CN114409578A - 一种新型多元适体分子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型多元适体分子的制备方法，其制备包括如下步骤：S1、选择同时提供‑NO2和‑CH(NH2)COOH的原料，并与醇发生酯化反应获得产物Ⅰ，产物Ⅰ再与氨水发生酰胺化反应获得产物Ⅱ，产物Ⅱ还原获得产物Ⅲ；S2、产物Ⅲ与卤代酯类发生取代反应获得产物Ⅳ，产物Ⅳ与二胺反应获得产物Ⅴ；S3、重复步骤S2获得产物Ⅵ，产物Ⅵ与卤代酯类发生取代反应，再催化加氢还原‑NO2获得具有氨基的产物Ⅶ；S4、产物Ⅶ水解获得产物Ⅷ，产物Ⅷ与硫光气反应获得产物Ⅸ。产物Ⅸ经过一系列反应，最终获得产物Ⅺ。本发明方案针对现有技术中放大倍数不足的问题，通过优化多元适体分子的制备方法，从而获得了一种高效能的特异性多元适体分子。

Description

一种新型多元适体分子的制备方法
技术领域
本发明是关于生物技术，特别是关于一种新型多元适体分子的制备方法。
背景技术
在生物技术中，通常，将某个生物分子与另一个生物分子或者其他的固相载体，通过中间偶联物或者直接交联，形成一个新的整体分子。该新的生物分子在某些领域具有特定的功能。
目前，这类交联剂是指一类分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的化合物。交联剂可分为三种类型：同型双功能试剂、异型双功能试剂和可被光活化试剂等。
目前，免疫类技术标记用的偶联方法包括共价交联方法和物理吸附法两种。其中，共价交联方法最多。共价交联方法又分为同型共价交联剂和异型共价交联剂。同型共价交联剂主要有戊二醛、戊二酸、己二胺、乙酸酐、二缩水甘油基乙醚、辛二亚氨酸甲酯等，此类交联剂容易形成分子内或者分子间的自身交联，没有方向选择性。异型交联剂使单个分子上两个末端的不同的活性基团分别与两个不同的分子交联，不会形成分子内或分子间的自身交联。现有的交联剂受限于支链结构、空间构象、空间位阻等方面的限定，标记放大能力受到了较大的限制。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型多元适体分子的制备方法，其能够用于解决多个适体分子共同组成一个新的多元大分子。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种新型多元适体分子的制备方法，多元适体分子结构通式如下：SCN-R1-L1-(COOH)n，其制备包括如下步骤：S1、选择同时提供-NO2和-CH(NH2)COOH的原料，该原料的主链选自环基、芳香基、烷基、卤代基，并与醇发生酯化反应获得产物Ⅰ，产物Ⅰ再与氨水发生酰胺化反应获得产物Ⅱ，产物Ⅱ还原获得含有伯氨的产物Ⅲ；S2、产物Ⅲ与卤代酯类发生取代反应获得具有多个酯基(优选的这里形成的酯基数量可以为2个或者3个或者4个等)的产物Ⅳ，产物Ⅳ与过量原料二胺反应获得产物Ⅴ；S3、重复步骤S2执行同一反应路线m次，获得产物Ⅵ，产物Ⅵ与卤代酯类发生取代反应，再催化加氢还原-NO2获得具有氨基的产物Ⅶ；S4、产物Ⅶ水解获得具有n个羧基的产物Ⅷ，产物Ⅷ的氨基与硫光气反应获得具有异硫氰基的产物Ⅸ。优选的，步骤S3中可以重复步骤S2执行同一反应路线m次，m必然为0或正整数，优选的m＝(log2n-2)。其中R1为碳链或者杂链或者多元环结构，L1选自至少提供多元氨基的C1-C100长链基团；n为正整数且不小于4。C1-C100主要用于表示主链长度，可以为碳链或者具有杂原子的主链，其中C1-C100指含有1-100个主链原子的链结构，即一般而言为C原子、O原子、Si原子、N原子等在主链中的数量。L1优选的选自乙二胺、丙二胺、丁二胺等。R1选自环基、芳香基、烷基、卤代基。优选的，产物Ⅲ为二胺。
在本发明的一个或多个实施方式中，还包括步骤S5、产物Ⅸ的异硫氰基与氨基磁珠的氨基共价反应获得产物Ⅹ，产物Ⅹ的通式为：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-(COOH)n，n为正整数，n不小于4，结构简式如下所示：
Figure BDA0003493387120000031
在本发明的一个或多个实施方式中，还包括步骤S6、产物Ⅹ中羧基与氨基化适体分子Ap1反应获得产物Ⅺ，产物Ⅺ的通式是：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-[C(O)-NH-Ap1]n，n为正整数，n不小于4，结构简式如下所示：
Figure BDA0003493387120000032
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤S6中氨基化适体分子Ap1为DNA单链序列或DNA双链序列，其包括但不限于配对检测物质T的适体分子。
在本发明的一个或多个实施方式中，检测物质T至少选自抗原CRP、CA125、AFP。
在本发明的一个或多个实施方式中，氨基化适体分子Ap1为序列5’-AACCTTGACTGG-3’或5’-AACCTTGACTGGTTTAACCTATACGGGCACATTAAACCCGTA-3’或5’-CAATGGTACGGTACGGCCAAAGGGACCCTCATGTGCGCGC-3’或5’-CCCATGCTAAAGTGGGGGA-3’或5’-TTAACTTATTGCTAAATA-3’或其他序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤S5中氨基磁珠Mag-NH2粒径为：0.01-1000μm。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤S4中产物Ⅶ水解反应为产物Ⅶ与过量TFA反应。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤S1中原料为对硝基苯丙氨酸。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤S2或S3或S4中卤代酯类选自溴乙酸甲酯、溴丙酸甲酯、溴乙酸叔丁酯、溴乙酸乙酯。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的一种新型多元适体分子具有将多个适体分子通过中间长链间隔开的方式共同共价固定在单个固相磁珠上，形成具有特定用途的新的生物大分子。其主要通过多元功能基团增加了适体分子的数量，同时通过链长L1增加了多个适体分子之间的间隔长度。新型多元适体分子通过异硫氰酸基与氨基磁珠的氨基共价交联，形成氨基磁珠化的多元分子。氨基磁珠化的多元分子再通过多元化的羧基与氨基适体的氨基共价交联，形成多元化的酰胺键，生成新型多元适体分子。包括而不限于本发明的新型多元适体分子、特异性磁珠以及药物组合物等都可以应用于磁分离、提取、免疫检测、靶向给药等各个方面。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式，对本发明技术方案进行示例性的详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
根据本发明优选实施方式的多元适体分子的合成路线，此处，以n＝16为例；如果n要调整为8或者4，可以减少合成步数；如果n要增加为32或其他，就要增加合成步数或者调整合成路线。
1、对硝基苯丙氨酸甲酯(化合物1，即产物Ⅰ的一种可能)盐酸盐的制备
1L干燥烧瓶中加入800mL甲醇，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入120mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入42g(0.2mol)对硝基苯丙氨酸，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为96.5％，产物的TLC：Rf＝0.65(展开剂：氯仿∶甲醇＝5∶1)。
2、对硝基苯丙氨酰胺(化合物2，即产物Ⅱ的一种可能)的制备
250mL烧瓶中加入13g(50mmol)对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐，加入100mL浓氨水，冰浴下搅拌8h以上，TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用冰水洗三次，干燥后即得到产品。该反应产率为85.5％，产物的TLC:Rf＝0.55(氯仿：甲醇＝5∶1)。
3、2-(4-硝基苄基)-乙二胺(化合物3，即产物Ⅲ的一种可能)的制备
250mL三口烧瓶中加入4.2g(20mmol)对硝基苯丙氨酰胺和3.5gNaBH4，加入150mL无水THF，N2保护下搅拌，冰盐浴冷却至-10℃，缓慢滴加15mLBF3-乙醚溶液，滴完后再反应1h，然后升温至60℃回流，并在此温度下反应48h。TLC监测反应进程，待反应完全后，冰盐浴冷却至-10℃，滴加甲醇至不再有气体产生，用丙酮吸收尾气，待溶液中无气体逸出时，减压蒸去溶剂，加入100mL无水乙醇搅拌均匀，然后滤去不溶物，往滤液中通入干燥HCl气体至饱和，此时有固体产生，加热溶液并回流17h，冷却后滤出固体并用乙醚洗涤，烘干后用少量水溶解，然后用10mol/LNaOH溶液调节pH至14，并用氯仿萃取(10mL×8)，氯仿相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，减压蒸去溶剂即得产物。该反应产率为83.5％，产物的TLC:Rf＝0.25(展开剂：乙腈∶水＝5∶1)。
4、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酸甲酯(化合物4，即产物Ⅳ的一种可能)的制备
250mL烧瓶中加入1.95g(10mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺，用80mL二氯甲烷溶解。再加入4g碳酸钾和少量碘化钾，氮气保护下室温搅拌1h；然后加入15.3g(9.4mL，100mmol)溴乙酸甲酯，氮气保护下升温至60℃回流48h。TLC监测反应进程，待反应完后，冷却后滤出沉淀，旋转蒸出溶剂，再减压蒸出过量的溴乙酸甲酯，残留物用二氯甲烷溶解，用水洗8～10次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，将滤液浓缩，经硅胶柱色谱分离(洗脱剂为：二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)。洗脱液中产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，将含有纯产物的洗脱液蒸干即得黄色产物，产率80％。产物的TLC:R f＝0.6(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
5、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺(化合物5，即产物Ⅴ的一种可能)的制备，到此本过程中步骤S2执行完毕
250mL烧瓶中加入34mL(0.5mol)乙二胺，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入30mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入24.15g(0.05mol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酸甲酯，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为82％，产物的TLC:Rf＝0.55(展开剂：氯仿∶甲醇＝5∶1)。
Figure BDA0003493387120000061
以下所展示的步骤6-7为可选步骤，反应条件、试剂选择等可以视合成需求而进行更多次的重复这一过程。
6、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酸甲酯(化合物6，即产物Ⅳ的又一种可能)的制备
在氮气保护下，干燥的250mL三口烧瓶中，分别加入5.95g(10mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺和80mL甲醇，置于冰水浴中搅拌均匀。在磁力搅拌器上，用恒压滴液漏斗将9.1mL(100mmol)溴丙酸甲酯逐滴加入到三口烧瓶中，混合搅拌30分钟。升高水浴温度到30度，保持温度反应30h。反应完成后，保持温度40度，用旋转蒸发器减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的溴丙酸甲酯，得产物。产率为97.6％，产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝14∶1)。
7、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺(化合物7，即产物Ⅵ的一种可能情形)的制备
250mL烧瓶中加入68mL(1.0mol)乙二胺，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入30mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入64.15g(0.05mol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酸甲酯，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为81％，产物的TLC:Rf＝0.55(展开剂:氯仿∶甲醇＝5∶1)。
Figure BDA0003493387120000081
如下步骤8也可以同等地承接前述步骤5，反应条件、试剂选择等同样地视合成需求而定。
8、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯的制备
250mL烧瓶中加入7.535g(5mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺，用80mL二氯甲烷溶解。再加入2g碳酸钾和少量碘化钾，氮气保护下室温搅拌1h；然后加入29.259g(24.3mL，150mmol)溴乙酸叔丁酯，氮气保护下升温至50℃回流48h。TLC监测反应进程，待反应完后，冷却后滤出沉淀，旋转蒸出溶剂，再减压蒸出过量的溴乙酸叔丁酯，残留物用二氯甲烷溶解，用水洗8～10次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，将滤液浓缩，经硅胶柱色谱分离(洗脱剂为：二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)。洗脱液中产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，将含有纯产物的洗脱液蒸干即得黄色粘稠产物，产率75％。产物的TLC:Rf＝0.6(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
Figure BDA0003493387120000091
9、2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯(即产物Ⅶ的一种可能)的制备
称取6.662g(2.0mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯溶于50mL甲醇中，并加入到100mL三口瓶内，待固体溶解后加入0.1g10％Pd/C，反应瓶用氢气置换10次并保持通氢气状态于室温搅拌24h，TLC检测反应完全后，将反应液过滤，滤饼用甲醇洗三次合并滤液，旋蒸干溶剂后用油泵抽干得产物，产率为92％。滤饼在湿润状态下回收至装有甲醇的广口瓶中。产物的TLC:Rf＝0.45(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
Figure BDA0003493387120000101
10、2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸(产物Ⅷ的一种可能)的制备
100mL烧瓶中加入4.952g(1.5mmol)2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯，然后加入20mLTFA，室温下反应48h。TLC监测反应进程，待反应完后，旋转蒸出TFA，往残留物中加入冷乙醚，并用玻璃棒研磨，有灰白色固体析出，冷藏后过滤出固体，烘干即得产物，产率为91％。产物的TLC:Rf＝0.25(乙腈∶水＝3∶1)。
11、2-(4-异硫氰酸基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸(产物Ⅸ的一种可能)的制备
100mL三口烧瓶中加入2.886g(1.2mmol)2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸，用少量水溶解，剧烈搅拌下滴加5mL硫光气的氯仿溶液，室温下反应3h。待反应完后，静止分层，氯仿相用水洗3次，合并所有水相，减压浓缩至5mL左右时冻干，得产物，产率为88％。
到目前为止，阶段性产物p-SCN-R1-L1-(COOH)16的总产率为19.7％。
Figure BDA0003493387120000111
12、2-(4-磁珠-硫脲-苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸(产物Ⅹ的一种可能)的制备
取10mg氨基磁珠(1mg/mL，10mL，磁珠的粒径为220μm)用双蒸水清洗三次，然后用10mLPBS-pH7.4的缓冲液溶解，放入50mL玻璃瓶，封闭后，振荡混匀，加入2.447mg(1.0μmol)2-(4-异硫氰酸基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸(用1.0mLDMF溶解)，再次振荡混匀，在摇床上室温反应2h。将磁珠反应液靠近磁铁后，用PBS清洗三次，收集上清液，余下的磁珠混合物为产物。测量上清液中化合物含量，计算产率。产率为86％。
本方案中的氨基磁珠，还可以选择0.01μm、50μm、100μm、300μm、500μm、800μm、880μm、1000μm以及0.01-1000μm范围内的其它任意值。
Figure BDA0003493387120000131
13、2-(4-磁珠-硫脲-苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸十六适体分子(产物Ⅺ的一种可能)的制备
取10mg上述氨基磁珠产物(1mg/mL，10mL)用双蒸水清洗三次，然后用10mLPBS-pH7.4的缓冲液溶解，放入50mL玻璃瓶，封闭后，振荡混匀，加入50mgEDC和50mgNHS，再次振荡混匀，在摇床上室温反应0.5h。将磁珠反应液靠近磁铁后，用PBS清洗三次。加入1.0μg氨基适体分子(H2N-Ap1)，振荡混匀后，在4℃旋转反应过夜。取出磁珠适体反应液，靠近磁铁，清洗三次，收集上清液，余下的磁珠混合物为产物。测量上清液中适体分子含量，计算产率。产率为81％。
Figure BDA0003493387120000141
本发明方案制备的新型多元适体分子在甲胎蛋白AFP浓度检测时，检测信号强度提高近15倍，明显优于现有技术的产品。
上述实施例中的序列也可以选择性地为5’-AACCTTGACTGGTTTAACCTATACGGGCACATTAAACCCGTA-3’或5’-CAATGGTACGGTACGGCCAAAGGGACCCTCATGTGCGCGC-3’或5’-CCCATGCTAAAGTGGGGGA-3’或5’-TTAACTTATTGCTAAATA-3’，引入路线可以如前述方案或者等同方案，在甲胎蛋白AFP浓度检测时，检测信号强度提高近15倍，明显优于现有技术的产品。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述多元适体分子部分结构通式如下：SCN-R1-L1-(COOH)n，其制备包括如下步骤：
S1、选择同时提供-NO2和-CH(NH2)COOH的原料，该原料的主链选自环基、芳香基、烷基、卤代基，并与醇发生酯化反应获得产物Ⅰ，产物Ⅰ再与氨水发生酰胺化反应获得产物Ⅱ，产物Ⅱ还原获得含有伯氨的产物Ⅲ；
S2、产物Ⅲ与卤代酯类发生取代反应获得具有多个酯基的产物Ⅳ，产物Ⅳ与过量原料二胺反应获得产物Ⅴ；
S3、重复步骤S2若干次，获得产物Ⅵ，产物Ⅵ与卤代酯类发生取代反应，再催化加氢还原-NO2获得具有氨基的产物Ⅶ；
S4、产物Ⅶ水解获得具有n个羧基的产物Ⅷ，产物Ⅷ的氨基与硫光气反应获得具有异硫氰基的产物Ⅸ。
2.如权利要求1所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，还包括步骤S5、产物Ⅸ的异硫氰基与氨基磁珠的氨基共价反应获得产物Ⅹ，通式为：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-(COOH)n，n为正整数，n不小于4，结构简式如下：
Figure FDA0003493387110000011
3.如权利要求2所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，还包括步骤S6、产物Ⅹ中羧基与氨基化适体分子Ap1反应获得产物Ⅺ，通式是：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-[C(O)-NH-Ap1]n，n为正整数，n不小于4，结构简式如下：
Figure FDA0003493387110000021
4.如权利要求3所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中氨基化适体分子Ap1为DNA单链序列或DNA双链序列，其包括但不限于配对检测物质T的适体分子。
5.如权利要求4所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述检测物质T至少选自抗原CRP、CA125、AFP。
6.如权利要求4所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述氨基化适体分子Ap1为序列5’-AACCTTGACTGG-3’或5’-AACCTTGACTGGTTTAACCTATACGGGCACATTAAACCCGTA-3’或5’-CAATGGTACGGTACGGCCAAAGGGACCCTCATGTGCGCGC-3’或5’-CCCATGCTAAAGTGGGGGA-3’或5’-TTAACTTATTGCTAAATA-3’。
7.如权利要求2所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中氨基磁珠粒径为：0.01-1000μm。
8.如权利要求1所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中产物Ⅶ水解反应为产物Ⅶ与过量TFA反应。
9.如权利要求1所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中原料为对硝基苯丙氨酸。
10.如权利要求1所述的新型多元适体分子的制备方法，其特征在于，所述步骤S2或S3或S4中卤代酯类选自溴乙酸甲酯、溴丙酸甲酯、溴乙酸叔丁酯、溴乙酸乙酯。
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