CN107118999B

CN107118999B - 一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用

Info

Publication number: CN107118999B
Application number: CN201710243427.8A
Authority: CN
Inventors: 聂尧; 徐岩; 李斌; 景晓冉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: CN107118999A

Abstract

本发明公开了一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用，属于生物催化技术领域。本发明构建了一株表达羟基化酶的重组菌，并进一步建立转化羟基氨基酸的高效共性的反应体系。本发明在发酵与转化耦联的反应体系中，利用重组大肠杆菌催化底物L‑脯氨酸，获得产物反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。通过优化重组酶的活性表达和调控转化过程来强化产物合成，将菌体细胞接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养60h，将温度转为30℃反应20h，得到产物反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，产率达到95.8％。与粗酶和全细胞转化体系相比，处理相对简单，节约了时间和劳动成本，因此该重组大肠杆菌的发酵转化耦联系统是一种高效的生物催化系统。

Description

一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用

技术领域

本发明涉及一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用，属于生物催化技术领域。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸的化学结构为：

反式-4-羟基-L-脯氨酸是一种稀有亚氨基酸，在医药保健方面可以作为重要的医药中间体来合成消炎药、碳青霉烯类抗生素等；在材料化工方面作为一种手性合成元件，用来合成聚酯碳酸、N-烷基吡咯、N-芳香基吡咯、(1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环庚烷以及生物碱TAN1251A]等具有高附加值的产品；在食品营养和护肤美容方面也具有广泛的应用价值。

目前，国内生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法主要是生物组织提取法，然而从明胶或骨胶中利用酸水解的方法提取羟脯氨酸有诸多弊端，在当今提倡节能环保、绿色生产的政策下，微生物合成法的优点却越来越明显。

Lawrenced等从Streptomyces griseoviridusP8648中纯化出脯氨酸-4-羟化酶，并对该酶的特性进行了初步研究，但此酶的表达量较低，每毫克蛋白每分钟的羟脯氨酸产量仅为907pmol/L。刘合栋等将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的pUC19质粒，构建重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中。在摇瓶水平，重组菌以L-脯氨酸(200mM)为底物发酵8h，可积累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羟脯氨酸，产物转化率仅达到1.9％左右，产物转化率过低。微生物合成法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中，现有基因工程菌多以大肠杆菌为出发菌株，在摇瓶水平以脯氨酸为底物发酵生产羟脯氨酸的过程中，菌体生长缓慢，很难达到高密度发酵，脯氨酸的有效转化率较低，从而造成生产原料的浪费。

虽然已有许多开展生物催化转化羟基脯氨酸研究的相关报道，但能够羟基化L-脯氨酸的资源仍然有限，且在以游离L-脯氨酸为底物时，底物脯氨酸的消耗率较低，羟脯氨酸的产率较低，有必要进一步开发新的羟基化酶，探索更经济的生物转化条件。

发明内容

本发明的目的是构建一种表达羟基化酶的重组菌，以及该重组菌在耦联合成羟脯氨酸中的应用。本发明目的不仅仅在于构建一种表达羟基化酶的重组菌，并实现其在合成羟脯氨酸中的应用，从表达和转化过程耦联强化产物合成，进一步建立转化羟基氨基酸的高效共性的反应体系。

本发明第一个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌，所述重组菌表达了编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述羟基化酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的基因载体为pET28a。

本发明第二个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因K1连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-K1；

2)将重组质粒pET28a-K1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-K1)。

本发明第三个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法：在含有L-脯氨酸作为底物的培养基中，对所述重组菌细胞发酵转化耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸进行三阶段温度调控，从发酵产酶和生物转化两个过程强化产物合成，建立高效的生物反应体系。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的三阶段控温过程为：于37℃，220rpm振荡培养3h；将培养条件变为20℃，自诱导表达培养过程20-60h；将温度转为30℃，转化反应过程20-60h。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl 2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3mM，L-pro20mM-100mM。

本发明第四个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌在羟脯氨酸生产中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是利用氨基酸序列为SEQIDNO:2的基因所表达的酶作为催化剂。

本发明的有益效果：

利用重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET-28a-K1)，在发酵体系中加入L-脯氨酸作为底物，对发酵表达转化过程进行耦联调控，产物反式-4-羟基-L-脯氨酸最高产率达到95.8％。

这些工作不仅得到了一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用，且为建立转化羟基氨基酸高效共性的反应体系提供了有效途径，对于今后生物催化合成重要中间体的开发具有较为重要的意义。

附图说明

图1合成反式-4-羟基-L-脯氨酸路径。

具体实施方式

氯胺T试剂：称取1.41g氯胺T置于10mL水中，溶解后依次添加10mL正丙醇和80mL柠檬酸缓冲液，混匀置于棕色试剂瓶中，低温放置。

显色剂：称取10g的4-(二甲氨基)苯甲醛溶于35mL的高氯酸，再缓慢加入65mL异丙醇，混匀后置于棕色试剂瓶中，低温放置。

实施例1：出发菌株的获得

基因挖掘方法：利用基因挖掘工具，根据已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶(GenBank Accession No.BAA20094.1)，通过同源序列比对在NCBI上BLAST后，选取与其序列同源性为51％的基因序列作为候选基因。

通过同源序列比对，选取与已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶序列同源性为51％的基因序列作为候选基因，将候选基因的来源菌株作为出发菌株，菌种为白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)CGMCC 4.1347。

实施例2：目的基因K1的获得

1347培养基：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，pH 7.3，固体培养基添加1.5％琼脂粉。

将白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)CGMCC 4.1347接种于5mL 1347培养基中于28℃、200rpm振荡培养48h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)(碧云天公司)提取基因组。

根据已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶(GenBank AccessionNo.BAA20094.1)，在NCBI上BLAST后，通过同源序列比对，选取与其序列同源性为51％的基因序列作为候选基因，根据候选目的基因序列设计了以下引物：引物1：5'TGCATCATATGCTCACCGATTCGCAGT-3'(SEQ ID NO：3)，引物2：5'-TTAAGCTTTCATGCGCCCAGGC-3'(SEQ ID NO：4)。引物1含有NdeI限制性酶切位点，引物2含有HindIII限制性酶切位点。

PCR反应体系：ddH₂O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物1(50pmol/μL)1μL，引物2(50pmol/μL)1μL，基因组DNA 5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。

PCR反应过程如下：95℃预变性5min；95℃1min，47℃1min，72℃1min，循环30次；72℃延伸10min。

用PCR纯化试剂盒(Bioer Technology Co.Ltd)纯化DNA片段。

DNA片段与pMD19-T连接：将外源基因与质粒pMD19-T连接，反应体系组成如下：质粒pMD19-T 0.8μL，外源基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，ddH₂O将体系补足10μL。混合连接液，将其置于16℃下连接4h。

利用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek)从克隆大肠杆菌中提取质粒pMD19-T-K1，保藏备用。

实施例3：含有基因K1的重组大肠杆菌构建

(1)质粒pMD19-T-K1及质粒pET28a的酶切：

按照水、缓冲液、PCR产物、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴4h，在管中加入1/10的LoadingBuffer，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

反应体系组成：10×H Buffer 4μL，DNA 10μL，NdeI 2μL，HindIII 2μL，ddH₂O将体系补足40μL。

(2)目的基因与质粒pET28a的连接，得到pET28a-K1：

将外源基因与质粒pET28a连接，反应体系组成如下：质粒pET28a 0.8μL，外源基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，ddH₂O将体系补足10μL。混合连接液，将其置于16℃下连接12-16h。

(3)重组质粒pET28a-K1转化大肠杆菌，得到重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-K1)：

在每管的100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50μg/mL卡纳抗生素的LB平板上，37℃倒置培养。

实施例4：含有候选目的基因P4H、K2、K3、IDO的重组大肠杆菌构建

将已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶的基因P4H(GenBank AccessionNo.BAA20094.1)连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-P4H；将重组质粒pET28a-P4H转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-P4H)。，构建得到重组大肠杆菌。

根据已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶(GenBank AccessionNo.BAA20094.1)，通过同源序列比对在NCBI上BLAST后，选取与其序列同源性为45％的基因序列作为候选基因K2(GenBank Accession No.WP_030110684.1)。将K3连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-K2；将重组质粒pET28a-K2转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-K2)，构建得到重组大肠杆菌。

根据已报道的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化酶(GenBank AccessionNo.BAA20094.1)，通过同源序列比对在NCBI上BLAST后，选取与其序列同源性为42％的基因序列作为候选基因K3(GenBank Accession No.WP_025355730.1)。将K3连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-K3；将重组质粒pET28a-K3转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-K3)，构建得到重组大肠杆菌。

根据已报道的L-异亮氨酸双加氧酶IDO(GenBank Accession No.KC884243.1)，将IDO连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-IDO；将重组质粒pET28a-IDO转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-IDO)，构建得到重组大肠杆菌。

实施例5：重组菌表达和转化过程耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

LB培养基：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，卡纳抗生素50μg/mL，固体培养基添加琼脂粉1.5％；

自诱导转化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl 2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3mM，L-pro 20-100mM。

挑取重组菌单菌落接种于5mL含50μg/mL卡纳抗生素的自诱导转化液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；将1.5mL培养液转接于50mL含50μg/mL卡纳抗生素的自诱导转化培养基中，于37℃，220rpm振荡培养3h，将培养条件变为20℃，220rpm，发酵转化80h至终点。

反应结束后，将发酵液12000rpm，10min离心，取上清稀释一定的倍数至终体积为2.5mL，向其中加入1mL的氯胺T试剂，混匀后室温放置20min，然后再加入1mL的显色剂，塞上塞子后放置于60℃水浴锅中保温20min。取出试管，置于室温的水中冷却，在分光光度计中测定560nm处的吸光度值。

实施例6：重组菌K1、P4H、K2、K3、IDO表达和转化过程耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

发酵转化反应体系为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl 2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3Mm及不同浓度的L-pro。将重组大肠杆菌K1和P4H接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃在恒温摇床上振荡反应80h。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用氯胺T法检测。

结果显示：

(1)在培养基中L-pro为20mM下，重组菌K1的羟脯氨酸的产量为2106mg/L，生物量(OD 600)达到14.89，产物羟脯氨酸的产率80.4％；而重组菌P4H的羟脯氨酸的产量为1790mg/L，生物量(OD 600)达到13.56，产物羟脯氨酸的产率68.3％；而重组菌K2的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到14.32，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌K3的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到17.68，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌IDO的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到14.27，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(2)在培养基中L-pro为40mM下，重组菌K1的羟脯氨酸的产量为2581mg/L，生物量(OD 600)达到22.14，产物羟脯氨酸的产率49.2％；而重组菌P4H的羟脯氨酸的产量为1852mg/L，生物量(OD 600)达到22.23，产物羟脯氨酸的产率35.21％；而重组菌K2的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到16.2，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌K3的羟脯氨酸的产量不足15mg/L，生物量(OD 600)达到16.68，产物羟脯氨酸的产率低于8‰；而重组菌IDO的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到15.21，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(3)在培养基中L-pro为60mM下，重组菌K1的羟脯氨酸的产量为3480mg/L，生物量(OD 600)达到24.12，产物羟脯氨酸的产率44.23％；而重组菌P4H的羟脯氨酸的产量为2855mg/L，生物量(OD 600)达到21.76，产物羟脯氨酸的产率36.28％；而重组菌K2的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到21.2，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌K3的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到17.68，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌IDO的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到15.43，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(4)在培养基中L-pro为80mM下，重组菌K1的羟脯氨酸的产量为5078mg/L，生物量(OD 600)达到21.16，产物羟脯氨酸的产率46.42％；而重组菌P4H的羟脯氨酸的产量为3376mg/L，生物量(OD 600)达到20.86，产物羟脯氨酸的产率32.18％；而重组菌K2的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到17.25，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌K3的羟脯氨酸的产量不足15mg/L，生物量(OD 600)达到18.68，产物羟脯氨酸的产率低于8‰；而重组菌IDO的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到17.24，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(5)在培养基中L-pro为100mM下，重组菌K1的羟脯氨酸的产量为4800mg/L，生物量(OD 600)达到24.82，产物羟脯氨酸的产率36.6％；而重组菌P4H的羟脯氨酸的产量为3770mg/L，生物量(OD 600)达到23.27，产物羟脯氨酸的产率28.75％；而重组菌K2的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到19.24，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；而重组菌K3的羟脯氨酸的产量不足8mg/L，生物量(OD 600)达到15.88，产物羟脯氨酸的产率低于4‰；而重组菌IDO的羟脯氨酸的产量不足10mg/L，生物量(OD 600)达到17.21，产物羟脯氨酸的产率低于5‰。

实施例7：重组菌K1表达和转化过程耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

发酵转化反应体系为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl 2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3mM，L-pro 20mM。将重组大肠杆菌K1接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养一定时间，将温度转为30℃反应一定时间。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用氯胺T法检测。

结果显示：

(1)将重组大肠杆菌K1接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养20h，将温度转为30℃反应60h。羟脯氨酸的产量为1662mg/L，生物量(OD 600)达到15左右，产物羟脯氨酸的产率63.4％；

(2)将重组大肠杆菌K1接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养40h，将温度转为30℃反应40h，羟脯氨酸的产量为2165mg/L，生物量(OD 600)达到15左右，产物羟脯氨酸的产率82.6％；

(3)将重组大肠杆菌K1接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养60h，将温度转为30℃反应20h，羟脯氨酸的产量为2512mg/L，生物量(OD 600)达到15左右，产物羟脯氨酸的产率95.8％。

实施例8：重组菌K1、P4H、K2、K3、IDO通过IPTG诱导

将重组菌K1、P4H、K2、K3、IDO分别进行IPTG诱导，发酵转化反应体系为GT培养基：葡萄糖10g/L、甘油5g/L、胰蛋白胨8g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钠2g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.015g/L、硫酸亚铁3mM，L-pro 20Mm,pH 8.0。将将重组大肠杆菌K1在37℃下，200r.min^-1振荡培养过夜。将5mL种子液转接至含卡那抗生素的30mL GT液体培养基中，于37℃下，250r.min^-1振荡培养至OD600约为0.6～0.8。向培养基中加入终浓为0.1mmol·L^-1的IPTG，于35℃、250r·min^-1进行诱导培养96h,直至发酵结束。反应后混合物离心，取上清液衍生化后用氯胺T法检测。

结果显示：

(1)将重组菌K1进行IPTG诱导，羟脯氨酸的产量为40mg/L，生物量(OD 600)达到4左右，产物羟脯氨酸的产率低于1.5％；

(2)将重组菌P4H进行IPTG诱导，羟脯氨酸的产量为120mg/L，生物量(OD 600)达到4.5左右，产物羟脯氨酸的产率低于4.5％；

(3)将重组菌K2进行IPTG诱导，羟脯氨酸的产量低于10mg/L，生物量(OD 600)达到3.9左右，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(4)将重组菌K3进行IPTG诱导，羟脯氨酸的产量低于10mg/L，生物量(OD 600)达到5左右，产物羟脯氨酸的产率低于5‰；

(5)将重组菌IDO进行IPTG诱导，羟脯氨酸的产量低于10mg/L，生物量(OD 600)达到9.5左右，产物羟脯氨酸的产率低于5‰。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 白色库茨涅尔氏菌（Kutzneria albida） CGMCC 4.1347

<400> 1

atgctcaccg attcgcagtt cgccacctac cacaccgagg ggttcgtcgt cgttcccgac 60

gtcatcccgc ccgcggatct cgcgctggtg cgggacgatg tcgagacgtt gttcgcgctg 120

gaccaccccg gccgcatgct cgagacggac ggcacgaccg tgcgcggcgt gcacggctgc 180

caccaggtca gctcgctgtt cgaccggctc acccggctgc cgaggttgct gggggcggcg 240

gagcaggtcc ttgagagcaa ggtctacgtg taccagtcga aggtcaacgc caagctggcg 300

ctgcgtggcg acgtgtggcc ttggcaccag gactacatct tctgggagcg cgaggacggc 360

atgcgcaccc cgcgggcgat gaacatcgcg ctgttcctcg acgacgcgac ggacttcaac 420

ggtccgctgc tgttcctgcc tggttcgcac ctgctgggca cggtgcggac cgagcggcgc 480

agcgccgggg atgactgggc cgcgaacctc aaggccgacc tcaactacca actgagcccg 540

cggcaactgg cctcggtcgc ggcggacctc ggtatccgcg cggccactgg caccgcgggc 600

agcctgctgt tgttcgatcc gcggctcatc cacgggtccg gtacgaacat gtccccgcag 660

gaccggcggc tgctgttgat cacgtacaac agcgtggaca acgcgcccgt gccggtcccc 720

aatccgcgac cggagttcct ggtgtcgacg gactccaccg cgctcaccgc gtgggaagcg 780

ggcctgggcg catga 795

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 白色库茨涅尔氏菌（Kutzneria albida） CGMCC 4.1347

<400> 2

Met Leu Thr Asp Ser Gln Phe Ala Thr Tyr His Thr Glu Gly Phe Val

1 5 10 15

Val Val Pro Asp Val Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ala Leu Val Arg Asp

20 25 30

Asp Val Glu Thr Leu Phe Ala Leu Asp His Pro Gly Arg Met Leu Glu

35 40 45

Thr Asp Gly Thr Thr Val Arg Gly Val His Gly Cys His Gln Val Ser

50 55 60

Ser Leu Phe Asp Arg Leu Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Gly Ala Ala

65 70 75 80

Glu Gln Val Leu Glu Ser Lys Val Tyr Val Tyr Gln Ser Lys Val Asn

85 90 95

Ala Lys Leu Ala Leu Arg Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110

Ile Phe Trp Glu Arg Glu Asp Gly Met Arg Thr Pro Arg Ala Met Asn

115 120 125

Ile Ala Leu Phe Leu Asp Asp Ala Thr Asp Phe Asn Gly Pro Leu Leu

130 135 140

Phe Leu Pro Gly Ser His Leu Leu Gly Thr Val Arg Thr Glu Arg Arg

145 150 155 160

Ser Ala Gly Asp Asp Trp Ala Ala Asn Leu Lys Ala Asp Leu Asn Tyr

165 170 175

Gln Leu Ser Pro Arg Gln Leu Ala Ser Val Ala Ala Asp Leu Gly Ile

180 185 190

Arg Ala Ala Thr Gly Thr Ala Gly Ser Leu Leu Leu Phe Asp Pro Arg

195 200 205

Leu Ile His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro Gln Asp Arg Arg Leu

210 215 220

Leu Leu Ile Thr Tyr Asn Ser Val Asp Asn Ala Pro Val Pro Val Pro

225 230 235 240

Asn Pro Arg Pro Glu Phe Leu Val Ser Thr Asp Ser Thr Ala Leu Thr

245 250 255

Ala Trp Glu Ala Gly Leu Gly Ala

260

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgcatcatat gctcaccgat tcgcagt 27

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaagctttc atgcgcccag gc 22

Claims

1.一种表达羟基化酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达了编码氨基酸序列为SEQID NO：2的基因。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的基因载体为pET28a。

5.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2)将重组质粒pET28a-K1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株。

6.一种利用权利要求1所述的重组菌耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其特征在于，在含有L-脯氨酸作为底物的培养基中，对所述重组菌细胞发酵转化耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸进行三阶段温度调控，从发酵产酶和生物转化两个过程强化产物合成；所述重组菌耦联合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的三阶段温度调控过程为：于37℃，220rpm振荡培养3h；将培养条件变为20℃，自诱导表达培养过程20-60h；将温度转为30℃，转化反应过程20-60h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3mM，L-脯氨酸20mM-100mM。

8.权利要求1所述的重组菌在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产中的应用。

9.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸生产方法，其特征在于，所述方法是利用氨基酸序列为SEQ ID NO:2的基因所表达的酶作为催化剂。