节pH为8.0～9.0，体系在20±5℃条件下反应，至pH值不再降低作为反应终点，收集反应液分离菌体；