CN110387379A

CN110387379A - 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用

Info

Publication number: CN110387379A
Application number: CN201910642412.8A
Authority: CN
Inventors: 齐佳坤; 洪皓; 范超; 刘军; 吴文忠
Original assignee: Dalian Promise Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Dalian Promise Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110387379B

Abstract

本发明公开了一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用，该工艺是分别将GshF基因和ppk2基因整合到质粒载体上，获得含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌，二者以5:4‑5:2的比例混合培养获得混菌细胞。再将该混菌细胞在37‑45℃，pH为6‑7.5条件下，通过诱导表达，催化合成还原型谷胱甘肽。实现了在低成本的六偏磷酸钠存在下可催化ADP和AMP的磷酸化，催化产物的高能磷酸键断裂为谷胱甘肽的合成反应供能。节约了成本，回避了因反应效率高、剩余的细胞的安置问题、操作简便易控，有良好的应用前景。

Description

一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用。

背景技术

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸缩合得到的一种小分子多肽，广泛存在于各种生物体内，是微生物及植物生物细胞内最主要含巯基的小分子肽。谷胱甘肽是体内一种重要的抗氧化剂。还原型的谷胱甘肽在活组织中具有许多重要的功能，在肝损伤、眼部疾病、物质代谢，调节细胞凋亡等方面发挥着重要的作用。此外，其在食品保鲜领域也发挥同样重要的作用，因此国内外医药市场、食品，化妆品领域对于谷胱甘肽的需求也在稳步提升。

目前谷胱甘肽的制备方法很多，常见的包括溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。萃取法从谷物胚芽等含有大量谷胱甘肽的植物中提取谷胱甘肽，存在得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高等缺点，现已较少使用。化学合成法合成谷胱甘肽活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。因此，目前国内外生产谷胱甘肽多是采用发酵法或酶法，发酵法是将编码合成谷胱甘肽酶系或者双功能酶的基因克隆到细菌或酵母中，发酵培养获得谷胱甘肽。发酵法中酵母发酵法工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂，环境污染较大。专利CN201810844388和CN201680013630分别在酵母和大肠杆菌中外源表达谷胱甘肽合成双功能酶基因，达到发酵生产谷胱甘肽的目的，但是产量很低，不适合批量化生产。

酶法生产谷胱甘肽具有工艺明确，底物转化率高，产品纯度高等优点，已引起了人们的广泛关注。新发现的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)逐渐取代原有的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (Gsh I，EC 6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II，EC 6.3.2.2)两种酶，用来酶法催化生产GSH，反馈抑制作用较小，适合应用于大规模生产。但是，现有技术中，依然存在各种问题妨碍该技术的工业化应用，专利CN201710543648获得了氨基酸序列不同的GshF-4突变体，其合成活力、比活以及最适温度都有所提高，但是存在产量偏低；ATP消耗量大，成本高的问题，不利于工业化生产。

酶法合成谷胱甘肽需要三磷酸腺苷(ATP)作为能量供体，但是ATP的价格会大幅提高生产成本，因此建立ATP再生系统是谷胱甘肽合成中关键的一环。专利CN201310538982在大肠杆菌细胞中过表达(外源的)谷胱甘肽双功能酶(STH)以及乙酸激酶(ack)，获得重组表达细胞，虽然达到了ATP再生的目的，但是Rosetta(DE3)稳定性并不高，所需要的底物乙酰磷酸二锂盐成本高，且产物产量低，破碎酶液提高分离成本，此外，还有质粒存在丢失可能的问题，以及抗生素的使用对环境并不友好的问题，难以进行工业推广；专利CN201710452240 利用GshF酶、ATP再生酶(PPK酶和PAP酶)和AK酶在反应器中生成谷胱甘肽，使用腺苷替代ATP或AMP，但是其中的ATP再生酶系统包含PPK酶、PAP酶和AK酶多种酶存在分别培养导致成本增高的问题，以及固定化分离步骤繁琐，能耗高，此外，还有质粒存在丢失可能的问题；抗生素的使用对环境并不友好的问题等，最终导致其无法很好的在工业上推广。

发明内容

为了解决上述问题，本发明在大肠杆菌中过表达谷胱甘肽双功能酶的同时，选择了PPK2 家族中可利用AMP/ADP催化核苷酸磷酸化的红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)来源的 ppk2基因作为ATP循环再生的酶，两种大肠杆菌细胞建立起一种了谷胱甘肽合成-ATP循环再生系统。实现了在低成本的六偏磷酸钠存在下可催化ADP和AMP的磷酸化，催化产物的高能磷酸键断裂为谷胱甘肽的合成反应供能。

一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其步骤包括：分别将GshF基因和ppk2基因整合到质粒载体上，获得含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌，二者以5:4-5:2的比例混合培养获得混菌细胞。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2 基因的大肠杆菌以3:2-2:1比例混合培养。进一步优选的情况下，所述含有GshF基因的大肠杆菌的制备步骤包括：利用质粒载体将密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因GshF转化大肠杆菌。进一步优选的情况下，所述含有ppk2基因的大肠杆菌的制备步骤包括：利用质粒载体将密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因ppk2转化大肠杆菌。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述质粒载体为pET-30a。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述混合培养的方法是：将活化后的含有GshF 基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌按照5:4-5:2的比例混合后，以8％-12％体积比的接种量接种，在37±0.5℃，pH为6.7±0.1，通气量20-100L·h^-1、搅拌转速100-600rpm，使溶氧控制在10％-40％，发酵至对数后期收集菌体得混菌细胞。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2 基因的大肠杆菌混合培养获得的混菌细胞在37-45℃，pH为6-7.5条件下，通过诱导表达，催化合成还原型谷胱甘肽。进一步优选的情况下，所述混菌细胞在40-42℃，pH为6.5-7.0 条件下，通过诱导表达，催化合成还原型谷胱甘肽。进一步优选的情况下，诱导表达是在对数初期时添加0.1mM的IPTG作诱导剂。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述催化合成还原型谷胱甘肽中使用的底物为L-甘氨酸130-150mM、L-谷氨酸钠130-150mM、MgSO₄·7H₂O 60-80mM、L-半胱氨酸盐酸盐110-130mM、ATP 3-7mM、六偏磷酸钠50-70mM。

对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述催化合成还原型谷胱甘肽中使用的底物为L-甘氨酸135-145mM、L-谷氨酸钠135-145mM、MgSO₄·7H₂O 65-75mM、L-半胱氨酸盐酸盐115-125mM、ATP 4-6mM、六偏磷酸钠55-65mM。

有益效果

1.同时同罐混菌培养，节约了时间成本和原料成本，回避了因反应效率高、剩余的细胞的安置问题；

2.具有原材料廉价易得、操作简便易控、合成途径绿色高效、生物安全性好、反应速率快、转化率高等优势，在本发明最佳实施例中，获得谷胱甘肽高达34.22g/L，转化率达到 93.77％。

附图说明

图1是BL21-pET-30a-GshF和BL21-pET-30a-ppk2生长曲线图；

图2是不同添加量的BL21-pET30a-ppk2湿菌体对反应结果的影响图；其中(a)为添加不同量的BL21-pET30a-ppk2湿菌体时谷胱甘肽的转化率；(b)为添加不同量的 BL21-pET30a-ppk2湿菌体时体系中ATP、ADP、AMP的浓度；

图3是不同添加量的BL21-pET30a-GshF湿菌体对反应结果的影响图；其中(a)为添加不同量的BL21-pET30a-GshF湿菌体时谷胱甘肽的转化率；(b)为添加不同量的 BL21-pET30a-GshF湿菌体时体系中ATP、ADP、AMP的浓度；

图4是BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ppk2以不同比例接种后谷胱甘肽的转化率(a) 和ATP、ADP以及AMP的含量(b)图；

图5是单独培养的BL21-pET30a-GshF添加不同量的ATP进行反应的谷胱甘肽的产量图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本申请实施例中所使用的生物材料或试剂，如无特殊说明，均为常规的商业化产品，均可购买获得。

开发设计用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用的实验方法。首先分别构建外源基因表达的含谷胱甘肽合成双功能酶和ATP再生酶的大肠杆菌，再进行谷胱甘肽合成反应条件以及催化体系的优化，最后，通过两种大肠杆菌混合培养以及菌种比例和发酵工艺的优化，实现谷胱甘肽的生产，最大程度节约原料、设备以及合成反应过程的成本。

由于谷胱甘肽合成和ATP再生过程的耦合，反应过程中需要按照一定比例添加两种基因工程菌的细胞，而两种菌需要分两批次培养，能耗高，耗时久；观察生长曲线，将产生两种酶的基因分别以大肠杆菌为表达宿主，将谷胱甘肽双功能酶GshF基因和ATP再生酶ppk2基因通过质粒载体导入到大肠杆菌中，通过优化接种量，混合培养获得混菌细胞，一釜双酶，缩短了菌株培养的时长和设备的需求量。使用上述菌株可将底物谷氨酸钠、半胱氨酸和甘氨酸高效转化为谷胱甘肽。节省了培养的时间和原料，降低了工业化应用和生产的成本。

实施例一、构建重组大肠杆菌

1.构建重组表达载体

对Streptococcus thermophilus来源的目的基因GshF(SEQ ID NO.1)、和来源于Rhodobacter sphaeroides的ppk2(Gene ID:3718134，VERSION：CP000143.2；SEQ ID NO.3)进行密码子优化，获得密码子优化后的GshF基因序列(SEQ ID NO.2)，密码子优化后的ppk2基因序列(SEQ ID NO.4)以密码子优化后的序列设计引物，即在目的基因片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列(所述线性化载体的末端序列为引物序列中的大写字母)，使得插入片段5’和3’两端带有载体两端的一致性序列(15-25bp)，如表1所示，引物与模板序列分别配对应进行高保真PCR后切胶回收；同时将质粒pET-30a在多克隆位点的任意位置酶切后切胶回收，将线性化的质粒分别与GshF、和ppk2回收后的片段按照天根生化科技的“EasyGeno 快速重组克隆试剂盒”要求的比例和用量建立重组体系，于50℃反应15min，反应结束后瞬时离心，之后置于冰上冷却即获得重组产物，等待进行后续转化反应。

表1引物序列

引物名称	引物序列	SEQ ID NO
			GshF-F	CTTTAAGAAGGAGATATACATATGaccctgaaccaactgc	5
GshF-R	GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGttaggtttggcctgccacaatc	6
			ppk2-F	CTTTAAGAAGGAGATATACATATGgccgaagatcgtgctatg	7
ppk2-R	GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGtcaaccttgacgcggtttac	8

取E.coli BL21感受态细胞置于冰中，向感受态细胞悬液中加入5-10μL重组产物，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。将离心管置于42℃水浴中放置60-90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管；向每个离心管中加入350μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃、180rpm摇床振荡培养45min，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏；将转化体系混匀，吸取100μL已转化的感受态细胞加到含Kan^R抗生素的LB固体琼脂培养基上，用涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。

将得到的菌落接种1-5mL LB(含有Kan^R抗生素)培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，送测序公司鉴定插入片段是否正确。正确的菌株命名为 BL21-pET-30a-GshF、BL21-pET-30a-ppk2，留作下一步实验。

2.生长情况分析

将甘油管中保藏的BL21-pET-30a-GshF和BL21-pET-30a-ppk2分别按照体积比1％接种量接入含有50μg/mL的Kan^R抗生素的TB培养基中，过夜活化后按照体积比10％的接种量接入发酵罐中，每隔2h取样测菌体量，培养至对数期末期后加入0.1mM的IPTG诱导10h后下罐，菌体离心，作为反应的细胞备用。其生长曲线如图1所示：

由图1可以看出，在相同的宿主中，同样的质粒表达蛋白，在培养初期菌体量几乎没有差别，随着诱导之后，蛋白表达，BL21-pET-30a-GshF比BL21-pET-30a-ppk2菌体量略低，但是差别不明显，不存在强势优势菌株，两者如果同罐培养具有可行性。

实施例二、谷胱甘肽合成反应菌添加量的优化

为了降低成本，对BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ppk2的添加量进行优化。反应体系如下：L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐120mM、ATP 5mM、60mM六偏磷酸钠、100mL去离子水。将湿菌体加入反应体系中，在42℃， pH为7条件下反应2.5h后取样，8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量和ATP、ADP以及AMP的含量。

当BL21-pET30a-GshF湿菌体添加量为50mg时，比较不同添加量的BL21-pET30a-ppk2 湿菌体(BL21-pET30a-GshF：BL21-pET30a-ppk2的质量比分别为50:8，50:15，50：25，50:35) 对反应结果的影响。如图2所示，15-35mg的BL21-pET30a-ppk2湿菌体对于谷胱甘肽的合成不构成限制因素，8mg的BL21-pET30a-ppk2湿菌体的体系中谷胱甘肽转化率只能达到 86％，腺苷ATP和ADP消耗成为AMP，能量无法顺畅循环为谷胱甘肽合成提供能量；而15mg的BL21-pET30a-ppk2湿菌体的体系中谷胱甘肽的转化率为94.37％，与25、35mg的 BL21-pET30a-ppk2湿菌体效果几乎相同。因此选择15mg的BL21-pET30a-ppk2湿菌体进行ATP再生系统的循环。

当BL21-pET30a-ppk2湿菌体添加量为15mg时，比较不同添加量的BL21-pET30a-GshF 湿菌体(BL21-pET30a-GshF：BL21-pET30a-ppk2的质量比分别为15:15，25:15，35:15，45:15) 对反应结果的影响。如图3所示，35mg的BL21-pET30a-GshF湿菌体可达到93.4％的转化率，与添加45mg条件下的谷胱甘肽转化率和能量比例相似，说明35mg以上的 BL21-pET30a-GshF湿菌体是过量的；而少于35mg的湿菌体则会成为谷胱甘肽生产的限制因素。

综上，BL21-pET30a-GshF湿菌体35mg与BL21-pET30a-ppk2的湿菌体15mg可经济性地进行ATP循环耦合谷胱甘肽合成反应，即BL21-pET30a-GshF与BL21-pET30a-ppk2以7:3的比例混合后取50mg。

实施例三、混合培养接种量的优化

欲得到与BL21-pET30a-GshF与BL21-pET30a-ppk2以7:3的比例混合后的混菌下相同的催化效果，须控制两者的接种比例。将BL21-pET30a-GshF与BL21-pET30a-ppk2分别过夜活化后按照不同的比例(5:4,3:2,2:1,5:2)混合后以体积比10％的接种量将混合后的菌接入发酵罐(含有Kan^R抗生素的TB培养基)中，维持温度在37℃±0.5℃，pH为6.7±0.1，通过调节通气量(20-100L·h^-1)和搅拌转速(100-600rpm)来将溶氧控制在10％-40％，对数初期时添加 0.1mM的IPTG作诱导剂，培养至对数后期下罐，菌体离心，作为反应的细胞备用。

将BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ppk2以不同接种比例混合发酵的湿菌体50mg在 42℃，pH为7条件下与L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L- 半胱氨酸盐酸盐120mM、ATP 5mM、六偏磷酸钠60mM、100mL去离子水中反应，建立 ATP再生耦合谷胱甘肽合成系统，2.5h后取样，8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC 检测谷胱甘肽的产量和ATP、ADP以及AMP的含量。如图4所示，接种比例为3:2-2:1可达到93％以上转化率且ATP有效利用的效果。接种比例在5:4和5:2之间可以有效完成工艺。

通过试验确定最佳培养条件，并将反应体系进行放大，实验过程如下：

将BL21-pET30a-GshF与BL21-pET30a-ppk2分别过夜活化后按照2：1的比例混合后以 10％的接种量接入发酵罐(含有Kan^R抗生素的TB培养基)中，维持温度在37℃±0.5℃，pH为6.7±0.1，通过调节通气量(20-100L·h^-1)和搅拌转速(100-600rpm)来控制溶氧范围在 10％-40％，对数初期时添加0.1mM的IPTG作诱导剂，发酵至对数后期下罐，菌体离心，作为反应的细胞备用。

将BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ppk2混合发酵的湿菌体25g在42℃，pH为7条件下与L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐120 mM和ATP 5mM、60mM六偏磷酸钠、50L去离子水，建立ATP再生耦合谷胱甘肽合成系统，2.5h后取样，8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量。得到谷胱甘肽34.22g/L，转化率达到93.77％。

实施例四、非ATP耦合系统中ATP消耗量的优化

将BL21-pET30a-GshF发酵的湿菌体50mg在42℃，pH为7条件下与L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐120mM、100mL去离子水，与不同量的ATP(80mM、120mM、150mM、180mM、200mM)进行反应，2.5h后取样， 8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量。

如图5所示，添加150mM的ATP能够达到最大的产量，而更低的ATP显示出能量供应不足。因此，如若没有ATP再生系统，需要30倍的ATP才能达到同样的效果，产业化成本巨大。

实施例五、ATP再生系统之ack与ppk2比较分析

将BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ppk2以2：1混合发酵的湿菌体50mg在42℃，pH为7条件下与L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐120mM和ATP 5mM、60mM六偏磷酸钠、100mL去离子水，建立ATP再生耦合谷胱甘肽合成系统，2.5h后取样，8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量。可得到谷胱甘肽33.7g/L，转化率达到92.34％。

将BL21-pET30a-GshF和BL21-pET30a-ack(BL21-pET30a-ack的构建方法参考实施例一中BL21-pET30a-ppk2的构建过程)以2:1混合发酵的湿菌体50mg在42℃，pH为7条件下与L-甘氨酸140mM、L-谷氨酸钠140mM MgSO₄·7H₂O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐120 mM、乙酰磷酸二锂盐210mM、ATP 10mM、100mL去离子水，建立ATP再生耦合谷胱甘肽合成系统，2.5h后取样，8000rpm离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量。可得到谷胱甘肽31.69g/L，转化率达到86.84％。

由此可见，ack酶虽然可用于ATP的再生，但是成本高，转化能力弱，谷胱甘肽产量低。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 大连医诺生物股份有限公司

<120> 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> Streptococcus thermophilus来源的GshF基因序列

<400> 1

atgacattaa accaacttct tcaaaaactg gaagctacca gccctattct ccaagctaat 60

tttggaatcg agcgcgagag tctacgtgtc gataggcaag gacaactggt gcatacacct 120

cacccatcct gtctaggagc tcgtagtttc cacccctata ttcagactga tttttgcgag 180

tttcagatgg aactcatcac accagttgcc aaatctacta ctgaggctcg ccgatttctg 240

ggagctatta ctgatgtagc tggccgctct attgctacag acgaggttct ctggccttta 300

tccatgccac ctcgtctaaa ggcagaggag attcaagttg ctcaactgga aaatgacttc 360

gaacgccatt atcgtaacta tttggctgaa aaatacggaa ctaaactaca agctatctca 420

ggtatccact ataatatgga actgggtaaa gatttagttg aggccttgtt ccaagaaagt 480

ggtcagaccg atatgattgc cttcaaaaac gccctctatc ttaagctggc tcagaactac 540

ttgcgctacc gttgggtgat tacctatctc tttggggcct cacccatcgc cgaacaaggt 600

ttctttgacc aggaagttcc agaacctgtg cgttccttcc gtaacagtga ccacggctat 660

gtcaataagg aagagattca agtatccttt gtaagtctag aagattatgt ctcagccatt 720

gaaacctata tcgaacaagg agatttgaat gcagagaaag aattttactc agctgttcgt 780

ttccgtggac aaaaggttaa tcgttccttc cttgacaaag gaatcaccta cctagagttc 840

cgtaatttcg accttaaccc ttttgagcgt atcggtatta gtcagactac tatggacact 900

gtgcacttac tcattttagc cttcctttgg cttgatagcc ctgaaaatgt cgaccaagct 960

cttgcacaag gccacgcgtt aaatgagaaa attgccctct ctcatcctct agaacctcta 1020

ccttcggagg ctaaaactca ggacattgta actgccctag accaactggt gcaacacttt 1080

ggacttggtg actatcatca agatctggtt aagcaagtta aggcagcctt tgcggatcca 1140

aatcaaacgc tctctgccca gctcttaccc tatatcaaag acaaatctct agccgaattt 1200

gctttaaaca aggctcttgc ctatcatgat tacgactgga ctgcccacta tgctctcaag 1260

ggctatgaag agatggaact ctccacccag atgttgctct ttgatgccat ccaaaagggg 1320

attcactttg aaatattgga tgagcaagat caattcctaa aactttggca ccaagaccat 1380

gttgaatacg tcaaaaacgg taacatgacc tcaaaagaca actacgtggt tccccttgct 1440

atggctaata agaccgtaac caagaagatt ctagcagatg ctggctttcc agttccttca 1500

ggagacgaat ttaccagtct tgaggaagga cttgcctact accctcttat caaggataag 1560

caaattgttg tcaaacccaa gtcaactaac tttggtctgg gaatttccat tttccaagaa 1620

cctgccagtc ttgacaacta tcaaaaagcc cttgaaattg ctttcgcaga agatacctct 1680

gtccttgttg aagaatttat tccaggaacc gaataccgtt tcttcatctt ggatgggcgt 1740

tgtgaggctg ttcttctgcg tgtcgctgcc aatgttattg gtgatggcaa acacaccatt 1800

cgtgaactag tcgctcagaa aaatgctaat ccattgcgtg gccgtgatca ccggtcacct 1860

ctggaaatca ttgagctagg agacatcgaa caactaatgt tagctcaaca gggttacaca 1920

cctgatgata ttctcccaga aggaaaaaag gtcaatctgc gtcgtaattc caacatctct 1980

acaggtggtg actctattga tatcactgag accatggatt cctcttacca agaattagcc 2040

gcagccatgg caactagcat gggcgcctgg gcttgcgggg ttgatctgat aattccagat 2100

gaaactcaaa ttgccaccaa ggaaaatcct cattgcacct gcattgagct caactttaac 2160

ccttcgatgt atatgcacac ctactgtgct gagggtcctg gccaagctat cactactaaa 2220

atcctagata aactttttcc agaaatagtg gctggtcaaa cttaa 2265

<210> 2

<211> 2271

<212> DNA

<213> 密码子优化后的GshF基因序列

<400> 2

atggagctca ccctgaacca actgctgcag aaactggagg caacaagccc gatcctgcag 60

gccaacttcg gcatcgagcg cgagagcctg cgtgtggacc gtcagggcca gctggtgcat 120

acacctcatc cgagttgcct gggcgcacgt agctttcacc cgtatatcca aaccgacttc 180

tgcgagttcc aaatggaact gattacaccg gttgccaaga gtaccaccga ggcacgccgt 240

ttcttaggcg ccattaccga cgttgccggc cgtagcattg ccaccgatga ggtgttatgg 300

ccgctgagca tgccgccgcg tttaaaagcc gaggaaattc aggtggccca actggaaaac 360

gacttcgagc gccactaccg caattacctg gccgagaaat atggcaccaa actgcaggcc 420

atcagtggca ttcactacaa catggaactg ggcaaagatt tagtggaggc actgtttcag 480

gaaagcggcc agaccgacat gatcgccttt aagaacgccc tgtatctgaa gctggcccag 540

aactatctgc gctaccgctg ggttatcacc tacctgttcg gtgccagtcc gattgcagaa 600

cagggctttt tcgaccagga agttccggag ccggttcgta gtttccgtaa cagcgaccac 660

ggctacgtga acaaggaaga gattcaagtg agttttgtga gtctggagga ttacgttagc 720

gccattgaaa cctacatcga gcagggtgat ctgaacgccg aaaaagagtt ttatagtgca 780

gtgcgctttc gtggccagaa agtgaatcgc agcttcctgg acaaaggcat cacctatctg 840

gaatttcgta attttgatct gaacccgttc gagcgcattg gcattagcca gaccaccatg 900

gacaccgttc atctgctgat cctggcattc ctgtggttag atagcccgga aaacgtggat 960

caggcactgg cccagggtca cgcactgaat gagaagatcg ccctgagcca tcctctggag 1020

ccgctgccga gcgaggcaaa gacccaggac attgtgaccg ccttagacca actggtgcaa 1080

cactttggcc tgggcgacta ccaccaggac ctggtgaagc aagtgaaagc agcctttgca 1140

gatccgaacc aaacactgag tgcccagctg ttaccgtaca tcaaggacaa gagcctggcc 1200

gagttcgcac tgaataaagc cctggcctac catgactatg attggaccgc ccactatgcc 1260

ctgaagggtt atgaggagat ggagctgagc acccaaatgc tgttatttga cgccattcaa 1320

aaaggcattc acttcgaaat cttagatgag caggatcagt ttctgaagct gtggcaccag 1380

gaccatgtgg aatatgtgaa aaacggtaac atgaccagta aggataatta cgtggttccg 1440

ctggccatgg caaacaaaac cgtgaccaag aaaatcctgg ccgacgccgg ctttccggtg 1500

ccgagtggcg atgaattcac cagcctggaa gaaggtctgg catactatcc gctgatcaaa 1560

gacaaacaaa ttgttgttaa accgaaaagc accaactttg gtctgggcat cagcatcttt 1620

caggaaccgg ccagcctgga taattaccaa aaagcattag aaatcgcctt cgcagaagat 1680

acaagcgttc tggtggagga gtttatcccg ggcaccgaat atcgcttttt tatcctggat 1740

ggtcgttgtg aagccgttct gttacgcgtt gcagcaaacg tgattggtga cggcaaacac 1800

acaattcgcg aactggtggc ccagaagaac gcaaatccgc tgcgcggccg cgatcatcgt 1860

agccctctgg aaatcatcga gctgggtgat atcgagcagc tgatgctggc ccagcagggc 1920

tacacccctg atgatatctt accggaaggc aagaaagtga acctgcgccg taacagcaac 1980

atcagcacag gtggcgacag cattgacatc acagaaacca tggacagcag ctatcaggaa 2040

ctggcagcag ccatggccac cagtatgggc gcctgggcat gtggcgttga tctgatcatc 2100

ccggatgaaa cccagatcgc caccaaagaa aatccgcact gcacctgcat cgaactgaac 2160

ttcaacccga gcatgtacat gcatacctac tgcgcagagg gtccgggtca ggcaattacc 2220

acaaaaatct tagataaact gtttccggag attgtggcag gccaaaccta a 2271

<210> 3

<211> 1011

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides来源的ppk2基因序列

<400> 3

atggccgaag accgcgcgat gcccgtgatg ccgcctgccg cagacgcggc cgaggcggtg 60

cctgccgccc ccacggccct gccggaagag gggcccgcag ggcccgaggc ccctcttcag 120

acgctgcacg gaccgcgcca tttcccggcc gtggatgcga atgcgatacg gcaggccttc 180

gagggcgggc attatcccta tccgcgccgg ttgggccgcg tggtctacga ggccgagaaa 240

gccagattgc aggccgaact gctgaaggtg cagatctggg cgcaggagac cgggcagaag 300

ttcgtcatcc tgatggaagg gcgcgacgcc gccggcaagg gtggcacgat caagcgcttc 360

atggagcatc tcaatccgcg ctatgcccgc gtcgtggccc tgaccaagcc cggcgagcgc 420

gagcgcggcc aatggttctt tcagcgctat atcgaacatc tgccgaccgc gggcgagatc 480

gtctttttcg accgcagctg gtataaccgc gcgggcgtcg agcgggtgat ggggttctgc 540

accccctcgg aatatctcga attcatgcgc caggcgcccg agctcgagcg gatgctggtc 600

cgctcgggga tccggctcta caaatactgg ttctcggtga cgcgcgacga acagcgcgcc 660

cgcttcctcg cccgcgagac cgatcccctg aaacgctgga agctctcgcc catcgacaag 720

gcgagcctcg acaagtggga cgattatacc gaggcgaagg aggcgatgtt cttctacacc 780

gacacggccg atgcgccctg gaccatcgtc aagtccaacg acaagaagcg cgcgcggctg 840

aactgcatgc ggcacttcct gtcgagcctc gactatccgg gcaaggaccc ggaggtggtg 900

ggcgtgcccg atccgctgat cgtgggacgt gcggcgcagg tgatcggcac ggcggccgac 960

atcctcgaca gcgccacgcc gcccgcgctg cgcaagccgc gtcagggatg a 1011

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 密码子优化后的ppk2基因序列

<400> 4

atggccgaag atcgtgctat gccggttatg ccgccggctg ctgacgctgc tgaagccgtc 60

ccggccgctc cgaccgccct gccggaagaa ggtccggcag gtccggaagc accgctgcaa 120

accctgcatg gtccgcgtca ctttccggca gttgatgcga acgccattcg ccaggctttc 180

gaaggcggtc attatccgta cccgcgtcgc ctgggccgtg tggtttatga agcggaaaaa 240

gcccgcctgc aggcagaact gctgaaggtc cagatttggg cgcaagaaac cggtcagaaa 300

tttgtgatcc tgatggaagg ccgtgatgcg gccggtaaag gcggtacgat caagcgcttc 360

atggaacatc tgaacccgcg ttatgcacgc gtcgtggctc tgaccaaacc gggcgaacgt 420

gaacgcggtc aatggttttt ccagcgttac attgaacacc tgccgacggc cggcgaaatc 480

gtgtttttcg atcgcagctg gtataatcgt gcaggcgtgg aacgcgttat gggtttttgc 540

accccgtctg aatacctgga atttatgcgt caagcgccgg aactggaacg tatgctggtt 600

cgctcaggta ttcgtctgta taaatactgg ttttcggtca cccgcgatga acagcgtgca 660

cgcttcctgg cccgtgaaac ggacccgctg aaacgctgga agctgagtcc gattgataaa 720

gcgtccctgg acaagtggga tgactatacc gaagcaaaag aagctatgtt tttctacacc 780

gatacggcag acgctccgtg gacgatcgtg aagtccaacg ataaaaagcg tgcccgcctg 840

aattgtatgc gtcactttct gagctctctg gattatccgg gcaaagaccc ggaagttgtc 900

ggtgtcccgg acccgctgat tgtgggtcgt gcagctcagg ttatcggtac cgctgccgac 960

attctggact ccgccacccc gccggccctg cgtaaaccgc gtcaaggttg a 1011

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> GshF-F

<400> 5

ctttaagaag gagatataca tatgaccctg aaccaactgc 40

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> GshF-R

<400> 6

gtggtggtgg tggtggtgct cgagttaggt ttggcctgcc acaatc 46

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> ppk2-F

<400> 7

ctttaagaag gagatataca tatggccgaa gatcgtgcta tg 42

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> ppk2-R

<400> 8

gtggtggtgg tggtggtgct cgagtcaacc ttgacgcggt ttac 44

Claims

1.一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，步骤包括：分别将GshF基因和ppk2基因整合到质粒载体上，获得含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌，二者以5:4-5:2的比例混合培养获得混菌细胞。

2.根据权利要求1所述的用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，所述含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌以3:2-2:1比例混合培养。

3.根据权利要求1所述的用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，所述含有GshF基因的大肠杆菌的制备方法包括：利用质粒载体将密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因GshF转化大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，所述含有ppk2基因的大肠杆菌的制备方法包括：利用质粒载体将密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因ppk2转化大肠杆菌。

5.根据权利要求3或4任一项所述的用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，所述质粒载体为pET-30a。

6.根据权利要求1所述的用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺，其特征在于，所述混合培养的方法是：将活化后的含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌按照5:4-5:2的比例混合后，以8％-12％体积比的接种量接种，在37±0.5℃，pH为6.7±0.1，通气量20-100L·h^-1、搅拌转速100-600rpm，使溶氧控制在10％-40％，发酵至对数后期收集菌体得混菌细胞。

7.如权利要求1所述工艺在生产谷胱甘肽中的应用，其特征在于，所述含有GshF基因的大肠杆菌和含有ppk2基因的大肠杆菌混合培养获得的混菌细胞在37-45℃，pH为6-7.5条件下，通过诱导表达，催化合成还原型谷胱甘肽。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述混菌细胞在40-42℃，pH为6.5-7.0条件下，通过诱导表达，催化合成还原型谷胱甘肽。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化合成还原型谷胱甘肽中使用的底物为L-甘氨酸130-150mM、L-谷氨酸钠130-150mM、MgSO₄·7H₂O 60-80mM、L-半胱氨酸盐酸盐110-130mM、ATP 3-7mM、六偏磷酸钠50-70mM。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述催化合成还原型谷胱甘肽中使用的底物为L-甘氨酸135-145mM、L-谷氨酸钠135-145mM、MgSO₄·7H₂O 65-75mM、L-半胱氨酸盐酸盐115-125mM、ATP 4-6mM、六偏磷酸钠55-65mM。