CN103954762A - 一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，(1)用寡聚组氨酸或类似标签融合表达酶及其突变体，制备诱导表达细胞裂解液为未纯化融合酶样品；(2)固定化抗标签单抗或其它亲和分离介质；(3)所有测定中所用固定化亲和分离介质的结合容量相同；(4)用来自相同未纯化融合酶样品的不同总蛋白量与固定化亲和分离介质反应，分离结合的融合酶测定其活性，获得结合的融合酶活性对反应体系总蛋白量的响应曲线；(5)据亲和反应的化学计量学建立上述响应的数学模型，用单抗为亲和分离介质时所用融合酶远多于固定化单抗结合容量而适用简化模型，用Ni²⁺-NTA需用非简化模型，预测结合的融合酶最大活性作为比活性的等效量进行比较。

Description

一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法

技术领域

本发明属于生物亲和分析技术，是用于筛选酶变体库时确认阳性突变体及建立酶序列和活性关系的一种快速分析方法，适用于以蛋白或短肽为融合标签表达的酶及其突变体。 

发明的技术背景 

酶作为催化剂在医药、工业和环境生物技术领域应用广泛且这些应用都需高活性酶。用进化生物技术设计筛选突变体库是获得高活性酶的主要策略，此策略依赖于快速测定大量酶突变体的比活性进行筛选。将酶突变体逐个重组表达、分离纯化后测定比活性是发现高活性突变体最可靠的方法，但其成本和效率使得酶的定向进化的成本和效率很不满意。对于研究酶的序列-活性关系，也是重组表达、分离纯化后测定比活性，其效率和成本也很不满意。 

用诱导表达酶及其突变体的细胞裂解液直接测定其中的目标酶的活性进行比较是识别催化效率增加的阳性突变体的成本最理想且效率也很高的分析方法。然而，细胞裂解效率和突变体表达效率的波动会带来许多假阳性或假阴性结果，这使得直接用细胞裂解液为样品测定目标酶的活性进行比较和筛选的方法仅仅适合于酶突变体库的初步筛选；经过初步筛选获得的阳性突变体还需要重组表达、分离纯化后再测定比活性确认。测定细胞裂解液中融合酶及其突变体的活性对总蛋白浓度的比值，即表观比活性，仅能消除细胞裂解效率的影响，不能消除诱导表达效率的影响，也很难提高识别阳性突变体的可靠性。 

本发明建立一种以重组表达酶及其突变体细胞裂解液为样品，有效消除细胞裂解效率差异、酶及其突变体诱导表达效率差异的方法，快速比较混合物样品中目标酶的比活性。 

为纯化重组表达蛋白，其常与6个组氨酸(6His)标签肽或类似短肽、分子量较小的蛋白为融合标签进行重组表达；此类标签可添加在重组表达酶及其突变体的N端或C端；针对此类融合标签的单抗或多抗、Ni²⁺-NTA类金属离子螯合物，是此类融合标签的亲和分离介质。 

研究酶的序列-活性关系、筛选酶突变体库时，重组表达的酶及其突变体的融合标签可保持不变。本发明利用此融合标签和固定化亲和分离介质的亲和反应和直接测定亲和分离的融合酶的活性，优化固定化亲和分离介质结合容量及亲和反应体系的样品量，建立了一种快速预测固定化亲和分离介质的最大亲和分离结合活性作为融合酶比活性等效量的方法，用于快速比较细胞裂解液中未纯化融合酶及其突变体的比活性。 

发明内容概述 

本发明涉及如下技术要点：(1)将融合酶及其突变体诱导表达后制备细胞裂解液作为未纯化融合酶样品，同时制备不含插入序列的空载体诱导表达的细胞裂解液为对照裂解液用于稀释样品，(2)将识别所选融合标签的抗体或类似亲和分离介质固定在微孔板测定室的内孔表面或易于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面，(3)分离亲和反应结合的融合酶及其突变体并测定结合融合酶及其突变体的活性，(4)用相同量亲和分离介质，测定结合融合酶及其突变体的活性对亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或总活性的响应曲线，(5)据可逆结合化学计量学分析响应曲线预测亲和分离介质结合位点被饱和结合后的最大活性，(6)所预测的结合位点被饱和结合后的融合酶及其突变体的最大活性是其比活性的等效量；用已知比活性的融合酶或某个突变体测定固定化亲和分离介质的结合容量后，用此等效量可换算出融合酶及其突变体的比活性。本发明的主要内容和实施细节的特征如下： 

1、一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，其特征如下： 

(一)、在拟比较比活性的酶及其突变体的N端或C端，按分子克隆及重组表达常规过程经连接肽段加入选定的融合标签，构建原核或真核融合表达载体，用相应诱导剂或诱导条件诱导表达，收集诱导表达宿主细胞，按下所述制备未纯化融合酶样品： 

(1)选择对融合酶及其突变体没有抑制作用的弱碱性Tris-HCl、中性磷酸盐或其它缓冲液为裂解缓冲液；耐超声的融合酶及其突变体，超声处理细胞后再离心得细胞裂解液；不耐超声的融合酶及其突变体，用上述裂解缓冲液加溶菌酶处理细胞再离心得细胞裂解液；耐受表面活性剂的融合酶及其突变体，用含Tween-20或NP-40类表面活性剂的裂解缓冲液处理细胞再离心得细胞裂解液；上述细胞裂解液为未纯化融合酶样品； 

(2)用不含插入序列空载体转化相同宿主细胞后相同条件下诱导表达；来自制备未纯化融合酶样品时相同体积培养液的细胞诱导表达后，用制备未纯化融合酶样品时80％体积裂解缓冲液，相同方法所制备裂解液为不含融合酶及其突变体的对照裂解液； 

(二)、选择并固定化一种针对所选用融合标签的亲和分离介质： 

(1)所选亲和分离介质需以适当方式固定化在固相支持介质表面并保留对融合酶及其突变体中融合标签的亲和力，以实现对融合酶及其突变体的亲和分离； 

(2)针对超过连续6个氨基酸残基融合标签，其高亲和力单抗及多抗适合作为此类融合标签的亲和分离介质；此类抗体能通过吸附固定化在微孔板的孔内表面，或共价固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面； 

(3)当用4个及以上连续组氨酸构成的组氨酸标签时，Ni²⁺-NTA类金属离子螯合物适合作为组氨酸标签融合酶及其突变体的亲和分离介质；此类亲和分离介质需经对吸附固定在微孔板孔内表面的载体蛋白如牛血清白蛋白共价键修饰而被间接固定化在微孔板的孔内表面，或通过共价反应而固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面； 

(4)在微孔板的孔内表面经吸附固定化抗体或间接固定化螯合金属离子所需载体蛋白时，50.0mM且pH为9.6碳酸钠是适合的固定缓冲液；用96孔板时，每孔加含0.1到2.0μg所需单抗或足量载体蛋白的200μL缓冲液且每孔所用蛋白总量/体积相同；固定抗体时设不加抗体仅用固定缓冲液处理的对照孔；每孔用360μL牛血清白蛋白或类似物溶解在20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl缓冲液封闭测定室内表面的暴露部分； 

(5)Ni²⁺-NTA类螯合物通过其所含氨基与微纳米颗粒表面活化的羧基反应而共价固定化，或转变成异硫氰酸酯形式修饰微孔板上吸附固定化载体蛋白的氨基而固定化；固定化此类亲和分离介质的简单方案为先固定化螯合基团再螯合金属离子； 

(三)、用相同量的固定化亲和分离介质，测定亲和分离所得融合酶或其突变体的活性对亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶总活性的响应曲线： 

(1)融合标签与固定化亲和分离介质的反应称亲和反应，其所用缓冲液称为亲和反应缓冲液；制备未纯化融合酶样品时所用不含表面活性剂的裂解缓冲液、pH7.2～9.0的Tris-HCl缓冲液、中性或碱性磷酸盐缓冲液，以及其它对融合酶及其突变体没有抑制作用且适合亲和反应的缓冲液，都适合作为本发明所述亲和反应缓冲液； 

(2)用微孔板吸附固定化抗体或间接固定化亲和分离介质时，每孔所含亲和分离介质结合容量相同；用微纳米颗粒固定亲和分离介质时，每次测试所用微纳米颗粒量相同； 

(3)亲和反应体系中，来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体，同固定化亲和分离介质亲和反应时间为10～120分钟，反应温度在20～37摄氏度；亲和反应达到平衡后，用亲和反应缓冲液反复洗涤除去非特异吸附部分；再加入pH接近最适且含必须辅助因子的缓冲液溶解的显色底物，启动固定化亲和分离介质所结合融合酶的反应； 

(4)用微孔板固定化亲和分离介质时，用酶标仪连续跟踪反应过程测定吸收变化，或反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再用酶标仪测定吸收； 

(5)用便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒固定化亲和分离介质时，有两种方式终止融合酶反应再测定吸收：反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再除去微纳米颗粒、用酶标仪或光度计测定吸收，或反应指定时间后快速分离去除微纳米颗粒、用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应、用酶标仪或光度计测定吸收； 

(6)改变亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性测定亲和分离融合酶或其突变体活性即初速度；结合的融合酶或其突变体活性随亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶或其突变体总活性变化称响应曲线； 

(7)用固定化抗体为亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品如下稀释：将对照裂解液总蛋白浓度稀释到与未纯化融合酶样品相同再用于梯度稀释未纯化融合酶样品，最后用亲和反应缓冲液稀释相同体积；每次测试所用蛋白总量相同而来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体总活性不同，且每次测试所用来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量大于固定化抗体最大结合容量的10倍； 

(8)用Ni²⁺-NTA类亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品直接用亲和反应缓冲液进行梯度稀释；稀释后亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量和其中融合酶或其突变体的总活性都不同；来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量，不超过固定化亲和分离介质最大结合容量的3倍； 

(9)据拟比较比活性的融合酶及其突变体的比活性范围，优化每次/孔测试所用固定化亲和分离介质的量，使得当来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体占据固定化亲和分离介质结合位点总量50％时，亲和反应后分离所得融合酶或其突变体在设定测定条件下作用于其显色底物造成的产物或底物吸收变化速度超过每分钟0.003； 

(10)固定所用固定化亲和分离介质用量调节来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性的范围；所用样品总蛋白量的最大量应使固定化抗体结合位点被占据比例最大值不小于50％，固定化Ni²⁺-NTA类亲和分离介质结合位点被占据比例最大值不小于80％；所用样品总蛋白量的最小量应使得结合酶反应的吸收变化高于每分钟0.003； 

(11)用微孔板固定化单抗为亲和分离介质时，用20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl或类似中性缓冲液为洗涤缓冲液，重复洗涤微孔除去非特异结合成分；洗涤时先用含0.01～0.05％Tween-20类表面活性剂的洗涤缓冲液洗涤至少1次，再用不含此类表面活性剂的洗涤缓冲液重复洗涤至少3次；最后一次洗涤后将洗涤缓冲液尽量完全去掉；用磁性或非磁性微纳米材料固定化亲和分离介质时，直接用亲和反应缓冲液反应洗涤； 

(12)将显色底物溶解在测定活性的缓冲液中，在20到37摄氏度间某温度预热10分钟以上；在恒温条件下，每孔或每次测试加入相同体积的显色底物溶液；当用微孔板固定化亲和分离介质时，所加入的显色底物溶液的体积，需小于吸附固定亲和分离所用抗体或载体蛋白时所用溶液的体积；将微孔板快速震荡1.0～5.0分钟促进反应达到稳态； 

(13)终止融合酶反应的适当方法需满足如下要求：用微纳米颗粒固定化亲和分离介 质时，所用终止融合酶反应的试剂不妨碍快速除去固定化亲和分离介质所用微纳米颗粒，且不与固定化亲和分离介质的微纳米颗粒反应而产生干扰测定融合酶显色底物或产物吸收的任何物质；用微孔板吸附固定化亲和分离介质时，所用终止融合酶反应的试剂不与固定化亲和分离介质反应而产生干扰测定融合酶显色底物或产物吸收的任何物质； 

(14)采用反应设定时间后终止融合酶反应再测定底物或产物吸收的方式时，终止融合酶反应的方法包括但不限于加入强酸或强碱、酶的快速失活不可逆抑制剂、含强酸或强碱对剩余底物或产物进行显色反应的显色剂； 

(15)当显色底物有自发反应时，设定无亲和分离介质的反应测定自发反应本底，并从所得初速度中扣除此本底； 

(四)、分别用如下所述方法分析上述步骤(三)所得响应曲线，获得融合酶及其突变体的比活性的等效量，用这些等效量代替比活性进行定量比较甚至推算出比活性绝对值： 

(1)定义如下的符号用于推导所需数据处理公式： 

K：融合标签与固定化亲和分离介质复合物解离常数 

N：每次测试所用固定化亲和分离介质的最大结合容量 

b：亲和反应后分离所得结合的融合酶或其突变体量 

n：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的带标签融合酶或其突变体总量 

V：亲和反应后分离所得结合的融合酶或其突变体的初速度 

Vs：固定化亲和分离介质被饱和时分离所得结合的融合酶或其突变体的初速度 

T：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总活性 

s：结合的融合酶或其突变体的初速度对结合的融合酶或其突变体量的响应系数 

P：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量 

f：未纯化融合酶样品中融合酶或其突变体的丰度 

(2)用固定化单抗为亲和分离介质时，据亲和反应解离常数的定义有Equ.(1)： 

$K=\frac{(n-b)\×(N-b)}{b}---\left(1\right)$

被分析数据对应亲和反应体系的融合酶或其突变体的总量n大于固定化抗体结合容量N的10倍，即Equ.(1)中b肯定小于n的10％而可忽略，故Equ.(1)简化为Equ.(2)： 

$\frac{1}{b}\≈\frac{1}{N}+\frac{K}{N}\×\frac{1}{n}---\left(2\right)$

s对于结合的某个融合酶或其突变体应该相同，对不同催化效率的融合酶及其突变体可 能不同；故V＝b×s，Vs＝N×s，T＝n×s，且Equ.(2)转变成Equ.(3)： 

$\frac{1}{V}\≈\frac{1}{V_s}+\frac{K}{N}\×\frac{1}{T}---\left(3\right)$

Equ.(3)表明对响应曲线进行双倒数转换后为线性，此线性响应曲线截距的倒数为Vs；另外，T=P×f×s，故Equ.(3)还可进一步转变成Equ.(4)： 

$\frac{1}{V}\≈\frac{1}{V_s}+\frac{K}{N\×f\×s}\×\frac{1}{P}---\left(4\right)$

只要维持对不同的未纯化融合酶样品所用亲和分离介质结合容量相同，据Equ.(3)或Equ.(4)分析响应曲线能获得Vs作为来自未纯化融合酶样品的带标签融合酶或其突变体的比活性的等效量；此等效量适合直接用于比较或者相除计算它们比活性的比值；用纯化后已知比活性的融合酶或其某个突变体，即已知其s，用Equ.(3)或Equ.(4)分析响应曲线能确定N，从而能直接推算所测融合酶或其它突变体的比活性； 

(3)用固定化Ni²⁺-NTA类高亲和力亲和分离介质时，用如下所述Equ.(6)分析步骤(三)所得响应曲线，获得融合酶及其突变体的比活性或其等效量并用于比较： 

$b=[(N+K+n)-\sqrt{{(N+K+n)}^2-4\×n\×N}]/2---\left(5\right)$

$V=[(V_s+K\×s+T)-\sqrt{{(V_s+K\×s+T)}^2-4\×T\×V_s}]/2---\left(6\right)$

Ni²⁺-NTA类亲和分离介质对组氨酸标签的亲和力很高但对非标签肽段的选择性低于单抗；用Ni²⁺-NTA类螯合金属离子进行亲和分离时，亲和反应体系所用总蛋白浓度不能太高，以免出现较强的非特异性竞争吸附而妨碍数据分析。 

2、据权利要求1所述一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，该方法应用时所涉及的融合酶、融合标签和其对应的亲和分离介质有如下特征： 

(一)、适用于此方法的融合酶及其突变体同时具有如下三个特征： 

(1)有对应显色底物，能在240nm以上波长测定融合酶底物或反应产物或终止融合酶反应后对底物或产物进行衍生后产物的吸收，从而测定此类融合酶活性； 

(2)在此类酶及其突变体的N端或C端经恰当连接肽段加上融合标签后，融合酶及其突变体的比活性高于非融合表达形式比活性的10％； 

(3)结合在固定化亲和分离介质上的融合酶及其突变体，比活性达到游离的融合酶及其突变体比活性的50％以上； 

(二)、适用于此方法的融合表达系统有如下特征： 

(1)适用的融合表达系统包括原核和真核重组表达系统，对应原核融合重组表达宿主细胞包括大肠杆菌，对应的真核融合重组表达宿主细胞包括毕赤酵母及昆虫细胞； 

(2)插入到适用的融合表达载体上的酶及其突变体，能在乳糖操纵子或其它系统控制下诱导表达，且未纯化融合酶样品中目标蛋白丰度不低于总蛋白量的3％； 

(3)适用的融合表达标签包括连续4个及更多组氨酸残基构成的组氨酸标签、Flag标签、SUMO标签、谷胱甘肽-S-转硫酶即GST、麦芽糖结合蛋白即MBP标签； 

(三)、适用于此方法的亲和分离介质有如下特征： 

(1)适用的亲和分离介质能通过吸附固定在微孔板上测定室的内表面，或共价修饰被吸附固定化的载体蛋白而间接固定化在微孔板测定室的内表面，或共价修饰固定化在微纳米颗粒表面，并能用于吸附分离带融合标签的融合酶及其突变体； 

(2)不同标签亲和分离介质的通用代表为单抗，即都可用其单抗为亲和分离介质；单抗适合通过吸附固定化在微孔板测定室的内表面； 

(3)如用组氨酸标签，Ni²⁺-NTA类金属螯合物是适合的亲和分离介质，但需间接吸附固定在微孔板上测定室的内表面或共价固定化在微纳米颗粒的表面； 

(4)此方法所需亲和分离介质固定化后，与含融合标签的融合酶及其突变体形成可逆特异复合物，此类复合物在室温下解离常数需小于50.0μmol/L； 

(5)适用的亲和分离介质吸附固定化后，其识别基团同不含融合标签的其它蛋白不形成复合物，或所形成复合物的解离常数比相同条件下与含对应融合标签的融合酶及其突变体所形成复合物解离常数高20倍； 

(6)所选的亲和分离介质及其所含杂质，对融合酶及其突变体没有显著抑制作用； 

(7)所用亲和分离介质为Ni²⁺-NTA类金属螯合物固定化后与融合酶或其突变体形成的特异复合物在室温下解离常数小于0.1nmol/L；此条件下亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的融合酶及其突变体总量需小于固定化亲和分离介质结合容量的3倍； 

(8)如固定化亲和分离介质的结合位点被占据超过80％时结合的融合酶及其突变体的初速度仍低于每分钟吸收变化0.003，须增加固定化亲和分离介质的用量以提高最大结合容量；当用微孔板固定抗体或载体蛋白时，微孔板的有限吸附容量使得增加固定化亲和分离介质后最大结合容量不能提高，则此方法失效； 

(四)、适用于此方法的数据分析方法有如下特征： 

(1)被分析的结合酶反应的吸收变化速度最小值应高于每分钟0.003；被分析的结合酶反应的吸收变化速度最大值应在酶标仪或其它光度计的可测范围内； 

(2)Equ.(6)为通用模型，适合常用的亲和分离介质； 

(3)用Equ.(4)分析时，要求被分析的数据对应的亲和反应体系中来自样品的融合酶及其突变体的总量大于固定化亲和分离介质结合容量的10倍。 

应用实施例 

本发明的应用实施例所用材料及辅助分析方法 

羧酸酯酶及其突变体：对硝基苯酚丁酸酯来自青岛奥克化工有限公司；抗组氨酸标签的单抗来自南京中鼎生物科技有限公司。羧酸酯酶及其突变体的N端含经过7个中性残基连接的6个组氨酸残基为组氨酸标签；表达载体选用pET29a；羧酸酯酶编码序列参照gi29893336：由北京中美泰和生物技术有限公司全合成，并插入表达载体中；突变体为M326L，也由北京中美泰和生物技术有限公司全合成并插入表达载体中。 

大肠杆菌碱性磷酸酶及其突变体：对硝基苯酚磷酸二钠来自Sigma-Aldrich。Ni²⁺-NTA-磁珠来自Qiagen。大肠杆菌碱性磷酸酶表达载体选用pET24a；编码序列参照gi147225：，C端含经过7个中性残基连接的6个组氨酸残基为组氨酸标签并在其后连接2个中性残基保护；由北京中美泰和生物技术有限公司全合成编码序列并插入表达载体中；突变体为R167K，也由北京中美泰和生物技术有限公司全合成并插入表达载体中。 

羧酸酯酶活性测定：含底物的缓冲液为50.0mM且pH为7.4的Tris-HCl，0.25mM对硝基苯酚丁酸酯。测定405nm产物吸收变化。游离酶用Mapada UV-1600PC连续测定吸收变化。被固定化在微孔板上单抗吸附的酶，用Biotek ELX800酶标仪连续测定吸收变化。 

碱性磷酸酶活性测定：含底物的缓冲液为1.0M二乙醇胺-HCl缓冲液，pH10.0，底物对硝基苯酚磷酸二钠终浓度10.0mM，MgCl₂终浓度2.0mM。测定405nm产物吸收变化。游离酶用Mapada UV-1600PC连续测定吸收变化。测定吸附在Ni²⁺-NTA-磁珠上的碱性磷酸酶活性时，反应体系共加入含底物的缓冲液0.20ml；反应指定时间后加入10ul浓度为10.0M的氢氧化钠溶液终止反应，快速磁分离去掉磁珠，用Biotek ELX800酶标仪测定吸收。 

对两种酶，每分钟生成1微摩尔产物对硝基苯酚的酶量为一个单位。 

总蛋白浓度测定：用Bradford方法测定。 

实施例1：以单抗为亲和分离介质快速比较未纯化羧酸酯酶及其突变体比活性 

(1)羧酸酯酶及其突变体的融合表达和未纯化融合酶样品的制备：将羧酸酯酶及其突变体M326L重组后的质粒转化于BL21(DE3)感受态细胞中；接菌至含0.1mg/ml硫酸卡那霉素的灭菌TB培养基中，37℃，180r/min扩大培养3-4h；加入诱导剂IPTG终浓度在0.24mg/ml，18℃，136r/min诱导表达16-20h；4℃、7500rpm离心10min收集菌体；用20mM Tris-HCl(pH7.4)洗涤2次后收集菌体并以1/10TB培养基的体积进行重悬，超声裂解：Ampl＝28％，Pulse3s，Cool5s，Δt＝10min，T_total50min，冰水浴；4℃13000rpm离心30min至上清液变得清澈透亮；用孔径为0.22um的微孔滤膜滤过上清，收集上清液即为未纯化融合酶样品。 

(2)单抗作为亲和分离介质在微孔板的固定化：选用96孔板，如未说明则每孔加含0.6μg分离单抗的200μL固定缓冲液，物理吸附固定在微孔板测定室内表面；每孔加入的亲和分离介质总量需相同；用单抗时固定缓冲液包括50.0mM且pH为9.6碳酸钠缓冲液；设置不加入亲和分离介质仅用固定缓冲液处理的对照孔；用360μL牛血清白蛋白或类似物溶解在20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl缓冲液封闭测定室内表面暴露部分； 

(3)响应曲线的测定： 

(a)对每个样品用对照裂解液进行梯度稀释获得至少4个稀释比例倒数成线性变化的稀释后样品；最低稀释度时稀释后样品中融合表达酶或其突变体浓度高于最大稀释度时稀释后样品中融合表达酶或其突变体浓度的16倍；最低稀释度样品可以是未纯化融合样品； 

(b)针对每个样品，选择系列固定有相同量亲和分离介质的测定室，加入相同体积的不同稀释比例的稀释后样品；加入的稀释后样品体积200μL；每种稀释后样品至少在3个测定室内重复分析；每种稀释后样品同步加入相应对照孔，并且所有操作处理与测定孔完全相同； 

(c)吸附分离来自稀释后样品的融合表达酶或其突变体，室温下吸附反应1.0小时反应后去掉稀释后样品；用20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl或类似的缓冲液洗涤；洗涤时先用含0.05％的Tween-20类表面活性剂的洗涤缓冲液洗涤3次，再用不含Tween-20类表面活性剂的洗涤缓冲液重复洗涤4次；最后一次洗涤后将洗涤缓冲液尽量完全去掉； 

(d)将显色底物溶解在测定活性的缓冲液即50.0mM且pH为7.4的Tris-HCl中，预先 恒温到室温；在恒温条件下，每孔加入相同体积的200μL显色底物溶液；将微孔板快速震荡2.0分钟促进反应达到稳态；用微孔板读数器连续跟踪每个测定室中溶液的吸收变化30min，记录其吸光度变化值，用30分钟内的吸收变化总量表示结合酶的活性。 

(4)数据分析：(a)结合的羧酸酯酶的活性对固定化所用单抗量的响应(附图1a和1b)；(b)用对照裂解液稀释后具有不同表观比活性的模拟样品，用本发明所述方法分析得到的V_s无差异(附图2a和2b)；(c)超过50次重复测定羧酸酯酶和所设计突变体的表观比活性比值为3.2±1.0；用本发明所述方法，用0.6ug固定化单抗，吸附分离后预测的羧酸酯酶及其突变体M326L的V_s比值为3.0±0.2(附图3a和3b)。 

实施例2：用Ni²⁺-NTA-磁珠快速比较未纯化碱性磷酸酶及其突变体比活性 

(1)大肠杆菌碱性磷酸酶ECAP及其突变体的重组表达及未纯化融合酶样品的制备：将大肠杆菌碱性磷酸酶及其突变体R167K重组后的质粒转化于BL21(DE3)感受态细胞中；接菌至含0.1mg/ml硫酸卡那霉素的灭菌TB培养基中，37℃，180r/min扩大培养3-4h；加入诱导剂IPTG终浓度在0.24mg/ml，18℃，136r/min诱导表达16-20h；4℃条件下、7500r/mm、离心10min收集菌体；用20mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤2次后收集菌体沉淀并以1/10TB培养基的体积进行重悬，超声裂解：Ampl＝30％，Pulse5s，Cool5s，T_total≥30min，冰水浴；13000r/min，4℃离心30min，直至上清液变得清澈透亮；用孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过上清，收集上清液即为未纯化融合酶样品。 

(2)亲和分离介质预处理：商品Ni²⁺-NTA-磁珠用pH为8.0的20.0mM Tris-HCl缓冲液反复洗涤，稀释到商品悬浮液浓度的八分之一浓度；每次取20ul磁珠悬浮液于eppendorf管。 

(3)测定响应曲线： 

(a)对每个样品用pH为8.0的20.0mM Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释获得至少5个稀释比例样品；最低稀释度时稀释后样品中融合表达酶或其突变体浓度高于最大稀释度时稀释后样品中融合表达酶或其突变体浓度的20倍； 

(b)针对每个样品，选用相同量的磁珠，加入不同比例稀释后样品180μL；每种稀释 后样品至少重复测定2次； 

(c)融合表达酶或其突变体稀释后样品与磁珠在eppendorf管中混匀后，室温下将eppendorf管在其林贝尔微孔板震荡仪充分震荡反应1.0小时(在此过程中间歇手振eppendorf管，尽量使Ni²⁺-NTA-磁珠处于混悬状态)；反应后将Ni²⁺-NTA-磁珠置于Promega磁力架中，磁分离后去掉未结合的融合酶； 

(d)结合的酶用pH为8.0的20.0mM Tris-HCl缓冲液洗涤3次，每次洗涤过程中用移液枪不停吹打洗涤液，使得磁珠充分混悬后再进行磁分离，去掉洗涤液：第一次洗涤时将磁珠移至新eppendorf管中，再进行磁分离操作；最后一次洗涤时洗涤液体积为360μL，充分混悬后取磁珠60μL于新eppendorf管中，并将洗涤液尽量除尽；对照用0.1M咪唑-20.0mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤，操作过程与样品孔一致。 

(e)将显色底物溶解在测定活性的缓冲液(含有2mM MgCl₂的1.0M二乙醇胺-HCl缓冲液，pH10.0)中终浓度为10mM，预先恒温到室温；在恒温条件下，每eppendorf管中加入相同体积的1ml显色底物溶液；将eppendorf管置于EP管架上借助于其林贝尔微孔板震荡仪充分震荡反应，反应15分钟。 

(f)到达设定反应时间后，将eppendorf管置于磁力架上磁分离60s后，取190μL上清液加到含有10μL的10M NaOH的微孔板的微孔中，置于微孔板震荡仪上，充分震荡混匀后，用微孔板读数器测定每个测定室中溶液的吸光度值，在405nm波长下进行终点读数，记录其吸光度值，用15分钟内的吸收变化表示结合的酶活性。 

(4)数据分析：(a)用对照裂解液稀释后未纯化融合突变体R167K使其有不同表观比活性作为模拟样品，据表观比活性确定其丰度在1％到4％；用本发明所述方法分析发现只有丰度在3％以上时相同磁珠的饱和结合活性Vs才能无差异(附图4a)；(b)Ni²⁺-NTA亲和分离柱纯化后样品，测定大肠杆菌碱性磷酸酶和所设计突变体的比活性分别为117kU/g和177kU/g，二者的比值为1.75+0.08；用本发明所述方法，用20ul固定化Ni²⁺-NTA-磁珠，吸附分离后预测比值为1.73+0.14(附图4b)。 

附图说明

图1a不同量单抗固定化后测定的结合融合羧酸酯酶反应速度(30min内吸收变化)对反应体系总蛋白量的响应曲线，样品中羧酸酯酶丰度大于10％ 

图1b用Equ.(4)作图分析V_s对单抗用量的响应 

图2a用未纯化融合羧酸酯酶和对照裂解液稀释成不同表观比活性的模拟样品分析对应的响应曲线，样品中羧酸酯酶丰度大于10％ 

图2b用Equ.(4)作图分析结合图2a中结合的融合羧酸酯酶活性对总蛋白量响应 

图3a用未纯化融合羧酸酯酶及其突变体M326L所得响应曲线，样品中羧酸酯酶丰度大于10％ 

图3b用Equ.(4)作图分析用未纯化融合羧酸酯酶和其突变体所得响应曲线 

图4a不同表观比活性未纯化融合大肠菌碱性磷酸酶突变体模拟样品的响应曲线；样品中该融合突变体的丰度从1％到4％ 

图4b未纯化融合大肠杆菌碱性磷酸酶和其突变体的V_s的比较；所用样品中丰度高于3％。 

Claims (2)

1.一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，其特征如下：

(一)、在拟比较比活性的酶及其突变体的N端或C端，按分子克隆及重组表达常规过程经连接肽段加入选定的融合标签，构建原核或真核融合表达载体，用相应诱导剂或诱导条件诱导表达，收集诱导表达宿主细胞，按下所述制备未纯化融合酶样品：

(1)选择对融合酶及其突变体没有抑制作用的弱碱性Tris-HCl、中性磷酸盐或其它缓冲液为裂解缓冲液；耐超声的融合酶及其突变体，超声处理细胞后再离心得细胞裂解液；不耐超声的融合酶及其突变体，用上述裂解缓冲液加溶菌酶处理细胞再离心得细胞裂解液；耐受表面活性剂的融合酶及其突变体，用含Tween-20或NP-40类表面活性剂的裂解缓冲液处理细胞再离心得细胞裂解液；上述细胞裂解液为未纯化融合酶样品；

(2)不含插入序列空载体转化相同宿主细胞后在相同条件下诱导表达；来自与制备未纯化融合酶样品时相同体积培养液的细胞诱导表达后，用制备未纯化融合酶样品时80％体积裂解缓冲液，相同方法所制备裂解液为不含融合酶及其突变体的对照裂解液；

(二)、选择并固定化一种针对所选用融合标签的亲和分离介质：

(1)所选亲和分离介质需以适当方式固定化在固相支持介质表面并保留对融合酶及其突变体中融合标签的亲和力，以实现对融合酶及其突变体的亲和分离；

(2)针对超过连续6个氨基酸残基融合标签，其高亲和力单抗及多抗适合作为此类融合标签的亲和分离介质；此类抗体能通过吸附固定化在微孔板的孔内表面，或共价固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；

(3)当用4个及以上连续组氨酸构成的组氨酸标签时，Ni²⁺-NTA类金属离子螯合物适合作为组氨酸标签融合酶及其突变体的亲和分离介质；此类亲和分离介质需经对吸附固定在微孔板孔内表面的载体蛋白如牛血清白蛋白共价键修饰而被间接固定化在微孔板的孔内表面，或通过共价反应而固定化在便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒表面；

(4)在微孔板的孔内表面经吸附固定化抗体或间接固定化螯合金属离子所需载体蛋白时，50.0mM且pH为9.6碳酸钠是适合的固定缓冲液；用96孔板时，每孔加含0.1到2.0μg所需单抗或足量载体蛋白的200μL缓冲液且每孔所用蛋白总量/体积相同；固定抗体时设不加抗体仅用固定缓冲液处理的对照孔；每孔用360μL牛血清白蛋白或类似物溶解在20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl缓冲液封闭测定室内表面的暴露部分；

(5)Ni²⁺-NTA类螯合物通过其所含氨基与微纳米颗粒表面活化的羧基反应而共价固定化，或转变成异硫氰酸酯形式修饰微孔板上吸附固定化载体蛋白的氨基而固定化；固定化此类亲和分离介质的简单方案为先固定化螯合基团再螯合金属离子；

(三)、用相同量的固定化亲和分离介质，测定亲和分离所得融合酶或其突变体的活性对亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶总活性的响应曲线：

(1)融合标签与固定化亲和分离介质的反应称亲和反应，其所用缓冲液称为亲和反应缓冲液；制备未纯化融合酶样品时所用不含表面活性剂的裂解缓冲液、pH7.2～9.0的Tris-HCl缓冲液、中性或碱性磷酸盐缓冲液，以及其它对融合酶及其突变体没有抑制作用且适合亲和反应的缓冲液，都适合作为本发明所述亲和反应缓冲液；

(2)用微孔板吸附固定化抗体或间接固定化亲和分离介质时，每孔所含亲和分离介质结合容量相同；用微纳米颗粒固定亲和分离介质时，每次测试所用微纳米颗粒量相同；

(3)亲和反应体系中，来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体，同固定化亲和分离介质亲和反应时间为10～120分钟，反应温度在20～37摄氏度；亲和反应达到平衡后，用亲和反应缓冲液反复洗涤除去非特异吸附部分；再加入pH接近最适且含必须辅助因子的缓冲液溶解的显色底物，启动固定化亲和分离介质所结合融合酶的反应；

(4)用微孔板固定化亲和分离介质时，用酶标仪连续跟踪反应过程测定吸收变化，或反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再用酶标仪测定吸收；

(5)用便于分离的磁性或非磁性微纳米颗粒固定化亲和分离介质时，有两种方式终止融合酶反应再测定吸收：反应指定时间后用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应再除去微纳米颗粒、用酶标仪或光度计测定吸收，或反应指定时间后快速分离去除微纳米颗粒、用酸或碱或其它恰当试剂终止融合酶反应、用酶标仪或光度计测定吸收；

(6)改变亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性测定亲和分离融合酶或其突变体活性即初速度；结合的融合酶或其突变体活性随亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量或融合酶或其突变体总活性变化称响应曲线；

(7)用固定化抗体为亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品如下稀释：将对照裂解液总蛋白浓度稀释到与未纯化融合酶样品相同再用于梯度稀释未纯化融合酶样品，最后用亲和反应缓冲液稀释相同体积；每次测试所用蛋白总量相同而来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体总活性不同，且每次测试所用来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量大于固定化抗体最大结合容量的10倍；

(8)用Ni²⁺-NTA类亲和分离介质测定响应曲线时，亲和反应体系中未纯化融合酶样品直接用亲和反应缓冲液进行梯度稀释；稀释后亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量和其中融合酶或其突变体的总活性都不同；来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总量，不超过固定化亲和分离介质最大结合容量的3倍；

(9)据拟比较比活性的融合酶及其突变体的比活性范围，优化每次/孔测试所用固定化亲和分离介质的量，使得当来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体占据固定化亲和分离介质结合位点总量50％时，亲和反应后分离所得融合酶或其突变体在设定测定条件下作用于其显色底物造成的产物或底物吸收变化速度超过每分钟0.003；

(10)固定所用固定化亲和分离介质用量调节来自未纯化融合酶样品总蛋白量或融合酶总活性的范围；所用样品总蛋白量的最大量应使固定化抗体结合位点被占据比例最大值不小于50％，固定化Ni²⁺-NTA类亲和分离介质结合位点被占据比例最大值不小于80％；所用样品总蛋白量的最小量应使得结合酶反应的吸收变化高于每分钟0.003；

(11)用微孔板固定化单抗为亲和分离介质时，用20.0mM且pH为7.4的Tris-HCl或类似中性缓冲液为洗涤缓冲液，重复洗涤微孔除去非特异结合成分；洗涤时先用含0.01～0.05％Tween-20类表面活性剂的洗涤缓冲液洗涤至少1次，再用不含此类表面活性剂的洗涤缓冲液重复洗涤至少3次；最后一次洗涤后将洗涤缓冲液尽量完全去掉；用磁性或非磁性微纳米材料固定化亲和分离介质时，直接用亲和反应缓冲液反应洗涤；

(12)将显色底物溶解在测定活性的缓冲液中，在20到37摄氏度间某温度预热10分钟以上；在恒温条件下，每孔或每次测试加入相同体积的显色底物溶液；当用微孔板固定化亲和分离介质时，所加入的显色底物溶液的体积，需小于吸附固定亲和分离所用抗体或载体蛋白时所用溶液的体积；将微孔板快速震荡1.0～5.0分钟促进反应达到稳态；

(13)终止融合酶反应的适当方法需满足如下要求：用微纳米颗粒固定化亲和分离介质时，所用终止融合酶反应的试剂不妨碍快速除去固定化亲和分离介质所用微纳米颗粒，且不与固定化亲和分离介质的微纳米颗粒反应而产生干扰测定融合酶显色底物或产物吸收的任何物质；用微孔板吸附固定化亲和分离介质时，所用终止融合酶反应的试剂不与固定化亲和分离介质反应而产生干扰测定融合酶显色底物或产物吸收的任何物质；

(14)采用反应设定时间后终止融合酶反应再测定底物或产物吸收的方式时，终止融合酶反应的方法包括但不限于加入强酸或强碱、酶的快速失活不可逆抑制剂、含强酸或强碱对剩余底物或产物进行显色反应的显色剂；

(15)当显色底物有自发反应时，设定无亲和分离介质的反应测定自发反应本底，并从所得初速度中扣除此本底；

(四)、分别用如下所述方法分析上述步骤(三)所得响应曲线，获得融合酶及其突变体的比活性的等效量，用这些等效量代替比活性进行定量比较甚至推算出比活性绝对值：

(1)定义如下的符号用于推导所需数据处理公式：

K：融合标签与固定化亲和分离介质复合物解离常数

N：每次测试所用固定化亲和分离介质的最大结合容量

b：亲和反应后分离所得结合的融合酶或其突变体量

n：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的带标签融合酶或其突变体总量

V：亲和反应后分离所得结合的融合酶或其突变体的初速度

Vs：固定化亲和分离介质被饱和时分离所得结合的融合酶或其突变体的初速度

T：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的融合酶或其突变体的总活性

s：结合的融合酶或其突变体的初速度对结合的融合酶或其突变体量的响应系数

P：亲和反应体系中来自未纯化融合酶样品的总蛋白量

f：未纯化融合酶样品中融合酶或其突变体的丰度

(2)用固定化单抗为亲和分离介质时，据亲和反应解离常数的定义有Equ.(1)：

$K=\frac{(n-b)\×(N-b)}{b}---\left(1\right)$

被分析数据对应亲和反应体系的融合酶或其突变体的总量n大于固定化抗体结合容量N的10倍，即Equ.(1)中b肯定小于n的10％而可忽略，故Equ.(1)简化为Equ.(2)：

$\frac{1}{b}\≈\frac{1}{N}+\frac{K}{N}\×\frac{1}{n}---\left(2\right)$

s对于结合的某个融合酶或其突变体应该相同，对不同催化效率的融合酶及其突变体可能不同；故V＝b×s，Vs＝N×s，T＝n×s，且Equ.(2)转变成Equ.(3)：

$\frac{1}{V}\≈\frac{1}{V_s}+\frac{K}{N}\×\frac{1}{T}---\left(3\right)$

Equ.(3)表明对响应曲线进行双倒数转换后为线性，此线性响应曲线截距的倒数为Vs；另外，T=P×f×s，故Equ.(3)还可进一步转变成Equ.(4)：

$\frac{1}{V}\≈\frac{1}{V_s}+\frac{K}{N\×f\×s}\×\frac{1}{P}---\left(4\right)$

只要维持对不同的未纯化融合酶样品所用亲和分离介质结合容量相同，据Equ.(3)或Equ.(4)分析响应曲线能获得Vs作为来自未纯化融合酶样品的带标签融合酶或其突变体的比活性的等效量；此等效量适合直接用于比较或者相除计算它们比活性的比值；用纯化后已知比活性的融合酶或其某个突变体，即已知其s，用Equ.(3)或Equ.(4)分析响应曲线能确定N，从而能直接推算所测融合酶或其它突变体的比活性；

(3)用固定化Ni²⁺-NTA类高亲和力亲和分离介质时，用如下所述Equ.(6)分析步骤(三)所得响应曲线，获得融合酶及其突变体的比活性或其等效量并用于比较：

$b=[(N+K+n)-\sqrt{{(N+K+n)}^2-4\×n\×N}]/2---\left(5\right)$

$V=[(V_s+K\×s+T)-\sqrt{{(V_s+K\×s+T)}^2-4\×T\×V_s}]/2---\left(6\right)$

Ni²⁺-NTA类亲和分离介质对组氨酸标签的亲和力很高但对非标签肽段的选择性低于单抗；用Ni²⁺-NTA类螯合金属离子进行亲和分离时，亲和反应体系所用总蛋白浓度不能太高，以免出现较强的非特异性竞争吸附而妨碍数据分析。

2.据权利要求1所述一种快速比较未纯化融合酶及其突变体比活性的方法，该方法应用时所涉及的融合酶、融合标签和其对应的亲和分离介质有如下特征：

(一)、适用于此方法的融合酶及其突变体同时具有如下三个特征：

(1)有对应显色底物，能在240nm以上波长测定融合酶底物或反应产物或终止融合酶反应后对底物或产物进行衍生后产物的吸收，从而测定此类融合酶活性；

(2)在此类酶及其突变体的N端或C端经恰当连接肽段加上融合标签后，融合酶及其突变体的比活性高于非融合表达形式比活性的10％；

(3)结合在固定化亲和分离介质上的融合酶及其突变体，比活性达到游离的融合酶及其突变体比活性的50％以上；

(二)、适用于此方法的融合表达系统有如下特征：

(1)适用的融合表达系统包括原核和真核重组表达系统，对应原核融合重组表达宿主细胞包括大肠杆菌，对应的真核融合重组表达宿主细胞包括毕赤酵母及昆虫细胞；

(2)插入到适用的融合表达载体上的酶及其突变体，能在乳糖操纵子或其它系统控制下诱导表达，且未纯化融合酶样品中目标蛋白丰度不低于总蛋白量的3％；

(3)适用的融合表达标签包括连续4个及更多组氨酸残基构成的组氨酸标签、Flag标签、SUMO标签、谷胱甘肽-S-转硫酶即GST、麦芽糖结合蛋白即MBP标签；

(三)、适用于此方法的亲和分离介质有如下特征：

(1)适用的亲和分离介质能通过吸附固定在微孔板上测定室的内表面，或共价修饰被吸附固定化的载体蛋白而间接固定化在微孔板测定室的内表面，或共价修饰固定化在微纳米颗粒表面，并能用于吸附分离带融合标签的融合酶及其突变体；

(2)不同标签亲和分离介质的通用代表为单抗，即都可用其单抗为亲和分离介质；单抗适合通过吸附固定化在微孔板测定室的内表面；

(3)如用组氨酸标签，Ni²⁺-NTA类金属螯合物是适合的亲和分离介质，但需间接吸附固定在微孔板上测定室的内表面或共价固定化在微纳米颗粒的表面；

(4)此方法所需亲和分离介质固定化后，与含融合标签的融合酶及其突变体形成可逆特异复合物，此类复合物在室温下解离常数需小于50.0μmol/L；

(5)适用的亲和分离介质吸附固定化后，其识别基团同不含融合标签的其它蛋白不形成复合物，或所形成复合物的解离常数比相同条件下与含对应融合标签的融合酶及其突变体所形成复合物解离常数高20倍；

(6)所选的亲和分离介质及其所含杂质，对融合酶及其突变体没有显著抑制作用；

(7)所用亲和分离介质为Ni²⁺-NTA类金属螯合物固定化后与融合酶或其突变体形成的特异复合物在室温下解离常数小于0.1nmol/L；此条件下亲和反应体系来自未纯化融合酶样品的融合酶及其突变体总量需小于固定化亲和分离介质结合容量的3倍；

(8)如固定化亲和分离介质的结合位点被占据超过80％时结合的融合酶及其突变体的初速度仍低于每分钟吸收变化0.003，须增加固定化亲和分离介质的用量以提高最大结合容量；当用微孔板固定抗体或载体蛋白时，微孔板的有限吸附容量使得增加固定化亲和分离介质后最大结合容量不能提高，则此方法失效；

(四)、适用于此方法的数据分析方法有如下特征：

(1)被分析的结合酶反应的吸收变化速度最小值应高于每分钟0.003；被分析的结合酶反应的吸收变化速度最大值应在酶标仪或其它光度计的可测范围内；

(2)Equ.(6)为通用模型，适合常用的亲和分离介质；

(3)用Equ.(4)分析时，要求被分析的数据对应的亲和反应体系中来自样品的融合酶及其突变体的总量大于固定化亲和分离介质结合容量的10倍。