ES2341946T3 - Reactivos y un metodo para el marcaje por saturacion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Un conjunto concordante de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en la que n es diferente para cada uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó 3; Z1 y Z2 representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo fenilo o naftilo; uno de los grupos R1 y R2 es el grupo: **(Ver fórmula)** en el que Y es un grupo de unión diana; el grupo restante R1 o R2 se elige entre los grupos -(CH2)4-W o -(CH2)r-H; el grupo R3 es hidrógeno, excepto cuando o bien R1 o bien R2 es -(CH2)r-H, en cuyo caso R3 es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato; p es un número entero de 3 a 6; q se elige para que sea 2 ó 3; y r es un número entero de 1 a 5; y sus sales; caracterizado porque cuando n de dos de dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos colorantes difiere en -1.
Description
Reactivos y un método para el marcaje por
saturación de proteínas.
La presente invención se refiere a colorantes
fluorescentes y a un método para marcar muestras de proteínas
complejas para permitir el análisis diferencial de proteínas.
La Electroforesis Diferencial en Gel 2D
(bidimensional) (Difference Gel Electrophoresis: DIGE) usa
colorantes fluorescentes concordantes, resueltos espectralmente,
para marcar muestras de proteína antes de la separación
electroforética bidimensional (2D) (Minden, J. et al,
Electrophoresis, (1997), 18, 2071). Este método multiplexor
fluorescente supera muchos de los inconvenientes de la
electroforesis 2D tradicional. El premarcaje fluorescente de
muestras de proteína permite que muestras múltiples sean analizadas
sobre el mismo gel, lo que hace que se identifiquen fácilmente
diferencias cuantitativas entre las muestras por superposición de
las imágenes fluorescentes. Para permitir la multiplexación
fluorescente, las muestras de proteína han de ser marcadas por
igual con los colorantes, y la migración de las proteínas marcadas
en el gel ha de ser concordante posicionalmente, para que sea
posible detectar diferencias cuantitativas.
El documento WO 96/33406 (Minden, J. et
al) describe un método para detectar diferencias entre distintas
muestras de células usando colorantes concordantes, resueltos
espectralmente, para marcar proteínas en las muestras antes de la
electroforesis 2D. Se describen colorantes que son concordantes para
el peso molecular y la carga para dar una migración equivalente. El
método emplea colorantes de cianina que tienen un grupo reactivo
éster de N-hidroxisucinimidilo (NHS) para marcar
aminas. El grupo éster de NHS está diseccionado en el
\varepsilon-amino de los restos de lisina en las
proteínas y tiene por resultado el marcaje covalente. Tres
colorantes diferentes (Cy2^{TM}, Cy3 y Cy5) son derivatizados
para permitir la multiplexación. Estas moléculas de colorante tienen
un peso molecular de aproximadamente 500 Daltons y son concordantes
en masa para dar la migración equivalente de la proteína marcada.
Los colorantes cuentan con la carga intrínseca del flúor de la
cianina para compensar la pérdida de una carga positiva de la
lisina en la conjugación del colorante con la lisina. El documento
WO 96/33406 describe el uso de estos colorantes en una estrategia
mínima de marcaje para marcar entre 1 y 2% de los sitios de unión
disponibles. Para conseguir una migración equivalente, las parejas
de colorante eran concordantes por su masa compensando la
diferencia de la longitud del enlazador entre los anillos de indol
de la cianina por modulación del tamaño de la cadena alifática unida
a un nitrógeno del indol por dos unidades de carbono. Dos o más
colorantes resueltos espectralmente que cumplen estos criterios
representan un conjunto de colorantes de marcaje mínimo
concordantes. La migración equivalente del conjunto de colorantes
concordante de marcaje mínimo de lisina fue demostrada usando propil
Cy3 y metil Cy5 para marcar proteínas, seguido por su separación en
2D superponiendo las imágenes resultantes para mostrar la
concordancia posicional de las dos muestras marcadas.
La publicación de Ernst L. A. et al.,
Cyanine dye labeling reagents for sulphydryl groups cytometry, Alan
Liss, Nueva York, EE.UU., vol. 10, nº 1, 1989, páginas
3-10, XP000071370 ISSN: 0196-4743,
describe reactivos que comprenden colorantes fluorescentes de
merocianina y cianina, para el marcaje covalente de proteínas y
otras biomoléculas. Los colorantes se describen como poseedores de
unas propiedades ventajosas para la citoquímica. Los colorantes
usados en este artículo no son concordantes entre sí con respecto a
la estructura molecular y a la carga.
Los restos de lisina son muy abundantes en las
proteínas, asegurando que esta estrategia de marcaje representará a
todas la proteínas presentes en una muestra compleja. Sin embargo,
el contenido de lisina típico de una proteína es 7% y, si cada
lisina de una proteína fuese marcada, esto tendría por resultado un
gran desplazamiento de la masa debido al colorante. Así, la
estrategia empleada es marcar "mínimamente" la proteína para
asegurar que solamente son marcadas de aproximadamente 1 a 5
moléculas de proteína, dando así una probabilidad estadística de
que cada molécula marcada tiene solamente un colorante unido. Esto
crea un patrón de manchas en 2D que es muy similar a las imágenes
teñidas con plata, pero que da una mayor sensibilidad y margen
dinámico, y la facultad de multi-
plexar.
plexar.
Un análisis en gel en 2D típico implica
"picar" manchas de la proteína de interés a partir del gel para
su identificación por MALDI-MS (Matrix Assisted
Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry). El
método de marcaje mínimo tiene por resultado 2 manchas por proteína
(es decir, marcada y no marcada), con la mayor parte de la proteína
en la mancha no marcada. La mancha no marcada ha de estar situada
para recuperar proteína suficiente para permitir la identificación
por MALDI-MS. Esto requiere una etapa de tinción
adicional antes de picar la mancha. Con el fin de facilitar el
picado de la mancha de proteína directamente a partir de geles
fluorescentes, se requiere una estrategia de marcaje que dé una
sola mancha por proteína.
La estrategia de marcaje empleada en la presente
invención procura saturar la proteína con colorante con el fin de
marcar el mayor número posible de restos diana y producir una sola
mancha marcada por isoforma de proteína. Así, una molécula de
colorante de cianina es acoplada a todos los restos diana de
aminoácido disponible en una proteína, dando así una población
única de moléculas de proteína marcadas, con un número similar de
moléculas de colorante unidas. De acuerdo con la presente
invención, el marcaje de saturación se consigue usando conjuntos de
colorantes direccionados en los restos de cisteína, que contienen un
grupo tiol. Los restos de cisteína están presentes en el 95% de la
proteínas, pero en cada proteína hay menos restos de cisteína que de
lisina. Esto quiere decir que pueden ser marcadas todas las
moléculas de proteína, pero cada molécula de proteína tendrá menos
restos marcados que si los restos de lisina fuesen marcados a
saturación. Esto tiene por resultado el aumento de la sensibilidad
de detección ya que la proporción de proteína marcada es más alta
que con el marcaje mínimo, pero asegura que las proteínas siguen
siendo solubles.
El aumento de la masa debido a la adición de
colorante (el desplazamiento de masa) con el marcaje de saturación
de los restos de cisteína será mayor que el aumento empleando una
estrategia de marcaje mínimo de los restos de lisina. Sin embargo,
el aumento de la masa es menor que el que se observaría si se
emplease un método de marcaje de saturación sobre restos de lisina.
La cuantía del desplazamiento de masa debido a la adición de
colorante variará para cada proteína dependiendo del contenido de
cisteína en la proteína individual (típicamente aproximadamente 2%)
y la disponibilidad de los restos de cisteína para el colorante bajo
las condiciones de marcaje. Esto tiene por resultado un patrón 2D
de manchas que es muy diferente de los mapas de proteína 2D teñidos
con plata publicados.
La presente invención por consiguiente
proporciona reactivos fluorescentes y un método para el marcaje
reproducible de todos los restos de cisteína disponibles que son
accesibles en una mezcla de proteínas que contienen cisteína. Los
derivados de colorante de cianina de acuerdo con la presente
invención proporcionan valiosos conjuntos de marcadores
fluorescentes, cada uno de los cuales tiene una estructura de núcleo
común, y que son particularmente útiles para análisis
multiplexión.
En consecuencia, en un primer aspecto, la
presente invención proporciona un conjunto concordante de colorantes
fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes
diferentes que tienen la fórmula (I):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre los grupos
-(CH_{2})_{4}-W o
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W;
W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato; p
es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de dichos
colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos
colorantes difiere en -1.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un conjunto de colorantes fluorescentes concordantes,
en el que cada colorante del conjunto es capaz de unión covalente a
una proteína y en el que cada uno de los colorantes tiene una
estructura molecular y una carga que son concordantes unas con
otras, de tal forma que la movilidad electroforética relativa de
una proteína marcada con un colorante del conjunto es la misma o
sustancialmente la misma que la movilidad electroforética de la
proteína marcada con un colorante diferente del mismo conjunto. En
una realización de acuerdo con el primer aspecto, el conjunto
concordante de colorantes comprende al menos dos colorantes
fluorescentes diferentes, en donde cada colorante de dicho conjunto
es un compuesto que tiene la fórmula (I) y en donde Z^{1},
Z^{2}, R^{1}, R^{2}, R^{3}, Y, W, n, p, q y r se han
definido antes en el presente texto. Adecuadamente, los diferentes
colorantes en el conjunto concordante de colorantes fluorescentes
pueden ser resueltos espectralmente para permitir que diferentes
muestras marcadas con tales colorantes se distingan unas de otras.
Adecuadamente, al menos dos colorantes del conjunto concordante de
colorantes tienen una estructura de acuerdo con la fórmula (I) y
pueden elegirse entre la clase de colorantes de trimetina cianina
(en la que n = 1), la clase de colorantes de pentametina cianina (en
la que n = 2) y los colorantes de heptametina cianina (en la que n
= 3).
Adecuadamente, el conjunto concordante de
colorantes fluorescentes de acuerdo con la invención comprende al
menos dos diferentes colorantes fluorescentes que tienen la fórmula
(II):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre -(CH_{2})_{4}-W o
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W;
W se elige entre ácido sulfónico y
sulfonato;
p es un número entero entre 3 y 6;
q se elige para que sea 2 ó 3;
y r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de dichos
colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos
colorantes difiere en -1.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el conjunto concordante de
colorantes fluorescentes comprende al menos dos colorantes
diferentes de acuerdo con la fórmula (I) o (II) en la cual:
n se elige para que sea 1 ó 2;
p se elige para que sea 4 ó 5;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r se elige para que sea 1, 2 ó 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el grupo de unión diana Y en
cada colorante del conjunto concordante de colorantes fluorescentes
es el mismo y se elige entre un grupo maleimido y un grupo
yodoacetamido. Un grupo de unión diana particularmente preferido
para cada colorante es un grupo maleimido.
Particularmente preferidos son los conjuntos de
colorante de acuerdo con la fórmula (I) o (II) que son elegidos
entre la clase de colorantes de trimetina cianina y la clase de
colorantes de pentametina cianina. Tales colorantes se describen
como colorantes Cy3^{TM} y Cy5. Los datos de absorbancia y emisión
para los colorantes de cianina se muestran a continuación en la
Tabla 1.
Adecuadamente, las sales de los colorantes
fluorescentes de acuerdo con la fórmula (I) o (II) pueden ser
elegidas entre K^{+}, Na^{+}, NH_{4}^{+}, R^{3}NH^{+} y
R_{4}N^{+} en donde R es alquilo C_{1} a C_{4}.
En una realización alternativa, el conjunto
concordante de colorantes puede incluir opcionalmente uno o más
colorantes adicionales, con la condición de que cada uno de tales
colorantes adicionales posea unas características de carga y masa,
de forma que la movilidad electroforética de una proteína marcada
con el colorante sea la misma o sustancialmente la misma que la
movilidad electroforética de una proteína marcada con un colorante
de acuerdo con la fórmula (I) o (II). Otro de estos colorantes
adicionales puede incluir colorantes que contienen benzoxazol. Un
ejemplo de colorante adicional es Cy2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los conjuntos ejemplares que contienen pares de
colorantes fluorescentes de acuerdo con la fórmula (I) o (II) que
son concordantes en movilidad electroforética cuando se acoplan con
proteínas son los siguientes:
Conjunto
1
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto I); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1,3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto II);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
2
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-propil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto III); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto IV);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
3
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto I); y
1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto V);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
4
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto VI); y
1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto VII).
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
5
1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto VIII); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto IV); y
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
6
1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto IX); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto X).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención por consiguiente
proporciona un conjunto concordante de reactivos para marcar
reproduciblemente todos los restos de cisteína accesibles en una
mezcla de proteínas que contienen cisteína bajo las condiciones
usadas. La migración equivalente en la dimensión pI se logra usando
conjuntos de colorantes con una carga neutra global con el fin de
coincidir con la carga neutra en el grupo tiol con el cual están
conjugados los colorantes. Los colorantes de cianina neutros pueden
ser obtenidos por medio de un grupo sustituyente de ácido sulfónico
o sulfonato unido covalentemente a la estructura del colorante.
Además, se ha descubierto que la migración de masa equivalente no
se consigue simplemente haciendo concordar el peso molecular de los
conjuntos de colorante, sino que más bien requiere la cuidadosa
manipulación del tamaño y la masa globales del colorante con el fin
de conseguir la concordancia posicional de las proteínas marcadas
con tales colorantes. Con el fin de obtener la migración
equivalente empleando un método de marcaje de saturación de
cisteína, se requieren conjuntos de colorantes en los que cada uno
de los colorantes concordantes de acuerdo con la fórmula (I) difiera
en masa en una única unidad de carbono. Los conjuntos de colorantes
pueden obtenerse variando diferentes sustituyentes unidos al
cromóforo del colorante. Dos o más colorantes resueltos
espectralmente que cumplen estos criterios representan un conjunto
de colorantes de saturación
concordante.
concordante.
La presente invención también proporciona un
método para el marcaje de saturación de una proteína con un
colorante fluorescente con el fin de marcar todos los restos de
aminoácido diana disponibles de la proteína, dando así
esencialmente una población única de moléculas de proteína marcadas.
Adecuadamente, el aminoácido diana es un resto de cisteína. Por el
término "disponible" se entienden restos de aminoácido que son
accesibles al colorante fluorescente para la reacción. Los restos
de cisteína disponibles han de ser accesibles, y en una forma
reducida (es decir, en un tiol libre).
\vskip1.000000\baselineskip
Así, en un segundo aspecto, se proporciona un
método para marcar una mezcla de proteínas de una muestra en la que
cada una de dichas proteínas contiene uno o más restos de cisteína,
comprendiendo dicho método:
i) añadir a un líquido acuoso que contiene dicha
muestra un colorante fluorescente en donde dicho colorante contiene
un grupo de unión diana que es reactivo de forma covalente con
dichas proteínas; y
ii) hacer reaccionar dicho colorante con dichas
proteínas de forma que dicho colorante marque dichas proteínas;
caracterizado porque todos los restos de
cisteína disponibles de dichas proteínas son marcados con dicho
colorante.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el grupo de unión diana se
elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.
En una realización preferida de acuerdo con el
segundo aspecto, el método comprende además, antes de la etapa i),
la etapa de tratar la proteína con un reductor.
Preferentemente, el colorante de cianina se usa
en un intervalo de 5 a 200 nmoles de colorante por 50 \mug de
proteína.
Preferentemente, el método para marcar una
mezcla de proteínas en una muestra de acuerdo con el segundo aspecto
se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 6,0 a 9,0.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona un método de
marcaje y de esta forma conferir propiedades fluorescentes a una
muestra, adecuadamente una muestra de proteína, usando un colorante
de acuerdo con la fórmula (I). Así, en un tercer aspecto, se
proporciona un método para marcar una o más proteínas en una
muestra, comprendiendo el método:
i) añadir a una muestra líquida que contiene
dichas una o más proteínas un colorante fluorescente de fórmula
(I):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo de fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre -(CH_{2})_{4}-W ó
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W;
W se elige entre ácido sulfónico y
sulfonato;
p es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de dichos
colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos
colorantes difiere en -1; e incubar dicho colorante con
dicha muestra bajo condiciones adecuadas para marcar dichas una o
más proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, cada uno de los grupos Z^{1}
y Z^{2} representan los átomos de carbono necesarios para
completar un sistema de anillo de fenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el método de acuerdo con el
tercer aspecto emplea un colorante fluorescente de fórmula (I) en
la que:
n se elige para que sea 1 ó 2;
p se elige para que sea 4 ó 5;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r se elige para que sea 1, 2 ó 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente el grupo de unión diana Y se
elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.
\newpage
Para llevar a cabo el método para marcaje de
saturación de restos de cisteína en proteínas, se han de considerar
varios parámetros, que incluyen:
En proteínas plegadas nativas muchos restos de
cisteína están implicados en la estructura secundaria de las
proteínas por la formación de puentes disulfuro, y también pueden
estar enterrados dentro del núcleo de la molécula. Con el fin de
marcar esos restos, la proteína ha de ser desplegada para permitir
la accesibilidad de los colorantes, usando agentes de
desnaturalización de proteína tales como la urea, y han de reducirse
para generar el tiol libre. La elección del reductor es importante
para permitir una reducción eficiente de la proteína. Los
reductores de proteína que contienen tiol usados comúnmente son
ditiotreitol (DTT) y \beta-mercaptoetanol. Los
agentes reductores de fosfina adecuados incluyen tributil fosfina
(TBP) y tris(2-carboxietil)fosfina
(TCEP). También puede usarse el borohidruro sódico. La TCEP es un
agente reductor preferido para dar una reducción eficaz, al tiempo
que se minimiza la reacción con el colorante.
La eficacia de la reducción viene influida por
la concentración de agente reductor (relativa al contenido de
cisteína de la muestra de proteína), la temperatura de reacción (que
afecta a la desnaturalización de la proteína) y la duración de la
reacción. Si el agente reductor es inmovilizado sobre esferas, esto
puede afectar también a la eficacia. La concentración óptima de
agente reductor para un tipo de muestra en particular variará
dependiendo del agente reductor usado y del contenido de cisteína de
la muestra. Sin embargo, típicamente 50 \mug de proteína
requieren 10 nmoles de TCEP para la reducción (suponiendo un
contenido medio de cisteína de 2%). Para muestras de mamífero con
un contenido más alto de cisteína, se usan entonces típicamente 20
nmoles de TCEP. Es también importante mantener la relación de 1
nmol de TCEP a 2 nmoles de colorante para dar un marcaje óptimo.
La combinación óptima de estos factores varía
dependiendo de la estructura y del contenido de cisteína de la
proteína en concreto. Una temperatura de reducción más elevada dará
un mayor marcaje, como resultado del aumento de la
desnaturalización de la proteína y por tanto una mayor accesibilidad
de las cisteínas. Sin embargo, las temperaturas altas pueden tener
un efecto adverso sobre la proteína. La urea existe en equilibrio
con carbamilato, pero a temperaturas más elevadas (generalmente
> 40ºC) el equilibrio se desplaza en favor del carbamilato.
El carbamilato es un especie más reactiva
químicamente que la urea y puede atacar a aminas primarias (p. ej.
el grupo amino N-terminal y el grupo
\varepsilon-amino de las lisinas), dando lugar a
una heterogeneidad de carga artificiosa y a la generación de trenes
de carga en los geles 2D. El marcaje de saturación de restos de
cisteína a 37ºC en presencia de urea no manifiesta efectos de
carbamilación.
La naturaleza hidrófoba de los colorantes de
cianina requiere el uso de disolventes orgánicos (p. ej. 10% DMF)
para ayudar a la solubilidad. Para conseguir la saturación de los
restos diana disponibles de forma que el marcaje llegue a ser
completo, es necesario usar concentraciones elevadas de colorante
para el marcaje, manteniendo al mismo tiempo la solubilidad del
colorante. El uso de un grupo sulfonato en los colorantes de
cianina contribuye a mantener la solubilidad en concentraciones de
colorante elevadas. La concentración de colorante óptima en la
reacción de marcaje para un tipo de muestra en particular variará
dependiendo del contenido de cisteína de la muestra y de si hay
cualquier otro componente en la muestra que pueda interferir con el
marcaje. Sin embargo, el colorante debe siempre estar presente al
menos en exceso del contenido de tiol para conseguir el marcaje de
saturación, y es también importante mantener la relación de 1 nmol
de TCEP a 2 nmoles de colorante para dar el marcaje óptimo. El uso
del colorante en exceso requeriría típicamente que el colorante
esté en el intervalo de 5 a 200 nmol por 50 \mug de muestra de
proteína. Sin embargo, 50 \mug de proteína requieren típicamente
20 nmoles de colorante para una reacción de marcaje (suponiendo un
contenido medio de cisteína de 2%). Para muestras de mamífero con
un contenido de cisteína más alto, se usa típicamente 40 nmoles de
colorante. Sin embargo, otros componentes presentes en la muestra
pueden también reaccionar con el colorante. Por ejemplo, las
muestras hepáticas puede contener niveles elevados de tripéptido
glutatión, en respuesta a sustancias agresivas o tóxicas. En
consecuencia, pueden requerirse mayores concentraciones de colorante
con el fin de mantener la eficacia del marcaje. Las muestras de
suero que contienen niveles elevados de albúmina, que es una
proteína muy abundante con un elevado contenido de cisteína, puede
también requerir mayores concentraciones de colorante.
Los restos de cisteína son fuertemente
nucleófilos y pueden ser marcados en las proteínas usando reactivos
que tienen grupos reactivos yodoacetamida y maleimida. Un grupo
reactivo particularmente preferido es el grupo maleimido. El pKa de
un grupo tiol es crítico en la determinación de su reactividad. Por
encima del correspondiente pH, su nucleofilicidad aumenta
marcadamente a medida que la forma tiolato (S^{-}) reemplaza a la
especie protonada. En una molécula de cisteína aislada, el grupo
tiol tiene un pKa de aproximadamente 8,6; sin embargo, el
microentorno del tiol dentro de la proteína puede también afectar a
su pKa. La velocidad de reacción de los grupos tiol con maleimidas
aumenta a pH alcalino, debido al aumento de concentración de anión
tiolato. Bajo condiciones alcalinas, la hidrólisis de la maleimida
a ácido maleámico se convierte en una importante reacción
secundaria, y las reacciones de competencia con otros grupos
funcionales tales como lisina e histidina se hacen más
importantes.
El grupo \varepsilon-amino de
la lisina se comporta como una amina típica con un pKa en proteínas
de 9,0-9,5. A un pH más bajo, p. ej. a pH 6,5, la
mayor parte de los grupos amina están predominantemente en la forma
protonada, NH_{3}^{+} no reactivo, y la reacción con los grupos
maleimida es aproximadamente 1000 veces más lenta que con tioles.
Los grupos amina terminales tienen valores de pKa de
7,5-8 dependiendo del aminoácido implicado. La
amina terminal estará presente en forma no protonada (reactiva) a pH
más bajo que el de la lisina. Así, la reacción de grupos maleimida
con aminas requiere un pH más alto que la reacción con grupos tiol.
En consecuencia, el marcaje de grupos tiol con maleimidas es más
específico a pH más bajo, con menos potencial para marcar restos de
lisina. Así pues, el pH de la reacción es también un factor crítico
para conseguir el marcaje de saturación y para el marcaje
específico de los grupos tiol. Preferentemente, el marcaje de
saturación usando colorantes fluorescentes, por ejemplo de acuerdo
con la fórmula (I), se lleva a cabo en un intervalo de pH de 6,0 a
9,0, lo más preferentemente un pH de 8,0, siendo un compromiso entre
la presencia del tiolato reactivo y la presencia de aminas
reactivas.
Las muestras de proteína para comparación pueden
derivarse de un diversidad de fuentes de células, incluyendo todas
la células normales y transformadas derivadas de cualquier fuente
reconocida con respecto a especies (p. ej. humana, de roedor,
simio), fuente de tejido (p. ej. cerebro, hígado, pulmón, corazón,
riñón, piel, músculo) y tipo de célula (p. ej. epitelial,
endotelial). Hay protocolos establecidos disponibles para el
cultivo de diversos tipos de células (véase, por ejemplo, Freshney,
R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2ª
Edición, Alan R. Liss Inc. 1987). Esta invención puede también ser
usada para comparar muestras de plantas usando plantas intactas o
células vegetales cultivadas. Además, las muestras para uso en el
método de la invención pueden derivarse de células que han sido
transfectadas con genes recombinantes y cultivadas, células que han
sido sometidas a un estímulo externo (tal como choque térmico o
tratamiento con fármacos) u otros fluidos biológicos (tales como el
líquido cerebroespinal o suero). La presente invención puede
también ser usada para direccionar subconjuntos de proteínas
presentes en una célula antes del marcaje; por ejemplo, aislando
fracciones particulares tales como proteínas de bajo peso molecular
o margen de pI; compartimentos sub-celulares tales
como proteínas nucleares.
Los expertos en la técnica sabrán que las
muestras de proteína pueden ser extraídas de tales muestras usando
una diversidad de métodos y reactivos de extracción. Típicamente,
las células del tejido o el cultivo se rompen, por ejemplo mediante
homogenización, sonicación, lisis de células, y la proteína se
extrae y se solubiliza en presencia de reactivos, incluyendo
reactivos de desnaturalización, tales como urea, tiourea,
detergentes tales como SDS, CHAPS, Triton X-100,
NP-40, agentes reductores tales como ditiotreitol
(DTT), mercaptoetanol, y tampones tales como Tris, Hepes. También
pueden añadirse inhibidores de proteasa, tales como fluoruro de
fenilmetanosulfonilo (PMSF), ácido etilendiaminatetraacético (EDTA),
leupeptina, aprotinina, para minimizar la degradación por proteasas
endógenas.
El conjunto concordante de colorantes
fluorescentes y el método de marcaje pueden ser usados para detectar
diferencias en el contenido de proteína de al menos dos muestras de
proteína diferentes, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito
por Minden, J. et al. (Electrophoresis, (1997), 18, 2071). En
un ejemplo típico del método, se extrae la proteína de cada una de
las 2 diferentes muestras por métodos conocidos como los que se
describen anteriormente, y se determina la concentración de
proteína. A una parte alícuota de 50 \mug de cada extracto de
proteína se añaden 10 nmoles de TCEP
(tris-(2-carboxietil)fosfina) y esto se
incuba durante una hora a 37ºC. A cada una de estas muestras de
proteína reducida se añaden 20 nmol de colorante y se incuban
durante 30 minutos a 37ºC. La primera muestra de proteína se marca
con el primer colorante (por ejemplo Cy3) de un conjunto
concordante de colorantes, y la segunda muestra de proteína se marca
con el segundo colorante del conjunto concordante de colorantes
(por ejemplo Cy5). La reacción se detiene mediante la adición de
tampón para muestras que contiene DTT. Las muestras de proteína
marcadas se mezclan para dar una única muestra para separación. Las
muestras se separan electroforéticamente, preferentemente mediante
2D-PAGE. Los procedimientos para la separación
electroforética son bien conocidos por los expertos en la
técnica.
En un cuarto aspecto de la invención, se
proporciona un kit que comprende un conjunto concordante de
colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes
fluorescentes diferentes que tienen la fórmula (I):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2, ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre los grupos
-(CH_{2})_{4}-W o
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W;
W se elige entre ácido sulfónico y
sulfonato;
p es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de dichos
colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos
colorantes difiere en -1.
La invención se ilustra con más detalle mediante
la referencia a los siguientes ejemplos y figuras, en las que:
La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo típico
para análisis diferencial de muestras de proteína usando colorantes
reactivos con cisteína con electroforesis 2D. Dos muestras
diferentes de proteína se preparan a partir de células, tejidos u
otros fluidos biológicos. La primera y segunda muestras de proteína
pueden ser dos muestras cualquiera en las que se desea comparar el
contenido de proteína, por ejemplo, procedente de un tejido normal
y uno enfermo, o de testigo frente a células tratadas o estimuladas
con fármaco. El método puede también ser aplicado a un sistema de
separación dimensional.
La Fig. 2 muestra imágenes superpuestas de
proteínas marcadas con conjuntos de colorante 1, 12 y 9 y separadas
mediante electroforesis en 2D con los contornos de las manchas de
proteína marcada para demostrar la concordancia posicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los espectros de 1H NMR (\delta_{H}) fueron
obtenidos en un espectrómetro Jeol JNM-LA300 FT NMR.
Los desplazamientos químicos se expresan en \delta (ppm). Las
muestras fueron preparadas como soluciones en un disolvente
deuterado adecuado tal como d_{4}-metanol. La
espectroscopía UV/VIS se llevó a cabo usando el espectrómetro Unicam
UV3 UV/VIS. El trimetoxipropeno fue adquirido de Karl Industries
Inc., Ohio, EE.UU. Todos los demás productos químicos fueron
adquiridos de Sigma-Aldrich Company Limited, Dorset,
Inglaterra.
La
N-BOC-aminoetilmaleimida y la
N-BOC-aminopropilmaleimida se
prepararon de acuerdo con la descripción bibliográfica en la
publicación J. Org. Chem., (1995), 60,
5352-5355.
Se disolvió ácido hidrazinobenzenosulfónico
(20,0 g) en ácido acético (60 ml), y se añadió
3-metil-2-butanona
(26,0 g) y luego se calentó a reflujo durante 3 horas. El compuesto
deseado se precipitó por enfriamiento en el frigorífico con raspado
y la suspensión blanquecina se diluyó con
propan-2-ol y se filtró (71%).
La
2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolenina
(16,45 g) se disolvió en metanol (160 ml) con calentamiento y se
añadió una solución saturada de KOH en
propan-2-ol (100 ml). La solución
viró a un color amarillo y se formó un sólido. La solución se
enfrió y el sólido se filtró para formar un sólido blanquecino (15,9
g, 98%). \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 7,84 (m, 2H); 7,46
(d, 1H); 3,30 (s, 3H) y 1,35 (s, 6H).
La sal de potasio del ácido
2,3,3-trimetilindolenin-5-sulfónico
(1,0 g, 3,61 mmoles) y yodometano (0,25 ml, 3,97 mmoles) se
mezclaron con diclorobenceno (10 ml) bajo una atmósfera de
nitrógeno. La solución se calentó a 100ºC usando un baño de arena
durante 4 horas. Se había comenzado a formar un sólido pero el
análisis por tlc (cromatografía en capa fina) (30% MeOH/70% DCM)
indicó que la formación de producto no era completa, por lo que se
añadió un equivalente más de yodometano, y la mezcla de reacción se
calentó durante 2 horas más antes de enfriarla a temperatura
ambiente. El sólido se recogió mediante filtración, se lavó con
diclorobenceno y dietil éter y luego se secó bajo vacío para dar un
sólido color violeta (0,89 g, 98%). \delta_{H} (300 MHz,
CD_{3}OD) 8,06 (m, 1H); 7,94 (dd, 1H); 7,84 (m, 1H); 4,02 (s, 3H)
y 1,61 (s, 6H).
La sal de potasio del ácido
2,3,3-trimetilindolenin-5-sulfónico
(10,0 g, 41,97 mmoles) y yodoetano (4,0 ml, 50,35 mmoles) fueron
mezclados con diclorobenceno (40 ml bajo una atmósfera de nitrógeno.
La solución se calentó a 120ºC usando un baño de arena durante 16
horas, produciendo un sólido violeta. El sólido se recogió mediante
filtración y luego se lavó con diclorobenceno, cloroformo y éter
para producir un sólido de color rosa pálido (10,2 g, 91%).
\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 7,98 (m, 3H), 4,55 (q, 2H),
1,56 (s, 6H) y 1,48 (t, 3H).
La sal de potasio del ácido
2,3,3-trimetilindolenin-5-sulfónico
(1,0 g, 3,61 mmoles) y yodopropano (0,4 ml, 3,97 mmoles) se
mezclaron con diclorobenceno (10 ml) bajo una atmósfera de
nitrógeno. La solución se calentó a 100ºC usando un baño de arena
durante 20 horas, produciendo un sólido gelatinosa de color pardo
rojizo. El sólido se recogió mediante filtración y después se lavó
con diclorobenceno, cloroformo y dietil éter para dar un sólido de
color rosa, (472 mg, 47%). \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 7,91
(m, 3H), 4,50 (t, 2H), 2,01 (dt, 2H), 1,56 (s, 6H) y 1,13 (t,
3H).
Se mezclaron
2,3,3-trimetilindolenina (2,0 g, 12,6 mmoles) y
1,4-butanosulfona (1,7 g, 12,6 mmoles) y se calentó
a 100ºC durante 6 horas. La solución se volvió roja gradualmente y
después de las 6 horas la mezcla de reacción se enfrió a
temperatura ambiente. El sólido se dispersó en dietil éter y se
filtró. El sólido se recogió y se secó. \delta_{H} (300 MHz,
CD_{3}OD) 7,91 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,42 (m, 2H), 4,58 (m, 2H),
2,93 (m, 2H), 2,18 (m, 2H), 1,94 (m, 2H) y 1,61 (s, 6H).
Se disolvió
2,3,3-trimetilindolenina (6,4 g, 40 mmoles) en
diclorobenceno (25 ml) y se agitó hasta que la solución era
homogénea. A esto se añadió ácido 6-bromohexanoico
(15,6 g, 80 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 110ºC en
un baño de arena durante 6,5 horas. La mezcla de reacción se dejó
enfriar a temperatura ambiente, los lados del matraz se rasparon y
luego el matraz se puso en el frigorífico durante 1 hora. Al cabo
de este tiempo, se había formado un sólido de color beige en la
solución violeta, y así el sólido se recogió mediante filtración,
luego se lavó con diclorobenceno y éter para dar un sólido beige
(7,42 g, 52%). \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 7,91 (m, 1H),
7,78 (m, 1H), 7,62 (m, 2H), 4,52 (t, 2H), 2,38 (t, 2H), 2,04 (p,
2H), 1,88-2,45 (m, 4H) y 1,61 (s, 6H).
Se disolvió
2,3,3-trimetilindolenina (11,3 g, 40 mmoles) en
diclorobenceno (30 ml) y se agitó hasta que la solución fue
homogénea. A esto se añadió ácido 5-bromobutanoico
(19,3 g, 106,6 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 110ºC
en un baño de arena durante 6,5 horas. La mezcla de reacción se dejó
enfriar a temperatura ambiente y entonces los lados del matraz se
rasparon, y luego el matraz se puso en el frigorífico durante 1
hora. Al cabo de este tiempo se formó un sólido beige en la solución
violeta de forma que el sólido se recogió mediante filtración y
luego se lavó con diclorobenceno y éter para dar un sólido beige
(18,0 g, 75%). \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 7,90 (m, 1H),
7,78 (m, 1H), 7,62 (m, 2H), 4,59 (t, 2H), 2,41 (t, 2H), 2,04 (m,
2H), 1,76 (m, 2H) y 1,61 (s, 6H).
A una solución de ácido clorhídrico 4M en
dioxano se añadió la BOC-aminoalquilmaleimida
apropriada y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 30 minutos. Al cabo de este tiempo la mezcla de reacción
había depositado un sólido y los disolventes se eliminaron bajo
vacío para dejar un sólido blanco esponjoso. El compuesto se usó en
crudo en las etapas subsiguientes.
Se disolvieron yoduro de
1-etil-2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolio
(2,0 g, 7,48 mmoles), N,N'-difenilformamidina (1,5
g, 7,48 mmoles) y trietilortoformiato (1,1 g, 7,48 mmoles) en etanol
(10 ml), y luego se calentó a reflujo (100ºC) durante 3 horas. Se
formó un sólido en los lados del matraz de reacción y el UV/VIS
mostró un nuevo pico a 408 nm. Se añadió dietil éter y precipitó y
el sólido se recogió mediante filtración, se lavó con éter y se
secó bajo vacío para dar un sólido amarillo/naranja (1,83 g, 66%).
UV/VIS (MeOH); absorción \lambda_{max} = 408 nm.
A una solución del semicolorante Cy3 (1,83 g,
6,22 mmoles) en piridina anhidra (10 ml) se añadió anhídrido
acético (1,0 ml), y la mezcla de reacción se agitó bajo una
atmósfera de nitrógeno durante 10 minutos. Al cabo de este tiempo
se añadió bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindolio
(2,2 g, 6,22 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción fue controlado
mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El disolvente se eliminó bajo
presión reducida y se purificó usando cromatografía en columna
rápida (sílice fase inversa: gradiente de agua-50%
metanol) para dar 299 mg del producto deseado ácido Cy3 (9%).
UV/VIS (MeOH); absorción \lambda_{max} = 550 nm.
El ácido Cy3 (200 mg, 0,36 mmoles) se disolvió
en DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (80 \mul, 0,40 mmoles) y
TSTU (120 mg, 0,40 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró la conversión completa en el éster de
NHS por tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con un
segundo equivalente de DIPEA (80 \mul, 0,40 mmoles) y se
añadieron aminoetilmaleimida (80 mg, 0,40 mmoles), y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante 2 horas. La cromatografía en capa
fina (tlc) indicó que había tenido lugar la conversión en un nuevo
producto y la mezcla de reacción se diluyó con dietil éter (50 ml)
y los disolventes se decantaron para dejar un residuo de color
rosa. La cromatografía en columna rápida (sílice: gradiente de
DCM-40% de metanol) dio le producto de maleimida
deseado (98 mg, 34%). UV/VIS (MeOH); absorción \lambda_{max} =
550 nm. \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 8,56 (t, 1H), 7,92 (m,
2H), 7,62-7,38 (m, 5H), 6,72 (s, 2H), 6,50 (dd, 2H),
4,19 (m, 4H), 3,52 (m, 2H), 2,15 (t, 2H), 1,94-1,56
(m, 6H), 1,75 (s, 12H) y 1,44 (t, 3H).
Se suspendió yoduro de
1,2,3,3-tetrametil-5-sulfonil-indolio
(5,00 g, 11,90 mmoles) en una mezcla de ácido acético (40 ml) y TFA
(2 ml, 18,0 mmoles) hasta que se disolvió todo el sólido. Se añadió
1,3,3-trimetoxipropeno (12,5 ml, 95,0 mmoles) a la
mezcla de reacción, y se agitó a temperatura ambiente durante 5
horas. La solución se pipeteó en 500 ml de dietil éter y el
precipitado se recogió mediante filtración (4,80 g, contiene
sales).
A una solución del semicolorante Cy5 (4,80 g,
14,9 mmoles) en metanol (40 ml) se añadió acetato potásico (3,00 g,
34,2 mmoles) y bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio (3,00 g, 16,4 mmoles). Después de agitar durante la noche,
la solución fue pipeteada en dietil éter (500 ml) y el sólido azul
se recogió mediante filtración y se secó bajo vacío. La
purificación se consiguió mediante cromatografía en columna rápida
(sílice fase inversa: gradiente de agua-50%
metanol) para dar 2,30 g del producto deseado (28%). UV/VIS (MeOH);
absorción \lambda_{max} = 642 nm.
El ácido Cy5 (200 mg, 0,36 mmoles) se disolvió
en DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (80 \mul, 0,40 mmoles) y
TSTU (120 mg, 0,40 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró la conversión completa en el éster de
NHS por tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con un
segundo equivalente de DIPEA (80 \mul, 0,40 mmoles) y se añadió
aminoetilmaleimida (80 mg, 0,40 mmoles) y la mezcla de reacción se
dejó agitando durante 2 horas. La tlc indicó que había tenido lugar
la conversión en un nuevo producto y la mezcla de reacción se
diluyó con dietil éter (50 ml) y los disolventes se decantaron para
dejar un residuo de color rosa. La cromatografía en columna rápida
(sílice: gradiente de DCM-40% de metanol) dio el
producto de maleimida deseado (105 mg, 43%). UV/VIS (MeOH);
absorción \lambda_{max} = 644 nm. \delta_{H} (300 MHz,
CD_{3}OD) 8,18 (dt, 2H), 7,82 (m, 2H), 7,56-7,24
(m, 5H), 6,80 (s, 2H), 6,64 (t, 1H), 6,45 (d, 1H), 6,24 (d, 1H),
4,17 (t, 2H), 3,60 (s, 3H), 3,40 (t, 2H), 2,09 (t, 2H),
1,89-1,48 (m, 6H) y 1,79 (s, 12H).
Se disolvieron
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolio
(4,0 g, 14,59 mmoles) malonaldehído bis(fenilimina)
hidrocloruro (7,55 g, 29,18 mmoles) en ácido acético (20 ml) y
después se calentaron a reflujo (120ºC) durante 4 horas. La mezcla
de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego los
disolventes se eliminaron bajo vacío. El aceite rojo se disolvió en
cloroformo y se lavó con agua, y luego se secó con sulfato de
magnesio y se concentró para dar un aceite rojo de semicolorante
Cy5. Este aceite se usó sin más purificación.
A una solución del semicolorante Cy5 (1,00 g,
2,07 mmoles) en piridina anhidra (10 ml) se añadió anhídrido
acético (1,0 ml) y la mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera
de nitrógeno durante 10 minutos. A esto se añadió yoduro de
1-etil-2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolio
(0,59 g, 2,28 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción se
controló mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El disolvente se eliminó
bajo presión reducida y se purificó usando cromatografía en columna
rápida (sílice: gradiente DCM-40% metanol) para dar
365 mg del producto deseado ácido Cy5 (31%). UV/VIS (MeOH);
absorción \lambda_{max} = 644 nm.
El ácido Cy5 (52 mg, 0,09 mmoles) se disolvió en
DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (10 \mul, 0,10 mmoles) y
TSTU (28 mg, 0,10 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (10 \mul, 0,10 mmoles), se añadió
aminoetilmaleimida (18 mg, 0,10 mmoles) y la mezcla de reacción se
dejó agitando durante 2 horas. La tlc indicó que había tenido lugar
la conversión en un nuevo producto de forma que la mezcla de
reacción se diluyó con dietil éter (30 ml) y los disolventes se
decantaron para dejar un residuo azul. La cromatografía en columna
rápida (sílice: gradiente DCM-40% metanol)
proporcionó el producto de maleimida deseado (29 mg, 47%). UV/VIS
(MeOH); absorción \lambda_{max} = 644 nm. \delta_{H} (300
MHz, CD_{3}OD) 8,38 (m, 2H), 7,88 (m, 2H),
7,55-7,24 (m, 5H), 6,80 (s, 2H), 6,71 (t, 1H), 6,42
(d, 1H), 6,24 (d, 1H), 4,11 (m, 4H), 3,54 (t, 2H), 2,12 (t, 2H),
1,92-1,36 (m, 9H) y 1,81 (s, 12H).
Se disolvieron bromuro de
1-(4-carboxibutil)-2,3,3-trimetil
indolio (2,00 g, 5,88 mmoles) y malonaldehído
bis(fenilimina) hidrocloruro (2,28 g, 8,82 mmoles) en ácido
acético (30 ml) y después se calentó a 120ºC durante 6 horas.
Después se dejó enfriar la mezcla de reacción antes de eliminar el
ácido acético bajo vacío para dar un aceite movedizo. Este se
disolvió en cloroformo, se lavó con agua, se secó con sulfato de
magnesio, se filtró y se concentró bajo vacío para dar un aceite
más viscoso. La mayor parte de la malonaldehído
bis(fenilimina) no reaccionada quedó en la interfase del
sistema cloroformo/agua. El compuesto se purificó usando
cromatografía en columna rápida (gradiente
diclorometano-30% metanol) para dar un sólido rojo
(120 mg, 5%).
A una solución del semicolorante Cy5 (120 mg,
0,31 mmoles) en piridina anhidra (3 ml) se añadió anhídrido acético
(0,5 ml) y la mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de
nitrógeno durante 10 minutos. Al cabo de este tiempo, se añadió el
yoduro de
1-etil-2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolio
(83 mg, 0,31 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó bajo presión
reducida y se purificó usando cromatografía en columna rápida
(sílice: gradiente diclorometano-40% metanol) para
dar 84 mg del producto deseado (48%). UV/VIS (MeOH); absorción
\lambda_{max} = 644 nm.
Se disolvió Cy5 (84 mg, 0,15 mmoles) en DMF
anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno, y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (26 \mul, 0,15 mmoles) y
TSTU (45 mg, 0,15 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que la conversión en el éster de NHS se consideró
completa por tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (DIPEA (26 \mul, 0,15 mmoles) y
luego se añadió aminoetilmaleimida (52 mg, 0,30 mmoles), y la
mezcla de reacción se dejó agitando durante otras 2 horas. La tlc
indicó que había tenido lugar la conversión en un nuevo producto, de
forma que la mezcla de reacción se diluyó con dietil éter (50 ml) y
los disolventes se decantaron para dejar un residuo de color rosa.
La cromatografía en columna rápida (sílice: gradiente
DCM-40% metanol) proporcionó el producto de
maleimida deseado (30 mg, 30%). UV/VIS (MeOH); absorción
\lambda_{max} = 644 nm. \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD)
8,15 (q, 2H), 7,80 (m, 2H), 7,52-7,31 (m, 5H), 6,75
(s, 2H), 6,64 (t, 1H), 6,46 (d, 1H), 6,32 (d, 1H), 4,27 (m, 4H),
4,15 (t, 2H), 2,09 (t, 2H), 1,79 (s, 6H), 1,65 (s, 6H)
2,56-2,44 (m, 4H) y 1,12 (t, 3H).
Se disolvieron bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio (500 mg, 1,41 mmoles),
N,N'-difenilformamidina (278 mg, 1,41 mmoles) y
yoduro de
1-sulfobutil-2,3,3-trimetilindolio
(418 mg, 1,41 mmoles) en piridina anhidra (5 ml), y se agitó a
temperatura ambiente. Después se añadió anhídrido acético (0,4 ml) y
la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura
ambiente. La piridina se eliminó bajo vacío y el aceite de color
magenta se purificó mediante cromatografía en columna rápida
(gradiente diclorometano-10% metanol) para dar un
sólido de color rosa (67 mg, 8%).
El ácido Cy3 (50 mg, 0,09 mmoles) fue disuelto
en DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno, y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (20 \mul, 0,09 mmoles) y
TSTU (59 mg, 0,18 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (20 \mul, 0,09 mmoles) y luego se
añadió la aminoetilmaleimida (32 mg, 0,18 mmoles), y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante otras 2 horas. La mezcla de
reacción se diluyó con dietil éter (50 ml) y los disolventes se
decantaron para dejar un residuo de color rosa. La cromatografía en
columna rápida (sílice: gradiente DCM-40% metanol)
proporcionó el producto de maleimida deseado (24 mg, 43%). UV/VIS
(MeOH); absorción \lambda_{max} = 550 nm. \delta_{H} (300
MHz, CD_{3}OD) 8,49 (t, 1H), 7,52-7,35 (m, 8H),
6,72 (s, 2H), 6,46 (dd, 2H), 4,09 (m, 4H), 3,57 (m, 2H), 2,85 (m,
2H), 2,15 (t, 2H), 1,94-1,43 (m, 10H) y 1,85 (s,
12H).
Se disolvieron bromuro de
1-(4-carboxibutil)-2,3,3-trimetil
indolio (1,0 g, 2,94 mmoles) y malonaldehído bisfenilimina
hidrocloruro (760 mg, 2,94 mmoles) en ácido acético (10 ml), y luego
se calentó a 120ºC durante 18 horas. La mezcla de reacción se dejó
después enfriar antes de eliminar el ácido acético bajo vacío para
dar un aceite rojo movedizo. Este se disolvió en cloroformo y se
lavó con agua, se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se
concentró bajo vacío para dar un aceite pardo rojizo más viscoso. El
compuesto se purificó usando cromatografía en columna rápida
(gradiente diclorometano - 20% metanol) para
dar un sólido naranja (1,43 g, 55%).
A una solución del semicolorante Cy5 (120 mg,
0,26 mmoles) en piridina anhidra (5 ml) se añadió anhídrido acético
(0,5 ml y la mezcla de reacción se agitó bajo una atmófera de
nitrógeno durante 10 minutos. Al cabo de este tiempo se añadió
yoduro de
1-sulfobutil-2,3,3-trimetilindolio
(83 mg, 0,28 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas. El disolvente se eliminó bajo presión
reducida y se purificó usando cromatografía en columna rápida
(sílice: gradiente diclorometano - 20%
metanol) para dar 78 mg del producto deseado (51%).
El ácido Cy5 (50 mg, 0,09 mmoles) se disolvió en
DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (15 \mul, 0,10 mmoles) y
TSTU (28 mg, 0,10 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (15 \mul, 0,10 mmoles) y después
se añadió aminoetilmaleimida (30 mg, 0,17 mmoles) y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante otras 2 horas. El análisis de tlc
indicó la conversión en un nuevo producto. La reacción se diluyó con
dietil éter (50 ml) y los disolventes se decantaron para dejar un
residuo azul. La cromatografía en columna rápida (sílice: gradiente
DCM - 40% metanol) proporcionó el producto de
maleimida deseado (30 mg, 30%). UV/VIS (MeOH); absorción
\lambda_{max} = 644 nm. \delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD)
8,19 (t, 2H), 7,52-7,42 (m, 8H), 6,71 (s, 2H), 6,64
(t, 1H), 6,36 (dt, 2H), 4,18 (m, 4H), 3,55 (m, 2H), 2,89 (m, 2H),
2,15 (t, 2H), 1,79 (s, 12H) y 2,01-1,36 (t,
8H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio (354 mg, 1,00 mmoles),
N,N'-difenilformamidina (196 mg, 1,00 mmoles) y
yoduro de
1-etil-2,3,3-trimetil-5-sulfonil-indolio
(267 mg, 1,00 mmoles) en piridina anhidra (15 ml), y se agitó a
temperatura ambiente. Entonces se añadió anhídrido acético (0,5 ml)
y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura
ambiente. La piridina se eliminó bajo vacío y el aceite magenta se
purificó mediante cromatografía en columna rápida (gradiente
diclorometano - 40% metanol) para dar un
sólido de color rosa (30 mg, 6%).
El ácido Cy3 (30 mg, 0,05 mmoles) se disolvió en
DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (10 \mul, 0,05 mmoles) y
TSTU (2 mg, 0,05 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 2
horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (10 \mul, 0,05 mmoles) y luego
se añadió la aminoetilmaleimida (9 mg, 0,05 mmoles), y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante otras 2 horas. La mezcla de
reacción se diluyó con dietil éter (20 ml y los disolventes se
decantaron para dejar un residuo de color rosa. La cromatografía en
columna rápida (sílice: gradientre DCM - 40%
metanol) proporcionó el producto de maleimida deseado (15 mg, 44%).
UV/VIS (MeOH); absorción \lambda_{max} = 550 nm. \delta_{H}
(300 MHz, CD_{3}OD) 8,53 (t, 1H), 7,95 (m, 2H),
7,59-7,41 (m, 5H), 6,78 (s, 2H), 6,50 (t, 2H), 4,17
(m, 4H), 3,50 (m, 2H), 3,14 (t, 2H), 2,14 (t, 2H),
1,98-1,28 (m, 11H) y 1,79 (s, 12H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio (6,0 g, 16,95 mmoles) y
N,N'-difenilformamidina (6,63 g, 33,87 mmoles) en
ácido acético (20 ml) y luego se calentó a 120ºC durante 5 horas. El
ácido acético se eliminó bajo vacío y el residuo se purificó usando
cromatografía en columna (sílice: gradiente diclorometano
- 20% metanol) dando un sólido de color
amarillo/naranja (1,34 g, 21%).
A una solución del semicolorante Cy3 (250 mg,
0,55 mmoles) en piridina anhidra (5 ml) se añadió anhídrido acético
(0,5 ml) y la mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de
nitrógeno durante 10 minutos. Al cabo de este tiempo se añadió
yoduro de
1-sulfobutil-2,3,3-trimetilindolio
(161 mg, 0,55 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 22 horas. El disolvente se eliminó bajo
presión reducida y se purificó usando cromatografía en columna
rápida (sílice: gradiente diclorometano - 20%
metanol) para dar 142 mg del producto de ácido Cy3 deseado
(45%).
El ácido Cy3 (50 mg, 0,09 mmoles) se disolvió en
DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (15 \mul, 0,10 mmoles) y
TSTU (28 mg, 0,10 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (15 \mul, 0,10 mmoles) y se
añadió aminopropilmaleimida (18 mg, 0,10 mmoles), y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante 2 horas. La mezcla de reacción se
diluyó con dietil éter (50 ml) y los disolventes se decantaron para
dejar un residuo de color rosa. La cromatografía en columna rápida
(sílice: gradiente DCM - 40% metanol)
proporcionó el producto de maleimida deseado (15 mg, 24%).
\delta_{H} (300 MHz, CD_{3}OD) 8,49 (t, 1H),
7,78-7,22 (m, 8H), 6,72 (s, 2H), 6,50 (t, 2H), 4,12
(m, 4H), 3,47 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 2,15 (t, 2H),
2,01-1,24 (m, 12H) y 1,85 (s, 12H).
Se disolvieron bromuro de
5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio (353 mg, 1,00 mmoles), malonaldehído bisfenilimina
hidrocloruro (259 mg, 1,00 mmoles) y yoduro de
1-sulfobutil-2,3,3-trimetilindolio
(295 mg, 1,00 mmoles) en piridina anhidra (5 ml) y se agitó a
temperatura ambiente. Después se añadió anhídrido acético (0,4 ml) y
la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura
ambiente. La piridina se eliminó bajo vacío y el aceite azul se
purificó mediante cromatografía en columna rápida (gradiente
diclorometano - 10% metanol) para dar un
sólido azul (54 mg, 8%).
El ácido Cy5 (49 mg, 0,08 mmoles) se disolvió en
DMF anhidra bajo una atmósfera de nitrógeno, y luego se agitó a
temperatura ambiente. Se añadieron DIPEA (12 \mul, 0,09 mmoles) y
TSTU (27 mg, 0,09 mmoles) y la mezcla de reacción se agitó durante
2 horas hasta que se consideró completa la conversión en el éster de
NHS mediante tlc (20% MeOH/80% DCM). El éster de NHS se trató con
un segundo equivalente de DIPEA (12 \mul, 0,09 mmoles) y después
se añadió aminoetilmaleimida (28 mg, 0,16 mmoles) y la mezcla de
reacción se dejó agitando durante otras 2 horas. La tlc indicó que
había tenido lugar la conversión en un nuevo producto de forma que
la reacción se diluyó con dietil éter (50 ml) y los disolventes se
decantaron para dejar un residuo de color rosa. La cromatografía en
columna rápida (sílice: gradiente DCM - 40%
metanol) proporcionó el producto de maleimida deseado (24 mg, 45%).
UV/VIS (MeOH); absorción \lambda_{max} = 644 nm. \delta_{H}
(300 MHz, CD_{3}OD) 8,21 (t, 2H), 7,54-7,26 (m,
8H), 6,80 (s, 2H), 6,64 (t, 1H), 6,38 (dd, 2H), 4,18 (m, 4H), 3,58
(m, 2H), 2,89 (m, 2H), 2,15 (t, 2H), 1,76 (s, 12H) y
2,06-1,39 (m,
10H).
10H).
\vskip1.000000\baselineskip
Por métodos similares se hicieron reaccionar
yoduro de
1,2,3,3-tetrametil-5-sulfonil-indolio
y bromuro de
1-(5-carboxipentil)-2,3,3-trimetil
indolio con N,N'-difenilformamidina para formar el
ácido Cy3, que cuando se activó al éster de
N-hidroxisuccinimida y se trató con
aminoetilmaleimida, se conviertió en
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1,3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizaron experimentos iniciales en muestras
de E. coli. La cepa ER1647 de E. coli (Amersham
Biosciences, Buckinghamshire, RU) se desarrolló en medio MOPS rico
en glucosa a 37ºC durante la noche, y a continuación se recolectó
mediante centrifugación durante 10 minutos a 4ºC a 12.000 x g. El
sedimento de células se lavó dos veces con tampón para lavado (Tris
10 mM pH 8,0, acetato de magnesio 0,5 mM). Las células fueron
después resuspendidas en tampón para lisis (urea 8M, CHAPS 4% p/v,
Tris 40 mM pH 8,0) y se lisaron mediante sonicación (pulsos 3 x 10
segundos en hielo). La concentración de proteína del lisado de E.
coli fue determinada usando el ensayo Bio-Rad
Dc Protein Assay como describe el fabricante
(Bio-Rad, Hertfordshire, RU).
Antes de su uso, los colorantes de cianina
fueron reconstituídos en DMF anhidra (Aldrich código de catálogo
22.705-6) para dar una concentración final de 10 mM
(10 nmol/\mul). El colorante se agitó en vórtice brevemente
después de la adición de DMF para asegurar que el colorante estaba
completamente disuelto. El colorante reconstituído fue almacenado a
-20ºC y usado dentro de las 2 semanas.
Los puentes disulfuro en 50 \mug de proteína
en tampón para lisis fueron reducidos mediante la adición de 10
nmoles de TCEP [tris-(2-carboxietil)fosfina]
seguida por la incubación a 37ºC durante 1 hora. Después de la
reducción, se añadieron 20 nmoles de colorante reconstituido y se
incubó durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se detuvo con un
volumen igual de 2x tampón para muestra (tampón para muestra más 20
mg/ml de DTT y 4% (v/v) de Pharmalytes 3-10). Las
muestras se almacenaron brevemente en hielo antes de la separación
en primera dimensión o se congelaron protegidas contra la luz para
un almacenamiento más largo.
\vskip1.000000\baselineskip
Cantidades iguales de muestras de proteína
marcada con los compuestos Cy3 y Cy5 I a XI fueron mezcladas para
dar los conjuntos de pares de colorante que se indican en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó electroforesis 2D usando el equipo
estándar Amersham Biosciences 2D PAGE y reactivos PlusOne^{TM}
(Buckinghamshire, RU). Tiras DryStrips Immobiline(pH
3-10 NL o pH 4-7 NL, 24 cm) fueron
rehidratadas durante la noche en 450 \mul de tampón para
rehidratación (urea 8M, 4% p/v CHAPS, 1% Pharmalytes (pH
3-10), 2 mg/ml DTT) recubiertas con 2,5 ml de
fluido de cobertura DryStrip Cover Fluid, en una bandeja de
rehinchamiento Immobiline DryStrip Reswelling Tray. Las tiras
fueron enfocadas usando el sistema de enfoque isoeléctrico
Multiphor. Antes de la 2ª dimensión de PAGE, cada tira fue
equilibrada con 10 ml de tampón para equilibrado A (urea 8M,
Tris-HCl 100 mM pH 6,8, 30% v/v glicerol, SDS al 1%
p/v, 5 mg/ml de DTT) en una mesa basculante durante 10 minutos,
seguido por 10 ml de tampón para equilibrado B (urea 8M,
Tris-HCl 100 mM pH 6,8, 30% v/v glicerol, SDS al 1%
p/v, 45 mg/ml de yodoacetamida) durante 10 minutos más. Después se
cargaron las tiras y se analizaron en geles isocráticos Laemmli al
12% para SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas marcadas fueron visualizadas
usando el aparato 2920 MasterImager (Amersham Biosciences,
Buckinghamshire, RU) con los siguientes ajustes:
Los tiempos de exposición fueron optimizados
para experimentos individuales para dar un valor de píxeles máximo
en la imagen de 50.000 para evitar la saturación de la señal. Los
datos de 2D-Master fueron exportados como archivos
TIF a Paintshop Pro^{TM} para generar superposiciones de color
para inspección visual. Para un análisis cuantitativo detallado de
concordancia de colorantes, las imágenes del gel fueron exportadas
al programa de software 2D Image Master.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del gel en este estudio se realizó
usando una plataforma de software de análisis 2-D
Image Master (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, RU). Después
de la detección de las manchas, el centro de cada mancha se usó
para generar coordenadas de píxel para cada una de las imágenes de
Cy3 y Cy5. La cuantía de la concordancia de migración se determinó
comparando las posiciones de las coordenadas de los centros de las
manchas de Cy3 y Cy5. Esto puede usarse para describir la
concordancia posicional en términos del número de manchas
concordantes dentro de \pm2 píxeles de cada una tanto en las
coordenadas x (pI) como y (masa).
Como ambos colorantes han sido usados para
marcar la misma muestra, las mismas proteínas están presentes en
cada muestra marcada y por tanto si los colorantes son concordantes
para una migración equivalente todas las manchas se deberían
superponer exactamente entre las 2 imágenes. Se midió el % de
manchas dentro de \pm2 píxeles para determinar la concordancia
global.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los efectos de la estructura del colorante
fueron ensayados marcando la misma muestra de proteína compleja
(lisado de E. coli) con cada colorante, mezclando las
muestras marcadas con Cy3 y Cy5, y separando mediante
electroforesis 2D. Después del escaneo de fluorescencia, las
imágenes fueron superpuestas y analizadas como se ha descrito en el
ejemplo anterior.
El lisado de E. coli fue marcado con
compuestos Cy3 y con compuestos Cy5 como se ha descrito. La muestras
marcadas se mezclaron antes de la separación para dar los conjuntos
de colorantes 1, 2, 9, 11 y 12 para mostrar el efecto de variar la
longitud de la cadena de alquilo mediante la adición de unidades de
CH_{2}. La Tabla 3 muestra los datos posicionales cuantitativos
después del análisis de imágenes superpuestas de proteínas marcadas
con los conjuntos de colorantes 1, 2, 9, 11 y 12.
Así, cuando los compuestos Cy3 y Cy5 tienen
cadenas alquilo iguales (p. ej. los conjuntos de colorantes 11 y
12) la masa global de Cy3 disminuye en relación con Cy5. Esto tiene
por resultado una escasa concordancia posicional en la dimensión
masa. Cuando hay una diferencia de dos unidades de carbono en la
longitud de la cadena alquilo (p. ej. conjunto de colorantes 9), la
concordancia de masa mejora. La concordancia óptima tanto para masa
como para pI se obtiene cuando hay una diferencia de un único átomo
de carbono entre los colorantes (p. ej. conjunto de colorantes 1 y
2). El conjunto de colorantes preferido es el conjunto de colorantes
1. Esto indica que la concordancia de la migración usando una
diferencia de una única unidad de carbono en el enlazador r da una
buena concordancia posicional de proteínas marcadas diferencialmente
en la electroforesis 2D.
La Figura 2 muestra imágenes de superposición de
proteínas marcadas con los conjuntos de colorantes 1, 12 y 9 y
separadas mediante electroforesis 2D con contornos de manchas de
proteína marcada para demostrar la concordancia posicional. Las
superposiciones se toman de una porción de un gel de electroforesis
2D de lisado de E. coli marcado con Cy3 o Cy5 mostrando el
intervalo de masa de aproximadamente 20-30 kDa y el
intervalo de pI de aproximadamente 5,5-6,0. Los
círculos que representan las posiciones de contorno de las manchas
de proteína para las proteínas tanto marcadas con Cy3 como con Cy5
(con flechas) fueron determinados usando el software 2D
ImageMaster. El conjunto de colorantes 12 da una escasa concordancia
de masa ya que las proteínas marcadas con Cy5 corren por debajo de
las proteínas marcadas con Cy3 (ejemplo señalado con flecha). El
conjunto de colorantes 9 también muestra una escasa concordancia de
masa, en este caso corriendo las proteínas marcadas con Cy5 por
encima de las proteínas marcadas con Cy3 (ejemplo señalado con
flecha). El conjunto de colorantes preferido 1 da la concordancia
posicional óptima.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El lisado de E. coli fue marcado con
compuestos Cy3 y Cy5 y las muestras se mezclaron para dar los
conjuntos de colorantes 1 y 3 como se ha descrito. La Tabla 4
muestra los datos posicionales cuantitativos después del análisis
de las imágenes superpuestas de proteínas marcadas con estos
conjuntos de colorantes.
Esto indica que la concordancia de migración
usando una diferencia de una sola unidad de carbono en el enlazador
p da una buena concordancia posicional de proteínas marcadas
diferencialmente en electroforesis 2D.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La variación del enlazador q se consiguió
aumentando la longitud del enlazador en una única unidad CH_{2}
desde una aminoetil a una aminopropil maleimida. El lisado de E.
coli fue marcado con compuestos Cy3 y Cy5 y las muestras se
mezclaron para dar los conjuntos de colorantes 1, 5 y 7 como se
describe. La Tabla 5 muestra los datos posicionales cuantitativos
después del análisis de las imágenes superpuestas de proteínas
marcadas con estos conjuntos de colorantes.
Así, el enlazador de aminoetilo (conjunto de
colorantes 1) tiene una concordancia de pI mejorada en comparación
con el enlazador de aminopropilo (conjuntos de colorantes 5 y 7),
posiblemente debido al efecto \beta. Cuando hay una diferencia de
dos unidades de carbono entre los colorantes, la concordancia de
masa también disminuye (conjunto de colorantes 7). Cuando hay una
diferencia de una única unidad de carbono la concordancia de masa
mejora. Así, se prefiere un enlazador de aminoetil maleimida (q = 2)
para la concordancia de pI.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los colorantes de cianina sulfonada tienen
generalmente el grupo sulfonato directamente unido al anillo de
indol como en el conjunto de colorantes 1. La variación de la
posición del sulfonato se realizó uniendo el sulfonato al anillo
por medio de un enlazador de cadena de butilo. El lisado de E.
coli fue marcado con compuestos Cy3 y Cy5 y las muestras se
mezclaron para dar los conjuntos de colorantes 1, 4, 6, 8 y 10 como
se describe. La Tabla 6 muestra los datos posicionales cuantitativos
después del análisis de las imágenes superpuestas de proteínas
marcadas con estos conjuntos de colorantes.
La comparación con datos anteriores indica que
la eliminación del sulfonato desde el sistema de anillo a una
cadena de butilo colgante no parece cambiar la concordancia de pI.
La concordancia en la dimensión masa no es mejor que la conseguida
con el conjunto de colorantes 1. Cuando no hay compensación por la
diferencia de n entre los colorantes, la concordancia de migración
disminuye (conjunto de colorantes 10). Cuando hay una diferencia de
dos unidades de carbono (conjunto de colorantes 8), la concordancia
de masa disminuye en comparación con el conjunto de colorantes 1.
Cuando hay una diferencia de una única unidad de carbono (conjuntos
de colorantes 4 y 6) la concordancia se mejora. La mejor
combinación con un sulfonato de butilo colgante es modificar el
enlazador q con la maleimida (conjunto de colorantes 6).
Claims (17)
1. Un conjunto concordante de colorantes
fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes
diferentes de fórmula (I):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre los grupos
-(CH_{2})_{4}-W o
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;
p es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de
dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de
dichos dos colorantes difiere en -1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un conjunto concordante de colorantes
fluorescentes de acuerdo con la reivindicación 1ª, que comprende al
menos dos diferentes colorantes fluorescentes de fórmula (II):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
\newpage
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre -(CH_{2})_{4}-W o
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;
p es un número entero entre 3 y 6;
q se elige para que sea 2 ó 3;
y r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de
dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de
dichos dos colorantes difiere en -1.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un conjunto concordante según las
reivindicaciones 1ª o 2ª, que comprende al menos dos colorantes
fluorescentes diferentes de acuerdo con la fórmula (I) o (II) en la
cual:
n se elige para que sea 1 ó 2;
p se elige para que sea 4 ó 5;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r se elige para que sea 1, 2 ó 3.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un conjunto concordante según cualquiera de
las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que dicho grupo de unión diana
Y en cada colorante del conjunto de colorantes es el mismo, y se
elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.
5. Un conjunto concordante según la
reivindicación 4ª, en el que dicho colorante Y es un grupo
maleimido.
6. Un conjunto concordante según cualquiera de
las reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que dichas sales se eligen
entre K^{+}, Na^{+}, NH_{4}^{+}, R_{3}NH^{+} y
R_{4}N^{+} en donde R es alquilo C_{1} a C_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un conjunto concordante según cualquiera de
las reivindicaciones 1ª a 6ª, elegidos entre:
Conjunto
1
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto I); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1,3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto II);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
2
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-propil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto III); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto IV);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
3
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto I); y
1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto V);
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
4
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto VI); y
1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto VII).
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
5
1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto VIII); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto IV); y
\vskip1.000000\baselineskip
Conjunto
6
1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio
(Compuesto IX); y
1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio
(Compuesto X).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un método para marcar una mezcla de proteínas
de una muestra en la que cada una de dichas proteínas contiene uno
o más restos de cisteína, comprendiendo dicho método:
i) añadir a un líquido acuoso que contiene dicha
muestra un colorante fluorescente elegido entre un conjunto
concordante de colorantes fluorescentes según las reivindicaciones
1ª o 2ª, en donde dicho colorante contiene un grupo de unión diana
que es reactivo de forma covalente con dichos uno o más restos de
cisteína de dichas proteínas; y
ii) hacer reaccionar dicho colorante con dichas
proteínas de forma que dicho colorante marque dichas proteínas;
con lo que todos los restos de cisteína
disponibles en dichas proteínas son marcados con dicho
colorante.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un método según la reivindicación 8ª, en el
que dicho grupo de unión diana se elige entre un grupo maleimido y
un grupo yodoacetamido.
10. Un método según la reivindicación 8ª, que
comprende además, antes de la etapa i), la etapa de tratar la
proteína con un reductor.
11. Un método según la reivindicación 8ª, en el
que dicho colorante se usa en un intervalo de 5 a 200 nmoles de
colorante por 50 \mug de proteína.
12. Un método según la reivindicación 8ª, en el
que dicho marcaje se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 6,0 a
9,0.
\newpage
13. Un método para marcar una o más proteínas de
una muestra, comprendiendo el método:
i) añadir a una muestra líquida que contiene
dichas una o más proteínas un colorante fluorescente elegido entre
un conjunto concordante de colorantes fluorescentes, teniendo cada
colorante de dicho conjunto la fórmula (I):
en la que n es diferente para cada
colorante y es 1, 2 ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre los grupos
-(CH_{2})_{4}-W ó
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;
p es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de
dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de
dichos dos colorantes difiere en -1; y
\vskip1.000000\baselineskip
ii) incubar dicho colorante con dicha muestra
bajo condiciones adecuadas para marcar dichas una o más
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un método según la reivindicación 13ª, en el
que cada uno de los grupos Z^{1} y Z^{2} representa los átomos
de carbono necesarios para completar un sistema de anillo de
fenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un método según la reivindicación 13ª o la
reivindicación 14ª, en el que
n se elige para que sea 1 ó 2;
p se elige para que sea 4 ó 5;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r se elige para que sea 1, 2 ó 3.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que el grupo de unión Y se elige
entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un kit que comprende un conjunto concordante
de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes
fluorescentes diferentes que tiene la fórmula (I):
en la que n es diferente para cada
uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó
3;
Z^{1} y Z^{2} representan independientemente
los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de
anillo fenilo o naftilo;
uno de los grupos R^{1} y R^{2} es el
grupo:
en el que Y es un grupo de unión
diana;
el grupo restante R^{1} o R^{2} se elige
entre los grupos
-(CH_{2})_{4}-W ó
-(CH_{2})_{r}-H;
el grupo R^{3} es hidrógeno, excepto cuando o
bien R^{1} o bien R^{2} es
-(CH_{2})_{r}-H, en cuyo caso
R^{3} es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;
p es un número entero de 3 a 6;
q se elige para que sea 2 ó 3; y
r es un número entero de 1 a 5;
y sus sales;
caracterizado porque cuando n de dos de
dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de
dichos dos colorantes difiere en -1.
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