CN106754853A - 标签gst的一种不可逆亲和标记试剂及应用 - Google Patents

标签gst的一种不可逆亲和标记试剂及应用 Download PDF

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Abstract

标签谷胱甘肽‑S‑转硫酶sjGST的一种不可逆亲和标记试剂，包括N‑(对甲氧基苯氧乙基)‑(N‑对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类单价标记试剂，及其与二烷基三胺衍生所得双酰胺类二价标记试剂；所述不可逆标记试剂含四类功能基，即对甲氧基苯氧乙基类疏水定位基引导标记试剂进入GST活性中心疏水位点、α‑卤代酰基为代表的修饰功能基与GST活性中心附近巯基/氨基反应、N‑双取代氨基酸类偶联功能基与微纳米材料成酰胺偶联、对氨基苯甲酸或谷氨酸或二者酰化产物为连接骨架提供修饰功能基所需柔性臂；此类亲和标记试剂经偶联功能基的羧基/氨基与微纳米材料氨基/羧基成酰胺偶联后，用于亲和标记sjGST实现融合表达蛋白的活性位点外共价连接，制备蛋白功能化新型微纳米材料。

Description

标签GST的一种不可逆亲和标记试剂及应用
技术领域
本发明属于蛋白质生物技术领域，涉及针对融合表达标签谷胱甘肽-S-转硫酶(siGST)活性位点的不可逆亲和标记试剂，及将此亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面后对GST融合蛋白实现位点选择性固定化的应用。此GST亲和标记试剂的设计，是针对GST活性中心的H位点设计大体积疏水配基并在合适位置添加高反应活性的基团，使其与GST活性位点结合后与活性位点附近特定官能团形成共价键，实现不可逆亲和标记；将此亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面且保留其亲和标记活性则能实现GST融合表达蛋白活性位点之外的位点选择性固定化，制备蛋白功能化的微纳米材料。
背景技术
蛋白功能化材料包括固定化蛋白的微整列芯片、微纳米材料等，在蛋白质生物技术领域有广泛的应用，如生物分子高通量筛选、蛋白pull-down、微流体催化等[NatChem.2016，8：103-113]。相对于DNA固定化，蛋白固定化面临的技术挑战主要在于如何控制其连接反应的位点选择性和蛋白取向一致性从而尽可能保留被固定蛋白的活性。显然，必须蛋白位点选择性固定化，而且为了形成稳定的加合物，位点选择性共价固定化的思路更有吸引力。
微纳米材料是指直径在1nm～100μm的微球(微囊)和厚度在1nm～100μm的薄膜，包括但不限于微纳米磁珠和蛋白共价加合物/蛋白聚合物颗粒。现有在微纳米材料表面的蛋白位点选择性固定化策略包括：1)基于标签的固定化如GST标签、HaloTag标签、His标签等与亲和标记试剂反应[Bioconjug Chem.2014，25(10)：1902-1909]；2)靶酶工程化氨基酸经酶催化或高选择性化学反应共价链接，如点击化学反应；3)基于生物素链亲和素高亲和力结合等非共价固定化[Nat Commun.2016，7：13128；Molecules.2016，21(10)：1370；ChemRev.2015，115(5)：2174-2195；Pharm Res.2011，28(7)：1480-1499；Biomacromolecules.2007，8(6)：1775-1789]。不同应用常需不同固定化方法。基于磁珠固定化靶蛋白，“联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法”[中国发明专利ZL200810237298.2]，有望用于液相组合合成混合物库和天然药物提取物中发现高亲和力配体为先导配体，但需特殊的蛋白质固定化策略。
GST融合表达标签(sjGST)适于亲和纯化靶蛋白并具有一定的增溶能力，被广泛应用于真核靶蛋白在原核系统大量低成本可溶表达及纯化。基于sj GST的自催化或化学固定化策略均有报道[Bioconjug Chem.2014，25(11)：1911-1915；Bioconjug Chem.2014，25(10)：1902-1909；Bioconjug Chem.2013，24(4)：571-577；Bioconjug Chem.2013，24(8)：1295-1301；J Org Chem.2013，78(19)：9647-9658；J Am Chem Soc.2004，126(38)：12047；JAm Chem Soc.2003，125(26)：7810-7811；Bioconjug Chem.2005，16(4)：1009-1018]。但值得注意的是，GST是二聚体，有两个大体积的疏水结合位点，对配体选择性低；目前所见基于sjGST的固定化方法中，并未实现完全封闭其疏水结合位点，所得功能材料将面临疏水小分子的非特异性结合，不适用于筛选小分子配体库。本发明设计sjGST不可逆亲和标记试剂并尽可能封闭二聚体中双活性中心的疏水位点，使基于sjGST的磁珠固定化靶蛋白也适用于小分子配体库筛。
发明内容
本发明设计标签GST的疏水大体积亲和标记试剂，偶联到微纳米材料表面后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，同时采用特殊策略封闭其二聚体中两个活性中心的疏水位点以避免功能化材料对疏水小分子的结合。本发明内容如下：
1.N-(对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其与标记活性对应的显著结构特点是包括至少四种功能基，其对应作用在于：
(1)引导亲和标记试剂进入活性位点疏水腔的对甲氧基苯氧乙基，也称为疏水定位基；
(2)与活性中心附近巯基、胺基发生亲核取代反应的修饰基团，包括但不限于1-卤代乙酰基、丙烯酰基、N-烷基马来酰亚胺基、乙烯磺酰基；
(3)将亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面的偶联功能基，包括但不限于甘氨酸、β-氨基丙酸，γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸，以其羧基与材料表面氨基偶联；
(4)疏水定位、修饰功能基及偶联功能基之间的连接骨架功能基，包括但不限于对氨基苯甲酰基、6-氨基己酰基、γ-谷氨酰基、及对氨基苯甲酰基的氨基与所述氨基酸形成的酰胺衍生物，以其氨基与修饰基团相连而酰基与偶联基团的氨基相连；
2.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST单价不可逆亲和标记试剂，其应用特征在于经微纳米材料表面氨基与单价标记试剂偶联功能基中羧基成酰胺键偶联后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，使亲和标记试剂疏水定位基进入GST活性位点疏水腔，借助连接基团的柔韧性，使修饰基团能对活性中心附近巯基或氨基能实现共价修饰，从而实现对GST不可逆亲和标记；
3.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其特征在于：所述单价不可逆亲和标记试剂，通过偶联功能基中羧基与二乙基三胺或二丙基三胺的末端伯氨基缩水成双酰胺，转变成能同时结合到GST两个活性中心的二价不可逆亲和标记试剂，以其亚氨基为偶联基团或该亚胺基与丁二酸酐或戊二酸酐反应所得羧基为偶联基团对应与材料表面羧基或氨基偶联；
4.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联过程有如下特征：非蛋白类微纳米材料与相对于表面可反应基团过量的标记试剂在包括但不限于N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈中经脱水缩合成酰胺偶联得亲和标记试剂偶联微纳米材料；对蛋白类微纳米材料，先将亲和标记试剂在所述溶剂中用水溶性活化剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加蛋白微纳米材料偶联；
5.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联后，对GST或其融合蛋白的固定化及封闭过程有如下特征：在缓冲液中加入相对于亲和标记试剂偶联微纳米材料表面反应官能团过量的GST或其融合蛋白进行不可逆亲和标记；再用过量单价标记试剂封闭固定化GST中的未修饰活性中心；最后用过量半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、巯基乙酸、巯基乙磺酸之一或其混合物，将偶联在微纳米材料表面的剩余亲和标记试剂转变成亲水基团；以避免功能化材料对疏水小分子的结合。
附图说明
附图1标记试剂合成路线
附图2标记试剂(Br-I)和(Br-II)对sjGST的半抑制浓度(IC50)
附图3 sjGST和标记试剂(Br-I)和(Br-II)等当量结合的kinact
附图4 sjGST与100倍当量标记试剂(Br-I)和(Br-II)结合的kinact
附图5 sjGST自催化100倍当量两种标记试剂与GSH加合物的结合速率常数k
附图6单价标记试剂(Br-I)与sjGST的结合比
附图7二价标记试剂(Br-II)与sjGST的结合比
附图8氨基磁珠与单价标记试剂(Br-I)偶联前后对sjGST固定化动力学及容量
附图9氨基磁珠与单价标记试剂(Br-I)偶联前后对sjGST自催化固定动力学及容量
附图10单价标记试剂(Br-I)偶联磁珠固定化sjGST后对碱性磷酸酶(ECAP)的非特异结合
附图11 SDS-PAGE验证单价标记试剂(Br-I)偶联磁珠对siGST的不可逆结合
附图12单价标记试剂(Br-I)偶联磁珠固定化sjGST再处理后对荧光小分子ANS的非特异结合
附表1标记试剂及其原位生成产物对sjGST的半抑制浓度(IC50)
附表2标记试剂及其原位生成产物对sjGST的抑制常数Ki
应用实施例1
(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-卤代乙酰胺基苯甲酰基)甘氨酸及其二乙基三胺双酰胺的合成(附图1)
1.1对甲氧基苯氧乙基溴(化合物1)的合成
对甲氧基苯酚(5g，40mmol)，1，2-二溴乙烷(15.04g，80mmol)悬浮于水(24mL)中，加入40％-NaOH水溶液(12mL，75mmol)，置于80℃油浴中反应24h。冷却至室温，加入水(100mL)，乙酸乙酯萃取(50mL*3)，合并有机层，用10％-NaOH洗涤(50mL*2)和水洗(50mL*2)，硅胶柱层析纯化，石油醚洗脱。得白色固体6.5g，产率70.3％；
1.2 N-对甲氧基苯氧乙基甘氨酸乙酯(化合物2)的合成
化合物(1)(5.78g，25mmol)，甘氨酸乙酯盐酸盐(6.98g，50mmol)，碳酸钾(6.9g，50mmol)溶于乙腈(100mL)中，回流反应24h。冷却至室温，过滤收集滤液，减压干燥，得黄色液体溶于乙酸乙酯(100mL)，水洗(50mL*2)，干燥浓缩得粗品黄色液体6g，直接用于下一步；
1.3 Boc保护对氨基苯甲酸的合成
对氨基苯甲酸(6.85g，50mmol)，三乙胺(7.57g，75mmol)溶于1，4-二氧六环(100mL)和水(50mL)中，加入Boc2O(16.35g，75mmol)室温反应过夜。反应溶剂减压干燥，得无色液体，加入3M HCl酸化，析出大量白色固体，过滤得固体，固体用水洗(50mL*3)至中性，烘干得白色固体Boc保护对氨基苯甲酸10.7g，产率90％；
1.4 N-对甲氧基苯氧乙基-N’-叔丁氧甲酰胺基苯甲酸甘氨酸乙酯及其酸(化合物3和4)的合成
在三颈烧瓶中加入Boc保护对氨基苯甲酸(4.74g，20mmol)，EDCI(5.75g，30mmol)，4-N，N-二甲氨基吡啶(0.24g，2mmol)，溶于DMF(20mL)，在冰浴下反应10分钟，加入化合物(2)(4.9g，20mmol)室温反应过夜。加入水(150mL)，乙酸乙酯萃取(30mL*3)，有机层分别用1M HCl(20mL*3)，饱和NaHCO3(20mL*3)，水(20mL*3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得化合物3粗品直接用于下一步；
上一步所得化合物(3)溶于乙醇(20mL)，加入NaOH(2g，50mmol)溶于水(20mL)，室温反应2小时。反应溶剂减压除去，加入水(50mL)，乙酸乙酯洗涤(20mL*2)，水层用1M HCl酸化(pH＝1～2)，乙酸乙酯萃取(40mL*3)，有机层水洗(20mL*2)，无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析纯化，洗脱系统为v(石油醚)：v(乙酸乙酯)＝1∶1～1∶2。得化合物4的无色粘稠状液体5.1g，产率57.4％；
1.5单价标记试剂(N-对甲氧基苯氧乙基-N’-溴乙酰酰胺基苯甲酸)甘氨酸(Br-I)的合成
化合物(4)(4.44g，10mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入三氟乙酸(7mL)，室温反应4h，反应溶剂减压除去，加入水(20mL)，用饱和NaHCO3调节至中性，析出大量白色固体，过滤得固体，烘干，溶于四氢呋喃(20mL)置于三颈烧瓶，加入三乙胺(3.03g，30mmol)，置于冰浴下反应10分钟，溴乙酰溴(4.04g，20mmol)溶于四氢呋喃(5mL)，在冰浴下缓慢滴加，滴加完后在室温下反应2小时。减压除去反应溶剂，硅胶柱层析纯化，洗脱系统为v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1～1∶2，得单价标记试剂(Br-I)白色固体2.4g，产率71％；
13C NMR(600MHz，CDCl3)δ175.42(s，1C)，170.31(s，1C)，168.24(s，1C)，159.15(s，2C)，126.01(s，4C)，114.52(s，2C)，105.21(s，2C)，104.15(s，2C)，74.44(s，1C)，59.33(s，1C)，58.74(s，1C)，34.97(s，1C)，22.23(s，1C)；1H NMR(600MHz，CDCl3)δ10.3(s，1H)，7.6-7.9(m，4H)，6.7(m，4H)，4.88(s，2H)，4.29(s，2H)，3.92(s2H)，3.73(s，3H)，3.5(m，2H)。MS：[M+H]＝466.17(理论值466.30)
1.6二价标记试剂双(N-对甲氧基苯氧乙基-N’-溴乙酰酰胺基苯甲酸)甘氨酰二乙基三胺二酰胺(Br-II)合成
化合物(I)(0.93g，2mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.25g，2.2mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，置于冰浴下反应10分钟，二环己基碳二亚胺(DCC)(0.45g，2.2mmol)溶于四氢呋喃(5mL)，冰浴下缓慢滴加，滴加完后室温反应过夜。过滤除去不溶物，滤液减压除去溶剂，加入二氯甲烷(10mL)溶解，置于冰浴下冷却，二乙基三胺(0.103g，1mmol)溶于二氯甲烷(5mL)冰浴下缓慢滴加，滴加完后室温反应3小时。减压除去反应溶剂，硅胶柱层析纯化，洗脱系统为v(二氯甲烷)∶v(甲醇)＝100∶1～100∶10，得二价标记试剂(Br-II)的白色固体0.22g，产率22％。
13C NMR(600MHz，DMSO)δ172.56(s，2C)，169.61(s，2C)，165.71(s，2C)，153.95(s，4C)，128.07(s，8C)，119.37(s，2C)，119.14(s，2C)，115.67(s，4C)，115.02(s，4C)，75.36(s，2C)，66.21(s，2C)，55.80(s，4C)，35.63(s，2C)，30.73(s，2C)，25.89(s，2C)。1H NMR(600MHz，DMSO)δ10.54(s，1H)，10.27(s，1H)，8.43(s，2H)，8.17(s，2H)，7.3-7.6(m，8H)，6.76.8(m，8H)，4.7(s，4H)，3.6-3.7(s，10H)，3.5(s，10H)，2.5(s，4H).2.3(s，1H)MS：[M+H]＝998.45(理论值998.72)
应用实施例2
单价和二价亲和标记试剂及其GSH加合物对sjGST的抑制作用
2.1 sjGST的重组表达
参照文献(重庆医科大学学报2012；37(9)：791-795)，经GSH-Sepharose 4B亲和纯化。
2.2连续跟踪sjGST催化显色底物CDNB和GSH反应生成加合物测定活性
用Bradford方法测定蛋白含量。用Habig法测定sjGST活性，缓冲液用20mM pH 6.5磷酸盐缓冲液；在1.0mL反应体系中，GSH和CDNB终浓度均为1.0mM，sjGST终浓度为10nM，有机溶剂含量控制在5％以下；340nm波长下测定其初速度。产物消光系数为9.6(mM)-1.cm-1，每分钟生成1徽摩尔产物酶量为1个单位。测得比活性约为10.0±1U/mg。
2.3标记试剂(Br-I)和(Br-II)及其与GSH酶催化原位生成加合物对sjGST半抑制浓度(IC50)的测定
在1.0mL的反应体系中，固定CDNB和GSH终浓度为1.0mM。分别测定标记试剂自身及其与GSH酶催化加合物的ICa0：a)标记试剂自身IC50：先后间隔约5秒依次加入CDNB、标记试剂和sjGST，再加入终浓度为1.0mM GSH启动反应，测定340nm波长下吸收随着时间的变化；b)原位生成GSH加合物IC5o：将sjGST、GSH和标记试剂预先反应10min，再加入CDNB到终浓度为1.0mM，测定340nm波长下吸收随着时间的变化。测定不同浓度抑制剂下初速度对无抑制剂时初速度的比值为剩余活性比例，其与1.0之差为抑制率；回归分析抑制率约35％～65％的数据测定抑制剂的半抑制浓度。(附图2和附表1)
2.4标记试剂(Br-I)和(Br-II)与GSH加合物对sjGST抑制常数(Ki)的计算
对于不可逆标记过程考虑其结合位点的逐渐占有，参照文献(MethodsEnzymol.1979，63：437-467；Anal Biochem.2004，327(1)：61-67.)，用方程(1)经Matalab6.5内嵌CFtool程序拟合初速度对抑制剂浓度响应曲线使R2＞0.98所得表观Ki即可近视为真实Ki。(附表2)。
P0：为GST亚基总浓度It：为抑制剂总浓度
v：无抑制剂时的初速率v0：存在某浓度抑制剂时的初速率
2.5标记失活速率常数kinact的测定
在250μL20mM pH 6.5磷酸盐缓冲液中，siGST的终浓度为1μM，分别与终浓度为200μM和3μM的单价标记试剂(Br-I)和终浓度为100μM和1.5μM的二价标记试剂(Br-II)孵育0、5、10、15、20min，取10μL，加入终浓度1.0mM的CDNB和GSH，测定340nm吸收随着时间的变化。用单指数函数模型对响应曲线非线性拟合可得100倍和1倍单价标记试剂浓度下标记失活速率常数kinact分别约为0.20min-1、0.11min-1(附图3)，100倍和1倍二价标记试剂浓度下标记失活速率常数kinact分别约为0.23min-1、0.0078min-1，R-square均大于0.995。(附图4)。
在250μL的20mM pH 6.5磷酸盐缓冲液反应体系中，siGST的终浓度1μM，加入终浓度为200μM的单价标记试剂(Br-I)或终浓度为100μM的二价标记试剂(Br-II)，终浓度为1mM的GSH，孵育不同时间后，取出10μL，再加入终浓度1.0mM的CDNB和GSH，测定340nm波长下吸收随着时间的变化。通过单指数函数模型对响应曲线非线性拟合得100倍单价标记试剂生成的加合物结合速率常数kinact约为0.619min-1，100倍二价标记试剂加合物速率常数kinact约为0.729min-1，R-square可达到0.99。(附图5)
2.6紫外分光光度法检测剩余酶活性测定标记试剂结合比
在250μL的反应体系中，sjGST终浓度为1μM，分别与不同浓度的单价和二价标记试剂孵育10h后，取出10μL，再加入终浓度1.0mM的CDNB和GSH，测定340nm吸收随着时间的变化，沿结合曲线分别作饱和结合相和非饱和结合相的两条归一化直线的交点近视为结合当量点，单价标记试剂结合比约为2(附图6)，二价标记试剂结合比约为1。(附图7)
应用实施例3：磁珠偶联不可逆标记试剂对sjGST的固定化及表征
3.1磁珠偶联标记试剂
直接法制备单价标记试剂偶联磁珠(M-MSP)：25mg氨基磁珠(FBD-MSP-NH2，重庆博蓝鹰生物技术有限公司)用4mL DMF重悬，加入0.3g DCC，取1mL单价标记试剂(Br-I)的2mMDMF溶液，250r/min搅拌室温反应12h，DMF 5mL*3次洗涤得偶联单价标记试剂的磁珠(M-MSP)；
直接法二价标记试剂偶联磁珠(D-MSP)：25mg氨基磁珠(FBD-MSP-NH2，重庆博蓝鹰生物技术有限公司)用4mL DMF重悬，加入0.3g DCC，及表面可反应氨基1.5倍的丁二酸酐，250r/min室温搅拌反应12h，磁分离洗涤得羧基磁珠；25mg制备所得羧基磁珠用4mL DMF重悬，加入0.3g DCC，取1mL二价标记试剂(Br-II)的2mM DMF溶液，250r/min搅拌室温反应12h，DMF5mL*3次洗涤得偶联二价标记试剂的磁珠(D-MSP)；
酶自催化偶联单价、二价标记试剂：与直接偶联相同操作，但与标记试剂同时加入10倍量GSH，反应30min。
3.2磁珠偶联不可逆标记试剂对sjGST的固定化动力学及其固定化容量
在六组200μL 20mM pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，分别加入单价标记试剂(Br-I)偶联磁珠(M-MSP)和sjGST 10μg，二价标记试剂(Br-II)偶联磁珠(D-MSP)100μg和sjGST 10μg；设sjGST空白对照样品。分别孵育30min、60min、120min、240min、360min、480min后，小心磁分离取上清，磁珠用缓冲液(100μL*2)洗涤合并上清。各组取400μL，转移到石英测量杯中，调节Carry Eclipse荧光分光光度计的激发和发射狭缝/带宽为10nm，光电倍增管的电压调节到“中”，280nm激发测定340nm荧光信号，计算其荧光信号与空白对照样品荧光信号之比与1的差值，按下述方法测定磁珠非特异结合并校正，得GST特异性固定化百分比约32±2.8％，GST特异性饱和固定化容量为32±2.8μg/g磁珠(附图8)；
磁珠对sjGST的非特异性结合：在200μL20mM pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，加入氨基磁珠(FBD-MSP-NH2，重庆博蓝鹰生物技术有限公司)100μg和sjGST 10μg，以sjGST为空白对照样品。与固定化反应平行操作，取洗涤上清400μL，测定280nm激发340nm荧光信号，计算其荧光信号与空白对照样品荧光信号之比与1的差值，得480min对sjGST非特异性吸附小于2％，即小于2μg/g。(附图8)
3.3磁珠自催化固定化sjGST时间及其固定化饱和容量
在六组200μL的在20毫摩尔pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，各加入M-MSP 100μg，sjGST10μg，同时加入终浓度为100μM的GSH，以sjGST空白对照样品。分别孵育5min、10min、20min、30min、45min、60min后，小心地磁分离取上清，磁珠用缓冲液(100μL*2)小心洗涤，合并液体。各组样品取400μL，转移到石英测量杯中，调节Carry Eclipse荧光分光光度计的激发和发射狭缝/带宽为10nm，光电倍增管的电压调节到中，280nm激发测定340nm荧光信号，计算其荧光信号与空白对照样品荧光信号之比与1的差值，同法测定磁珠自催化固定非特异性吸附并校正，得GST特异性固定化百分比约31±2.1％。(附图9)
3.4标记试剂偶联磁珠对碱性磷酸酶(ECAP)的非特异性吸附
在四组200μL10mM pH 7.4的HEPES缓冲液中，分别取NH2-MSP 100μg和ECAP 10μg、取M-MSP100μg和ECAP 10μg、取M-MSP 100μg和sjGST 10μg与ECAP 10μg、取M-MSP 100μg加sjGST 10μg及GSH终浓度1mM和ECAP 10μg；各组平行反应6h，小心磁分离得磁珠，磁珠用缓冲液(100μL*2)小心洗涤。测定磁珠上碱性磷酸酶活性，以此计算各组碱性磷酸酶的吸附量：每组磁珠分别取出1ng，加入对硝基苯磷酸酯(PNPP，10mM)200μL，同时取ECAP 2ng加入PNPP(10mM)200μL作为阳性对照，PNPP(10mM)200μL作为阴性对照，反应30min后加入NaOH(1mM)50μL淬灭反应，取出200μL经酶标仪读取其在405nm处的吸光度；
NH2-MSP对ECAP的吸附量为0.036μg/g，M-MSP对ECAP的吸附量为0.052μg/g，M-MSP在sjGST存在下对ECAP的吸附量为0.11μg/g，M-MSP在sjGST及GSH存在下对ECAP的吸附量为0.10μg/g，证明各组对ECAP的吸附量均小于12％。(附图10)
3.5 SDS-PAGE检测标记试剂偶联磁珠siGST的不可逆固定化
在三组200μL20毫摩尔pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，分别取NH2-MSP 200μg和sjGST20μg(非特异固定组4)；M-MSP 200μg和sjGST 20μg(不可逆特异固定组3)；M-MSP 200μg和sjGST 20μg及GSH终浓度1mM(可逆特异固定组5)；各组平行反应6h，小心地磁分离得磁珠，磁珠用缓冲液(100μL*2)小心洗涤，磁珠用SDS-PAGE loading buffer煮沸10min后，取上清进行SDS-PAGE。与氨基磁珠非特固定组4相比，直接固定化组3为不可逆固定化，自催化固定化组5为可逆固定。(附图11)。
3.6标记试剂偶联磁珠及其固定化GST经再处理后对小分子的非特异性结合
在两组200μL的20mM pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，一组取偶联磁珠M-MSP 100μg(示为a)；一组取偶联磁珠M-MSP 100μg加入终浓度为1mM半胱氨酸(Cys)，反应6h后小心地磁分离，磁珠用缓冲液(200μL*3)小心洗涤得再处理偶联磁珠M-MSP(示为b)，各加入终浓度为25μM的小分子荧光物质8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，孵育30min后小心磁分离得磁珠，用缓冲液(200μL*3)小心洗涤；
在另两组200μL的20mM pH 6.5的磷酸盐缓冲液中，均取M-MSP 100μg加入sjGST10μg反应6h，小心地磁分离得sjGST固定化磁珠，用缓冲液(200μL*3)小心洗涤；第一组加入缓冲液(示为c)，第二组加入50μM的单价标记试剂(Br-I)处理20分钟后加入1mM的Cys，再反应30min后小心地磁分离得再处理sjGST固定化磁珠(示为d)，用缓冲液(200μL*3)小心洗涤，各加入终浓度为25μM的ANS，孵育30min后小心地磁分离得磁珠，用缓冲液(200μL*3)小心洗涤；
各组磁珠分散于200μL缓冲液中，取少量涂于载玻片置于荧光显微镜40倍观察拍照，曝光时间为1s。结果显示，用Cys对标记试剂偶联磁珠M-MSP处理前后对小分子ANS的非特异结合均不明显(a，b)，标记试剂偶联磁珠固定化GST对小分子ANS的非特异结合明显(c)，但再依次用单价标记试剂(Br-I)和Cys处理后显著减少对小分子ANS的非特异结合(a)(附图12)。

Claims (5)

1.N-(对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其与标记活性对应的显著结构特点是包括至少四种功能基，其对应作用在于：
(1)引导亲和标记试剂进入活性位点疏水腔的对甲氧基苯氧乙基，也称为疏水定位基；
(2)与活性中心附近巯基、胺基发生亲核取代反应的修饰基团，包括但不限于1-卤代乙酰基、丙烯酰基、N-烷基马来酰亚胺基、乙烯磺酰基；
(3)将亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面的偶联功能基，包括但不限于甘氨酸、β-氨基丙酸，γ-氨基丁酸、6-氨基戊酸，以其羧基与材料表面氨基偶联；
(4)疏水定位、修饰功能基及偶联功能基之间的连接骨架功能基，包括但不限于对氨基苯甲酰基、6-氨基己酰基、γ-谷氨酰基、及对氨基苯甲酰基的氨基与所述氨基酸形成的酰胺衍生物，以其氨基与修饰基团相连而酰基与偶联基团的氨基相连。
2.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST单价不可逆亲和标记试剂，其应用特征在于经微纳米材料表面氨基与单价标记试剂偶联功能基中羧基成酰胺键偶联后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，使亲和标记试剂疏水定位基进入GST活性位点疏水腔，借助连接基团的柔韧性，使修饰基团能对活性中心附近巯基或氨基能实现共价修饰，从而实现对GST不可逆亲和标记。
3.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其特征在于：所述单价不可逆亲和标记试剂，通过偶联功能基中羧基与二乙基三胺或二丙基三胺的末端伯氨基缩水成双酰胺，转变成能同时结合到GST两个活性中心的二价不可逆亲和标记试剂，以其亚氨基为偶联基团或该亚胺基与丁二酸酐或戊二酸酐反应所得羧基为偶联基团对应与材料表面羧基或氨基偶联。
4.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联过程有如下特征：非蛋白类微纳米材料与相对于表面可反应基团过量的标记试剂在包括但不限于N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈中经脱水缩合成酰胺偶联得亲和标记试剂偶联微纳米材料；对蛋白类微纳米材料，先将亲和标记试剂在所述溶剂中用水溶性活化剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加蛋白微纳米材料偶联。
5.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联后，对GST或其融合蛋白的固定化及封闭过程有如下特征：在缓冲液中加入相对于亲和标记试剂偶联微纳米材料表面反应官能团过量的GST或其融合蛋白进行不可逆亲和标记；再用过量单价标记试剂封闭固定化GST中的未修饰活性中心；最后用过量半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、巯基乙酸、巯基乙磺酸之一或其混合物，将偶联在微纳米材料表面的剩余亲和标记试剂转变成亲水基团；以避免功能化材料对疏水小分子的结合。
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