CN111979206A - 固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents

固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法。本发明分别将谷胱甘肽合成酶基因、三磷酸腺苷再生酶基因与几丁质蛋白结构域基因连接、表达制备融合酶，利用几丁质载体能很专一、牢固的结合几丁质蛋白结构域，实现一步纯化固定化谷胱甘肽合成融合酶、三磷酸腺苷再生融合酶，该工序简单，固定化酶空间密度高。本发明制备的固定化融合酶，酶活性高可实现连续化生成谷胱甘肽，本发明采用固定化融合酶分批、连续的工艺路线，可生成高达31g/L的谷胱甘肽，目标产物浓度高，产物溶液中没有酶的残留、极大的简化了后期纯化工艺。

Description

固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸连接而成的一种天然三肽化合物，其分子式为C10H17N3O6S,分子量为307.3。GSH广泛存在于动、植物中，在生物体内起着重要的抗氧化功能。由于GSH里活泼的巯基-SH易被氧化脱氢，因而可以清除体内的自由基；与此同时，GSH还能提高人体免疫力、维护健康、抗衰老、以及让老人细胞迟缓化上都有功效；再加上广谱解毒作用，因此，谷胱甘肽不仅被应用于安全的药物添加辅料，而且被广泛用做功能性食品的基料，以及在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品中。
谷胱甘肽工业制备包含有天然产物分离法、化学合成法、微生物发酵法以及酶催化制备法。由于谷胱甘肽广泛存在于各种动植物体内，其最初的制备则主要是从大量的植物提取液里进行分离纯化，由于该方法分离程序繁琐、产率低，后来很快被更有效的化学合成法替代。化学法虽然成功的实现了谷胱甘肽的大量制备，但是其固有的两个劣势限制了其普遍应用：一是制备过程中氨基酸官能团选择性保护、脱保护程序大大的提高了其制备成本，二是由于化学合成法制备固有的不安全性严重的制约了其产品在食品、药品添加剂等领域的应用。因此，谷胱甘肽发酵法以及酶合成法成为其工业生产的主要选择。酶法的催化效率高、生产周期短、纯化方法更加节能环保、生产成本更低，因此酶法生产谷胱甘肽具有广阔发展前景。自然界中存在不少的谷胱甘肽合成酶,它通过利用三磷酸腺苷(ATP)活化进而将L-谷氨酸、L-半胱氨酸以及甘氨酸依次通过酰胺键合成谷胱甘肽。该合成酶一部分以GshA(EC 6.3.2.2)和GshB(EC 6.3.2.3)两种单功能酶形式存在，而另外一部分则以双功能酶GshAB(EC 6.3.2.2&EC 6.3.2.3)的形式存在；此外,通过多聚磷酸激酶PPK(Polyphosphate kinase,EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶Adk(Adenylate kinase,EC 2.7.4.3)、磷酸转移酶Pap(AMP phosphotransferase,EC 2.7.4.-)类三磷酸腺苷再生酶系利用多聚磷酸盐类实现三磷酸腺苷的循环再生。从而在合成酶 GshAB制备谷胱甘肽过程中大大减少三磷酸腺苷的使用量，进一步降低原料成本；
一方面酶法实现谷胱甘肽高效生产需要制备高纯度、高活力的酶，而规模化酶纯化工艺复杂，制备成本高；另一方面由于游离酶在水溶液中不稳定, 且只能一次性使用，难以回收。因此酶实际工业应用更倾向于采用固定化酶形式进行转化，因其具备以下几点明显的优势。(1)可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；(2)固定化酶极易与底物、产物分开；(3)酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高,对热、pH等的稳定性提高；(4)对抑制剂的敏感性降低，产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺；(5)酶反应过程能够严格控制酶的使用效率,成本降低。
现有技术大多采用游离的、未纯化的谷胱甘肽合成酶、ATP再生酶生产谷胱甘肽，液体酶一次性使用，无法实现其循环利用，这大大增加了酶的生产成本；与此同时，混合酶液中杂酶导致不少副产物的发生，再加上酶液自身与产品混合，因而不利于最终产品纯化；前期混合酶液制备过程中每批次的波动将影响最终产品的品质稳定性。部分技术也涉及固定化酶，常用的酶固定化的方法大多采用酶纯化后获得游离酶，再用吸附、包埋、共价结合等方式固定，其工艺繁琐、酶活回收率低。
因此，提供一种固定化酶及其制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法。本发明采用固定化融合酶分批、连续的工艺路线，可生成高达31g/L的谷胱甘肽，目标产物浓度高，产物溶液中没有酶的残留、极大的简化了后期纯化工艺。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了融合酶的组合物，包括：
(1)融合有谷胱甘肽合成酶与几丁质蛋白结合域的第一融合蛋白；和 (2)融合有包括三磷酸腺苷再生酶与几丁质蛋白结合域的第二融合蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述谷胱甘肽合成酶包括单功能合成酶GshA(EC 6.3.2.2)、GshB(EC 6.3.2.3)、双功能合成酶GshAB(EC 6.3.2.2&EC 6.3.2.3)中的一种或两者以上的酶。
在本发明的一些具体实施方案中，所述三磷酸腺苷再生酶包括多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(Adk,EC 2.7.4.3)、磷酸转移酶(Pap,EC 2.7.4.-)中的一种或两者以上的酶。
在本发明的一些具体实施方案中，几丁质蛋白结合域包括PF00942酶家族的成员，具体为Clostridium cellulovorans P38058，Clostridium Thermocellum 4B9F，Paenibacillus amylolyticus A0A1R1E3J9，Hungateiclostridium thermocellumEEU00265，Lachnoclostridium phytofermentans A9KJ82， Anaerocolumna jejuensisA0A1M6JI59，Lachnoclostridium phytofermentans A9KT91,Paenibacillus spA0A1H2W1K8，Paenibacillus odorifer A0A089MPB0，Paenibacillus kribbensisA0A222WU32或Hungateiclostridium saccincola A0A2S8R9S3。
在本发明的一些具体实施方案中，，所述第一融合蛋白：
(I)、具有如SEQ ID NO:1、2、3或4所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第二融合蛋白：
(IV)、具有如SEQ ID NO:5、6、7或8所示的氨基酸序列；或
(V)、如(IV)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(VI)、与(IV)或(V)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27 个、28个、29个、30个、31个或32个。
在上述研究的基础上，本发明还提供了表达所述的组合物中所述第一融合蛋白与所述第二融合蛋白的基因。
本发明还提供了含有所述基因的载体。
此外，本发明还提供了固定化融合酶的制备方法，以几丁质载体为固定化载体，纯化、固定所述组合物中所述第一融合蛋白和/或所述第二融合蛋白，获得固定化第一融合蛋白和/或固定化第二融合蛋白，所述固定化第一融合蛋白和/或固定化第二融合蛋白为固定化融合酶；
所述几丁质载体选自：几丁质树脂、几丁质磁性珠、甲壳素高聚体或甲壳素凝胶。几丁质蛋白结构域(Chitin Binding Domain,ChBD)的分子量小、结构稳定,该结构域可通过疏水作用与几丁质结合，专一性强、稳定性好、对目标蛋白影响小、酶活性高，由于ChBD结构域与几丁质载体结合紧密，因而可以方便的实现粗酶液的一次性纯化以及固定化。
本发明还提供了所述的制备方法制得的固定化融合酶。本发明提供的固定化融合酶可以为所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白混合后经固定化制得也可以分别制得固定化第一融合蛋白、固定化第二融合蛋白之后，包括所述固定化第一融合蛋白、固定化第二融合蛋白或所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白混合后经固定化制得的融合蛋白的组合物。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的固定化融合酶在制备谷胱甘肽中的应用。
此外，本发明还提供了固定化融合酶的组合物，包括所述的固定化融合酶，所述固定化第一融合蛋白与所述固定化第二融合蛋白的质量比为1： (0.05～20)。
在本发明的一些具体实施方案中，固定化融合酶的组合物中所述固定化第一融合蛋白与所述固定化第二融合蛋白的质量比为1：1、1：0.3、1：20、 20：1。
本发明还提供了谷胱甘肽的制备方法，取谷胱甘肽的合成原料经所述的固定化合成酶或所述的固定化融合酶的组合物催化，制得谷胱甘肽。
本发明采用一种新的方式一步完成酶纯化与固定化。在常用的酶纯化方式中，为了使目标蛋白易于纯化，常用的方法是融合表达亲和标签。与其它亲和标签相比，几丁质蛋白结构域(Chitin Binding Domain,ChBD)的分子量小、结构稳定，该结构域可通过疏水作用与几丁质结合，专一性强、稳定性好、对目标蛋白影响小、酶活性高，由于ChBD结构域与几丁质载体结合紧密，因而可以方便的实现粗酶液的一次性纯化以及固定化。本发明依据谷胱甘肽合成酶、三磷酸腺苷再生酶系的结构特点，将目标酶基因与几丁质结合域基因融合表达制备融合酶，通过几丁质载体一次性纯化固定，获得固定化融合酶，简化了酶纯化固定化工艺流程，极大的提高了酶的纯度，固定化单位活性密度高，催化效率高，同时固定化后对产物抑制性敏感度降低，可获得更高产物浓度的同时提高底物转化率，易于后期纯化。本发明制备的固定化融合酶，酶活性高可实现连续化生成谷胱甘肽，本发明采用固定化融合酶分批、连续的工艺路线，可生成高达31g/L的谷胱甘肽，目标产物浓度高，产物溶液中没有酶的残留、极大的简化了后期纯化工艺。本发明通过有效的整合了以上各方面的优势来生产谷胱甘肽，绿色指数高，易于规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示谷胱甘肽的合成路线及反应原理；
图2示实施例1中GshAB-ChBD(91.5KDa)与PPK-ChBD 52.8Kda的电泳结果；
图3示实施例1中纯化后谷胱甘肽(GSH)在600M Varian,D2O溶液核磁1H-NMR谱图；
图4示实施例1中纯化后谷胱甘肽(GSH)在600M Varian,D2O溶液核磁13C-NMR谱图；
图5示实施例1中实验组2纯化后谷胱甘肽纯品的高效液相色谱图；
图6示实施例1中对照组纯化后谷胱甘肽纯品的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明包括以下步骤：
1、构建谷胱甘肽合成酶与几丁质蛋白结合域(Chitin Binding Domain,ChBD) 融合蛋白表达基因，表达融合蛋白基因制备谷胱甘肽合成融合酶。
谷胱甘肽合成酶包括单功能合成酶GshA(EC 6.3.2.2)、GshB(EC 6.3.2.3)，双功能合成酶GshAB(EC 6.3.2.2&EC 6.3.2.3)中的一种或一种以上。
几丁质蛋白结合域包括(PF00942酶家族里的成员，譬如：Clostridiumcellulovorans P38058,Clostridium Thermocellum 4B9F,Paenibacillus amylolyticusA0A1R1E3J9,Hungateiclostridium thermocellum EEU00265,Lachnoclostridiumphytofermentans A9KJ82,Anaerocolumna jejuensis A0A1M6JI59, Lachnoclostridiumphytofermentans A9KT91,Paenibacillus sp A0A1H2W1K8, Paenibacillus odoriferA0A089MPB0,Paenibacillus kribbensis A0A222WU32, Hungateiclostridiumsaccincola A0A2S8R9S3等)。
2、构建三磷酸腺苷再生酶与几丁质蛋白结合域(Chitin Binding Domain, ChBD)融合蛋白表达基因，表达融合蛋白基因制备三磷酸腺苷再生融合酶。
三磷酸腺苷再生酶包括多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(Adk, EC2.7.4.3)、磷酸转移酶(Pap,EC 2.7.4.-)种的一种或多种。
几丁质蛋白结合域ChBD包括PF00942酶家族里的成员，例如：Clostridiumcellulovorans P38058,Clostridium Thermocellum 4B9F,Paenibacillus amylolyticusA0A1R1E3J9,Hungateiclostridium thermocellum EEU00265,Lachnoclostridiumphytofermentans A9KJ82,Anaerocolumna jejuensis A0A1M6JI59, Lachnoclostridiumphytofermentans A9KT91,Paenibacillus sp A0A1H2W1K8, Paenibacillus odoriferA0A089MPB0,Paenibacillus kribbensis A0A222WU32, Hungateiclostridiumsaccincola A0A2S8R9S3等)。
3、利用能与几丁质结合域特异结合的几丁质载体纯化及固定谷胱甘肽合成融合酶、三磷酸腺苷再生融合酶，制备固定化谷胱甘肽合成融合酶及固定化三磷酸腺苷再生融合酶。
几丁质载体包括选自：几丁质树脂、几丁质磁性珠、甲壳素高聚体、甲壳素凝胶等
4、利用固定化谷胱甘肽合成融合酶及固定化三磷酸腺苷再生融合酶生产制备谷胱甘肽，分离纯化谷胱甘肽。
固定化谷胱甘肽合成融合酶与固定化三磷酸腺苷再生融合酶之间质量比为1：0.05～1：20。
反应过程可以在反应罐中分批反应，也可以采用反应柱连续反应，连续反应可以是多根酶反应柱串联也可以是单根酶反应柱多次循环。
本发明分别将谷胱甘肽合成酶基因、三磷酸腺苷融合酶基因与几丁质蛋白结构域基因连接、表达制备融合酶，利用几丁质载体能很专一、牢固的结合几丁质蛋白结构域，实验一步纯化固定化谷胱甘肽合成融合酶、三磷酸腺苷再生融合酶，该工序简单，固定化酶空间密度高。本发明制备的固定化融合酶，酶活性高可实现连续化生成谷胱甘肽，本发明采用固定化融合酶分批、连续的工艺路线，可生成高达31g/L的谷胱甘肽，目标产物浓度高，产物溶液中没有酶的残留、极大的简化了后期纯化工艺。
表1
Figure RE-GDA0002130379840000071
Figure RE-GDA0002130379840000081
Figure RE-GDA0002130379840000091
本发明提供的固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
构建谷胱甘肽双功能酶(GshAB)EC 6.3.2.2与几丁质蛋白结合域(ChitinBinding Domain,Clostridium cellulovorans来源的P38058)融合蛋白表达基因 (GshAB-P38058)。GshAB-P38058蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
构建多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)与几丁质蛋白结合域(Chitin BindingDomain,Paenibacillus amylolyticus来源的A0A1R1E3J9)， PPK-A0A1R1E3J9蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司) 酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
构建腺苷酸激酶(Adk,EC 2.7.4.3)与几丁质蛋白结合域(Chitin BindingDomain,Paenibacillus odorifer来源的A0A089MPB0)，Adk-A0A089MPB0 蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到 pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
上述构建好的质粒分别转入E.coli JM109菌株(上海唯地生物)，确认正确的菌落培养到含100uM氨苄青霉素的LB培养液中，LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸二氢钾以及5％的甘油；当细胞增长至对数中后期迅速降温至15°，加入0.2mM异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在15℃诱导蛋白表达20小时，离心收集湿菌体 (GshAB-P38058、PPK-A0A1R1E3J9、Adk-A0A089MPB0)。
称取100g GshAB-P38058湿细胞，用1000ml溶液(含20mM Tris pH7.5) 重悬后经高压破碎得粗酶液，粗酶液活力为120U/ml，SDS-Page电泳见图2。 (将1分钟生成1μmol产物所需要的酶量定义为1个活性单位U)。在1000ml 粗酶液中加入25g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化GshAB-P38058 融合酶，活力为4416U/g(酶活回收92％)。
称取100g PPK-A0A1R1E3J9湿细胞，用1000ml溶液(20mM Tris pH7.5) 重悬后经高压破碎得粗酶液，粗酶液活力为180U/ml，SDS-Page电泳见图2。 (将1分钟生成1μmol产物所需要的酶量定义为1个活性单位U)。在1000ml 粗酶液中加入30g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶，活力为5400U/g(酶活回收90％)
称取100g Adk-A0A089MPB0湿细胞，用1000ml溶液(20mM Tris pH 7.5) 重悬后经高压破碎得粗酶液，粗酶液活力为450U/ml。(将1分钟生成1μmol 产物所需要的酶量定义为1个活性单位U)。在1000ml粗酶液中加入55g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化Adk-A0A089MPB0融合酶，活力为6954U/g(酶活回收85％)
实验组1：在100L反应罐中配制135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM 甘氨酸，20mM MgCl2，10mM ATP，270mM 多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5，反应液体积为80L，加入上述固定化GshAB-P38058 融合酶200g，固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶150g，固定化 Adk-A0A089MPB0融合酶49.8g，37℃搅拌下反应3h，生成谷胱甘肽92mM (28g/L)，氨基酸底物转化率达68％，反应液经筛网与固定化酶分离后无需除蛋白、脱色等处理，直接经阴阳离子交换吸附洗脱，浓缩后经乙醇结晶干燥获得谷胱甘肽纯品1.5kg，回收率70％，谷胱甘肽产品纯度99.3％，谷胱甘肽产品核磁谱图见图3、图4。反应后的固定化GshAB-P38058融合酶酶活为 4327U/g，固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶酶活为5346U/g，固定化 Adk-A0A089MPB0融合酶酶活为6884U/g。经30批次反应后，固定化 GshAB-P38058融合酶酶活为3974U/g，固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶酶活为4860U/g，固定化Adk-A0A089MPB0融合酶酶活为6258U/g。
实验组2：连续催化反应
将上述固定化GshAB-P38058融合酶、固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶、固定化Adk-A0A089MPB0融合酶按质量比4：3：1填充到玻璃柱中(柱径10 厘米，柱长100厘米)，即得固定化酶柱，然后将原料预混液(135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM 甘氨酸，20mMMgCl2，10mM ATP，270mM 多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5)预热至37℃，以流速2L/min通入柱子，收集流出液，流出液含谷胱甘肽101mM(31g/L)，底物转化率达75％，反应3h收集反应流出液360L,流出液直接经离子交换树脂吸附洗脱，浓缩后经乙醇结晶干燥获得谷胱甘肽纯品8.03kg，回收率72％，纯化后的谷胱甘肽产品经液相色谱分析纯度99.2％，如图5。固定化酶柱连续反应30天，固定化GshAB-P38058融合酶剩余80％，酶活为3532U/g，固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶剩余85％，酶活为4590U/g、固定化 Adk-A0A089MPB0融合酶剩余酶活88％，酶活为6119U/g。
对照组：
在100L反应罐中配制135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM 甘氨酸，20mMMgCl2，10mM ATP，270mM多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5，加入上述GshAB-P38058粗酶液7.36L，PPK-A0A1R1E3J9粗酶液4.5L，Adk-A0A089MPB0粗酶液0.78L，定容至80L。37℃搅拌下反应 3h，生成谷胱甘肽60mM(18.4g/L)，氨基酸底物转化率44％。反应后酶液无法重复利用。反应液经调酸除蛋白、超滤、脱色过滤等处理后，经离子交换树脂吸附洗脱，浓缩后经乙醇结晶干燥获得谷胱甘肽纯品0.85kg，回收率 58％，纯化后谷胱甘肽产品经液相色谱分析如图6，纯度98.3％。
由实验组1、实验组2与对照组比较可以看出，经本发明制备的固定化酶催化反应与游离粗酶反应比较，固定化酶对产品的敏感性降低可耐受更高浓度的产物，生成的谷胱甘肽浓度显著提高(28g/L，P＜0.05)，底物氨基酸的转化率更高(80％，P＜0.05)，底物氨基酸转化率高，固定化酶易与反应液分离，纯化工艺更简单，产品纯度更高99.3％(P＜0.05)。实验组2的连续酶催化反应，可实现连续化生产谷胱甘肽，生成的谷胱甘肽浓度可达31g/L(与对照组相比，P＜0.05)，底物氨基酸的转化率可达75％(与对照组相比， P＜0.05)。
实施例2
构建谷胱甘肽双功能酶(GshAB)EC 6.3.2.2与几丁质蛋白结合域(ChitinBinding Domain,Clostridium Thermocellum来源的4B9F)融合蛋白表达基因 (GshAB-4B9F)。GshAB-4B9F蛋白序列见附表1,基因合成后通过NdeI与XhoI (NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
构建多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)与几丁质蛋白结合域(Chitin BindingDomain,Paenibacillus amylolyticus来源的A0A1R1E3J9)， PPK-A0A1R1E3J9蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司) 酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
将上述质粒按实施例1的方法经诱导表达后制备GshAB-4B9F湿菌体、 PPK-A0A1R1E3J9湿菌体。
称取100g GshAB-4B9F湿细胞，用1000ml溶液(含20mM Tris pH7.5) 重悬后经高压破碎得粗酶液，粗酶液活力为110U/ml。在1000ml粗酶液中加入50g几丁质磁性珠在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化GshAB-4B9F融合酶，活力为1804U/g (酶活回收82％)。
称取100g PPK-A0A1R1E3J9湿细胞，用1000ml溶液(20mM Tris pH 7.5) 重悬后经高压破碎得粗酶液，粗酶液活力为150U/ml。在1000ml粗酶液中加入45g几丁质磁性珠在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶，活力为 2833U/g(酶活回收85％)。
将上述固定化GshAB-4B9F融合酶与固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶按重量1：0.5填充到玻璃柱中(柱径10厘米，柱长100厘米)，即得固定化酶柱，然后将原料预混液(135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM甘氨酸， 20mM MgCl2，10mM ATP，270mM 多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至 7.5)预热至37℃，以流速0.8L/min通入柱子，收集流出液，流出液含谷胱甘肽98mM(30g/L)，反应8h收集反应流出液384L，反应流出液经离子交换树脂吸附洗脱，浓缩后乙醇水溶液结晶干燥获得谷胱甘肽纯品5.7kg，回收率 62％，产品纯度98.8％。固定化酶柱连续反应30天，固定化GshAB-4B9F融合酶活性剩余80％，酶活为1443U/g，固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶活性剩余90％，酶活为2549U/g。
实施例3
构建谷胱甘肽单功能合成酶GshA(EC 6.3.2.2)与几丁质蛋白结合域(来源的A0A173MZQ9)融合蛋白表达基因(GshA-A0A173MZQ9)。 GshA-A0A173MZQ9蛋白序列见附表1,基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB 公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
构建谷胱甘肽单功能合成酶GshB(EC 6.3.2.3)与几丁质蛋白结合域(来源的A0A173MZQ9)融合蛋白表达基因(GshB-A0A173MZQ9)。 GshB-A0A173MZQ9蛋白序列见附表1,基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB 公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
构建多聚磷酸激酶(PPK,EC 2.7.4.1)与几丁质蛋白结合域(Chitin BindingDomain,Clostridium Thermocellum来源的4B9F)，PPK-4B9F蛋白序列见附表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本 TaKaRa公司)质粒上。
构建磷酸转移酶(Pap,EC 2.7.4.-)与几丁质蛋白结合域(Clostridiumcellulovorans来源的P38058)，Pap-P38058蛋白序列见表1。基因合成后通过 NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。
将上述质粒按实施例1的方法制备GshA-A0A173MZQ9粗酶液(酶活为 80U/ml)、GshB-A0A173MZQ9粗酶液(酶活为153U/ml)、PPK-4B9F粗酶液 (酶活为130U/ml)、Pap-P38058粗酶液(酶活为125U/ml)。
在1000ml GshA-A0A173MZQ9粗酶液中加入30g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化GshA-A0A173MZQ9融合酶，活力为2131U/g(酶活回收80％)。
在1000ml GshB-A0A173MZQ9粗酶液中加入30g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化GshB-A0A173MZQ9融合酶，活力为4335U/g(酶活回收85％)。
在1000ml PPK-4B9F粗酶液中加入40g几丁质磁性珠在4℃轻微搅拌2 小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化 PPK-4B9F融合酶，活力为2860U/g(酶活回收88％)。
在1000ml Pap-P38058粗酶液中加入30g几丁质珠树脂(NEB公司)在4℃轻微搅拌2小时进行融合酶的纯化、固定，最终过滤、洗涤、4℃保存待用，即得固定化Pap-P38058融合酶，活力为3750U/g(酶活回收90％)。
将上述固定化GshA-A0A173MZQ9融合酶、固定化PPK-4B9F融合酶、固定化Pap-P38058融合酶按重量1：0.2：0.1填充到玻璃柱中(柱径10厘米，柱长100厘米)，即得固定化酶A柱。将上述固定化GshB-A0A173MZQ9融合酶、固定化PPK-4B9F融合酶、固定化Pap-P38058融合酶按重量1：0.4： 0.2填充到玻璃柱中(柱径10厘米，柱长100厘米)，即得固定化酶B柱。A 柱与B柱串联，将原料预混液(135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135 mM甘氨酸，20mMMgCl2，10mM ATP，270mM多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5)预热至38℃，以流速0.5L/min依此通入A、B柱子，收集B 柱子流出液，流出液含谷胱甘肽97mM(29.8g/L)，反应8h收集反应流出液 240L，反应流出液经离子交换树脂吸附洗脱，浓缩后乙醇水溶液结晶干燥获得谷胱甘肽纯品5.0kg。固定化酶柱连续反应30天，固定化 GshA-A0A173MZQ9融合酶活性剩余75％，酶活为1599U/g，固定化 GshB-A0A173MZQ9融合酶活性剩余85％，酶活为3684U/g固定化PPK-4B9F 融合酶活性剩余90％，酶活为2574U/g、固定化Pap-P38058融合酶活性剩余82％，酶活为3075U/g。
实施例4
构建谷胱甘肽双功能酶(GshAB)EC 6.3.2.2与几丁质蛋白结合域(ChitinBinding Domain,Paenibacillus amylolyticus来源的A0A1R1E3J9)融合蛋白表达基因(GshAB-A0A1R1E3J9)。GshAB-A0A1R1E3J9蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。将构建好的质粒按实施例1的方法制备固定化 GshAB-A0A1R1E3J9融合酶，活力为5112U/g。
在100L反应罐中配制135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM 甘氨酸，20mMMgCl2，10mM ATP，270mM多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5，反应液体积为80L，加入上述制备的固定化GshAB-A0A1R1E3J9 融合酶20g，实施例2制备的固定化PPK-A0A1R1E3J9融合酶200g，实施例1制备的固定化Adk-A0A089MPB0融合酶200g，37℃搅拌下反应3h，生成谷胱甘肽80mM(24.5g/L)，反应液经筛网与固定化酶分离后无需除蛋白、脱色等处理，直接经阴阳离子交换吸附洗脱，浓缩后经乙醇结晶干燥获得谷胱甘肽纯品1.3kg，回收率70％。
实施例5
构建谷胱甘肽双功能酶(GshAB)EC 6.3.2.2与几丁质蛋白结合域(ChitinBinding Domain,Hungateiclostridium thermocellum来源的EEU00265)融合蛋白表达基因(GshAB-EEU00265)。GshAB-EEU00265蛋白序列见表1，基因合成后通过NdeI与XhoI(NEB公司)酶切亚克隆到pColdIII(日本TaKaRa公司)质粒上。将构建好的质粒按实施例1的方法制备固定化GshAB-EEU00265 融合酶，活力为2985/g。
在100L反应罐中配制135mM L-谷氨酸，135mM L-半胱氨酸，135mM 甘氨酸，20mMMgCl2，10mM ATP，270mM多聚磷酸(以单磷酸计)，调节pH至7.5，反应液体积为80L，加入上述制备的固定化GshAB-EEU00265 融合酶300g，实施例3中制备的固定化PPK-4B9F融合酶15g，37℃搅拌下反应3h，生成谷胱甘肽66mM(20.2g/L)，反应液经筛网与固定化酶分离后无需除蛋白、脱色等处理，直接经阴阳离子交换吸附洗脱，浓缩后经乙醇结晶干燥获得谷胱甘肽纯品1.01kg，回收率63％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司
<120> 固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法
<130> S18P2857
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 923
<212> PRT
<213> gshAB-P38058
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Ser Leu Arg Ile His Gln
20 25 30
Pro Thr Gln Arg Val Ala Gln Thr Pro His Pro Lys Thr Leu Gly Ser
35 40 45
Arg Asn Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala Lys Asp Ser Gln Glu Ala Ile Arg Phe
65 70 75 80
Leu Lys Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Asn His Asp Glu
85 90 95
Tyr Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Val Arg Glu Glu Asp Ile
100 105 110
Gln Ile Ala Gln Leu Glu Asp Ala Phe Glu Tyr Asp Tyr Arg Lys Tyr
115 120 125
Leu Glu Lys Thr Tyr Gly Lys Leu Ile Gln Ser Ile Ser Gly Ile His
130 135 140
Tyr Asn Leu Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Glu Leu
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Ser Gln Ala Asp Asn Ala Ile Asp Phe Gln Asn Gln Leu Tyr Met Lys
165 170 175
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210 215 220
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275 280 285
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405 410 415
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515 520 525
Ser Thr Asn Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ile Phe Lys Thr Ser Ala Asn
530 535 540
Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ile Asp Ile Ala Phe Thr Glu Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Leu Val Glu Glu Tyr Ile Glu Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe
565 570 575
Val Leu Glu Gly Asp Cys Ile Ala Val Leu Leu Arg Val Ala Ala Asn
580 585 590
Val Val Gly Asp Gly Ile His Thr Ile Ser Gln Leu Val Lys Leu Lys
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Asn Gln Asn Pro Leu Arg Gly Tyr Asp His Arg Ser Pro Leu Glu Val
610 615 620
Ile Glu Leu Gly Glu Val Glu Gln Leu Met Leu Glu Gln Gln Gly Tyr
625 630 635 640
Thr Val Asn Ser Ile Pro Pro Glu Gly Thr Lys Ile Glu Leu Arg Arg
645 650 655
Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp Val Thr Asn Thr
660 665 670
Met Asp Pro Thr Tyr Lys Gln Leu Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Met
675 680 685
Gly Ala Trp Val Cys Gly Val Asp Leu Ile Ile Pro Asn Ala Thr Gln
690 695 700
Ala Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Asn Ala Thr Cys Ile Glu Leu Asn Phe
705 710 715 720
Asn Pro Leu Met Tyr Met His Thr Tyr Cys Gln Glu Gly Pro Gly Gln
725 730 735
Ser Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Leu Ser Ser
740 745 750
Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Leu Thr Ile Gln Ser Phe Asn Gly
755 760 765
Asn Thr Ser Ala Ser Thr Asn Gly Val Ser Pro Lys Phe Lys Leu Val
770 775 780
Asn Ser Gly Asn Ser Asp Ile Pro Leu Ser Asp Val Lys Leu Arg Tyr
785 790 795 800
Tyr Tyr Thr Ile Asp Gly Glu Glu Ala Gln Ser Phe Trp Ser Asp Trp
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Ala Ser Met Gly Ser Ala Asn Val Thr Ser Asn Phe Val Lys Leu Ala
820 825 830
Thr Pro Val Thr Gly Ala Asp His Tyr Leu Glu Val Gly Phe Thr Ser
835 840 845
Ala Ala Gly Ser Leu Asn Ala Gly Gln Ser Ala Glu Ile Gln Thr Arg
850 855 860
Phe Ser Lys Asn Asn Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn Asp Tyr Ser
865 870 875 880
Phe Lys Ala Thr Gly Ser Gln Phe Ala Asn His Asp Lys Val Thr Gly
885 890 895
Tyr Val Asn Gly Gln Leu Val Trp Gly Ile Glu Pro
900 905
<210> 10
<211> 914
<212> PRT
<213> GshAB- EEU00265
<400> 10
Met Ile Ile Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ser His Ser His Leu Pro Ile
1 5 10 15
Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Ser Leu Arg Ile His Gln
20 25 30
Pro Thr Gln Arg Val Ala Gln Thr Pro His Pro Lys Thr Leu Gly Ser
35 40 45
Arg Asn Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala Lys Asp Ser Gln Glu Ala Ile Arg Phe
65 70 75 80
Leu Lys Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Asn His Asp Glu
85 90 95
Tyr Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Val Arg Glu Glu Asp Ile
100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Ser Lys Ala Cys Arg Asn Tyr Leu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Asp Ile Lys Glu Ala Asn Arg Leu Asn Asp Leu Ile Ala Leu Ser His
325 330 335
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340 345 350
Ala Met Gln Ser Val Ile Gln His Phe Asn Leu Ser Pro Tyr Tyr Gln
355 360 365
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450 455 460
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
His Val Gln Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr
865 870 875 880
Thr Gln Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu
885 890 895
Trp Asp Gln Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys
900 905 910
Glu Pro

Claims (10)

1.融合酶的组合物，其特征在于，包括：
(1)融合有谷胱甘肽合成酶与几丁质蛋白结合域的第一融合蛋白；和
(2)融合有包括三磷酸腺苷再生酶与几丁质蛋白结合域的第二融合蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶包括单功能合成酶GshA、GshB、双功能合成酶GshAB中的一种或两者以上的酶；
所述三磷酸腺苷再生酶包括多聚磷酸激酶、腺苷酸激酶、磷酸转移酶中的一种或两者以上的酶；
几丁质蛋白结合域包括Clostridium cellulovorans P38058，ClostridiumThermocellum 4B9F，Paenibacillus amylolyticus A0A1R1E3J9，Hungateiclostridiumthermocellum EEU00265，Lachnoclostridium phytofermentans A9KJ82，Anaerocolumnajejuensis A0A1M6JI59，Lachnoclostridium phytofermentans A9KT91,Paenibacillussp A0A1H2W1K8，Paenibacillus odorifer A0A089MPB0，Paenibacillus kribbensisA0A222WU32或Hungateiclostridium saccincola A0A2S8R9S3。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述第一融合蛋白：
(I)、具有如SEQ ID NO:1、2、3或4所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所述序列至少有80％同源性的
氨基酸序列；
所述第二融合蛋白：
(IV)、具有如SEQ ID NO:5、6、7或8所示的氨基酸序列；或
(V)、如(IV)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(IV)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(VI)、与(IV)或(V)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
4.表达如权利要求1至3任一项所述的组合物中所述第一融合蛋白与所述第二融合蛋白的基因。
5.含有如权利要求4所述的基因的载体。
6.固定化融合酶的制备方法，其特征在于，以几丁质载体为固定化载体，纯化、固定如权利要求1至3任一项所述的组合物中所述第一融合蛋白和/或所述第二融合蛋白，获得固定化第一融合蛋白和/或固定化第二融合蛋白，所述固定化第一融合蛋白和/或固定化第二融合蛋白为固定化融合酶；
所述几丁质载体选自：几丁质树脂、几丁质磁性珠、甲壳素高聚体或甲壳素凝胶。
7.如权利要求6所述的制备方法制得的固定化融合酶。
8.如权利要求7所述的固定化融合酶在制备谷胱甘肽中的应用。
9.固定化融合酶的组合物，其特征在于，包括如权利要求7所述的固定化融合酶，所述固定化第一融合蛋白与所述固定化第二融合蛋白的质量比为1：(0.05～20)。
10.谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，取谷胱甘肽的合成原料经如权利要求7所述的固定化合成酶或如权利要求9所述的固定化融合酶的组合物催化，制得谷胱甘肽。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024000620A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 南京华狮新材料有限公司 一种固定化酶及其用于制备乙基己基甘油的用途及方法

Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US6562958B1 (en) * 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
CN1425762A (zh) * 2002-12-30 2003-06-25 南京工业大学 利用枯草芽孢杆菌NX－2制备γ－聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体
US20030143215A1 (en) * 1999-12-20 2003-07-31 Toshio Miyata Carbonyl stress-ameliorating agents
US7041814B1 (en) * 1998-02-18 2006-05-09 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Enterobacter cloacae for diagnostics and therapeutics
CN1772915A (zh) * 2004-11-10 2006-05-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种用固定化酶生产壳寡糖的方法
US20060252130A1 (en) * 1999-11-03 2006-11-09 Acgt Pregenomics Ag Method for linking molecular substances
US20070178451A1 (en) * 2001-08-02 2007-08-02 Molian Deng Nucleic acid sequences from Chlorella sarokiniana and uses thereof
WO2008076938A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 University Of Iowa Research Foundation Method of making cyclic polypeptides with inteins
CN101633946A (zh) * 2008-12-02 2010-01-27 中山大学 一种elp融合蛋白及其应用
CN101831397A (zh) * 2010-03-30 2010-09-15 杭州宝晶生物化工有限公司 一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备l-半胱氨酸的方法
US7869957B2 (en) * 2002-10-15 2011-01-11 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
CN102220400A (zh) * 2011-05-12 2011-10-19 北京化工大学 一种体外合成谷胱甘肽的方法
CN102899310A (zh) * 2012-11-02 2013-01-30 江苏科技大学 磁性纳米粒子固定化家蚕来源的谷胱甘肽-s-转移酶的方法
CN103954762A (zh) * 2014-05-08 2014-07-30 重庆医科大学 一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法
CN104277111A (zh) * 2013-07-08 2015-01-14 百瑞全球有限公司 用于制备固定化蛋白质、多肽或寡肽的复合载体、制法及用途
CN104611396A (zh) * 2013-11-04 2015-05-13 中国科学院上海生命科学研究院 一种生产谷胱甘肽的方法
CN105219822A (zh) * 2015-09-24 2016-01-06 北京化工大学 一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法
CN106086126A (zh) * 2016-08-29 2016-11-09 开平牵牛生化制药有限公司 一种酶催化合成谷胱甘肽的方法
CN107267471A (zh) * 2017-07-05 2017-10-20 湖南福来格生物技术有限公司 双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用
CN107849572A (zh) * 2015-06-16 2018-03-27 Absci有限责任公司 用于可诱导共表达系统中的载体
CN108239664A (zh) * 2018-01-22 2018-07-03 深圳瑞德林生物技术有限公司 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺
CN108277244A (zh) * 2018-01-08 2018-07-13 深圳瑞德林生物技术有限公司 固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖
CN109134594A (zh) * 2017-06-15 2019-01-04 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备谷胱甘肽的方法
CN109266633A (zh) * 2018-09-14 2019-01-25 华东理工大学 碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用
CN109280680A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶促联产的方法
CN110373370A (zh) * 2019-07-16 2019-10-25 大连医诺生物股份有限公司 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
CN110387379A (zh) * 2019-07-16 2019-10-29 大连医诺生物股份有限公司 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用
CN110804634A (zh) * 2019-12-04 2020-02-18 深圳瑞德林生物技术有限公司 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
CN111269928A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 河南科技大学 通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
CN112280755A (zh) * 2020-11-06 2021-01-29 深圳瑞德林生物技术有限公司 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺

Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041814B1 (en) * 1998-02-18 2006-05-09 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Enterobacter cloacae for diagnostics and therapeutics
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US6562958B1 (en) * 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
US20060252130A1 (en) * 1999-11-03 2006-11-09 Acgt Pregenomics Ag Method for linking molecular substances
US20030143215A1 (en) * 1999-12-20 2003-07-31 Toshio Miyata Carbonyl stress-ameliorating agents
US20070178451A1 (en) * 2001-08-02 2007-08-02 Molian Deng Nucleic acid sequences from Chlorella sarokiniana and uses thereof
US7869957B2 (en) * 2002-10-15 2011-01-11 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
CN1425762A (zh) * 2002-12-30 2003-06-25 南京工业大学 利用枯草芽孢杆菌NX－2制备γ－聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体
CN1772915A (zh) * 2004-11-10 2006-05-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种用固定化酶生产壳寡糖的方法
WO2008076938A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 University Of Iowa Research Foundation Method of making cyclic polypeptides with inteins
US20100143972A1 (en) * 2006-12-14 2010-06-10 Horswill Alexander R Method of Making Cyclic Polypeptides with Inteins
CN101633946A (zh) * 2008-12-02 2010-01-27 中山大学 一种elp融合蛋白及其应用
CN101831397A (zh) * 2010-03-30 2010-09-15 杭州宝晶生物化工有限公司 一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备l-半胱氨酸的方法
CN102220400A (zh) * 2011-05-12 2011-10-19 北京化工大学 一种体外合成谷胱甘肽的方法
CN102899310A (zh) * 2012-11-02 2013-01-30 江苏科技大学 磁性纳米粒子固定化家蚕来源的谷胱甘肽-s-转移酶的方法
CN104277111A (zh) * 2013-07-08 2015-01-14 百瑞全球有限公司 用于制备固定化蛋白质、多肽或寡肽的复合载体、制法及用途
CN104611396A (zh) * 2013-11-04 2015-05-13 中国科学院上海生命科学研究院 一种生产谷胱甘肽的方法
CN103954762A (zh) * 2014-05-08 2014-07-30 重庆医科大学 一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法
CN107849572A (zh) * 2015-06-16 2018-03-27 Absci有限责任公司 用于可诱导共表达系统中的载体
CN105219822A (zh) * 2015-09-24 2016-01-06 北京化工大学 一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法
CN106086126A (zh) * 2016-08-29 2016-11-09 开平牵牛生化制药有限公司 一种酶催化合成谷胱甘肽的方法
CN109134594A (zh) * 2017-06-15 2019-01-04 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备谷胱甘肽的方法
CN107267471A (zh) * 2017-07-05 2017-10-20 湖南福来格生物技术有限公司 双功能谷胱甘肽合成酶突变体、核苷酸序列及其制备方法和应用
CN109280680A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶促联产的方法
CN108277244A (zh) * 2018-01-08 2018-07-13 深圳瑞德林生物技术有限公司 固定化酶级联反应制备景天庚酮糖及醛糖
CN108239664A (zh) * 2018-01-22 2018-07-03 深圳瑞德林生物技术有限公司 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺
CN109266633A (zh) * 2018-09-14 2019-01-25 华东理工大学 碳水化合物结合模块及其在固定化酶制备与融合蛋白纯化上的应用
CN110373370A (zh) * 2019-07-16 2019-10-25 大连医诺生物股份有限公司 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
CN110387379A (zh) * 2019-07-16 2019-10-29 大连医诺生物股份有限公司 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用
CN110804634A (zh) * 2019-12-04 2020-02-18 深圳瑞德林生物技术有限公司 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
CN111269928A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 河南科技大学 通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
CN112280755A (zh) * 2020-11-06 2021-01-29 深圳瑞德林生物技术有限公司 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDRE´S ILLANES等: ""Effect of modulation of enzyme inactivation on temperature optimization for reactor operation with chitin-immobilized lactase "", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 *
武溪溪: ""嗜热菌几丁质结合域及其在酶固定化中应用的研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *
沈立新等: ""谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质"", 《华东理工大学学报》 *
王爱琪等: ""谷胱甘肽双功能酶固定化研究"", 《华东理工大学学报（自然科学版）》 *
赵小曼: ""基因工程酶法生产谷胱甘肽"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 *
陈阳等: ""偶联ATP再生用于谷胱甘肽的酶法合成"", 《工程科技I辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024000620A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 南京华狮新材料有限公司 一种固定化酶及其用于制备乙基己基甘油的用途及方法

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