ES2325297B1 - Agentes de etiquetado doble basados en vinilsulfona. - Google Patents
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Abstract
Agentes de etiquetado doble basados en
vinilsulfona.
Agentes de etiquetado que comprenden un
compuesto con dos moléculas etiqueta y un grupo vinilsulfona.
Además, se refiere a los compuestos, el procedimiento de obtención
de los mismos y sus usos en el marcaje de biomoléculas, y más
concretamente de proteínas.
Description
Agentes de etiquetado doble basados en
vinilsulfona.
La presente invención se refiere a un compuesto
de fórmula general (I) que comprende dos moléculas etiquetas y un
grupo vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo la unión
covalente a las moléculas susceptibles de etiquetado. La presente
invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a
sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos
compuestos conteniendo simultáneamente biotina y fluoróforos, para
el etiquetado de biomoléculas y a sus aplicaciones
biotecnológicas.
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El etiquetado de biomoléculas es una herramienta
básica en el campo de la genómica y la proteómica para la
detección, purificación y estudio de interacciones entre
biomoléculas.
De entre la gama de etiquetados de biomoléculas
que son plausibles, destacan por su especial importancia los
etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones
biotecnológicas y su impacto comercial.
El etiquetado fluorescente es un elemento clave
para la detección y análisis de biomoléculas (Patton, W.F.
Electrophoresis (2000), vol. 21, pp.
1123-1144) y es el motor de una industria de miles
de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente,
frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie, la
plata, el oro coloidal o la radioactividad son las siguientes:
- Detección rápida y de sensibilidad elevada:
cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de
10^{7}-10^{8} fotones por segundo.
- Versatilidad: Distintos etiquetados originan
distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado
"policromático" como el empleado, por ejemplo, en la
secuenciación de ADN (Smith, L., et al., Nature (1986), vol.
321, pp. 674-679).
- Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo
raramente interfieren con la biomolécula marcada.
- Localización de la señal en el punto de
etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, su potencial va más allá de la
detección pasiva dado que técnicas como la polarización de
fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer,
también denominado Förster Resonance Energy Transfer) permiten
evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o
entre proteína y ligando. La medida de la polarización proporciona
información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar
las interacciones receptor-ligando (Jameson, D.M.,
Seifried, S.E., Methods (1999), vol. 19, pp.
222-233). FRET es una interacción entre fluoróforos
en la cual la excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a
otro que se excita (aceptor) sin la emisión de un fotón. Esta
interacción se produce cuando la longitud de onda de emisión del
donante es muy próxima a la de excitación del aceptor y es muy
dependiente de la distancia entre donante y aceptor, por lo que se
ha empleado como regla (Remedios, C.G., Moens, P.D., J. Struct.
Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185) para
analizar cambios conformacionales e interacción entre
biomoléculas.
\newpage
Actualmente existe una gran cantidad y variedad
de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de
biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la
rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus
aplicaciones se resumen en la tabla adjunta:
Por otro lado, el etiquetado con biotina también
tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A.,
Anal. Biochem. (1988), vol. 171, pp. 1-32).
La biotina es una molécula que actúa como grupo prostético de
determinadas carboxilasas relacionadas con el metabolismo del
dióxido de carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica
en la alta especificidad y afinidad que la avidina, estreptavidina
y otras proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula
(constante de disociación del orden de 10^{-15} M^{-1}),
haciendo que la interacción tenga la fortaleza de un enlace
covalente sin serlo. Así, la biotinilización transforma moléculas
difícilmente detectables en sondas que pueden ser detectadas o
capturadas con avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este
principio es común para localizar antígenos en tejidos, células y
para detectar biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de
hibridación de ADN. Sin embargo, para determinadas aplicaciones,
como por ejemplo la purificación mediante cromatografía de
afinidad, se necesita que la interacción
biotina-avidina sea reversible, para lo cual se
puede modificar tanto la avidina (por nitrosación de las tirosinas
del centro activo (Morag, E., et al., Biochem. J. (1996),
vol. 316, pp. 193-199) como usar derivados de
biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen biotinas marcadas
fluorescentemente para cuantificar los sitios activos de la avidina
(Gruber, H. J, et al., Biochim. Biophys. Acta (1998), vol.
1381, pp. 203-212) y biotina etiquetada con DNP
(DNP-X-biocytin-X;
US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de
actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos
anti-DNP, permitiendo la correlación entre
fluorescencia y estudios de microscopía electrónica. Existe también
en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con
biotina.
Un aspecto fundamental de cara al uso de
cualquier etiquetado es la unión a la biomolécula y la estabilidad
de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro
grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como
dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado
convenientemente derivatizados a través de la formación de un enlace
covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos
carboxílicos, que a continuación se detallan:
Aminas: Son la diana más común de los
reactivos de modificación covalente y la principal en proteínas. En
la mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y
además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena
lateral hay un grupo \varepsilon-amino fácilmente
modificable dado que se localiza mayoritariamente en la superficie
de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y
la reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de
amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como la
de la cadena lateral de la lisina, son moderadamente básicas y
reaccionan con la mayoría de los reactivos acilantes a pH superior
a 8.
Tres son las derivatizaciones de los reactivos
de etiquetado que reaccionan con las aminas de las
biomoléculas:
- Succinimidil ésteres. Reaccionan con aminas
para originar amidas. Es la derivatización más frecuente dada la
estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con
aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas
aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazoles (histidina).
En presencia de tioles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en
proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina.
Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil ésteres
es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por
ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que
pueden convertirse en sulfosuccinimidil ésteres (Staros, J.V.,
et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp.
220-222) o STP ésteres (Gee, K.R., et al.,
Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp.
1471-1474), que son más polares, y por ello más
solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco
expuestas.
- Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para
formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en la
mayoría de los casos.
- Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con
aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en
medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que
reaccionen con las aminas alifáticas, por lo que se trabaja a baja
temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable
y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes
alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles
(histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son
inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir
desplazamientos nucleofílicos.
- Otras funcionalizaciones pueden ser: aldehídos
y agentes arilantes. Aldehídos que reaccionan con las aminas para
formar bases de Schiff. Se han preparado derivados del
o-ftalaldehído (OPA), naftalendicarboxaldehído (NDA) y
3-acrilquinilencarbaxaldehído
(OTTO-TAG) y se han empleado para cuantificación de
aminas en solución (Liu, J., Hsieh, et al., Anal. Chem.
(1991), vol. 163, pp. 408-412). Y agentes arilantes
como el cloruro o fluoruro de
4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
(NBD) (Watanable, Y., Imai, K., J. Chromatogr, (1982), vol.
239, pp. 723-732).
Tioles: Son dianas más selectivas que el
grupo amino, pues son poco frecuentes en biomoléculas y para ser
reactivos tienen que estar libres (no formar puente disulfuro). El
grupo sulfhídrico puede ser introducido en la macromolécula a
marcar vía modificación química, reducción de puentes disulfuro o
vía inteína (Tan, L.P., Yao, S.Q., Protein and Pept. Lett.
(2005), vol. 12, pp. 769-751) (en el caso de
proteínas), o mediante mutagénesis dirigida para introducir
cisteina.
Los grupos tioles reaccionan a pH fisiológico
(pH 6.5-8) con reactivos alquilantes (como son las
yodoacetamidas y las maleimidas) o arilantes (como el
7-cloro ó
7-flúor-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
(NBD)), para originar tioéteres estables. Reaccionan también con
muchos de los reactivos acilantes de aminas, incluyendo
isotiocianatos y succinimidil ésteres. También los disulfuros
simétricos como la
didansyl-L-cisteína o el ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)
(DTNB) (Daly, T.J., et al., Biochemistry (1986), vol. 25,
pp. 5468-5474) reaccionan con los tioles para dar
uniones de tipo disulfuro no simétrico.
Alcoholes: La función hidroxilo está
presente en las cadenas laterales de la tirosina, serina y
treonina, en esteroles y carbohidratos, pero su reactividad en
soluciones acuosas es extremadamente baja, especialmente en
proteínas por la presencia de nucleófilos más activos como las
aminas y los tioles. Una función que reacciona específicamente con
dioles vecinales es el ácido borónico y forma complejos cíclicos
(Gallop, P.M., et al., Science (1982), vol. 217, pp.
166-169). Sin embargo, un procedimiento estándar
para incrementar la reactividad, especialmente en el caso de
carbohidratos, es la oxidación con peryodato para originar la
función aldehído. Las principales funcionalizaciones de los
reactivos de etiquetado que reaccionan con la función aldehído de
las biomoléculas son: amina, hidrazidas, semicarbazida,
carbohidrazida y O-alquilhidroxilaminas.
Ácidos carboxílicos: Son abundantes en
macromoléculas pero poco reactivos, por lo que es habitual
derivatizarlos de forma tal que se introducen aminas que reaccionan
con las funcionalizaciones anteriormente descritas.
Actualmente es posible adquirir comercialmente
toda una gama de productos de etiquetado con fluorescencia y con
biotina convenientemente derivatizados. La estrategia más frecuente
para funcionalizar los reactivos de etiquetado es la derivatización
como succinimidil ésteres para reaccionar con las funciones aminas
de la biomolécula.
Por otro lado, y desde una perspectiva química
las sulfonas \alpha,\beta-insaturadas (vinil
sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran
utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en
reacciones de adición 1,4 (aceptores de Michael). Adicionalmente,
las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia
variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S.,
Tetrahedron (1990), vol. 282, pp.
6951-6984). Estas características han encontrado
recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica
cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y
reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente
aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se
unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente
en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas
(Meadows, D. C., et al., Med. Res. Rev. (2006), vol.
26(6), pp. 793-814).
Sin embargo, desde un punto de vista
biotecnológico su potencial va más allá. La reactividad de las
vinilsulfonas con biomoléculas se ha aprovechado para la
introducción de polietilenglicol vía reacción con tioles (Morpurgo,
M., et al., Bioconjuq. Chem. (1996) vol. 7, pp.
363-368), para la formación de hidrogeles mediante
entrecruzamiento de péptidos con polietilenglicol funcionalizado
con vinilsulfona (Rizzi, S. C., et al., Biomacromolecules
(2006), vol. 7, pp. 3019-3029) y para la
introducción de moléculas de glucosa derivatizada con vinilsulfona
vía reacción con las aminas de las proteínas
(Lopez-Jaramillo, et al., Acta Cryst. (2005)
vol. F61, pp. 435-438).
Como marcadores, se han descrito diferentes
compuestos coloreados que contienen grupos vinilsulfona. En este
sentido, la patente US4473693 describe colorantes, para el marcaje
intracelular, basados en amarillo Lucifer y que contienen un grupo
vinilsulfona. En la patente EP0187076 se describen compuestos
fluorescentes que contienen un grupo vinilsulfona, estos compuestos
son útiles para estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención se proporciona un nuevo
compuesto de fórmula general (I) que comprende dos moléculas
etiquetas de distinta naturaleza, además de un grupo vinilsulfona,
y que permite llevar a cabo el etiquetado de biomoléculas de una
forma altamente eficaz y sencilla. Estos compuestos constituyen una
alternativa a las derivatizaciones empleadas en proteómica y
genómica para introducir un reactivo de etiquetado en
biomoléculas.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) (a
partir de ahora compuestos de la invención):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
Y es el grupo -SO_{2}R- ó no existe; donde
R es un radical, sustituido o no sustituido,
seleccionado del grupo que comprende un alquilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}))
ó un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}; donde n
toma valores de 2 a 20;
Z es un radical, sustituido o no sustituido,
seleccionado del grupo que comprende un alquilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}))
o un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}; donde n
toma valores de 2 a 20, preferiblemente n toma valores de 2 a 10,
más preferidamente n es 2, 3, 4 o 5 y aún más preferiblemente n es
2.
En una realización preferida, Z es un grupo
alquilo (C_{1}-C_{5}); y más preferiblemente es
un metilo (-CH_{2}-) 6 un alquilo (-CH_{2}CH_{2}-).
m toma valores de 1 a 20 y representa una cadena
alifática (lineal o ramificada, sustituida o no sustituida).
Preferiblemente m toma valores de 1 a 10, más preferiblemente de 1
a 5 y aún más preferiblemente m es 1.
\newpage
Cuando Y es un grupo -SO_{2}R, los compuestos
de la fórmula general (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, R es un grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}. En otra
realización preferida, n puede tomar un valor de entre 2 a 10, más
preferiblemente n es 2, 3, 4 ó 5 y aún más preferiblemente n es
2.
Cuando Y no existe, los compuestos de la
invención tienen la fórmula general (V):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por "alquilo" se entiende en la presente
invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen
de 1 a 10 átomos de carbonos, más preferiblemente tienen de 1 a 5
átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, tert-butilo,
sec-butilo, n-pentilo, etc.
Por "dialquilarilo" se entiende en la
presente invención a un grupo arilo que está sustituido con dos
grupos alquilo que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, más
preferiblemente tienen de 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos
alquilo pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente son
iguales. Y por "arilo" se entiende en la presente invención a
una cadena carbocíclica aromática, que tienen de 6 a 12 átomos de
carbono, pueden ser de anillo único ó múltiple, separado y/o
condensado. Los grupos arilo típicos contiene de 1 a 3 anillos
separados o condensados y desde 6 hasta aproximadamente 18 átomos
de carbono de anillo, tales como radicales fenilo, naftilo,
indenilo, fenantrilo o antracilo.
El término "molécula etiqueta" se refiere
en esta descripción a cualquier sustancia biorreconocible,
colorante, fluoróforo o cualquier otro grupo detectable por
técnicas espectrofotométricas, fluorométricas, de microscopía
óptica, fluorescencia o confocal, anticuerpos y/o RMN, y que
permite fácilmente la detección de otra molécula que por sí sola es
difícil de detectar y/o cuantificar. Preferentemente, esta molécula
etiqueta es biotina o un fluoróforo seleccionado de entre
marcadores fluorescentes que contienen o son susceptibles de ser
derivatizados para la introducción de un grupo ácido carboxílico,
un grupo ácido sulfónico ó un grupo azido, a partir de ahora
representadas las moléculas etiqueta, con grupos ácido carboxílico
ó ácido sulfónico, también según las figuras:
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferiblemente estos fluoróforos son
fluoresceína, dansilo, rodamina o cualquiera de sus derivados. Los
derivados de las moléculas etiqueta pueden ser halogenuros de ácido
ó de sulfonilo, y más preferiblemente cloruros de ácido o de
sulfonilo.
En la presente invención, las dos moléculas
etiqueta que incluyen los compuestos de la invención son de
diferente naturaleza.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un método de obtención de los compuestos de la invención
de fórmula general (IV), es decir, cuando Y es el grupo -SO_{2}R,
y que comprende:
reaccionar:
- una vinilsulfona funcionalizada de fórmula
general (II), conteniendo al menos un grupo amino y un grupo
alquinilo terminal, para la unión con las moléculas etiqueta,
donde R y m están definidos
anteriormente.
- con una molécula etiqueta que contiene un
grupo ácido carboxílico, un grupo ácido sulfónico o cualquiera de
los derivados activados de estas funciones antes o después de
reaccionar con un azido derivado de otra molécula de etiquetado de
diferente naturaleza a la anterior, según cualquiera de los
siguientes esquemas:
donde: Z, m y R están definidos
anteriormente.
El orden secuencial de estas reacciones es
indistinto, primero puede reaccionar el ácido derivado de una
molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados activados con el
compuesto de fórmula general (II) para formar una unión de tipo
amida o sulfonamica y posteriormente el azido derivado de otra
molécula etiqueta; o primero puede reaccionar el azido derivado de
una molécula etiqueta con el compuesto de fórmula general (II) y
posteriormente el ácido de otra molécula etiqueta o cualquiera de
los derivados activados de esta función, obteniéndose de la misma
forma, y en los dos casos, el compuesto de fórmula general (IV) que
corresponde al compuesto de fórmula general (I) de la invención
cuando Y es el grupo -SO_{2}R.
En una realización preferida de la presente
invención, se puede utilizar el cloruro de ácido derivado o el
cloruro de sulfonilo derivado de las moléculas etiquetas.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método de obtención de los compuestos de la invención
de fórmula general (V), es decir, cuando Y no existe, y que
comprende:
reaccionar:
- un compuesto derivado de
2-{[\omega-alquinilalquilamino)ethyl]sulfonyl}etanol
de fórmula (III), conteniendo al menos un grupo amino secundario y
un grupo alquinilo terminal para la unión con moléculas de
etiquetado,
donde m está definido
anteriormente.
- con una molécula etiqueta que contiene un
grupo ácido sulfónico, más preferiblemente una molécula etiqueta
derivada con un grupo cloruro de sulfonilo, y posterior reacción
con un azido derivado de otra molécula de etiquetado diferente de
la anterior:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde: Z y m están definidos anteriormente.
El orden secuencial de las reacciones es el
indicado anteriormente, obteniéndose mediante este procedimiento
compuestos de fórmula general (V) que corresponden a los compuestos
de fórmula general (I) de la invención cuando Y no existe.
Una realización preferida de la presente
invención comprende vinilsulfonas funcionalizadas de fórmula
general (II) donde R es el grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}, n está descrito
anteriormente; n puede tomar un valor de entre 2 a 10, más
preferiblemente n es 2, 3, 4 ó 5 y aún más preferiblemente n es 2.
Estas vinilsulfonas funcionalizadas se pueden obtener por reacción
de divinilsulfona (DVS) con etilenglicol (cuando n es 2) ó
derivados de polietilenglicol (cuando n es mayor de 2) y posterior
reacción de uno de los grupos vinil sulfona con
\omega-aiquinilalquilamino a través de una
reacción de adición tipo Michael, como se muestra a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida de la presente
invención el compuesto de fórmula (III) es
2-{[2-(prop-2-in-1-ilamino)etill]sulfonil}etanol
que se puede obtener por reacción de
(2-etenilsulfonil)etanol y propargilamina,
según el siguiente esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
De esta forma, los compuestos de fórmulas (II) y
(III) son compuestos trifuncionales con grupos que presentan una
reactividad ortogonal entre sí, circunstancia que permite modular
su reactividad. Así, según cualquiera de los métodos de la presente
invención, las vinilsulfonas de fórmula general (II) y (III)
permiten llevar a cabo la incorporación de cualquier molécula
etiqueta que contenga grupos funcionales con una reactividad
complementaria a los grupos presentes en las mismas y que dejen
inalterado un grupo vinilsulfona el cual es usado para la posterior
ligación a las biomoléculas. En particular y dado que las
vinisulfonas de fórmulas (II) de la realización preferida de la
presente invención son portadoras de las funciones amino y
alquinilo se pueden utilizar, pero sin limitarse a, derivados de
moléculas etiqueta conteniendo: a) la función cloruro de ácido ó
cloruro de sulfonilo y b) la función azido, respectivamente. De
forma alternativa dado que las vinisulfonas de fórmulas (III) de la
realización preferida de la presente invención son portadoras de
las funciones amino, hidroxilo y alquinilo se pueden utilizar, pero
sin limitarse a, derivados de moléculas etiqueta conteniendo: a) la
función cloruro de sulfonilo y b) la función azido.
En una realización preferida de la presente
invención las moléculas etiqueta utilizadas son biotina y los
fluoróforos seleccionados de entre fluoresceína, dansilo o
rodamina, o cualquiera de sus derivados. Una realización aún más
preferida de la presente invención comprende los siguientes
cloruros de ácido y el cloruro sulfonilo de estas moléculas
etiqueta:
y también los azido derivados, que
se indican a
continuación:
En una realización preferida de la presente
invención, la obtención de los compuestos de la invención, agentes
de etiquetado doble, se lleva a cabo por reacción de los anteriores
derivados de moléculas etiqueta (cloruros de ácido, cloruros de
sulfonilo y azido derivados) con vinilsulfonas de fórmula general
(II) ó con
2-{[\omega-alquinilalquilamino)ethyl]sulfonyl}etanol
de fórmula (III) a través de: a) reacciones de
N-acilación con cloruros de ácido de las etiquetas;
o reacciones de N-sulfonación con cloruros de
sulfonilo y b) reacciones de cicloadición
1,3-dipolares con azido derivados de las moléculas
etiqueta. El orden secuencial de estas reacciones es indistinto
para el caso del primer método de la invención descrito, aunque en
una realización preferida el orden es
N-acilación/cicloadición. Para el caso del segundo
método de la invención, anteriormente descrito, el orden secuencial
de estas reacciones es N-sulfonación seguido de
cicloadición.
El uso de la función vinilsulfona como
derivatización de los reactivos de etiquetado para llevar a cabo la
unión covalente biomolécula-compuesto de la
invención, presenta las siguientes ventajas:
- a)
- Estabilidad de los agentes de etiquetado.
- b)
- Formación de una unión covalente estable.
- c)
- La reacción es rápida y con altos rendimientos no generándose ningún tipo de subproducto.
- d)
- No se requieren grandes excesos de reactivos.
- e)
- Las reacciones se llevan a cabo en ausencia de catalizadores por simple mezcla de los reactivos.
- f)
- Las reacciones pueden llevarse a cabo en agua sin el uso de co-solventes.
- g)
- Las reacciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones fisiológicas: medio acuoso, rango de pH estrecho, temperaturas suaves.
- h)
- Procesos de purificación y aislamiento sencillos.
- i)
- Existe una tolerancia hacia los otros grupos funcionales presentes en las biomoléculas distintos de los grupos amino y tioles con los que reaccionan las vinil-sulfonas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) como
agentes de etiquetado para el marcaje o etiquetado de moléculas, y
más preferiblemente de biomoléculas. En la presente invención se
entiende por "agente de etiquetado" aquellos compuestos
capaces de unirse a una molécula y que además permitan la
visualización, detección y/o cuantificación mediante espectroscopia
(absorción, fluorescencia, RMN y otros), reacción enzimática
(peroxidasa, fosfatasa alcalina y otros) o espectrometría (masas y
otros) de la molécula objeto del marcaje.
Los agentes de etiquetado doble conteniendo
vinilsulfonas (compuestos de fórmula general (I)) pueden ser
ligados a cualquier biomolécula que contenga grupos funcionales
complementarios (grupos amino y grupos tioles) presentes en las
mismas de forma natural o artificial a través de una reacción de
adición tipo Michael. Además, los compuestos son compatibles con la
naturaleza biológica de las biomoléculas y la reacción de marcaje no
requiere ninguna estrategia de activación.
En una realización preferida de la presente
invención, las biomoléculas seleccionas son proteínas. En una
realización aún mas preferida de la presente invención, las
proteínas seleccionadas son albúmina sérica bovina (BSA), albumina
sérica humana (HSA), lisozima, peroxidasa de rábano picante,
peroxidasa de alcachofa, GFP (Green fluorescent protein) o
Concanavalina A.
En una realización preferida de la presente
invención el etiquetado de proteínas se realiza en una solución de
las mismas en un tampón que no contenga aminas libres como por
ejemplo, pero sin limitarse a, fosfato o HEPES, de fuerza iónica
moderada (50-200 mM) y pH básico
(7,5-8,7) y reacción con un exceso de los reactivo
de etiquetado de fórmula general (I) durante un tiempo suficiente
(habitualmente durante unas horas a temperatura ambiente o toda la
noche a 4ºC) eliminándose el exceso de reactivo mediante diálisis.
El etiquetado se lleva a cabo mediante el siguiente esquema:
Donde:
Y, Z y m están definidos anteriormente;
R^{2} puede ser NH ó S; y
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Fig 1: Muestra la fluorescencia de gel
SDS-PAGE de BSA tras reacción con el agente de
etiquetado doble 25 en función de las condiciones de reacción.
Calles 2, 3, 4 y 5 marcaje a temperatura ambiente y estequiometrías
reactivo de marcaje:proteína 5:1, 10:1, 25:1, y 50:1,
respectivamente. Calles 6, 7, 8 y 9 marcaje a 37ºC y estequiometrías
5:1, 10:1, 25:1, y 50:1, respectivamente. Calle 10 BSA control (sin
marcar).
Fig 2: Muestra el espectro de emisión del agente
de etiquetado doble 29 (A), de la HSA control (B) y de la HSA
marcada (C) tras excitación a 280 nm.
Fig 3: Muestra la fluorescencia de gel
SDS-PAGE tras reacción con el agente de etiquetado
doble 25 con la HRP (Fig. 3A) y con la peroxidasa de alcachofa
(Fig. 3B). De izquierda a derecha, las estequiometrías reactivo
marcaje:peroxidasa son 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 y 1:50.
Fig 4: Muestra la fluorescencia de gel
SDS-PAGE tras reacción de HRP con el agente de
etiquetado doble 25 (calles de la izquierda) y 27 (calles de la
derecha).
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de vinilsulfonas conteniendo grupos
propargilo y aminas secundarias. Compuestos de fórmula general
(II).
Compuesto 3: A una disolución de etilenglicol 2
(330 mg, 5.3 mmol) en THF (100 mL) se le adicionaron DVS 1 (1.6 mL,
16 mmol) y t-BuOK (119 mg, 1.1 mmol). La mezcla de
reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min). El disolvente se
eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt-hexano 2:1 a 3:1)
obteniéndose 3 como un sirope (800 mg, 51%).
Compuesto 5: A una disolución de 3 (414 mg, 1.4
mmol) en Cl_{2}CH_{2}-isopropanol 2:1 se le
adicionó propargilamina 4 (51 mg, 0.93 mmol). La mezcla de reacción
se dejó a temperatura ambiente (1 día). El disolvente se eliminó
por evaporación a vacío obteniéndose un crudo que se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt a AcOEt-MeOH 10:1)
obteniéndose 5 como un sirope (170 mg, 52%).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de derivados de
2-{[2-alquinilamino)ethyl]sulfonyl}etanol
de fórmula general (III).
Compuesto 8: Una disolución de mercaptoetanol 6
(300 mg, 3.84 mmol) en acetonitrilo anhidro (15 mL) se desoxigenó
por burbujeo de Ar durante 5 min. Se adicionó bromocloroetano 7
(0.7 mL, 7.68 mmol) y Cs_{2}CO_{3} (1.9 g, 5.76 mmol). La
mezcla de reacción se mantuvo con agitación durante 16 h. Tras
filtración del Cs_{2}CO_{3}, el disolvente se eliminó por
evaporación a vacío y el crudo resultante se purificó por
cromatografía en columna (éter-hexano 2:1)
obteniéndose 8 (410 mg, 76%).
Compuesto 9: A una disolución de 8 (237 mg, 1.68
mmol) en AcOH (8.5 mL) se le adicionó H_{2}O_{2} del 33% (3.4
mL). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente en la
oscuridad durante 1 día. Tras evaporación a vacío el crudo
resultante se purificó por cromatografía en columna (éter)
obteniéndose 9 (182 mg, 63%).
Compuesto 10: A una disolución de 9 (0.846 g,
4.9 mmol) en THF (10 mL) se le adicionó Et_{3}N (2 mL, 14 mmol).
La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (1.5 h). El
disolvente se eliminó por evaporación a vacío y el crudo resultante
se purificó por cromatografía en columna (AcOEt) obteniéndose 10
(540 mg, 81%).
Compuesto 11: A una disolución de 10 (577 mg,
4.24 mmol) en THF-isopropanol 1:2 (20 mL) se le
adicionó propargilamina 4 (212 mg, 3.85 mmol). La mezcla de
reacción se dejó a temperatura ambiente (1 día). El disolvente se
eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 5:1)
obteniéndose 11 como un sólido (710 mg, 96%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 13: Una disolución de biotina 12 (200
mg, 0.82 mmol) en Cl_{2}SO (5 mL) se mantuvo a temperatura
ambiente (1 h). El exceso de Cl_{2}SO se eliminó por evaporación
a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El sirope
obtenido corresponde al compuesto 13 y se usa directamente sin
ningún tipo de purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 15: Una disolución de rodamina B 14
(195 mg, 0.41 mmol) en POCl_{3} (5 mL) y
1,2-dicloroetano (5 mL) se mantuvo a reflujo (16 h).
El exceso de POCl_{3} y el disolvente se eliminó por evaporación
a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo
obtenido contiene el cloruro de rodamina 15 y es usado directamente
sin ningún tipo de purificación.
\newpage
Ejemplo
4.1
Compuesto 17: A una disolución en acetonitrilo
anhidro (15 mL) del cloruro derivado de biotina 13 obtenido según
se indica en el ejemplo 3.1 a partir de biotina (0.3 g, 1.22 mmol)
se le adicionaron 2-azido etilamina 16 (0.22 g,
2.45 mmol) y Et_{3}N (0.525 mL) disueltos en acetonitirlo anhidro
(5 mL). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (15
min). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío y el crudo
resultante se purificó por cromatografía en columna
(AcOEt-MeOH 5:1) obteniéndose 17 (0.28 g, 73%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4.2
Compuesto 19: A una disolución de cloruro de
dansilo comercial 18 (600 mg, 2.2 mmol) en Cl_{2}CH_{2} (15 mL)
se le adicionaron 2-azido etilamina 16 (390 mg, 4.5
mmol) y Et_{3}N (0.5 mL, 3.5 mmol). La mezcla de reacción se dejó
a temperatura ambiente (15 min). El disolvente se eliminó por
evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía
en columna (éter-hexano 2:1) obteniéndose 19 como
una espuma sólida (680 mg, 96%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4.3
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 21: A una disolución de
fluoresceinaamina 20 (450 mg, 1.3 mmol) en MeOH se le adicionó
anhídrido cloroacético (443 mg, 2.6 mmol). La mezcla de reacción se
dejó a temperatura ambiente (1 día). El precipitado que fue
apareciendo se filtró, lavó (con MeOH y posteriormente éter) y secó
obteniéndose así 21 (440 mg, 80%).
Compuesto 22: A una suspensión de 21 (400 mg,
0.94 mmol) en MeOH (20 mL) se le adicionó azida sódica (306 mg, 4.7
mmol). La mezcla de reacción se irradió con MW (500 W, 65ºC, 10 h).
El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido
se purificó por cromatografía en columna (AcOEt,
AcOEt-MeOH 1:1 a MeOH) obteniéndose 22 como un
sólido (330 mg, 82%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.1
Compuesto 23: Una disolución de cloruro de
biotina 13 en THF anhidro (15 mL), obtenido a partir de biotina
(200 mg, 0.82 mmol) según se indica en el ejemplo 3.1, se enfrió en
un baño de agua-hielo y se le adicionaron 5 (353
mg, 1 mmol) y Et_{3}N (0.230 mL, 1.6 mmol) disueltos en THE
anhidro (5 mL). Se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la
temperatura ambiente procediéndose entonces a la eliminación del
disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó
por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 5:1)
obteniéndose 23 como un sirope (438 mg, 92%).
Compuesto 24: A una disolución de 23 (120 mg,
0.21 mmol) en MeOH (15 mL) se le adicionaron 19 (80 mg, 0.25 mmol),
Et_{3}N (0.09 mL, 0.62 mmol) y
Cul(C_{2}H_{5}O)_{3}P (8 mg, 0.022 mmol). La
mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (3.5 h). El
disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH
3:1) obteniéndose 24 como un sólido (167 mg, 90%).
Compuesto 25: A una disolución de 23 (115 mg,
0.2 mmol) en MeOH (15 mL) se le adicionaron 22 (102 mg, 0.24 mmol),
Et_{3}N (0.085 mL, 0.4 mmol) y
Cul(C_{2}H_{5}O)_{3}P (10 mg, 0.023 mmol). La
mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (3.5 h). El
disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH
3:1 a MeOH) obteniéndose 25 como un sólido (140 mg, 70%).
\newpage
Ejemplo
5.2
Compuesto 26: Una disolución del cloruro de
rodamina B 15 en THF anhidro (15 mL), obtenido a partir de rodamina
B (195 mg, 0.41 mmol) según se indica en el ejemplo 3.2, se enfrió
en un baño de agua-hielo y se le adicionaron 5 (174
mg, 0.49 mmol) y Et_{3}N (0.174 mL, 1.22 mmol) disueltos en THE
anhidro (5 mL). Se dejó que la mezcla de reacción alcanzara la
temperatura ambiente procediéndose entonces a la eliminación del
disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó
por cromatografía en columna (Cl_{2}CH_{2}-MeOH
20:1) obteniéndose 26 como un sólido (272 mg, 86%).
Compuesto 27: A una disolución de 26 (140 mg,
0.18 mmol) en MeOH (15 mL) se le adicionaron el azido derivado 17
(69 mg, 0.22 mmol), Et_{3}N (0.080 mL, 0.057 mmol) y
Cul(C_{2}H_{5}O)_{3}P (10 mg, 0.029 mmol). La
mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (3.5 h). El
disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH
3:1 a MeOH) obteniéndose 27 como un sólido (141 mg, 72%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5.3
Compuesto 28: A una disolución de 11 (160 mg,
0.84 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (20 mL) se le adicionó
cloruro de dansilo 18 (680 mg, 2.52 mmol) y Et_{3}N (0.71 mL,
5.02 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (1
día). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo
obtenido se purificó por cromatografía en columna
(AcOEt-hexano 2:3) obteniéndose 28 como un sirope
(230 mg, 68%).
Compuesto 29: A una disolución de 28 (128 mg,
0.31 mmol) en MeOH (15 mL) se le adicionaron el compuesto
17(89 mg, 0.29 mmol), Et_{3}N (0.080 mL, 0.57 mmol) y
Cul(C_{2}H_{5}O)_{3}P (10 mg, 0.0.29 mmol). La
mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (2 h). El
disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se
purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH
4:1) obteniéndose 29 como un sólido (188 mg, 92%).
\vskip1.000000\baselineskip
El etiquetado de proteínas se realiza según el
siguiente protocolo general: una disolución de proteína en un
tampón que no contenga aminas libres, como por ejemplo fosfato o
HEPES, de fuerza fónica moderada (50-200 mM) y pH
básico (7,5-8,7) se hace reaccionar con 5 moles de
reactivo de marcaje por mol de proteína durante un tiempo
suficiente (habitualmente durante toda la noche a temperatura
ambiente). El exceso de reactivo se elimina mediante diálisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6.1
La BSA tiene un peso molecular de 66.4 kDa y 4.8
de punto isoeléctrico, es hidrosoluble y estable en solución por lo
que es un buen modelo para estudiar las condiciones óptimas de
marcaje. Se estudió la influencia de la temperatura (temperatura
ambiente y a 37ºC) y la estequiometría (reactivo marcaje:proteína
5:1, 10:1, 25:1 y 50:1) en la reacción de marcaje. Se analizó la
eficacia del marcaje mediante electroforesis en
SDS-PAGE y la fluorescencia se visualizó con un
transiluminador comercial (\lambda=365 nm) (Fig. 1). El resultado
muestra que tanto la temperatura como las elevadas estequiometrías
provocan un incremento de peso molecular del enzima consecuencia de
un mayor número de moléculas de reactivo de doble marcaje unido a
la BSA, aunque a efectos de fluorescencia de "visu" no
se observan diferencias significativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6.2
La albúmina sérica es la proteína más abundante
en el sistema circulatorio, responsable del 80% de la presión
oncótica de la sangre y el principal transportador de ácidos
grasos, hormonas poco hidrosolubles o fármacos que de otra forma
son insolubles en el suero. La reacción de marcaje se realizó
durante 12 horas y agitación a 4ºC en tampón carbonato 0.1 M pH 9 y
con una estequiometría HSA:reactivo de marcaje 1:20. El exceso de
agente de etiquetado doble se bloqueó con etanolamina y se eliminó
mediante diálisis frente a tampón PBS.
La reacción de marcaje se puso de manifiesto
mediante FRET. El experimento se realizó en un fluorímetro Shimadzu
RF-5301 PC con una cubeta de cuarzo de 1 mL y 1 cm
de paso de luz. La concentración de las muestras fue 0.1 mg/ml (en
PBS). Se excitó a 280 nm que, es la longitud de onda de excitación
del triptófano presente en la HSA, y se recogió el espectro de
emisión desde 300 hasta 550 nm. Los resultados muestran que la
proteína marcada presenta un espectro de emisión típico a
500-550 nm como consecuencia de la excitación del
dansilo por la transmisión de la energía de fluorescencia emitida
por el triptófano excitado a 280 nm de la propia proteína (Fig 2).
Ni la proteína sin marcar ni el agente de etiquetado doble 29
presentan este máximo de fluorescencia cuando son excitados a 280
nm lo que demuestra la existencia de FRET en la proteína
etiquetada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6.3
La lisozima de huevo tiene un peso molecular de
14.3 kDa, un punto isoeléctrico del orden de 11 y es soluble en
agua. Su punto isoeléctrico y bajo peso molecular la hacen un buen
modelo para complementar los estudios realizados con BSA. Se
estudió la influencia de la temperatura (temperatura ambiente/37ºC)
y la estequiometría (reactivo marcaje:proteína 5:1, 10:1, 25:1 y
50:1) en la reacción de marcaje. Se analizó la eficacia del marcaje
mediante electroforesis en SDS-PAGE y la
fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial
(\lambda=365 nm), comprobándose que tanto la temperatura como las
elevadas estequiometrías provocan un descenso en la solubilidad
consecuencia de un mayor número de moléculas de reactivo de doble
marcaje unidas a lisozima. Los mejores resultados se obtuvieron
cuando la reacción de marcaje se llevó a cabo a temperatura
ambiente y estequiometría 5:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6.4.
Las peroxidasas son enzimas que catalizan la
reducción de peróxido de hidrógeno con la ayuda de un sustrato que
pierde dos átomos de hidrógeno. Son utilizadas ampliamente en
bioquímica clínica. Además, al tratarse de glicoproteínas son un
buen modelo para evaluar la capacidad del reactivo de marcaje para
reaccionar con proteínas protegidas por una "cubierta" de
carbohidratos. Se seleccionaron las peroxidasas de rábano picante y
alcachofa porque la primera es la peroxidasa de referencia en
aplicaciones biotecnológicas y la segunda por presentar una gran
resistencia a la acción de proteasas, probablemente como
consecuencia de una mayor densidad de carbohidratos.
Se realizaron experimentos de marcaje de la
peroxidasa de rábano picante con los reactivos 24 y 29 en tampón
HEPES 100 mM pH 8.5 a dos temperaturas (temperatura ambiente y
37ºC) y tres estequiometrías agente etiquetado:proteína (5:1, 10:1
y 50:1). La eficacia del marcaje se analizó mediante electroforesis
en SDS-PAGE y la fluorescencia se visualizó con un
transiluminador comercial (\lambda=365 nm). Los resultados ponen
de manifiesto la importancia de la temperatura de marcaje, pues
ninguna de las dos peroxidasas se marcó a temperatura ambiente
independientemente de la estequiometría, pero sí a 37ºC.
Se estudió el marcaje de 2 mg de ambas
peroxidasas a 37ºC (1 día) en tampón HEPES 100 mM, pH 8.5, con el
reactivo 25 y estequiometrías proteína:reactivo de marcaje 1:5,
1:10, 1:20, 1:30, 1:40 y 1:50. Las muestras se analizaron mediante
electroforesis en SDS-PAGE y la fluorescencia se
visualizó con un transiluminador comercial (\lambda=365 nm). El
reactivo de marcaje reacciona, aunque de manera dependiente de la
estequiometría y de la peroxidasa: elevadas estequiometrías
originaron mayor fluorescencia y la HRP (Fig 3A) se marca mejor que
la peroxidasa de alcachofa (Fig 3B).
La HRP, 2 mg/mL en HEPES 100 mM, pH 8.5, se hizo
reaccionar con los reactivos de marcaje 25 y 27 usando dos
estequiometrías diferentes (proteína:reactivo de marcaje 1:25 y
1:50) y 37ºC (1 día). Las muestras se dializaron frente a tampón
fosfato 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM para eliminar el exceso de
reactivo de marcaje y se analizaron mediante electroforesis en
SDS-PAGE y la fluorescencia se visualizó con un
transiluminador comercial (\lambda=365 nm). Ambos reactivos de
marcaje reaccionaron (Fig 4), y al igual que en los casos
anteriores, a mayor estequiometría mayor fluorescencia. Se analizó
el efecto de la unión de los reactivos de doble etiquetado sobre la
actividad y sobre la capacidad para interaccionar con avidina. La
actividad específica de las peroxidasa marcadas es del orden del 65%
de las no marcadas, valor que está en el rango de lo descrito por
el proveedor (SIGMA) para soluciones de peroxidasa en tampón pH 8
después de 10 días, que es el tiempo que transcurrió desde el
comienzo del marcaje hasta el estudio de la actividad. La
interacción con avidina se puso de manifiesto incubando avidina
inmovilizada sobre pocillos de placas de ELISA con las enzimas
marcadas, comprobándose, tras lavar, la presencia de actividad
peroxidasa consecuencia de la interacción de la avidina con las
peroxidasas vía la biotina del marcaje, demostrando la
funcionalidad de la biotina de los reactivos de doble marcaje.
Claims (27)
1. Compuesto de fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
Y es el grupo -SO_{2}R- ó no existe; donde
R es un radical, sustituido o no sustituido,
seleccionado del grupo que comprende un alquilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}))
ó el grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}; donde n
toma valores de 2 a 20;
Z es un radical, sustituido o no sustituido,
seleccionado del grupo que comprende un alquilo
(C_{1}-C_{10}), un dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}))
ó un grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}; donde n
toma valores de 2 a 20;
m toma valores de 1 a 20; y
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde
las moléculas etiqueta se seleccionan de entre biotina, fluoróforo
o cualquiera de sus derivados.
3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el
fluoróforo se selecciona de entre dansilo, fluoresceína, rodamina o
cualquiera de sus derivados.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde Z es un alquilo
(C_{1}-C_{5}).
5. Compuesto según la reivindicación 4, donde Z
es un grupo etilo.
6. Compuesto según la reivindicación 4, donde Z
es un grupo metilo.
7. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde m es 1.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde Y es el grupo -SO_{2}R.
9. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 donde R es el grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}, n está definido en
la reivindicación 1.
10. Compuesto según la reivindicación 9, donde n
es 2.
11. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde Y no existe.
\newpage
12. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
13. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
14. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
15. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método de obtención de los compuestos de
fórmula general (I) cuando Y es el grupo -SO_{2}R que comprende
la reacción del compuesto de fórmula general (II)
\vskip1.000000\baselineskip
donde R y m están definidos en la
reivindicación
1
con una molécula etiqueta o cualquiera de sus
derivados, que contienen un grupo ácido ó sulfónilo, antes o
después de reaccionar con otra molécula etiqueta o cualquiera de
sus derivados distinta a la anterior que contiene un grupo
azido.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Método según la reivindicación 16, donde los
derivados de las moléculas etiqueta que contienen un grupo ácido o
sulfonilo son cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo.
18. Método según la reivindicación 16, donde R
es el grupo (CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}, n
está definido en la reivindicación 1.
19. Método según la reivindicación 18, donde n
es 2.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, donde m es 1.
21. Método de obtención de los compuestos de
fórmula general (I), cuando
Y no existe, que comprende:
- a.
- reacción del compuesto de fórmula general (III) con una molécula etiqueta o sus derivados, que contiene un grupo sulfonilo:
\vskip1.000000\baselineskip
- donde m está definido anteriormente; y
- b.
- reacción del compuesto obtenido en el paso (a) con otra molécula etiqueta o sus derivados, distinta de la anterior y que contiene un grupo azido.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Método según la reivindicación 21, donde los
derivados de las moléculas etiqueta que contienen un grupo
sulfonilo son cloruros de sulfonilo.
23. Método según la reivindicación 21, donde m
es 1.
24. Uso de un compuesto de fórmula general (I)
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como agente de
etiquetado.
25. Agente de etiquetado que comprende un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
26. Uso de un agente de etiquetado según la
reivindicación 25 para el marcaje de biomoléculas.
27. Uso de un agente según la reivindicación 26,
donde las biomoléculas son proteínas.
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WO2015065985A1 (en) * | 2013-10-31 | 2015-05-07 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Chemical reagents for attaching affinity molecules on surfaces |
WO2015131073A1 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Triazole-based reader molecules and methods for synthesizing and use thereof |
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2009
- 2009-02-19 WO PCT/ES2009/070035 patent/WO2009106665A1/es active Application Filing
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Also Published As
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